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1 ISSN CN / Q http: / / cjbmb. bjmu. edu. cn Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2014 年 9 月 30(9):927 ~ 932 DOI: / j. cnki. cjbmb 蚕豆萎蔫病毒 2 号山西分离株的全基因组序列测定与分析 牛颜冰, 赵欣, 赵慧琪, 张西梅 ( 山西农业大学生命科学学院, 山西太谷 ) 摘要 本试验在生物学接种的基础上, 利用非序列依赖性 PCR 扩增 ( sequence independent amplification,sia) 对感病青椒 (Capsicum annuum) 进行了分子鉴定. 序列测定及分析发现, 侵染青 椒的病毒为蚕豆萎蔫病毒 2 号 ( Broad bean wilt virus 2, BBWV2). 为明确 BBWV2 青椒分离物 (BBWV2 Ca) 的分类地位, 对 BBWV2 Ca 的全基因组序列进行了分段克隆 序列测定和分析. BBWV2 Ca RNA1 全长 bp, 含有 1 个 ORF. BBWV2 Ca RNA2 全长 bp, 含有 1 个 ORF, 编 码 3 种蛋白 :VP53 / VP37 外壳蛋白大亚基 (large coat protein, LCP) 和外壳蛋白小亚基 ( small coat protein, SCP). 全序列核苷酸同源性分析显示,BBWV2 Ca RNA1 与 BBWV2 其它分离物核苷酸同 源性在 77 9% ~ 93 7% 之间 ;RNA2 与 BBWV2 其它分离物核苷酸同源性在 80 2% ~ 93 8% 之间. 全序列系统进化分析显示,BBWV2 Ca RNA1 与 BBWV2 XJ14 3 以及 BBWV2 RP3 株系聚为一簇, 亲缘关系最近 ;RNA2 与 BBWV2 Am 形成一个独立分支, 亲缘关系最近. 关键词 青椒 ; 蚕豆萎蔫病毒 2 号 ; 全基因组序列 中图分类号 S432 4 Identification and Analysis of Complete Genomic Sequence of Broad bean wilt virus 2 Shanxi Isolate NIU Yan Bing, ZHAO Xin, ZHAO Hui Qi, ZHANG Xi Mei ( College of Life Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu , Shanxi, China) Abstract To identify the viruses that induced Capsicum annuum disease, biological inoculation and sequence independent amplification( SIA) were used. Results of SIA and sequencing showed that there was Broad bean wilt virus 2 ( BBWV2) in Capsicum annuum leaves. To further characterize the BBWV2 isolate Capsicum annuum ( BBWV2 Ca ), the complete sequence of BBWV2 Ca was cloned and determined. BBWV2 Ca RNA1 comprised bp nucleotides with one ORF. BBWV2 Ca RNA2 comprised nucleotides with one ORF and it encoded 3 kinds of proteins, VP53 / VP37, large coat protein and small coat protein. Nucleotide sequence similarity searches showed that BBWV2 Ca RNA1 and RNA2 were from 77 9% to 93 7% and from 80 2% to 93 8 % to that of other BBWV2 strains, respectively. Phylogenetic comparisons based on amino acid sequences showed that BBWV2 Ca RNA1 formed an independent branch with BBWV2 XJ14 3 and BBWV2 RP3. BBWV2 Ca RNA1 was most closely related to BBWV2 XJ14 3 and BBWV2 RP3. BBWV2 Ca RNA2 formed an independent branch with BBWV2 Am. Therefore, BBWV2 Ca RNA2 was most closely related to BBWV2 Am. Key words Capsicum annuum; Broad bean wilt virus 2; complete genome sequences 收稿日期 : ; 接受日期 : 公益性行业 ( 农业 ) 科研专项经费 (No ); 山西省自然科学基金项目 (No ) 资助 联系人 Tel: ; E mail:niuyanbingbest@ 163. com Received: January 17, 2014; Accepted: March 22, 2014 Supported by Special Fund for Agro scientific Research in Public Interest( No ); Natural Science Foundation of Shanxi( No ) Corresponding author Tel: ; E mail: niuyanbingbest@ 163. com

2 928 青椒 Capsicum annuum 是菊亚纲 Asteridae 茄科 Solanaceae 一年生或多年生草本植物 青椒 种植广泛 分布在全世界 60 多个国家和地区 1 青 椒营养丰富 辣味较淡 果肉厚而脆嫩 维生素 C 蛋 白质 糖类物质含量丰富 是群众最喜爱的蔬菜之 一 青 椒 病 毒 病 的 病 原 主 要 有 黄 瓜 花 叶 病 毒 Cucumber mosaic virus CMV 和 烟 草 花 叶 病 毒 Tobacco mosaic virus TMV 两种 2012 年作者对 山西太谷范村蔬菜种植基地的青椒病害进行调查 发现青椒表现出典型的花叶症状 为明确青椒病毒 病病原 本研究利用生物学方法 病毒 dsrna 分离技 术 非序列依赖性 PCR 扩增和 RT PCR 相结合的手 段 对青椒样品进行了分离检测与鉴定 确定其被蚕 豆萎蔫病毒 2 号 Broad bean wilt virus 2 BBWV2 所 侵染 并报道了 BBWV2 青椒分离物 BBWV2 Ca 的 基因组全序列 为研究 BBWV2 的基因遗传和变异提 供了理论依据 并为进一步构建侵染性克隆以及研究 BBWV2 的致病机制奠定了基础 1 第 30 卷 材料与方法 1 1 材料 青椒病样采自山西太谷范村蔬菜种植基地 表 现出典型花叶症状病株叶片 Fig 1 莫洛尼鼠白血 病病毒逆转录酶 M MLV 和 RNasin 核酸酶抑制剂 等 购 自 普 洛 麦 格 公 司 Taq DNA 聚 合 酶 Taqplus DNA 聚合酶 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒等购自 生工公司 克隆载体 pmd 18 T 购自宝生物公司 Fig 1 1 2 Symptoms of Capsicum annuum infected by virus 生物学接种试验 选取青椒病样叶片在磷酸盐缓冲液中研磨 将 其汁液摩擦接种于指示植物昆诺藜 心叶烟 进行症 状观察 1 3 1 4 检测 植物病原双链 RNA dsrna 的提取 参考牛颜冰等 2 3 和 Tzanetakis 等 4 方法进行 非序列依赖性 PCR SIA 和特异引物 PCR 以所提取的青椒病样 dsrna 为模板 进行 SIA 和全基因组的克隆 同时以健康青椒作为阴性对照 所用的随机引物和特异引物见 Table 1 Table 1 Sequences of primer pairs for PCR amplification Primer M4T M4 BBWV2 5 RNA1 F BBWV2 5 RNA1 R BBWV2 RNA1 F1 BBWV2 RNA1 R1 BBWV2 RNA1 F2 BBWV2 RNA1 R2 BBWV2 RNA1 F3 BBWV2 RNA1 R3 BBWV2 RNA1 F4 BBWV2 RNA1 R4 BBWV2 RNA1 F5 BBWV2 RNA1 R5 BBWV2 VP53 VP37 F BBWV2 VP53 VP37 R BBWV2 LCP F BBWV2 LCP R BBWV2 SCP F BBWV2 SCP R Sequences 5 3 GTTTTCCCAGTCACGAC T 16 GTTTTCCCAGTCACGAC TGTTTTAATAAAATATTGAAACAAAC TATGCCTTCGTTCAAATCTC CCA ATGAGATGGCWCG CTGTGAMGAMCCACGATG SGCAGATTGGTTATSWGAR ACCGTGAGRCCCACWAR MGRCGAAGRCACGCAGTRRT AAGCACACTTGTGTYCTMACAT CAAAGTGATRTKCCTAAYC CCRTCAAAYCTGCTGTAA CGSCTWGATCGTGGTCC TTCCCTCACTACTGAAATTTACTC CAGTCACTAAACAGCTTTC GCATAGCCRCTAAATAGCA GGCTTGATGGAGGAAGATG TTGACCAAGCATGTACCTC TGCGAGTGTTGCAGAAYTGYGCNTGG CCACGCACATTCCARCCCATNGA 反转 录 反 应 体 系 及 反 应 程 序 为 dsrna 模 板 3 μl 引 物 M4T 1 μl dntps 混 合 物 10 mmol L 1 μl ddh2o 9 7 μl 90 水浴 5 min 迅速冰上冷却 3 min 再加入 5 RT PCR 缓冲液 4 μl RNase 核酸 酶抑制剂 0 5 μl 逆转录酶 0 8 μl 42 1 h 70 15 min 反应结束后反应产物于 20 冰箱保存 PCR 反应体系及反应程序为 ddh2 O 18 75 μl 10 PCR 缓冲液 2 5 μl dntps 混合物 10 mmol L 0 5 μl 锚定引物 M4 或特异引物 1 μl Taqplus 酶 0 25 μl cdna 2 μl 反应程序为 94 3 min 94 30 s 52 30 s 72 1 5 min 36 个循环 72 10 min 4 保存 反应结束后 进行琼脂糖凝胶电泳检测 1 5 PCR 产物克隆及序列分析 利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段 并 将其与 PMD 18 T vector 进行连接转化 阳性克隆通 过 PCR 和酶切鉴定后送至北京华大基因研究中心 进行测序 登录 GenBank 对所得序列利用 Blast 进 行检索 用 DNAstar 对测序亚克隆进行拼接 拼接序 列用 EditSeq 程序修改和保存 结合 NCBI GenBank 部分共享数据 利用 DNAMAN 软件对所测序列与已 报道的分离物进行核苷酸序列 氨基酸序列的同源 性比较分析 运用 DNAMAN 软件构建系统进化树 以同 属 的 广 藿 香 轻 型 花 叶 病 毒 Patchouli mild mosaic virus PatMMV 和蚕豆萎蔫病毒 1 号 Broad

3 第 9 期 牛颜冰等 : 蚕豆萎蔫病毒 2 号山西分离株的全基因组序列测定与分析 929 bean wilt virus 1, BBWV1) 为外群. 2 结果 2 1 生物学接种结果青椒病样叶片的汁液在指示植物昆诺藜 心叶烟上均引起了明显的病毒病症状. 接种 7 d 后, 昆诺藜呈现坏死斑和退绿斑混合症状, 心叶烟呈现褪绿斑症状, 这符合 BBWV2 的发病特点 [5]. 2 2 SIA 检测以 M4T / M4 为引物, 以提取的 dsrna 为模板进行 SIA 检测, 得到大小约为 bp 片段, 而健康样品中未扩增出任何片段. 经克隆 测序和序列比对, 得到所扩增的病毒基因组片段为 950 bp, 与已报道的 BBWV2 RNA1 的同源性在 79% ~ 99% 之间, 证明青椒被 BBWV2 所侵染, 并将该分离物命名为 BBWV2 Ca. 2 3 BBWV2 Ca 基因组全序列的克隆 BBWV2 Ca RNA1 的克隆为进一步确定 BBWV2 Ca 的分类, 本试验以提取的青椒感病叶片中的 dsrna 为模板, 分别以 BBWV2 5 ( RNA1) F / BBWV2 5 ( RNA1) R BBWV2 ( RNA1) F1 / BBWV2 (RNA1) R1 BBWV2( RNA1) F2 / BBWV2 ( RNA1) R2 BBWV2 ( RNA1 ) F3 / BBWV2 ( RNA1 ) R3 BBWV2(RNA1) F4 / BBWV2( RNA1) R4 和 BBWV2 ( RNA1 ) F5 / BBWV2 ( RNA1 ) R5 为引物进行 BBWV2 Ca RNA1 克隆. 对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测, 分别得到大小为 393 bp bp 850 bp bp bp 和 bp 的目的片段, 而健康样品中未扩增出相应大小的片段 BBWV2 Ca RNA2 的克隆以青椒病样叶片组织所提取的 dsrna 为模板, 分别以 BBWV2 VP53 / VP37 F / BBWV2 VP53 / VP37 R ( 用于扩增 BBWV2 VP53 / VP37),BBWV2 LCP F / BBWV2 LCP R BBWV2 SCP F / BBWV2 SCP R ( 用于扩增 BBWV2 CP) 为引物进行特意引物 PCR 检测. 扩增产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测, 分别得到大小为 bp bp 和 693 bp 的目的片段, 而健康样品中未扩增出相应大小的片段. 2 4 序列相似性分析利用 DNAMAN 软件对 BBWV2 Ca RNA1 (GenBank 登录号 :KF498696) 全基因组序列与来自韩国 中国 西班牙 日本 新加坡和菲律宾的 17 个分离物进行核苷酸序列 氨基酸序列同源性比较分析 (Table 2). 结果表明,BBWV2 Ca RNA1 与 BBWV2 其它分离物核苷酸 氨基酸同源性均在 75% 以上. 与来自中国新疆的 BBWV2 XJ14 3 分离物核苷酸 氨基酸同源性均为最高, 分别是 93 7% 和 97 3 % ; 与外群 PatMMV Philippines 分离物核苷酸 氨基酸同源性为 89 3% 和 95 1% ; 与 BBWV1 Ben 分离物核苷酸 氨基酸同源性为 62 5% 和 61 3%. Table 2 Isolate Analysis of nucleotide and deduced amino acid sequences of BBWV2 Ca RNA1 with other reported isolates GenBank accession number Source Host Identity of nucleotide sequences(% ) Identity of amino acid sequences(% ) MB7 AB Japan Am JX China Ty AB Japan Gentiana triflora Capsicum annuum L AF Korea Capsicum annuum L Sp1 KC South Korea Spinacia oleracea ME AF Singapore BB2 KC South Korea Vicia faba XJ14 3 FN China Tomato RP1 JX Korea Capsicum annuum RP2 JX Korea Capsicum annuum RP3 JX Korea Capsicum annuum RP4 JX Korea Capsicum annuum RP5 JX Korea Capsicum annuum RP6 JX Korea Capsicum annuum RP7 JX Korea Capsicum annuum Ben AY Spain Capsicum annuum Philippines AB Philippines Pogostemon cablin Benth

4 930 第 30 卷 将 BBWV2 Ca RNA2(GenBank 登录号 :KF498697) 与来自中国 韩国 西班牙 日本 新加坡和菲律宾的 18 种分离物进行核苷酸序列 氨基酸序列同源性比 较分析 ( Table 3). 结果表明,BBWV2 Ca RNA2 与 BBWV2 其它分离物核苷酸 氨基酸同源性均在 Table 3 Isolate 80% 以上. 与 BBWV2 Am 分离物核苷酸 氨基酸同 源性均为最高, 分别是 93 8% 和 97 1% ;BBWV2 Ca 与外群 PatMMV Philippines 核苷酸 氨基酸同源性 为 81 1% 和 88 7% ; 与 BBWV1 Ben 分离物的核苷 酸 氨基酸同源性为 58 7% 和 58 6%. Analysis of nucleotide and deduced amino acid sequences of BBWV2 Ca RNA2 with other GenBank accession numbers Source Host Identity of nucleotide sequences(% ) Identity of amino acid sequences(% ) Am KC China Atractylodes macrocephala SP KC Korea Spinacia oleracea IA AB Japan Ty AB Japan Gentiana triflora P2 KC Korea Pisum sativum BB5 KC Korea Vicia faba ME AF Singapore XJP1 1 HQ China Pepper XJ14 3 HQ China Tomato RP1 JX Korea Capsicum annuum RP2 JX Korea Capsicum annuum RP3 JX Korea Capsicum annuum RP4 JX Korea Capsicum annuum RP5 JX Korea Capsicum annuum RP6 JX Korea Capsicum annuum RP7 JX Korea Capsicum annuum Ben AY Spain Capsicum annuum Philippines AB Philippines Pogostemon cablin Benth 为进一步研究 BBWV2 Ca 的起源与进化关系, 使用 DNAMAN 软件, 并以同属的 BBWV1 Ben PatMMV Philippines 株系为外群, 对该分离物和已报道的蚕豆病毒属其它株系分别构建 RNA1 RNA2 的氨基酸序列系统进化树 (Fig. 2A,2B). 从进化树上可以看出, BBWV2 Ca RNA1 与中国的 BBWV2 XJ14 3 以及韩国的 BBWV2 RP3 株系聚为一簇, 亲缘关系最近. 韩国的 BBWV2 BB2 株系 BBWV2 SP1 株系, 新加坡的 BBWV2 ME 株系, 以及韩国的 BBWV2 RP1 BBWV2 RP2 BBWV2 RP4 BBWV2 RP5 BBWV2 RP6 BBWV2 RP7 株系成一大支, 与 BBWV2 Ca 亲缘关系相对较远. BBWV2 Ca 与西班 Fig. 2 Phylogenetic tree analysis of BBWV2 Ca and other reported isolates on amino acid sequences ( A) Phylogenetic tree analysis of RNA1;( B) Phylogenetic tree analysis of RNA2

5 第 9 期 牛颜冰等 : 蚕豆萎蔫病毒 2 号山西分离株的全基因组序列测定与分析 931 牙的 BBWV1 Ben 株系亲缘关系最远. 根据 BBWV2 Ca RNA2 的氨基酸序列和已报道 的蚕豆病毒属株系构建系统进化树, 由进化树上可 以看出, BBWV2 Ca 分离物 RNA2 与中国的 BBWV2 Am 形成一个独立分支, 亲缘关系最近. 中 国的 BBWV2 XJP1 1 株系 韩国的 BBWV2 RP7 和 新加坡的 BBWV2 ME 株系形成一大支, 与 BBWV2 Ca 亲缘关系相对较远. BBWV1 Ben 株系亲缘关系最远. 3 讨论 BBWV2 Ca 与西班牙的 植物病毒是病毒学科的一个重要组成部分 [6] 年, Stubbs 首次从蚕豆中发现蚕豆萎蔫病 毒 [7] [8] 年, 奚仲兴等在我国首次发现蚕豆萎 蔫病毒. 蚕豆萎蔫病毒 2 号 (Broad bean wilt virus 2, BBWV2) 属于豇豆花叶病毒科 ( Comoviriadae) 蚕豆 病毒属 (Fabavirus). 该属现有 4 个成员 : 蚕豆萎蔫 病毒 1 号 蚕豆萎蔫病毒 2 号 野芝麻轻型花叶病毒 (lamium mild mosaic virus, LMMV) 和广藿香轻型花 叶病毒 ( patchouli mild mosaic virus, PatMMV) [9 12]. BBWV2 寄主范围很广, 可侵染 44 科 186 属 328 种 植物 [13], 是世界流行性病毒病原, 也是我国豆科作 物和蔬菜作物上危害最严重的病毒病原之一 [14 15]. 青椒病毒病是青椒的重要病害, 一般减产 20% ~ 30%, 严重的减产 50% 以上. 作者于 2012 年对山西 太谷范村蔬菜种植基地的青椒病害进行调查, 采取 五点取样法,12 块地中每块采集 5 株, 共采集 60 株 青椒样品, 发现其病毒病发病率在 80% 以上. 本试 验在生物学检测的基础上, 将 dsrna 分离技术 SIA 和 RT PCR 相结合, 对具有典型花叶症状的感病青 椒进行系统鉴定, 确定其被 BBWV2 所侵染, 初步将 其命名为 BBWV2 Ca. 试验中采用的 dsrna 分离技术 SIA 和 RT PCR 相结合等方法来检测鉴定植物病毒, 避免了传 统 RT PCR 所使用的总 RNA 抽提繁琐和反应易受 寄主中多酚 多糖物质等的干扰等缺点, 可有效解决 因病毒含量低 病毒颗粒不稳定等所带来的种种问 题 [16 17]. 非序列依赖性 PCR 扩增 (SIA) 是将随机引 物加入 dsrna 中, 引物 5 端含有 20 个固定序列的 核苷酸,3 端含有核苷酸随机简并序列 [18]. 退火时, 随机简并序列随机地与模板相应序列互补, 在反转 录酶的作用下延伸. 在 PCR 延伸过程中, 以固定序 列部分作引物, 进行扩增, 将其产物进行电泳分析 克隆 测序 [19]. SIA 可用于 RNA 病毒和同一病毒不 同株系的复合侵染 [20]. 为进一步确定 BBWV2 Ca 的分类地位和进化关系, 在 SIA 检测的基础上, 依据待测病毒的保守序列设计特异性引物, 采用 RT PCR 技术扩增该病毒的基因组全序列, 并将其测定结果进行同源关系和系统进化分析. BBWV2 Ca RNA1 全长为 bp, 含有 1 个 ORF, 始于 207, 终止于 5 819, 编码 个氨基酸,5 UTR 长度为 206 bp,3 UTR 长度为 110 bp. 将 BBWV2 Ca RNA1 与来自中国 韩国 西班牙 日本 新加坡和菲律宾的 17 个蚕豆病毒属分离物进行核苷酸序列 氨基酸序列同源性比较分析. 结果表明,BBWV2 Ca RNA1 与蚕豆病毒属其它分离物核苷酸 氨基酸同源性分别为 62 5% ~ 93 7% 和 61 3% ~ 97 3%. 与来自中国新疆的 BBWV2 XJ14 3 分离物核苷酸 氨基酸同源性均为最高, 分别是 93 7% 和 97 3 %, 而与外群 BBWV1 Ben 分离物的核苷酸 氨基酸同源性均为最低. BBWV2 Ca RNA2 全长 bp, 含有 1 个 ORF, 始于 190, 终止于 3 381, 编码 个氨基酸, 5 UTR 长度为 189 bp,3 UTR 长度为 178 bp. 将 BBWV2 Ca RNA2 分离物与来自中国 韩国 西班牙 日本 新加坡和菲律宾的 18 个分离物进行核苷酸序列 氨基酸序列同源性比较分析. 发现 BBWV2 Ca RNA2 与蚕豆病毒属其它分离物核苷酸 氨基酸同源性分别为 58 7% ~ 93 8% 和 58 6% ~ 97 1%. 与 BBWV2 Am 分离物核苷酸 氨基酸同源性均为最高. BBWV2 Ca 与 PatMMV Philippines 核苷酸 氨基酸同源性为 81 1% 和 88 7%, 与 BBWV1 Ben 分离物核苷酸 氨基酸同源性最低, 仅为 58 7% 和 58 6%. 本实验建立了简便 有效的植物病毒检测体系, 为监测田间 BBWV2 的发病情况打下基础, 同时也为有效地预防和控制青椒上 BBWV2 的普遍性流行提供了重要依据, 并为进一步进行抗 BBWV2 的基因工程研究奠定了基础. 参考文献 (References) [ 1 ] 杨永林, 闫淑珍, 田茹燕, 等. 中国六省 市辣 ( 甜 ) 椒病毒病种群及其分布的研究 [ J]. 中国病毒学 ( Yang Y L, Yan S Z, Tian R Y, et al. A report on the research of virus populations on pepper ( Capsicum frutescens L. ) and their distributions in six provinces or cities of China[ J]. Virol Sin), 1995, 10(4): [ 2 ] 牛颜冰, 王德富, 姚敏, 等. 侵染苘麻的烟草花叶病毒鉴定 [J]. 植物保护学报 ( Niu Y B, Wang D F, Yao M, et al. Identification of Tobacco mosaic virus in Abutilon theophrastii in

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