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1 中 国 农 业 科 学 2008,41(6): Scientia Agricultura Sinica doi: /j.issn 沙 田 柚 多 倍 体 的 获 得 与 基 因 组 原 位 杂 交 (GISH) 分 析 向 素 琼 1,2, 梁 国 鲁 1, 李 晓 林 1, 汪 卫 星 1, 郭 启 高 1, 何 桥 1, 陈 瑶 1 ( 1 西 南 大 学 园 艺 园 林 学 院, 重 庆 ; 2 中 国 农 业 科 学 院 柑 橘 研 究 所 重 庆 ) 摘 要 : 目 的 沙 田 柚 是 中 国 特 有 的 柚 类 名 优 品 种, 但 种 子 多, 一 般 100 粒 左 右 为 创 新 三 倍 体 无 核 品 种 积 累 育 种 材 料, 本 研 究 通 过 实 生 筛 选 获 得 不 同 倍 性 沙 田 柚 新 种 质, 同 时 运 用 基 因 组 原 位 杂 交 (GISH) 技 术 分 析 天 然 与 人 工 四 倍 体 新 种 质 的 染 色 体 组 组 成 方 法 随 机 采 集 沙 田 柚 自 然 授 粉 果 实, 萌 发 种 子 检 测 其 染 色 体 数 目 获 得 倍 性 变 异 植 株 ; 以 2x 母 株 gdna 为 探 针, 同 获 得 的 4x 植 株 中 期 染 色 体 杂 交 进 行 GISH 分 析 结 果 从 粒 沙 田 柚 种 子 中 共 获 得 三 倍 体 5 株, 四 倍 体 9 株 ; 对 沙 田 柚 天 然 与 人 工 四 倍 体 新 种 质 的 基 因 组 原 位 杂 交 (GISH) 分 析 表 明, 天 然 四 倍 体 中 有 7 株 为 异 源 四 倍 体,2 株 为 同 源 四 倍 体, 秋 水 仙 碱 诱 导 获 得 的 人 工 四 倍 体 4 株 均 为 同 源 四 倍 体 ; 初 步 观 察 显 示 ; 与 二 倍 体 相 比, 四 倍 体 植 株 生 长 缓 慢, 树 冠 较 小, 枝 短 而 密 生, 叶 片 浓 绿, 宽 度 变 宽, 叶 形 指 数 减 小, 叶 片 厚 度 增 加 明 显 结 论 多 倍 体 单 胚 柚 新 种 质 的 获 得 为 进 一 步 选 育 无 核 品 种 奠 定 了 基 础, 同 时 GISH 分 析 证 实 了 沙 田 柚 雌 性 未 减 数 配 子 的 存 在 关 键 词 : 沙 田 柚 ; 多 倍 体 ; 基 因 组 原 位 杂 交 ; 未 减 数 配 子 Obtaining Polyploids and Genome Analysis of Tetraploids by GISH in Citrus grandis cv. Shatianyou XIANG Su-qiong 1,2, LIANG Guo-lu 1, LI Xiao-lin 1, WANG Wei-xing 1, GUO Qi-gao 1, HE Qiao 1, CHEN Yao 1 ( 1 Horticulture and Landscape College, Southwest University, Chongqing ; 2 Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing ) Abstract: Objective Shatianyou (Citrus grandis Osbeck. cv. Shatianyou) is an elite pummelo cultivar in China, but it is seedy with about 100 seeds per fruit. The aim of this experiment was to obtain different ploidy new germplasm for seedless triploid breeding by screening seedlings, and to analyze genome constitution of natural and artificial tetraploids by genome in situ hybridization (GISH). Method Open-pollinated seeds were collected randomly, ploidy variation seedlings were screened by chromosome counting; In order to analyze genome constitution of tetraploids, the labeled total gdna of diploid as probe was hybridized to tetraploid metaphase chromosomes by GISH. Result Five triploids and nine tetraploids were found from seeds. GISH analysis of tetraploids showed that there were seven allotetraploid and two autotetraploid in natural tetraploids, while four artificial tetraploids from colchicine induction were all autotetraploid. Preparatory morphology observation on different ploidy plants suggested that tetraploids grew slower than comparable diploids. Tetraploids have smaller tree crown, shorter vernal branches, greener and obvious thicker leaves than corresponding diploids, but with smaller leaf indexes because of their bigger width. Conclusion These monoembryonic polyploids are valuable for seedless breeding. GISH result has proved the existence of unreduced eggs in Citrus grandis cv. Shatianyou. Key words: Citrus grandis Osbeck. cv. Shatianyou; Polyploid; Genome in situ hybridization (GISH); Unreduced gamete 0 引 言 研 究 意 义 中 国 是 柚 类 人 工 栽 培 最 早 的 国 家, 品 种 繁 多, 沙 田 柚 (Citrus grandis Osbeck. cv. Shatianyou) 为 中 国 特 有 的 柚 类 名 优 品 种, 但 种 子 数 平 均 每 果 100 粒 左 右, 很 大 程 度 上 影 响 了 其 可 食 性 和 商 品 性, 降 低 了 在 国 内 外 市 场 上 的 竞 争 力 因 此, 选 育 无 核 沙 田 柚 品 种 显 得 迫 切 而 具 有 重 要 经 济 价 值 前 收 稿 日 期 : ; 接 受 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( ) 和 重 庆 市 教 育 委 员 会 科 学 技 术 研 究 项 目 (KJ060313) 作 者 简 介 : 向 素 琼 (1971-), 女, 四 川 苍 溪 人, 副 研 究 员, 博 士 研 究 生, 研 究 方 向 为 果 树 遗 传 育 种 与 现 代 生 物 技 术 Tel/fax: ; xsq@swu.edu.cn 通 讯 作 者 梁 国 鲁 (1960-), 男, 重 庆 酉 阳 人, 研 究 员, 研 究 方 向 为 果 树 遗 传 育 种 Lianggl@swu.edu.cn

2 1750 中 国 农 业 科 学 41 卷 人 研 究 进 展 减 少 种 子 数 一 直 是 沙 田 柚 育 种 的 主 要 目 标 之 一, 国 内 有 许 多 学 者 在 选 育 无 核 沙 田 柚 方 面 进 行 了 包 括 激 光 诱 变 植 物 生 长 调 节 剂 诱 导 单 性 结 实 体 [1] 细 胞 杂 种 四 倍 体 授 粉 产 生 瘪 籽 少 籽 或 无 核 果 实 等 研 究, 但 由 于 产 量 或 品 质 等 原 因 至 今 仍 未 见 有 大 面 积 的 无 核 沙 田 柚 商 业 生 产 而 有 关 沙 田 柚 多 倍 体 的 研 究, [2] 目 前 仅 有 宋 健 坤 等 报 道 以 沙 田 柚 为 母 本, 用 体 细 胞 杂 种 橘 柚 + 无 酸 甜 橙 的 花 粉 授 粉 获 得 了 含 沙 田 柚 血 统 的 三 倍 体 此 外 未 见 报 道 本 研 究 切 入 点 柑 橘 天 然 四 倍 体 种 质 较 少, 而 用 于 有 性 杂 交 培 育 三 倍 体 无 核 品 种 的 单 胚 四 倍 体 亲 本 更 少 本 研 究 目 的 是 筛 选 沙 田 柚 自 然 授 粉 实 生 苗 中 的 倍 性 变 异, 获 得 单 胚 柚 的 三 倍 体 和 四 倍 体 新 种 质, 为 进 一 步 培 育 无 核 三 倍 体 品 种 奠 定 基 础 同 时 为 探 讨 多 倍 体 来 源, 采 用 基 因 组 原 位 杂 交 (GISH) 技 术 对 其 进 行 了 染 色 体 组 成 分 析 拟 解 决 的 关 键 问 题 从 沙 田 柚 实 生 苗 中 获 得 多 倍 体, 建 立 柑 橘 基 因 组 原 位 杂 交 流 程 并 运 用 其 初 步 分 析 部 分 多 倍 体 的 基 因 组 组 成 1 材 料 与 方 法 1.1 沙 田 柚 多 倍 体 的 实 生 筛 选 果 实 近 成 熟 时 随 机 采 收 沙 田 柚 果 实 ( 来 源 于 国 家 果 树 种 质 重 庆 柑 橘 圃 ), 从 自 然 授 粉 果 实 中 取 出 种 子, 促 其 萌 发 生 根, 检 测 根 尖 染 色 体 数 目, 从 中 筛 选 多 倍 体 植 株 染 色 体 标 本 的 制 备 采 用 去 壁 低 渗 - 火 焰 干 燥 [3] 法 并 略 有 改 进 取 根 尖 分 生 组 织, 室 温 mol L 羟 基 喹 啉 处 理 2~3 h, 然 后 于 新 配 置 的 甲 醇 - 冰 乙 酸 (3:1) 固 定 液 中 固 定 3% 纤 维 素 酶 和 果 胶 酶 混 合 液 中 解 离 2~3 h, 低 渗 10 min, 再 固 定 30 min, 火 焰 干 燥 涂 片 5% Giemsa 染 液 染 色 5~10 min, 冲 洗 晾 干, 镜 检 倍 性 1.2 不 同 倍 性 植 株 形 态 学 观 察 以 同 期 栽 植 的 沙 田 柚 二 倍 体 植 株 为 对 照, 观 察 7 年 生 四 倍 体 生 长 状 况, 测 量 相 同 发 育 时 期 的 植 株 高 度 干 周 当 年 春 梢 长 度 及 春 梢 成 熟 叶 片 的 长 度 宽 度 和 厚 度, 春 梢 长 度 和 叶 片 每 株 各 测 30 个 求 平 均 值 二 倍 体 植 株 为 5 株 求 平 均 值 1.3 基 因 组 原 位 杂 交 材 料 探 针 : 沙 田 柚 二 倍 体 母 株, 来 源 于 国 家 果 树 种 质 重 庆 柑 橘 圃, 提 取 gdna 标 记 为 探 针 ; 染 色 体 标 本 材 料 : 沙 田 柚 二 倍 体 母 株 ; 沙 田 柚 天 然 四 倍 体 9 株 ; 作 者 通 过 秋 水 仙 碱 诱 导 获 得 的 人 工 四 倍 体 4 株 1.4 基 因 组 原 位 杂 交 流 程 [4] 沙 田 柚 二 倍 体 母 株 gdna 的 提 取 参 照 熊 光 明 等 的 方 法 进 行 ; 标 记 采 用 随 机 引 物 法,DIG-High Prime 标 记 试 剂 购 自 Roche 公 司 取 茎 尖 或 2~5 mm 长 的 嫩 叶 制 备 染 色 体 标 本, 方 法 同 1.1 制 备 好 的 染 色 体 标 本 于 60 烘 箱 中 干 燥 约 6 h,100 μg ml -1 的 Rnase A 37 消 化 1 h,2 SSC 漂 去 盖 片,2 SSC 洗 涤 3 5 min, 用 70% 90% 和 100% 乙 醇 依 次 脱 水, 每 级 3 min;0.01% Pepsin 37 处 理 10~15 min,1 PBS 洗 涤 2 5 min;1% 甲 醛 (50 mmol L -1 MgCl 2,1 PBS 配 制 ) 于 室 温 固 定 5 min, 2 SSC 漂 洗 3 5 min 变 性 :70% 去 离 子 甲 酰 胺 (2 SSC 稀 释 )68 变 性 2 min, 立 即 通 过 预 冷 的 梯 度 乙 醇 脱 水 (70%,90%, 100%), 每 级 5 min 原 位 杂 交 : 每 张 制 片 20 μl 杂 交 液, 含 50% 甲 酰 胺,10% 硫 酸 葡 聚 糖,2 SSC,2 ng μl -1 探 针,0.5 μg ssdna 涡 流 混 匀, 在 PCR 仪 上 97 变 性 10 min 后 立 即 于 冰 浴 中 放 置 10 min 杂 交 液 滴 加 于 染 色 体 制 片 上, 加 盖 玻 片, 密 封,37 水 浴 杂 交 过 夜 洗 脱 与 杂 交 信 号 的 检 测 :2 SSC 漂 去 盖 片,0.1% SDS(2 SSC 配 制 )37 漂 洗 3 5 min,0.1% SDS (0.2 SSC 配 制 )37 漂 洗 3 5 min,2 SSC 室 温 下 冲 洗 2 次, 甩 干 制 片 加 100 μl/ 片 封 阻 试 剂, 加 盖 片,37 封 阻 30 min 甩 干 封 阻 液, 加 30~50μl/ 片 Anti-DIG-FITC( 用 封 阻 试 剂 与 1 PBS 稀 释 ), 加 盖 片,37 温 育 1 h 1 PBS/Tween20(0.2%)37 漂 洗 3 5 min,1~2 μg ml -1 PI 衬 染 10 min, 抗 荧 光 衰 减 剂 (Vectashield,H-1000) 封 片 Olympus BX60 荧 光 显 微 镜 观 察,SPOT Cooled CCD 装 置 俘 获 图 像 并 摄 影 2 结 果 与 分 析 2.1 沙 田 柚 多 倍 体 的 获 得 对 随 机 采 收 沙 田 柚 果 实 的 所 有 大 小 种 子 进 行 倍 性 检 测, 从 粒 种 子 中 筛 选 出 三 倍 体 (2n=3x=27, 图 1-B)5 株 四 倍 体 (2n=4x=36, 图 1-C)9 株, 其 发 生 频 率 分 别 为 0.08% 0.15%, 其 余 均 为 二 倍 体 (2n=2x=18, 图 1-A) 尽 管 多 倍 体 发 生 率 不 高, 但 说 明 通 过 此 途 径 可 以 获 得 柑 橘 多 倍 体 选 出 的 三 倍 体 其 种 子 大 小 约 为 正 常 种 子 的 1/2~2/3( 图 1-D), 并 非 小 粒 种 子 而 属 于 中 粒 种 子, 而 天 然 四 倍 体 其 种 子 大 小 属 于 正 常 种 子 范 畴 ( 图 1-D) 检 查 中 也 发 现 某 些

3 6 期 向 素 琼 等 : 沙 田 柚 多 倍 体 的 获 得 与 基 因 组 原 位 杂 交 (GISH) 分 析 1751 个 体 中 有 少 量 非 整 倍 体 细 胞, 但 并 不 存 在 完 全 的 非 整 倍 体 植 株, 或 许 非 整 倍 体 在 二 倍 体 杂 交 后 代 中 较 多 倍 体 杂 交 后 代 中 少 见 [5~7] 2.2 沙 田 柚 四 倍 体 的 基 因 组 原 位 杂 交 分 析 由 于 选 出 的 三 倍 体 生 长 势 较 弱, 本 文 仅 对 选 出 的 天 然 四 倍 体 和 作 者 利 用 秋 水 仙 碱 诱 导 获 得 的 人 工 四 倍 体 进 行 了 GISH 分 析 二 倍 体 母 株 的 gdna 自 身 荧 光 原 位 杂 交 如 图 1-E, 全 部 基 因 组 都 有 信 号, 表 明 基 因 组 自 身 杂 交 是 成 功 的, 说 明 该 GISH 流 程 在 技 术 上 是 可 行 的 以 沙 田 柚 母 株 gdna 为 探 针, 同 四 倍 体 中 期 染 色 体 杂 交 结 果 表 明, 天 然 四 倍 体 中 有 7 株 为 异 源 四 倍 体,2 株 为 同 源 四 倍 体, 秋 水 仙 碱 诱 导 获 得 的 4 株 人 工 四 倍 体 均 为 同 源 四 倍 体 在 7 株 天 然 四 倍 体 中, 可 以 清 晰 地 识 别 出 两 个 基 因 组 ( 如 图 1-F,G), 近 18 条 染 色 体 上 呈 现 较 均 匀 的 几 乎 分 布 于 整 条 染 色 体 上 的 大 而 明 亮 的 杂 交 信 号, 说 明 这 些 天 然 四 倍 体 染 色 体 组 构 成 中 含 有 沙 田 柚 二 倍 体 母 本 整 个 基 因 组, 另 18 条 染 色 体 上 信 号 很 弱 或 无, 但 两 个 染 色 体 组 间 也 有 极 少 部 分 交 叉 杂 交, 可 能 是 因 为 两 个 基 因 组 中 含 有 部 分 相 同 的 串 联 重 复 序 列 GISH 结 果 说 明, 这 7 株 天 然 四 倍 体 为 异 源 四 倍 体, 是 通 过 有 性 杂 交 获 得, 而 不 是 由 体 细 胞 染 色 体 单 纯 加 倍 而 来 的, 同 时 也 进 一 步 证 实 了 柚 雌 性 未 减 数 配 子 的 自 然 存 在 另 2 株 天 然 四 倍 体 与 4 株 秋 水 仙 碱 诱 导 获 得 的 人 工 四 倍 体 GISH 结 果 类 似 如 图 1-H,36 条 染 色 体 上 均 有 密 布 的 信 号, 应 为 同 源 四 倍 体 A:2n=2x=18;B:2n=3x=27;C:2n=4x=36;D: 不 同 倍 性 实 生 植 株 ;E: 沙 田 柚 2x 自 身 GISH;F: 天 然 四 倍 体 GISH;G: 天 然 四 倍 体 GISH 核 型 ; H: 诱 导 的 四 倍 体 GISH 结 果 图 中 标 尺 为 10 μm A: 2n=2x=18; B: 2n=3x=27; C: 2n=4x=36; D: Seedlings of different ploidy; E: Self-GISH of 2x; F: GISH of natural tetraploid; G: GISH karyotype of natural tetraploid; H: GISH of induced tetraploid. Scale bars=10 μm 图 1 沙 田 柚 不 同 倍 性 体 细 胞 染 色 体 与 实 生 植 株 及 基 因 组 原 位 杂 交 分 析 Fig. 1 Different ploidy somatic chromosomes and genome analysis of tetraploids in Citrus grandis cv. Shatianyou by GISH 2.3 不 同 倍 性 沙 田 柚 植 株 形 态 观 察 观 察 7 年 生 不 同 倍 性 植 株 生 长 状 况, 与 二 倍 体 相 比, 四 倍 体 植 株 表 现 生 长 缓 慢, 树 冠 较 小 ( 图 2-h,i), 树 高 与 干 周 分 别 为 二 倍 体 的 0.81~ ~0.90 倍 ( 表 ; 图 2-f,g,h,i), 春 梢 抽 梢 较 二 倍 体 短, 但 密 生, 刺 粗 而 长 春 梢 成 熟 叶 片 色 泽 浓 绿, 宽 度 变 宽, 叶 形 指 数 减 小, 叶 片 厚 度 增 加 ( 图 2-a,b,c,d) 异 源 四 倍 体 叶 片 表 现 出 比 同 源 四 倍 体 更 浓 绿 叶 形 指 数 更 小 天 然 四 倍 体 的 树 高 干 周 春 梢 长 度 叶 片 长 度 宽 度 厚 度 基 本 大 于 人 工 诱 导 四 倍 体 有 别 于 天 然 四 倍 体 的 叶 片 平 整, 人 工 四 倍 体 叶 片 向 内 卷 曲 明 显 ( 图 2-e) 测 量 中 发 现 叶 片 厚 度 是 鉴 别 多 倍 体 与 二 倍 体 的 重 要 性 状, 尤 其 是 天 然 四 倍 体 厚 度 范 围 为 0.45~ 0.52 mm, 平 均 为 0.49 mm, 明 显 大 于 二 倍 体 的 0.30 mm

4 1752 中 国 农 业 科 学 41 卷 a:7 株 天 然 异 源 四 倍 体 叶 片 ;b:2 株 天 然 同 源 四 倍 体 叶 片 ;c:4 株 人 工 同 源 四 倍 体 叶 片 ;d:2x 叶 片 ( 对 照 );e: 人 工 同 源 四 倍 体 叶 片 内 卷 ;f: 2x 树 干 ;g:4x 树 干 ;h:2x 树 冠 ;i: 多 株 4x 树 冠 a: Leaves of 7 natural allotetraploids; b: Leaves of 2 natural autotetraploids; c: Leaves of 4 artificial autotetraploids; d: Leaf of 2x(control); e: Involute leaves of artificial autotetraploid; f: 2x trunk; g: 4x trunk; h: Crown of tree of 2x; i: Crown of tree of 4x 图 2 不 同 倍 性 沙 田 柚 植 株 树 体 与 叶 片 比 较 Fig 2 Comparison of plants and leaves of different ploidy of Citrus grandis cv. Shatianyou 表 不 同 倍 性 沙 田 柚 植 株 树 体 与 叶 片 比 较 Table Comparison of plants and leaves of different ploidy of Citrus grandis cv. Shatianyou 编 号 倍 性 及 类 型 树 高 干 周 春 梢 长 度 叶 片 Leaves Code Ploidy and type Tree height Trunk diameter Length of vernal 厚 度 长 度 叶 宽 叶 形 指 数 ( 长 / 宽 ) (m) (cm) branch (cm) Thickness (mm) Length (cm) Width (cm) Leaf indexes T1 Allotetraploid T2 Allotetraploid T3 Allotetraploid T4 Allotetraploid T5 Allotetraploid T6 Allotetraploid T7 Allotetraploid T8 Autotetraploid T9 Autotetraploid 平 均 值 Mean Natural tetraploids I1 Autotetraploid I2 Autotetraploid I3 Autotetraploid I4 Autotetraploid 平 均 值 Mean Artificial tetraploids x (Control) Diploid 讨 论 3.1 单 胚 柚 三 倍 体 单 胚 材 料 由 于 作 为 育 种 母 本 时 可 以 避 免 珠 心 胚 的 干 扰, 因 此 在 杂 交 育 种 中 格 外 受 到 青 睐, 柚 是 柑 橘 属 中 的 单 胚 种 而 沙 田 柚 品 质 上 等, 但 种 子 多, 因 此 减 少 种 子 数 一 直 是 育 种 者 生 产 者 与 经 销 商 共 同 的 愿 望 关 于 柚 的 三 倍 体 研 究,Geraci 等 所 研 究 的 3 个 柚 类 品 种 中 均 未 出 现 三 倍 体 [8] [9] 陈 力 耕 和 胡 运 权 曾 希 望 通 过 小 粒 种 子 ( 大 小 为 正 常 种 子 的 1/3~1/6) 发 现 三 倍 体, 但 沙 田 柚 无 论 是 人 工 杂 交 果 还 是 自 然 授 粉 果 都 没 有 小 种 子 出 现, 本 试 验 也 发 现 其 小 种 子 比 例 极 低 而 岩 政

5 6 期 向 素 琼 等 : 沙 田 柚 多 倍 体 的 获 得 与 基 因 组 原 位 杂 交 (GISH) 分 析 1753 正 男 研 究 发 现, 虽 然 本 田 柚 的 小 粒 种 子 都 是 二 倍 体, 但 中 粒 种 子 却 有 10% 的 三 倍 体 [10], 本 文 发 现 的 三 倍 体 种 子 大 小 与 之 描 述 的 一 致 由 此 看 来, 在 柚 类 中, 从 小 粒 种 子 中 获 得 三 倍 体 的 可 能 性 还 有 待 商 榷 3.2 沙 田 柚 天 然 四 倍 体 的 来 源 多 年 的 研 究 结 果 表 明, 多 倍 体 主 要 是 通 过 未 减 数 配 子 融 合 体 细 胞 染 色 体 加 倍 以 及 多 精 子 受 精 3 种 方 式 起 源 的, 目 前 普 遍 认 为 自 然 界 绝 大 多 数 多 倍 体 是 通 过 未 减 数 配 子 的 融 合 而 产 生 的 [11~13] 柑 橘 多 倍 体 一 般 认 为 有 两 种 不 同 的 起 源 : 有 性 的 和 体 细 胞 的, 但 柑 橘 的 多 胚 现 象 增 加 了 其 复 杂 性 通 过 雌 性 未 减 数 配 子 获 得 柑 橘 多 倍 体 很 早 就 被 诸 多 外 国 学 者 由 杂 交 后 代 倍 性 分 析 推 测 和 描 述 [6,14~16], 而 关 于 雄 性 未 减 数 配 子 研 究 仅 有 Cavalcante 等 观 察 自 然 授 粉 植 株 小 孢 子 母 细 胞 减 数 分 裂 时 偶 然 发 现 其 中 一 株 的 花 粉 粒 大 且 形 状 不 同, 可 能 是 未 减 数 花 粉, 另 有 两 株 在 小 孢 子 发 生 时 期 发 现 有 二 分 体 与 三 分 体, 认 为 会 产 生 2n 花 粉 [17] 未 减 数 配 子 的 起 源 很 复 杂, Geraci 等 认 为 柑 橘 未 减 数 雌 配 子 是 受 遗 传 控 制 的, 可 能 机 制 是 第 二 次 减 数 分 裂 的 减 缩 或 胚 囊 形 成 前 大 孢 子 的 染 色 体 加 倍 [8] Esen 等 研 究 也 指 出, 产 生 一 定 比 例 的 未 减 数 雌 配 子 是 特 定 母 本 的 一 种 机 能 [5] 但 到 目 前 为 止 没 有 直 接 细 胞 学 证 据 明 确 具 体 成 因 此 外, 众 多 研 究 表 明, 外 界 及 环 境 因 素 如 温 度 创 伤 营 养 水 分 等 都 可 以 刺 激 产 生 未 减 数 配 子 本 试 验 采 集 沙 田 柚 的 周 围 环 境 基 本 为 柑 橘 属 材 料, 尤 其 以 柚 类 为 多, 但 无 酸 柚 GISH 分 析 中 由 于 父 本 信 息 不 明 未 加 封 阻 DNA, 却 可 以 区 分 出 天 然 异 源 四 倍 体 中 的 两 个 基 因 组, 这 说 明 这 7 株 天 然 四 倍 体 个 体 中 两 个 基 因 组 亲 缘 关 系 可 能 较 远, 可 能 有 另 一 基 因 组 (2n=2x=18) 的 2n 花 粉 参 与 这 些 四 倍 体 的 形 成, 但 究 竟 父 本 为 何 还 需 要 进 一 步 观 察 研 究 不 过 可 以 肯 定 的 是, 这 些 异 源 四 倍 体 不 含 酸 柚 的 成 分, 它 们 即 使 不 直 接 具 有 生 产 利 用 价 值, 也 可 作 为 良 好 的 原 始 育 种 材 料, 在 作 为 亲 本 选 育 无 核 三 倍 体 上 有 实 用 价 值 以 前 报 道 柑 橘 天 然 四 倍 体 多 为 同 源 四 倍 体, 而 笔 者 选 出 的 9 株 天 然 四 倍 体 中 有 7 株 为 异 源 四 倍 体, 仅 2 株 为 同 源 四 倍 体, 可 能 是 因 为 以 前 报 道 的 天 然 四 倍 体 主 要 来 源 于 珠 心 苗, 而 本 试 验 品 种 沙 田 柚 种 子 为 单 胚, 且 存 在 自 交 亲 和 性 不 高 的 特 点, 所 采 种 子 可 能 多 为 异 花 授 粉 杂 交 而 来, 从 而 形 成 了 异 源 四 倍 体 目 前, 这 些 植 株 已 有 少 量 单 株 开 花, 以 后 可 对 其 开 花 结 实 特 性 与 果 实 经 济 性 状 展 开 研 究, 探 讨 其 可 能 的 父 本 及 其 进 一 步 作 为 亲 本 开 展 更 多 深 入 研 究 3.3 GISH 技 术 在 果 树 多 倍 体 育 种 中 的 应 用 果 树 多 倍 体 一 般 具 有 生 长 旺 盛 果 实 大 且 少 籽 或 无 籽 产 量 高 适 应 性 和 抗 逆 性 强 等 特 点, 并 且 可 利 用 无 性 繁 殖 的 方 式 固 定 其 优 良 性 状, 在 生 产 上 长 期 利 用 因 此 果 树 的 多 倍 体 育 种 工 作 正 越 来 越 受 到 重 视, 已 经 成 为 果 树 育 种 工 作 的 重 要 组 成 部 分 [18] 果 树 在 自 然 条 件 下 几 乎 都 有 自 发 多 倍 体, 果 树 中 的 多 倍 体 品 种 也 越 来 越 多, 苹 果 梨 葡 萄 草 莓 香 蕉 柿 李 等 多 种 果 树 栽 培 品 种 为 多 倍 体, 要 想 对 其 来 源 与 遗 传 特 性 深 入 研 究,GISH 无 疑 是 一 种 特 别 有 效 的 方 法 一 般 来 说, 研 究 减 数 分 裂 染 色 体 的 行 为 能 够 更 深 入 了 解 基 因 组 与 基 因 组 之 间 的 关 系, 过 去 仅 仅 通 过 形 态 观 察 了 解 同 源 染 色 体 配 对, 现 在 运 用 GISH 技 术 不 仅 能 观 察 配 对 同 源 染 色 体 的 来 源, 而 且 对 鉴 定 染 色 体 重 组 易 位 都 非 常 有 效 [19,20], 同 时 对 有 丝 分 裂 染 色 体 也 可 区 分 来 源 与 发 现 变 异, 现 已 在 香 蕉 [21,22] 柿 [23] [24,25] 柑 橘 等 果 树 上 运 用 但 目 前 柑 橘 上 仅 用 于 柑 橘 属 间 杂 种 和 四 倍 体 体 细 胞 杂 种 分 析, 而 对 于 二 倍 体 基 因 组 间 关 系 及 更 近 的 种 间 杂 种 分 析 还 未 见 报 道 今 后 随 着 多 彩 色 原 位 杂 交 与 比 较 基 因 组 原 位 杂 交 技 术 改 进, 同 时 对 基 因 组 原 位 杂 交 机 理 新 见 解 及 其 对 杂 交 信 号 的 准 确 理 解 与 分 析 新 技 术 的 涌 现,GISH 技 术 可 能 在 亲 缘 关 系 较 近 的 种 间 同 源 性 分 析 上 取 得 突 破, 相 信 其 应 用 前 景 会 更 广 阔 4 结 论 单 胚 的 柑 橘 多 倍 体 尤 其 是 四 倍 体 很 少 见, 本 文 获 得 了 宝 贵 的 单 胚 沙 田 柚 四 倍 体 和 三 倍 体 新 种 质, 为 进 一 步 选 育 无 核 品 种 奠 定 了 基 础, 同 时 通 过 GISH 分 析 证 实 了 沙 田 柚 雌 性 未 减 数 配 子 的 存 在, 为 今 后 倍 性 定 向 育 种 提 供 了 理 论 基 础 References [1] 刘 可 慧. 瘪 籽 沙 田 柚 的 获 得 及 三 倍 体 柑 橘 新 种 质 创 建 研 究. 湖 南 农 业 大 学 硕 士 学 位 论 文, Liu K H. Research on the induction of seed abortive shatian pummelo and generation of triploid germplasm in Citrus. Master Dissertation of Hunan Agricultural University, (in Chinese) [2] 宋 健 坤, 郭 文 武, 伊 华 林, 刘 继 红, 陈 春 丽, 邓 秀 新. 以 异 源 四 倍 体 体 细 胞 杂 种 为 父 本 与 二 倍 体 杂 交 创 造 柑 橘 三 倍 体 的 研 究. 园 艺 学 报, 2005, 32(4): Song J K, Guo W W, Yi H L, Liu J H, Chen C L, Deng X X. Creation of triploid citrus plants by crossing elite allotetraploid somatic hybrid

6 1754 中 国 农 业 科 学 41 卷 pollen parents with diploid cultivars. Acta Horticulturae Sinica, 2005, 32(4): (in Chinese) [3] 陈 瑞 阳, 宋 文 芹, 李 秀 兰. 植 物 染 色 体 标 本 制 备 的 新 方 法. 植 物 学 报, 1979, 21(3): Chen R Y, Song W Q, Li X L. A new method for preparing mitotic chromosomes from plant. Acta Botanica Sinica, 1979, 21(3): (in Chinese) [4] 熊 光 明, 梁 国 鲁, 阎 勇, 向 素 琼, 吴 清, 李 喜 庆, 江 东. 适 于 AFLP 分 析 用 的 柑 橘 DNA 提 取 方 法. 果 树 学 报, 2002, 19(4): Xiong G M, Liang G L, Yan Y, Xiang S Q, Wu Q, Li X Q, Jiang D. DNA extraction method for AFLP analysis in Citrus. Journal of Fruit Science, 2002, 19(4): (in Chinese) [5] Esen A, Soost R K. Aneuploidy in Citrus. American Journal of Botany, 1972, 59(5): [6] Lee L S. Citrus polyploidy origins and potential for cultivar inprovement. Australian Journal of Agricultural Research, 1988, 39, [7] Ramsey J, Schemske D W. Neoploidy in flowering plants. Annual Review of Ecology and Systematics, 2002, 33: [8] Geraci G, Esen A, Soost R K. Triploid progenies from 2x 2x crosses of Citrus cultivars. The Journal of Heredity, 1975, 66: [9] 陈 力 耕, 胡 运 权. 从 二 倍 体 柑 橘 获 得 三 倍 体 的 研 究. 园 艺 学 报, 1981, 8(2): Chen L G, Hu Y Q. Studies on obtaining triploids from diploid citrus cultivars. Acta Horticulturae Sinica, 1981, 8(2): (in Chinese) [10] 杨 亦 农. 柑 橘 的 多 倍 体 育 种. 浙 江 柑 橘, 1985, (1): 5-9. Yang Y N. Polyploidy breeding of Citrus. Zhejiang Citrus, 1985, (1): 5-9. (in Chinese) [11] 孙 静 贤, 丁 开 宇, 王 兵 益. 植 物 多 倍 体 研 究 的 回 顾 与 展 望. 武 汉 植 物 学 研 究, 2005, 23(5): Sun J X, Ding K Y, Wang B Y. The review and prospect of plant polyploid research. Journal of Wuhan Botanical Research, 2005, 23(5): (in Chinese) [12] 杨 继. 植 物 多 倍 体 基 因 组 的 形 成 与 进 化. 植 物 分 类 学 报, 2001, 39(4): Yang J. The formation and evolution of polyploid genomes in plants. Acta Phytotaxonomica Sinica, 2001, 39(4): (in Chinese) [13] 丛 配 华, 吴 禄 平, 景 士 西. 2n 配 子 的 发 生 及 在 果 树 育 种 上 的 应 用. 果 树 科 学, 1998, 15(4): Cong P H, Wu L P, Jing S X. The occurrence of 2n gametes and their uses in fruit breeding. Journal of Fruit Science, 1998, 15(4): (in Chinese) [14] Esen A, Soost R K. Unexpected triploids in Citrus: Their origin, identification, and possible use. The Journal of Heredity, 1971, 62: [15] Guerra M, Pedrosa A, Silva A E B, Cornélio M T M, Santos K, Filho W S S. Chromosome number and secondary constriction variation in 51 accessions of a Citrus germoplasm bank. Brazilian Journal of Genetics, 1997, 20: [16] 楊 暁 伶, 北 島 宣, 長 谷 川 耕 二 郎. 土 佐 文 旦 'X 水 晶 文 旦 'の 倍 数 性 交 雑 実 生 の 染 色 体 構 成 に 基 づく 対 合 染 色 体 と 非 還 元 配 偶 子 の 推 定. 園 学 雑, 2002, 71(4): Yang X L, Kitajima A, Hasegawa K. Chromosome pairing set and the presence of unreduced gametes explain the possible origin of polyploid progenies from the diploids Tosa-Buntan Suisho-Buntan pummelo. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science, 2002, 71(4): (in Japanese) [17] Cavalcante H C, Schifino-Wittmann, Dornelles A L C. Meiotic behaviour and pollen fertility in an open-pollinated population of Lee mandarin (C. paradisi C. tangerina). Scientia Horticulturae, 2000, 86: [18] 王 同 坤, 张 京 政, 齐 永 顺, 庞 海 珍. 我 国 果 树 多 倍 体 育 种 研 究 进 展. 果 树 学 报, 2004, 21(6): Wang T K, Zhang J Z, Qi Y S, Pang H Z. Advances on polyploid breeding of fruit crops in China. Journal of Fruit Science, 2004, 21(6): (in Chinese) [19] Kato A, Vega J M, Han F P, Lamb J C, Birchler J A. Advances in plant chromosome identification and cytogenetic techniques. Current Opinion in Plant Biology, 2005, 8: [20] Schwarzacher T. Meiosis, recombination and chromosomes: a review of gene and isolation and fluorescent in situ hybridization data in plants. Journal of Experimental Botany, 2003, 54(380): [21] D Hont A, Paget-Goy A, Escoute J, Carreel F. The interspecefic genome structure of cultivated banana, Musa spp. revealed by genome in situ hybridization. Theoretical and Applied Genetics, 2000, 100: [22] D Hont A. Unraveling the genome structure of polyploids using FISH and GISH; examples of sugarcane and banana. Cytogenetic and Genome Research, 2005, 109: [23] Choi Y A, Tao R, Yonemori K, Sugiura A. Genomic in situ hybridization between Persimmon (Diospyros kaki) and several wild species of Diospyros. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science, 2003, 72(5): [24] 陈 春 丽, 郭 文 武, 邓 秀 新. 柑 橘 基 因 组 原 位 杂 交 (GISH) 技 术 体 系 的 建 立. 武 汉 植 物 学 研 究, 2003, 21(5): Chen C L, Guo W W, Deng X X. Establishment of GISH techinique in Citrus. Journal of Wuhan Botanical Research, 2003, 21(5): (in Chinese) [25] Fu C H, Chen C L, Guo W W, Deng X X. GISH, AFLP and PCR-RFLP analysis of an intergeneric somatic hybrid combining Goutou sour orange and Poncirus trifoliata. Plant Cell Reports, 2004, 23: ( 责 任 编 辑 曲 来 娥 )

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