JAB_2016_No_10(copy)

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1 Online system: 农 业 生 物 技 术 学 报 Journal of Agricultural Biotechnology 2016, 24(10): 1578~1587 DOI: /j.issn 填 饲 对 朗 德 鹅 SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 甲 基 化 和 mrna 表 达 的 影 响 1,2 方 倩 倩 3 李 祥 龙 1 唐 军 旺 1 田 勇 4 沈 建 良 1,4 任 晋 东 5 邵 荣 益 1* 卢 立 志 1 浙 江 省 农 业 科 学 院 畜 牧 兽 医 所, 杭 州 ;2 河 北 农 业 大 学 动 物 科 技 学 院, 保 定 ;3 河 北 科 技 师 范 学 院 动 物 科 技 学 院, 秦 皇 岛 ;4 湖 州 卓 旺 太 湖 鹅 原 种 场, 湖 州 ;5 长 兴 荣 耀 鹅 业 有 限 公 司, 湖 州 * 通 讯 作 者,lulizhibox@163.com 摘 要 DNA 甲 基 化 是 表 观 遗 传 学 的 研 究 热 点 之 一 为 了 探 索 填 饲 是 否 能 够 引 起 朗 德 鹅 (Anser anser) 肝 脏 脂 类 代 谢 中 DNA 甲 基 化 水 平 以 及 基 因 表 达 量 的 变 化 和 DNA 甲 基 化 修 饰 作 用 和 基 因 表 达 之 间 的 关 系 本 研 究 运 用 焦 磷 酸 测 序 技 术 分 析 鹅 肝 脏 硬 脂 酞 辅 酶 A 去 饱 和 酶 5 基 因 (stearovl-coa desaturase 5, SCD5) 固 醇 调 节 元 件 结 合 蛋 白 2 基 因 (sterol regulatory element-binding protein 2, SREBP2) 和 超 长 链 脂 肪 酸 延 伸 酶 6 基 因 (elongase of very long chain fatty acids 6, ELOVL6) 的 甲 基 化 水 平, 再 运 用 qrt-pcr 技 术 进 行 定 量 验 证 结 果 显 示,SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 各 2 个 片 段 的 甲 基 化 水 平 均 在 20% 以 上, 均 属 于 高 甲 基 化 状 态 ; 对 照 组 3 个 基 因 各 2 个 片 段 的 甲 基 化 水 平 均 高 于 填 饲 组, 填 饲 组 与 对 照 组 的 SCD5-1S 和 SREBP2-1S 片 段 甲 基 化 差 异 显 著 (P<0.05),SREBP2-2S 片 段 甲 基 化 差 异 极 显 著 (P<0.01),SCD5-2S ELOVL6-1S 和 ELOLV6-2S 片 段 甲 基 化 差 异 不 显 著 (P>0.05); 填 饲 组 SCD5 和 ELOVL6 的 mrna 表 达 量 均 高 于 对 照 组, 而 SREBP2 在 填 饲 组 的 mrna 表 达 量 显 著 低 于 对 照 组 (P<0.05) 综 合 各 项 指 标, 填 饲 引 起 鹅 肝 脏 组 织 SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 甲 基 化 水 平 降 低,SCD5 和 ELOVL6 mrna 表 达 量 上 升,SREBP2 的 mrna 表 达 量 降 低, 表 明 SCD5 和 ELOVL6 的 甲 基 化 修 饰 对 mrna 的 表 达 起 反 向 调 控 的 作 用 本 实 验 结 果 为 表 观 遗 传 学 上 DNA 甲 基 化 研 究 方 法 提 供 参 考, 为 选 育 鹅 肥 肝 高 产 高 质 系 提 供 重 要 的 分 子 遗 传 学 依 据, 也 为 人 类 肥 胖 症 和 脂 肪 肝 等 代 谢 疾 病 的 研 究 提 供 理 论 依 据 关 键 词 填 饲,DNA 甲 基 化, 硬 脂 酞 辅 酶 A 去 饱 和 酶 5, 固 醇 调 节 元 件 结 合 蛋 白 2, 超 长 链 脂 肪 酸 延 伸 酶 6 中 图 分 类 号 Q38 文 献 标 识 码 A The Effects of Force- Feeding on DNA Methylation and mrna Expression of SCD5, SREBP2 and ELOVL6 in Landes (Anser anser) FANG Qian-Qian 1,2 LI Xiang-Long 3 TANG Jun-Wang 1 TIAN Yong 1 SHEN Jian-Liang 4 REN Jin-Dong 1,4 SHAO Rong-Yi 5 LU Li-Zhi 1* 1 The Animal Husbandry and Veterinary Institute, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou , China; 2 College of Animal Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding , China; 3 College of Animal Science and Technology, Hebei Nomal University of Science and Technology, Qinhuangdao , China; 4 Zhuowang Original Breeding Farm of Taihu Goose in Huzhou, Huzhou , China; 5 Rongyao Goose Industry co., LTD. of Changxing, Huzhou , China * Corresponding author, lulizhibox@163.com Abstract DNA methylation is a hotspot in epigenetic research. This study was aimed to explore whether the force-feeding could change the levels of DNA methylation and gene expression related to lipid metabolism in liver of Landes(Anser anser), and to investigate the relationship between DNA methylation and gene 基 金 项 目 : 国 家 国 际 科 技 合 作 专 项 (No DFR30980) 国 家 水 禽 产 业 体 系 (No. CARS-43-2) 和 浙 江 省 十 二 五 育 种 专 项 (No. 2012C ) 收 稿 日 期 : 接 受 日 期 :

2 填 饲 对 朗 德 鹅 SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 甲 基 化 和 mrna 表 达 的 影 响 The Effects of Force-Feeding on DNA Methylation and mrna of SCD5, SREBP2 and ELOVL6 in Force-feeding Landes 1579 expression. The levels of DNA methylation of stearovl- CoA desaturase 5 gene (SCD5), sterol regulatory element-binding protein 2 gene (SREBP2) and elongase of very long chain fatty acids 6 gene (ELOVL6) were analyzed with pyrosequencing method and quantified by qrt-pcr. The upstream promoter sequence of SCD5 (about bp) was downloaded from University of California Santa Cruz (UCSC) website, there were 2 CpG islands, and the percentage of cytosine, G + C and CpG island were respectively reached of 22.7%, 50.06% and 3.81% after analyzing from the 406~1 220 bp CpG island (full-length fragment of 815 bp). The upstream promoter sequence of SREBP2 (about bp) was also downloaded from UCSC website, there were 2 CpG islands, and the percentage of cytosine, G + C and CpG island were respectively reached of 24.87%, 56.61% and 5.29% after analyzing from the 1~965 bp CpG island (full-length fragment of 965 bp). The upstream promoter sequence of ELOVL6 (about bp) was downloaded from UCSC website, there was 1 CpG island, and the percentage of cytosine, G + C and CpG island were respectively reached of 37.14%, 55.71% and 4.30% after analyzing from the 1 426~1 775 bp CpG island (full-length fragment of 350 bp). A total of 23 CpGs related DNA methylation were detected by using pyrosequencing method after amplified the promoter sequence of CpG island of SCD5, SREBP2 and ELOVL6 (each gene had two fragments of 37~55 bp). Results showed that the levels of DNA methylation of the 2 fragments of SCD5, SREBP2 and ELOVL6 in forcefeeding group (FFG) and control group(cg) were respectivlely higher than 20%, belongs to high methylation status. The levels of DNA methylation of CG were greater than FFG. Significant difference were found on DNA methylation in the first fragment of SCD5 and the first fragment of SREBP2 between FFG and CG(P< 0.05), markedly significant difference (P<0.01) in the second fragment of SREBP2, but no significant difference(p>0.05) in the second fragment of SCD5 and the first fragment and the second fragment of ELOVL6 between FFG and CG. The mrna expression of mrna of SCD5 and ELOVL6 in FFG were greater than those of CG, and there relative gene expression of SREBP2 in FFG was lower than that of CG (P<0.05). In conclusion, force- feeding decreased the expression of DNA methylation of SCD5, SREBP2 and ELOVL6, increased the mrna expression of SCD5 and ELOVL6 in liver of goose, but decreased the mrna expression of SREBP2, which indicated that the methylation of SCD5 and ELOVL6 played a negative regulation effect on the mrna expression of SCD5 and ELOVL6. The result will provide a reference to the research method of DNA methylation on epigenetics and an important molecular genetics basis on breeding high quality and high yield goose fatty liver, it will also provide theoretical basis for researching the metabolic diseases such as obesity and fatty liver. Keywords Force-feeding, DNA methylation, Stearovl-CoA desaturase 5, Sterol regulatory element-binding protein 2, Elongase of very long chain fatty acids 6 鹅 (Anser anser) 肥 肝 被 誉 为 世 界 绿 色 食 品 之 王, 经 强 制 填 饲 后 产 生 的 鹅 肥 肝 是 正 常 肝 重 的 5~ 10 倍, 含 有 蛋 白 质 脂 肪 维 生 素 卵 磷 脂 甘 油 三 脂 各 种 酶 核 糖 核 酸 脱 氧 核 糖 核 酸 和 多 种 微 量 元 素 等 营 养 成 分 (Hermier et al., 1994) 肝 脏 是 鹅 脂 肪 的 主 要 合 成 场 所, 体 内 脂 肪 的 合 成 与 分 解 都 是 通 过 一 系 列 的 酶 促 反 应 来 完 成, 在 这 些 过 程 中 受 到 日 粮 营 养 成 分 激 素 内 分 泌 相 关 酶 和 相 关 基 因 等 的 调 节 作 用 ( 弓 彦, 2011), 因 此, 从 分 子 的 层 面 上 研 究 鹅 肥 肝 的 形 成 有 着 重 要 意 义 硬 脂 酞 辅 酶 A 去 饱 和 酶 5 基 因 (stearovl-coa desaturase 5, SCD5) 固 醇 调 节 元 件 结 合 蛋 白 2 基 因 (sterol regulatory element- binding protein 2, SREBP2) 和 超 长 链 脂 肪 酸 延 伸 酶 6 基 因 (elongase of very long chain fatty acids 6, ELOVL6) 已 被 证 实 是 影 响 鹅 肥 肝 形 成 的 重 要 相 关 基 因 硬 脂 酞 辅 酶 A 去 饱 和 酶 是 一 类 单 不 饱 和 脂 肪 酸 合 成 的 限 速 酶, 位 于 内 质 网 上, 参 与 多 不 饱 和 脂 肪 酸 的 合 成 实 验 证 明, 填 饲 引 起 SCD1 在 鹅 肝 脏 中 的 表 达 显 著 增 加, 其 增 加 幅 度 与 肝 脏 甘 油 三 脂 血 浆 胰 岛 素 水 平 和 血 浆 极 低 密 度 脂 蛋 白 (very low- density lipoprotein, VLDL) 显 著 正 相 关 SCD5 最 早 发 现 于 一 个 家 族 唇

3 1580 农 业 生 物 技 术 学 报 Journal of Agricultural Biotechnology 裂 病 遗 传 谱 里 的 鉴 定, 位 于 4q21.1, 长 169 kb 含 5 个 外 显 子, 仅 在 大 脑 和 胰 腺 中 表 达 ( 付 晓 英, 2010) Sinner 等 (2012) 研 究 发 现,SCD5 的 组 成 型 表 达 能 够 促 进 人 类 神 经 元 细 胞 脂 肪 组 分 的 改 变, 引 起 单 不 饱 和 脂 肪 酸 的 升 高 和 饱 和 脂 肪 酸 的 降 低 SREBP2 是 脂 代 谢 的 主 要 调 控 因 子, 诱 导 很 多 涉 及 脂 肪 合 成 的 基 因 的 转 录, 调 节 鹅 脂 肪 合 成 和 葡 萄 糖 代 谢 相 关 基 因 的 表 达 (Horton et al., 2002) ELOVL6 是 长 链 脂 肪 酞 基 延 长 反 应 的 限 速 酶, 主 要 促 进 脂 肪 酸 的 从 头 合 成, 并 调 节 肝 脏 胰 岛 素 的 敏 感 度 ( 邵 丹 等, 2012) DNA 甲 基 化 是 表 观 遗 传 (epigenetics) 现 象 中 一 种 重 要 的 修 饰 作 用, 主 要 在 启 动 子 区 表 现 高 甲 基 化 DNA 甲 基 化 是 指 在 甲 基 转 移 酶 的 作 用 下 催 化 S- 腺 苷 甲 硫 氨 酸, 将 其 甲 基 基 团 共 价 结 合 到 胞 嘧 啶 上, 使 之 转 变 为 5- 甲 基 胞 嘧 啶 的 生 化 过 程 研 究 证 明,DNA 甲 基 化 可 以 通 过 调 控 脂 肪 细 胞 分 子 转 录 因 子 及 转 录 辅 助 因 子 和 特 异 性 基 因 的 表 达 来 影 响 脂 肪 组 织 的 生 长 发 育, 在 此 过 程 中 DNA 甲 基 化 是 动 态 变 化 的 ( 李 美 婷 等, 2014) 实 验 发 现, 朗 德 鹅 经 过 填 饲 后, 对 CCAAT 增 强 子 结 合 蛋 白 (CCAAT enhancer binding proteins, C/EBP) 基 因 启 动 子 区 域 的 54 个 CpG 位 点 有 2.96% 的 位 点 甲 基 化, 对 照 组 有 1.48% 的 位 点 发 生 甲 基 化, 这 说 明 填 饲 对 该 区 域 的 位 点 的 甲 基 化 水 平 有 影 响 作 用 ( 张 翔 等, 2009) 目 前 在 鹅 上 还 未 见 SCD5 对 填 饲 诱 导 鹅 肥 肝 形 成 影 响 的 相 关 报 道, 填 饲 对 鹅 SREBP2 和 ELOVL6 的 甲 基 化 水 平 影 响 及 甲 基 化 调 控 基 因 mrna 表 达 水 平 的 关 联 作 用 也 甚 少 报 道, 因 此 本 研 究 通 过 分 析 脂 类 代 谢 相 关 基 因 SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 在 填 饲 后 鹅 肥 肝 中 的 甲 基 化 水 平, 验 证 填 饲 后 脂 类 代 谢 基 因 甲 基 化 水 平 发 生 变 化, 并 调 控 基 因 的 表 达 水 平, 从 而 影 响 鹅 肥 肝 中 脂 肪 细 胞 的 合 成 及 分 化, 进 一 步 研 究 朗 德 鹅 肝 脏 脂 肪 沉 淀 的 机 制, 以 期 为 选 育 鹅 肥 肝 高 产 高 质 系 提 供 重 要 的 分 子 遗 传 学 依 据, 也 为 人 类 (Homo sapiens) 肥 胖 症 脂 肪 肝 等 代 谢 疾 病 的 研 究 提 供 参 考 1 材 料 与 方 法 1.1 SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 启 动 子 甲 基 化 分 析 实 验 材 料 与 试 剂 填 饲 组 : 选 取 70 日 龄 朗 德 鹅 (Anser anser) 公 鹅 25 只 经 强 制 填 饲 玉 米 (Zea mays) 等 日 粮 28 d( 包 含 预 饲 期 7 d); 对 照 组 : 同 一 批 70 日 龄 朗 德 鹅 ( 公 鹅 )25 只 用 常 规 日 粮 进 行 饲 喂 实 验 结 束 后, 从 每 组 中 随 机 各 抽 取 5 只 采 集 肝 脏 组 织, 立 即 置 于 液 氮 中 速 冻, 并 保 存 于 -70 备 用 康 为 世 纪 DNA 提 取 试 剂 盒 ( 北 京 ); 康 为 世 纪 RNA 提 取 试 剂 盒 ( 北 京 );PCR 引 物 由 上 海 某 科 技 公 司 合 成 ;KAPA2G Fast Multiplex Mix ( 上 海 TOYOBO 公 司 );DNA 聚 合 酶 (DNA polymerase) ATP 硫 酸 化 酶 (ATP sulfurytase) 荧 光 素 酶 (luciferase) 和 三 磷 酸 腺 苷 双 磷 酸 酶 (apyrase) 购 自 QIAGEN ( 北 京 ) 饲 养 管 理 实 验 鹅 圈 养 在 栏 内, 每 栏 4~5 只, 采 取 自 由 饮 水, 鹅 舍 保 持 清 洁 干 燥 通 风 盒 安 静 的 环 境, 室 温 维 持 在 15~25, 湿 度 为 55%~70% 填 饲 鹅 分 为 预 饲 期 和 填 饲 期, 预 饲 期 为 1 周, 采 取 填 饲 次 数 及 日 粮 量 逐 渐 增 加 的 方 式 进 行 填 饲, 从 第 一 天 填 饲 日 粮 2 次 逐 渐 增 加 到 第 7 天 填 饲 5 次, 日 粮 从 平 均 118 g/( 只 天 ) 增 加 到 304 g/( 只 天 ), 填 饲 期 为 第 8~ 28 天, 每 日 填 饲 5 次, 平 均 日 粮 为 430 g/( 只 天 ), 日 粮 组 分 见 表 DNA 提 取 按 照 康 为 世 纪 试 剂 盒 上 操 作 步 骤 进 行 提 取, 收 集 DNA 溶 液,-20 保 存 DNA DNA 浓 度 和 纯 度 检 测 分 光 光 度 计 检 测 后,1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳,130 V,15 min, 照 相 基 因 启 动 子 区 甲 基 化 位 岛 分 析 根 据 GenBank 上 查 找 到 的 参 考 序 列, 使 用 ABI 表 1 填 饲 组 与 对 照 组 的 日 粮 组 分 Table 1 Composition of diets in FFG and CG 组 别 Group FFG CG 成 分 Ingredient 蒸 熟 玉 米 Steamed corn 鹅 油 Goose oil 食 盐 Salt 维 生 素 及 矿 物 质 Vitamins and minerals 鹅 专 用 混 合 饲 料 Special feed for goose 含 量 /% Content FFG: 填 饲 组 ;CG: 对 照 组 下 同 FFG: Force-feeding group; CG: Control group; The same below

4 填 饲 对 朗 德 鹅 SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 甲 基 化 和 mrna 表 达 的 影 响 The Effects of Force-Feeding on DNA Methylation and mrna of SCD5, SREBP2 and ELOVL6 in Force-feeding Landes 1581 公 司 的 Methyl Primer Express v1.0 软 件 进 行 CpG 岛 分 析, 查 找 出 有 效 的 CpG 岛 密 集 的 区 域, 使 用 CpG Island View 软 件 分 析 基 因 位 点 启 动 子 序 列 甲 基 化 位 岛 预 扩 增 根 据 GeneBank 上 公 布 的 基 因 序 列, 使 用 软 件 Primer Premier 5 设 计 引 物 调 取 该 区 域 附 近 的 基 因 组 片 段, 确 保 目 的 区 域 序 列 的 准 确 性, 根 据 表 2 的 引 物 序 列 进 行 PCR 预 扩 增, 反 应 体 系 (25 μl) 如 下 : KAPA2G 多 重 混 合 液 12.5 μl; 正 反 向 引 物 (10 mol/ L) 各 1.0 μl( 表 2); 模 板 DNA 1.0 μl; 蒸 馏 水 9.5 μl 反 应 程 序 :94,5 min;94,30 s;60,30 s;72,1 min;72,5 min;35 个 循 环 ;4 保 存 选 择 性 扩 增 DNA 片 段 应 用 PyroMark Assay Design 2.0 软 件 设 计 并 合 成 引 物, 选 择 性 扩 增 硬 脂 酞 辅 酶 A 去 饱 和 酶 5 基 因 (stearovl-coa desaturase 5, SCD5) 固 醇 调 节 元 件 结 合 蛋 白 2 基 因 (sterol regulatory element-binding protein 2, SREBP2) 超 长 链 脂 肪 酸 延 伸 酶 6 基 因 (elongase of very long chain fatty acids 6, ELOVL6) 基 因 启 动 子 区 CpG 含 量 高 约 50 bp 的 2 个 DNA 片 段, 增 加 DNA 片 段 数 量 便 于 更 精 确 的 分 析 测 定,PCR 引 物 及 分 析 的 DNA 片 段 序 列 见 表 3,PCR 扩 增 体 系 及 反 应 程 序 同 预 扩 增 样 品 DNA 甲 基 化 处 理 按 照 Qiagen EpiTect Bisulfite Kit 试 剂 盒 上 操 作 步 骤 进 行 亚 硫 酸 盐 处 理 DNA 及 洗 涤 甲 基 化 的 DNA Pyrosequencing 检 测 按 照 PyroMark Gold Q96 Reagents 试 剂 盒 上 步 骤 操 作, 最 后 将 96 孔 反 应 板 放 入 Pyrosequencing 检 测 仪 (PyroMark Q96 ID, QIAGEN) 进 行 反 应, 用 Pyro Q-CpG 软 件 自 动 分 析 每 个 位 点 甲 基 化 状 态 启 动 子 区 序 列 甲 基 化 位 岛 分 析 从 UCSC 网 站 下 载 SCD5 上 游 bp 启 动 子 序 列,SREBP2 上 游 bp 启 动 子 序 列 和 ELOVL6 上 游 bp 启 动 子 序 列, 再 由 CpG Island view 软 件 导 出, 如 表 4 所 示 统 计 分 析 应 用 Excel 软 件 对 数 据 进 行 整 理 再 运 用 SPSS 20.0 软 件 采 用 T 检 验 进 行 方 差 分 析 结 果 以 P<0.05 为 差 异 显 著 水 平,P<0.01 为 差 异 极 显 著 水 平 1.2 SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 表 达 量 分 析 实 验 材 料 与 试 剂 实 验 样 品 同 上, 每 组 随 机 抽 取 3 个 样 品 分 析 mrna 的 表 达 量 RNA 提 取 试 剂 盒 购 自 康 为 世 纪 ( 北 京 );M- MLV 购 自 Promega 公 司 ( 北 京 );RNasin 购 自 Thermo 公 司 ( 美 国 );SYBR GREEN Realtime PCR Master Mix 购 自 TOYOBO 公 司 ( 上 海 ) RNA 提 取 及 RNA 浓 度 和 纯 度 的 检 测 按 照 康 为 世 纪 试 剂 盒 步 骤 提 取 RNA, 收 集 RNA 溶 液,-70 保 存 RNA, 防 止 降 解 RNA 浓 度 和 纯 度 检 测 方 法 同 反 转 录 利 用 反 转 录 试 剂 盒 合 成 cdna mrna 反 转 录 体 系 为 : 加 入 Total RNA 1 μg, oligo dt(10 μmol/l) 2 μl,dntp(2.5 mmol/l) 2 μl, 加 入 RNase-free ddh 2O 补 齐 至 14.5 μl 70, 水 浴 5 min, 后 冰 浴 2 min; 再 加 入 :4 μl 5 M-MLV Buffer,0.5 μl RNasin (40 U/μL),1 μl M- MLV (200 U/μL), 继 续 反 转 录 程 序 :42,50 min;72, 5 min Real-Time PCR 表 2 用 于 目 的 基 因 调 取 的 PCR 引 物 Table 2 Primer sets for obtaining target gene 序 列 号 基 因 引 物 序 列 (5'~3') No. Gene Primer sequences ACY_ SCD5 F: TTCCAGCTTCCCTTTGTGCT R: GCTTTACCCAGACTGCCTCA ACY_ SREBP2 F: CTTTCCCCTCCCTAACTGCG R: CAGTTTCTCCCTGTCCCACC ACY_ ELOVL6 F: CAAACAAGATTGCAGAGGGTC R: GTGGTACAGAAGGAAGAGGG SCD5: 硬 脂 酞 辅 酶 A 去 饱 和 酶 5 基 因 ;SREBP2: 固 醇 调 节 元 件 结 合 蛋 白 2 基 因 ;ELOVL6: 超 长 链 脂 肪 酸 延 伸 酶 6 基 因 ; 下 同 SCD5: Stearovl-CoA desaturase 5; SREBP2: Sterol regulatory element- binding protein 2; ELOVL6: Elongase of very long chain fatty acids 6; The same below

5 1582 农 业 生 物 技 术 学 报 Journal of Agricultural Biotechnology 以 反 转 录 好 的 cdna 做 为 模 板, 以 β-actin 为 内 参 基 因, 进 行 Real-Time PCR 实 验 Real-time PCR 体 系 为 : 加 入 SYBR green Kit Master Mix(2 ) 10 μl 上 下 游 引 物 (10 μmol/l) 0.5 μl cdna 1 μl, 加 H 2O 补 齐 至 20 μl PCR 程 序 为 :95 预 变 性 3 min;95 变 性 10 s;60 退 火 10 s,72 延 伸 10 s,40 个 循 环 ; 熔 解 曲 线 生 成 反 应 程 序 为 :95 15 s,60 15 s,95 15 s 数 据 分 析 处 理 实 验 结 束 后, 导 出 扩 增 过 程 中 的 扩 增 曲 线 和 熔 解 曲 线 然 后 对 实 验 原 始 数 据 进 行 整 理 分 析, 绘 制 表 达 量 分 析 柱 状 图 这 里 改 为 采 用 Mann-Whitney U-test 进 行 秩 和 检 验 结 果 以 P<0.05 为 差 异 显 著 水 平,P<0.01 为 差 异 极 显 著 水 平 2 结 果 与 分 析 2.1 填 饲 组 和 对 照 组 肝 脏 总 DNA 的 提 取 结 果 提 取 的 填 饲 组 和 对 照 组 各 组 5 个 肝 脏 组 织 DNA 经 1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测, 条 带 清 晰, 基 因 组 DNA 浓 度 较 高, 无 降 解 且 无 蛋 白 和 RNA 的 残 留, 结 果 符 合 要 求 ( 图 1) 2.2 SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 在 鹅 肝 脏 中 的 甲 基 化 水 平 结 果 与 分 析 通 过 对 SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 启 动 子 区 甲 基 化 位 岛 进 行 扩 增, 运 用 焦 磷 酸 测 序 分 析 了 SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 各 2 个 片 段 ( 大 小 为 37~55 bp) 共 23 个 CpGs 位 点 的 甲 基 化 水 平, 如 图 2 为 Pyro Q- CpG 软 件 自 动 分 析 SCD5 1 个 片 段 的 3 个 CpGs 位 点 表 3 选 择 性 扩 增 引 物 及 分 析 的 片 段 序 列 Table 3 The primer sequences of selective amplification and sequences to analysis 基 因 片 段 Gene fragments SCD5-1S SCD5-2S SREBP2-1S SREBP2-2S ELOVL6-1S ELOVL6-2S 引 物 序 列 (5'~3') Primer sequences F: GGGTTTTTTTGTATTGTGTAAGATAAGT R: TCCCAAAAAAAATTCAACTATACAAACCA 序 列 Sequencing: GGAGAGAGAGGTAGTTGTGG F: GAAAGTTGTAGTTTGTTGGGAAGGGAAAGA R: ACACACCAAAACCTTTCTCACAA 序 列 Sequencing: GGGAAGGGAAAGATT F: GGGTGGGGAAGGGTATTT R: TCAAAACCCAAACTTCCTCTTCCCTATT 序 列 Sequencing: GGGGAAGGGTATTTTTATA F: GGGTGGGGAAGGGTATTT R: TTTCGTGCGTGCGGATAAGGGA 序 列 Sequencing: GGGGAAGGGTATTTTTATA F: TGGTGATAAGTTAGAGGAGAAATAAT R: ACATAAATAAATAAACTTCCAAAAAAAAAT 序 列 Sequencing: AGAGGAGAAATAATGTTTG F: TAGAGGTGTGTATATAGGTTTTTGTAATA R: CCAAAACACATCCCTTCACTA 序 列 Sequencing: ACACATCCCTTCACTAT 片 段 序 列 Sequences to analysis TGTTYGYGTTATTATTGATTTGAGYGTTGTTAAG TAAAAAGTGGAAATAT TTTTTAGAGAYGGAATYGAAAGTAGGTTTTAAG GGAYGTT TTATTTTTATTAGGATTTTTTT TTGYGTGTYGTYGTTTYGTGYGTGYGGATAAGG GAAG AGYGTTTAGGTGGTTTAYGGGGTATAATTTYGTT AAATYGGATTAAATAGGGAAGAGGAAGTTT TTAYGTAYGAAAYGTTATTTTTATTTTTAGAGTTT TTT AAAACRAACTACTACCRTACCAAAAAATATACR ACACRCAAACACAAAAA AAAAC 表 4 SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 启 动 子 CpG 岛 信 息 Table 4 The information of CpGs in the promoter of SCD5, SREBP2 and ELOVL6 基 因 启 动 子 大 小 /bp CpG 岛 数 CpG 岛 长 度 及 位 置 /bp 胞 嘧 啶 百 分 比 /% C+G 百 分 比 /% CpG 百 分 比 /% Gene Promoter sequence length CpGs number CpGs length and site Cytosine percentage C+G percentage CpG percentage SCD , 406~ SREBP , 1~ ELOVL , 1426~

6 填 饲 对 朗 德 鹅 SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 甲 基 化 和 mrna 表 达 的 影 响 The Effects of Force-Feeding on DNA Methylation and mrna of SCD5, SREBP2 and ELOVL6 in Force-feeding Landes 1583 的 甲 基 化 状 态 3 个 基 因 各 2 个 片 段 的 在 不 同 处 理 组 中 甲 基 化 水 平 见 表 5 结 果 显 示,3 个 基 因 的 2 个 片 段 的 甲 基 化 水 平 均 在 20% 以 上, 均 属 于 高 甲 基 化 状 态 (Guenin et al., 2012); 与 对 照 组 相 比, 填 饲 引 起 3 个 基 因 各 2 个 片 段 的 甲 基 化 水 平 均 降 低,SREBP2 2 个 片 段 的 甲 基 化 水 平 均 低 于 SCD5 和 ELOVL6 填 饲 组 与 对 照 组 的 SCD5-1S 片 段 甲 基 化 差 异 显 著 (P<0.05), SREBP2-1S 片 段 甲 基 化 差 异 显 著 (P<0.05), M 图 1 Figure 1 填 饲 组 (1~5) 和 对 照 组 (6~10) 肝 脏 DNA 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 The agarose gel electrophoresis image of DNA from liver in FFG(1~5) and CG(6~10) M: DL5000 marker bp SREBP2-2S 片 段 甲 基 化 差 异 极 显 著 (P<0.01), 说 明 填 饲 对 鹅 肝 脏 SCD5 和 SREBP2 甲 基 化 存 在 显 著 的 调 控 作 用 2.3 SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 mrna 表 达 水 平 填 饲 组 和 对 照 组 SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 mrna 表 达 水 平 见 表 6 经 过 填 饲 的 填 饲 组 SCD5 和 ELOVL6 的 表 达 量 均 高 于 对 照 组, 差 异 不 显 著 (P>0.05), 而 SREBP2 在 填 饲 组 中 表 达 量 显 著 低 于 对 照 组 (P<0.05) 3 讨 论 表 观 遗 传 学 (epigenetics) 概 念 首 先 是 由 Waddington 首 先 提 出 的 (Waddington, 2012), 是 指 在 核 苷 酸 序 列 不 发 生 改 变 条 件 下, 基 因 表 达 可 遗 传 的 变 化 如 今, 其 是 一 个 广 泛 研 究 领 域, 对 表 观 遗 传 学 的 定 义 目 前 仍 没 有 达 成 共 识 (Robin, 2006; Bird, 2007; Deans, Maggert, 2015) 表 观 遗 传 是 除 了 表 5 3 个 基 因 各 2 个 片 段 的 在 填 饲 组 合 对 照 组 中 甲 基 化 水 平 比 较 Table 5 The comparison of methylation status in two fragments respectively of three genes in FFG and CG 组 别 Group FFG CG 样 本 数 Sample size 5 5 SCD5-1S 64.98±14.29 a 73.46±4.89 b SCD5-2S 79.17± ±7.34 甲 基 化 水 平 /% Methylation SREBP2-1S SREBP2-2S 45.31±1.64 a 21.18±2.51 A 52.46±8.96 b 28.52±7.19 B ELOVL6-1S 65.92± ±2.12 ELOVL6-2S 69.94± ±4.94 不 同 大 写 字 母 表 示 差 异 极 显 著 (P<0.01); 不 同 小 写 字 母 表 示 差 异 显 著 (P<0.05); 下 同 Different capital letters indicate extremely significant differences (P<0.01); Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05); The same below 序 列 分 析 :Sequence to analysis TGTTYGYGTTATTATTGATTTGAGYGTTGTTAAGTAAAAAGTGGAAATAT 分 析 参 数 编 辑 :Analysis parameter have been edited 91% 66% 52% 甲 基 化 水 平 The methylation status E S G T A G T C A G T C G T A T A T G A T G A T 位 点 碱 基 座 位 The base site of CpGs G T C G T 25 G 图 2 SCD5-1S 片 段 甲 基 化 状 态 Figure 2 The methylation status of SCD5-1S fragment

7 1584 农 业 生 物 技 术 学 报 Journal of Agricultural Biotechnology 表 6 3 个 基 因 在 不 同 处 理 组 中 mrna 表 达 量 比 较 Table 6 The comparison of mrna expression in 3 genes on FFG and CG 组 别 样 本 数 mrna 表 达 量 mrna expression Group Sample size SCD5 SREBP2 ELOVL6 FFG ± ±0.16 a 6.44±1.22 CG ± ±5.89 b 0.36±0.05 n=3; 内 参 基 因 :β-actin n=3; Reference gene: β-actin DNA 突 变 的 任 何 由 于 其 他 因 素 引 起 的 的 基 因 表 达 修 饰, 这 包 括 DNA 甲 基 化 组 蛋 白 翻 译 后 修 饰 非 编 码 RNA 基 因 表 达 调 控 和 基 因 组 不 稳 定 性 或 任 何 可 以 改 变 表 型 的 动 力 家 畜 遗 传 学 也 受 到 表 观 遗 传 学 定 义 的 影 响, 努 力 探 寻 家 禽 表 观 遗 传 学 机 制 需 主 要 集 中 在 调 控 某 些 基 因 或 基 因 组 区 域 表 达 的 分 子 遗 传 机 制, 这 可 能 是 对 一 些 外 界 环 境 如 营 养 母 性 行 为 或 气 候 变 化 的 表 达 DNA 甲 基 化 主 要 通 过 影 响 转 录 过 程 中 转 录 因 子 和 启 动 子 序 列 上 DNA 结 合 区 的 结 合 率 来 影 响 基 因 的 表 达 启 动 子 及 附 近 区 域 的 CpG 岛 甲 基 化 是 基 因 实 现 抑 制 表 达 的 重 要 途 径 (Rozenberg et al., 2008; Hamilton, 2011) 越 来 越 多 实 验 表 明, 环 境 因 素 是 影 响 表 观 遗 传 修 饰 的 重 要 因 素 之 一 1944~1945 年 荷 兰 饥 荒 的 研 究 发 现, 遭 受 饥 荒 的 人 群 与 未 遭 受 饥 荒 充 分 供 应 甲 级 供 体 食 物 的 西 方 人 群 的 IGFR2 的 甲 基 化 程 度 有 显 著 差 异, 导 致 IGFR2 的 表 达 量 的 差 异 (Hamilton, 2011) 本 实 验 通 过 强 制 填 饲 改 变 了 正 常 鹅 生 长 的 营 养 因 素, 引 起 鹅 肝 脏 内 脂 肪 代 谢 相 关 基 因 甲 基 化 修 饰 水 平 发 生 改 变, 从 而 引 起 其 调 控 的 基 因 表 达 量 发 生 变 化 本 实 验 结 果 显 示, 填 饲 引 起 3 个 基 因 各 2 个 片 段 的 甲 基 化 水 平 均 降 低, 即 未 填 饲 组 的 基 因 甲 基 化 均 高 于 填 饲 组, 同 时 SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 均 是 促 进 脂 类 代 谢 合 成 基 因, 这 与 甲 基 化 抑 制 基 因 表 达 的 理 论 相 符 SCD 是 一 个 重 要 的 脂 质 合 成 相 关 的 酶, 能 将 一 系 列 不 饱 和 脂 肪 酸 转 换 成 相 应 的 单 不 饱 和 脂 肪 酸 基 因 沉 默 和 酶 沉 默 等 研 究 结 果 表 明,SCD1 在 各 种 代 谢 紊 乱 的 调 节 上 起 重 要 作 用 这 种 进 化 独 特 的 人 类 (Homo sapiens)scd5 酶 具 有 相 对 于 SCD1 酶 61% 的 序 列 一 致 性, 并 在 大 脑 和 胰 腺 中 高 度 表 达 然 而 目 前 很 少 关 于 SCD5 详 细 报 道 (Lengi, Corl, 2008; Beiraghi et al., 2003; Sinner et al., 2012), 在 啮 齿 类 动 物 中 没 有 找 到 SCD5 等 效 基 因, 但 SCD5 却 在 灵 长 类 犬 类 和 其 他 高 等 生 物 中 有 所 表 达 (Lengi, Corl, 2008) 最 近 有 报 道 称,SCD5 mrna 表 达 量 在 阿 耳 茨 海 默 病 患 者 的 大 脑 中 有 所 提 高 (Astarita et al., 2011) 与 SCD1 不 同,SCD5 的 调 控 与 功 能 性 作 用 迄 今 为 止 还 没 有 在 人 体 细 胞 和 组 织 中 特 别 是 脑 细 胞 生 物 学 中 有 描 述 在 现 有 的 研 究 中 可 以 发 现, 在 小 鼠 (Mus musculus) 神 经 -2a 细 胞 的 人 类 SCD5 组 成 性 表 达 ( 一 个 良 好 的 神 经 元 分 化 细 胞 模 型 )(Luciana et al., 2011), 可 以 提 高 n-7 单 不 饱 和 脂 肪 酸 - 饱 和 脂 肪 酸 在 细 胞 总 脂 质 中 的 比 例, 并 修 饰 脂 质 的 从 头 合 成, 同 时,SCD5 酶 活 性 刺 激 细 胞 增 殖, 然 而 抑 制 由 视 黄 酸 诱 导 的 从 神 经 -2a 细 胞 分 化 为 成 熟 神 经 元 的 过 程, 说 明 该 酶 在 调 节 细 胞 的 扩 增 和 神 经 元 细 胞 分 化 之 间 的 起 着 平 衡 作 用 (Sinner et al., 2012) SCD5 是 SCD 的 异 构 体 之 一, 虽 然 目 前 SCD5 在 鹅 上 的 报 道 甚 少, 但 是 Zhu 等 (2011) 通 过 抑 制 性 消 减 杂 交 方 法 研 究 发 现, 填 饲 后 SCD1 在 鹅 肥 肝 中 的 表 达 水 平 显 著 增 加, 这 与 本 研 究 中 SCD5 在 填 饲 后 鹅 肝 脏 中 表 达 量 增 加 结 果 相 符 SREBP 具 有 3 个 亚 型,SREBP1a,SREBP1c 和 SREBP2, 在 脂 质 的 合 成 中 发 挥 着 不 同 的 作 用 肝 脏 的 脂 质 合 成 调 控 中,SREBP2 和 SREBP1c 会 被 SREBP 激 活 蛋 白 (SREBP activating protein, SCAP), 蛋 白 酶 1(site 1 protease, S1P) 和 蛋 白 酶 2(site 2 protease, S2P) 裂 解, 如 果 SCAP 中 断,SREBP2 或 SREBP1c 将 不 会 在 培 养 细 胞 中 发 生 裂 解 (Rawson et al., 1999), 那 么 表 明 培 养 体 系 中 没 有 其 他 裂 解 系 统 在 具 备 足 量 胆 固 醇 的 情 况 下, 脂 肪 生 成 中 断 是 因 为 SREBP1 裂 解 停 止 了 吗? 研 究 发 现, 分 型 良 好 的 肝 细 胞 中,SREBP1 的 裂 解 对 于 固 醇 抑 制 不 如 SREBP2 敏 感, 这 表 明 SREBP1 可 以 释 放 其 活 性 形 式 到 细 胞 核 中 甚 至 在 固 醇 的 存 在 下, 通 过 增 加 浓 度 激 活 脂 肪 合 成 基 因 (Hasty et al., 2000) 另 一 个 研 究 中, 不 饱 和 脂 肪 酸 调 节 SREBP1 但 不 调 节 SREBP2 的 裂 解 (Hannah et al., 2001), 这 可 能 会 开 辟 一 个 新 的 与 SREBP2 固 醇 调 控 形 成 对 照 的 SREBP1 介 导 调 控 的 脂 肪 酸 代 谢, 对 这 种 独 特 的 由 SREBP1 和 SREBP2 是 脂 质 传 感 机 理 的 关 键 是 SCAP 脂 质 敏 感 机 制, 通 过 在 不 同 水 平 上 复 杂 的 SREBP 调 节, SREBP2 在 裂 解 系 统 调 控 胆 固 醇 合 成, 而 SREBP1c 主 要 通 过 改 变 SREBP1c mrna 水 平 调 节 脂 肪 生

8 填 饲 对 朗 德 鹅 SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 甲 基 化 和 mrna 表 达 的 影 响 The Effects of Force-Feeding on DNA Methylation and mrna of SCD5, SREBP2 and ELOVL6 in Force-feeding Landes 1585 成 研 究 发 现 SREBP2 能 调 节 肝 脏 中 包 括 脂 肪 酸 甘 油 三 脂 合 成 所 需 众 多 基 因 的 表 达 (Shimomura et al., 1997), 而 本 实 验 中 填 饲 引 起 SREBP2 mrna 的 表 达 量 降 低, 这 与 SREBP1 基 因 促 进 脂 类 生 成 的 理 论 不 一 致, 但 是 根 据 苏 胜 彦 (2009) 的 研 究 发 现, 填 饲 可 以 降 低 SREBP1 mrna 的 表 达 量, 肝 脏 组 织 中 SREBP2 的 表 达 量 与 肝 重 指 数 呈 极 显 著 负 相 关 (P< 0.01) (Hang et al., 2002), 这 与 本 实 验 结 果 相 符 造 成 该 结 果 的 原 因 可 能 是 肝 脏 甘 油 三 酯 过 度 沉 积 导 致 鹅 机 体 产 生 一 种 适 应 性 ( 王 宝 维 等, 2014), 同 时, 体 外 多 不 饱 和 脂 肪 酸 抑 制 SREBP2 的 丰 度, 从 而 降 低 脂 类 合 成 基 因 的 表 达 ( 夏 露, 2013) ELOVL6 是 长 链 脂 肪 酸 延 长 反 应 的 限 速 酶 ELOVL6 属 于 参 与 长 链 脂 肪 酸 合 成 的 高 度 保 守 家 族 的 内 质 网 酶 (Leonard et al., 2004; Jakobsson et al., 2006) 通 过 培 养 细 胞 中 的 表 达 实 验 的 功 能 性 分 析 表 明, 这 种 酶 催 化 特 定 的 带 有 12,14 和 16 个 碳 原 子 的 延 伸 饱 和 和 单 不 饱 和 脂 肪 酸, 是 负 责 内 源 性 脂 肪 酸 合 成 酶 的 最 后 一 块 未 解 之 谜 在 小 鼠 中, ELOVL6 在 肾 上 腺 肝 脏 白 色 脂 肪 组 织 褐 色 脂 肪 组 织 脑 睾 丸 和 皮 肤 中 高 度 表 达, 这 些 部 位 的 脂 肪 合 成 和 胆 固 醇 合 成 活 跃 转 基 因 小 鼠 肝 脏 中 ELOVL6 的 持 续 激 活 会 使 核 固 醇 调 节 元 件 结 合 蛋 白 (SREBP 1a, 1c 或 2) 过 度 表 达 (Moon et al., 2001; Takashi et al., 2002) 通 过 禁 食 后 肝 脏 和 脂 肪 组 织 中 的 ELOVL6 mrna 水 平 显 著 提 高, 食 物 中 的 多 不 饱 和 脂 肪 酸 会 极 大 抑 制 ELOVL6 的 表 达, 肝 ELOVL6 表 达 水 平 会 在 缺 乏 瘦 素 的 ob/ob 小 鼠 中 高 度 上 调 (Takashi et al., 2002) 因 此, 这 种 延 伸 酶 是 哺 乳 动 物 通 过 SREBP1 调 控 脂 肪 合 成 酶 的 新 成 员, 在 从 头 合 成 长 链 饱 和 脂 肪 酸 和 单 不 饱 和 脂 肪 在 结 膜, 与 SCD1 和 脂 肪 酸 合 成 酶 基 因 (fatty acid synthetase, FAS) 结 合 中 发 挥 着 重 要 的 作 用, 分 析 小 鼠 ELOVL6 基 因 启 动 子 区 发 现 两 个 SREBP 结 合 位 点 : 近 端 SRE- 1 和 远 端 SRE- 2,ELOVL6 调 节 主 要 通 过 SREBP1c 直 接 调 控 (Kumadaki et al., 2008) ELOVL6 是 参 与 肝 脏 脂 肪 酸 从 头 合 成 的 关 键 酶, 根 据 以 往 报 道, 也 是 促 进 脂 肪 合 成 的 关 键 酶 通 过 陈 榕 等 (2012) 研 究 发 现, 患 有 脂 肪 肝 的 小 鼠 肝 脏 内 ELOVL6 的 表 达 量 显 著 高 于 正 常 小 鼠, 这 与 本 实 验 结 果 相 符 通 过 比 较 甲 基 化 水 平 与 基 因 表 达 量 的 验 证, 填 饲 引 起 SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 基 因 甲 基 化 水 平 降 低,SCD5 和 ELOVL6 mrna 表 达 量 上 升,SREBP2 的 mrna 表 达 量 降 低, 提 示 SCD5 和 ELOVL6 的 甲 基 化 修 饰 对 mrna 的 表 达 起 反 向 调 控 的 作 用 填 饲 处 理 的 鹅 肝 脏 SCD5 和 ELOVL6 甲 基 化 水 平 均 不 同 程 度 低 于 对 照 组, 填 饲 组 的 SCD5 和 ELOVL6 mrna 表 达 量 均 高 于 对 照 组, 这 与 甲 基 化 修 饰 抑 制 基 因 表 达 相 符 ; 填 饲 处 理 的 鹅 肝 脏 SREBP2 甲 基 化 程 度 低 于 对 照 组, 然 而 填 饲 组 SREBP2 表 达 量 也 高 于 对 照 组, 这 与 以 上 实 验 结 论 相 违 背, 这 可 能 是 DNA 甲 基 化 阻 碍 CTCF 与 目 的 序 列 的 结 合, 从 而 增 强 基 因 的 表 达,CCCTC 结 合 因 子 (CCCTC binding factor, CTCF) 是 广 泛 存 在 于 真 核 生 物 中 的 多 功 能 转 录 因 子, 能 够 切 断 增 强 子 与 启 动 子 之 间 的 联 系 (Hark et al., 2000) 4 结 论 本 研 究 分 析 了 朗 德 鹅 SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 甲 基 化 水 平 与 基 因 表 达 量 水 平, 结 果 显 示, 填 饲 引 起 SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 甲 基 化 水 平 降 低,SCD5 和 ELOVL6 mrna 表 达 量 上 升,SREBP2 的 mrna 表 达 量 降 低, 反 映 了 SCD5 和 ELOVL6 的 甲 基 化 修 饰 对 mrna 的 表 达 起 反 向 调 控 的 作 用 为 后 续 表 观 遗 传 调 控 机 制 的 研 究 提 供 了 理 论 依 据, 也 为 鹅 肥 肝 的 选 育 提 供 了 重 要 的 参 考 价 值 参 考 文 献 陈 榕, 曹 怡, 周 露 婷 脂 肪 肝 小 鼠 的 肝 脏 脂 质 代 谢 相 关 基 因 表 达 特 征 分 析 [J]. 第 二 军 医 大 学 学 报, 33(10): (Chen R, Cao Y, Zhou L T Characterization of lipid metabolism-related genes in mouse fatty liver[j]. Academic Journal of Second Military University, 33(10): ) 付 晓 英 鹅 SCD1 基 因 全 长 cdna 的 克 隆, 组 织 表 达 及 填 饲 对 其 表 达 的 影 响 [D]. 硕 士 毕 业 论 文, 四 川 农 业 大 学, 导 师 : 王 继 文. pp (Fu X Y Full-length cdna cloning and expression of stearoyl- CoA desaturase 1 (SCD1) gene in the liver of Sichuan white goose and Landes goose responding to overfeeding[d]. Thesis for M.S., Sichuan Agricultural University, Supervisor: Wang J W. pp ) 弓 彦 鹅 FAS, OBR, THRSPa 和 Apo AI 基 因 多 态 性 及 FAS 和 Apo-B 基 因 在 填 饲 鹅 中 表 达 模 式 的 研 究 [D]. 硕 士 毕 业 论 文, 南 京 农 业 大 学, 导 师 : 卢 立 志. pp (Gong Y Study on ploymorphsims of FAS/APO- B

9 1586 农 业 生 物 技 术 学 报 Journal of Agricultural Biotechnology gene expression in the goose[d]. Thesis for M.S., Nanjing Agricultural University, Supervisor: Lu L Z. pp ) 李 美 婷, 曹 林 林, 杨 洋 表 观 遗 传 修 饰 在 糖 脂 代 谢 中 的 作 用 [J]. 遗 传, 36(3): (Li M T, Cao L L, Yang Y The role of epigenetic modification in glucose and lipid metabolism[j]. Hereditas, 6(3): ) 邵 丹, 王 来 娣, 张 蕊 鹅 肥 肝 形 成 相 关 基 因 的 研 究 进 展 [J]. 中 国 畜 牧 兽 医, 39(9): (Shao D, Wang L D, Zhang R Advance research on related genes of fatty liver in the goose[j]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 39(9): ) 苏 胜 彦 朗 德 鹅 肝 脏 脂 平 衡 调 节 的 初 步 研 究 [D]. 博 士 毕 业 论 文, 南 京 农 业 大 学, 导 师 : 谢 庄, pp (Su S Y Preliminary study on regulation of lipid metabolism of Landes geese livers[d]. Thesis for Ph.D, Nanjing Agriculture University. Supervisor: Xie Z, pp: ) 王 宝 维, 舒 常 平, 葛 文 华, 等 填 饲 期 肥 肝 鹅 脂 肪 沉 积 血 脂 成 分 和 脂 类 代 谢 酶 的 变 化 规 律 [J]. 中 国 农 业 科 学, 47(08): (Wang B W, Shu C P, Ge W H, et al Deposition of foie gras goose body fat, composition of lipid and metabolism of lipid in overfeeding period[j]. Scientia Agricultura Sinica, 47(08): ) 夏 露 胆 固 醇 转 运 相 关 基 因 在 鹅 卵 泡 类 固 醇 激 素 合 成 中 的 作 用 研 究 [D]. 硕 士 毕 业 论 文, 四 川 农 业 大 学, 导 师 : 王 继 文. pp (Xia L Study on the role of cholesterol trafficking genes related to steroid hormones synthesis in goose follicles[d]. Thesis for M.S., Sichuan Agricultural University, Supervisor: Wang J W. pp ) 张 翔 朗 德 鹅 C/EBP 基 因 的 克 隆 表 达 及 DNA 甲 基 化 分 析 [D]. 硕 士 毕 业 论 文, 南 京 农 业 大 学, 导 师 : 谢 庄. pp (Zhang X DNA cloning, expression and DNA methylation status analysis of Landes geese C/ EBP gene[d]. Thesis for M.S., Nanjing Agricultural University, Supervisor: Xie Z. pp ) Astarita G, Jung K M, Vasilevko V, et al Elevated stearoyl-coa desaturase in brains of patients with alzheimer's disease[j]. Plos One, 6(10): e Beiraghi S, Zhou M, Talmadge C B, et al Identification and characterization of a novel gene disrupted by a pericentric inversion inv(4) (p13.1q21.1) in a family with cleft lip[j]. Gene, 309(1): Bird A Perceptions of epigenetics[j]. Nature, 447. Deans C, Maggert K A What do you mean, "Epigenetic"?[J]. Genetics, 199(4): Guenin S, Mouallif M, Deplus R, et al Aberrant promoter methylation and expression of UTF1 during cervical carcinogenesis[j]. Plos One, 7(8): 4-5. Hamilton J P Epigenetics: Principles and practice[j]. Digestive Diseases, 29(2): Hang W, Feng L, Millette C F, et al Expression of a novel, sterol- insensitive form of sterol regulatory element binding protein 2(SREBP2) in male germ cells suggests important cell- and stage-specific functions for SREBP targets during spermatogenesis[j]. Molecular & Cellular Biology, 22(24): Hannah V C, Ou J, Luong A, et al Unsaturated fatty acids down- regulate SREBP isoforms 1a and 1c by two mechanisms in HEK- 293 cells[j]. Journal of Biological Chemistry, 276(6): Hark A T, Schoenherr C J, Katz D J, et al CTCF mediates methylation-sensitive enhancer- blocking activity at the H19/Igf2 locus[j]. Nature, 405(6785): Hasty A H, Shimano H, Yahagi N, et al Sterol regulatory element- binding protein- 1 is regulated by glucose at the transcriptional level[j]. Journal of Biological Chemistry, 275(40): Hermier D, Rousselot-Pailley D, Peresson R, et al Influence of orotic acid and eserogen on hepatic lipid storage and secretion in the goose susceptible to liver steatosis[j]. Biochimica et Biophysica Acta, 1211(1): Horton J D, Goldstein J L, Brown M S SREBPs: Activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver[j]. The Journal of Clinical Investigation, 109(9): Jakobsson A, Westerberg R, Jacobsson A Fatty acid elongases in mammals: Their regulation and roles in metabolism[j]. Progress in Lipid Research, 45(3): Kumadaki S, Matsuzaka T, Kato T, et al Mouse Elovl-6 promoter is an SREBP target[j]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 368(2): Lengi A J, Corl B A Comparison of pig, sheep and chicken scd5 homologs: Evidence for an early gene duplication event[j]. Comparative Biochemistry & Physiology Part B: Biochemistry & Molecular Biology, 150 (4): Leonard A E, Pereira S L, Sprecher H, et al Elongation of long-chain fatty acids[j]. Progress in Lipid Research, 43(1): Luciana P, Claudia E, Pablo D, et al Role of phosphatidylcholine during neuronal differentiation[j]. Interna-

10 填 饲 对 朗 德 鹅 SCD5 SREBP2 和 ELOVL6 甲 基 化 和 mrna 表 达 的 影 响 The Effects of Force-Feeding on DNA Methylation and mrna of SCD5, SREBP2 and ELOVL6 in Force-feeding Landes 1587 tional Union of Biochemistry & Molecular Biology Life, 63(9): Moon Y, Shah N, Mohapatra S, et al Identification of a mammalian long chain fatty acyl elongase regulated by sterol regulatory element-binding proteins[j]. Journal of Biological Chemistry, 276(48): Rawson R, Debose B R J, Brown M Failure to cleave sterol regulatory element- binding proteins (SREBPs) causes cholesterol auxotrophy in Chinese hamster ovary cells with genetic absence of SREBP cleavage- activating protein[j]. Journal of Biological Chemistry, 274 (40): Robin H Epigenetics: A historical overview[j]. Epigenetics Official Journal of the DNA Methylation Society, 1(2): Rozenberg J M, Shlyakhtenko A, Glass K, et al All and only CpG containing sequences are enriched in promoters abundantly bound by RNA polymeraseⅡin multiple tissues[j]. BMC Genomics, 9(7): 67. Shimomura I, Shimano H, Horton J D, et al Differential expression of exons la and lc in mrnas for sterol regulatory element binding protein- 1 in human and mouse organs and cultured cells[j]. The Journal of Clinical Investigation, 99(5): Sinner D I, Kim G J, Henderson G C, et al Stearoylcoa desaturase-5: A novel regulator of neuronal cell proliferation and differentiation[j]. Plos One, 7(6): Takashi M, Hitoshi S, Naoya Y, et al Cloning and characterization of a mammalian fatty acyl-coa elongase as a lipogenic enzyme regulated by SREBPs[J]. Journal of Lipid Research, 43(6): Waddington C H The epigenotype[j]. International Journal of Epidemiology, 41(1): Zhu L H, Meng H, Duan X J, et al Gene expression profile in the liver tissue of geese after overfeeding[j]. Poultry Science, 90(1): ( 责 任 编 辑 王 晓 平 )