中国蔬菜 2013(20):24-31 CHINA VEGETABLES 结球甘蓝雌蕊调控转录因子 SPT 基因的克隆与序列分析杨朴丽许俊强刘智宇王志敏张丹华汤青林 ( 西南大学园艺园林学院, 南方山地园艺学教育部重点实验室, 重庆市蔬菜学重点实验室, 重庆 ) * 宋明 * 摘要

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1 中国蔬菜 2013(20):24-31 CHINA VEGETABLES 结球甘蓝雌蕊调控转录因子 SPT 基因的克隆与序列分析杨朴丽许俊强刘智宇王志敏张丹华汤青林 ( 西南大学园艺园林学院, 南方山地园艺学教育部重点实验室, 重庆市蔬菜学重点实验室, 重庆 ) * 宋明 * 摘要 : 以结球甘蓝 E1 为材料, 提取花蕾总 RNA, 反转录 cdna 根据拟南芥 SPT 基因设计引物, 采用同源克隆的方法从中克隆 SPT 基因序列 bp, 开放阅读框 bp 通过 cdna 推导得到的氨基酸序列分析表明,BoSPT 编码 353 个氨基酸残基, 预测分子量为 kd,pi 为 6.83 经过 EcoRⅠ 和 KpnⅠ 限制酶双酶切后, 构建原核表达质粒 pet43.1a-bospt 转化表达菌株 E. coli Rosetta (DE3), 通过 SDS-PAGE 检测该蛋白的表达经 Smart-embl 预测其具有 bhlh 家族结构域, 位于序列第 173~221 位氨基酸残基处进化树表明结球甘蓝 BoSPT 与拟南芥 AtSPT 和筷子芥 AlSPT 的亲缘关系较近 BoSPT 基因的原核表达得到纯化的融合蛋白关键词 : 结球甘蓝 ; 雌蕊 ;SPT; 基因克隆 ; 序列分析中图分类号 :S635.1 文献标识码 :A 文章编号 : (2013) Moclecular Cloning and Sequence Analysis of SPT Gene Transcription Factor Regulation of Pistil from Cabbage YANG Pu-li,XU Jun-qiang,LIU Zhi-yu,WANG Zhi-min,ZHANG Dan-hua,TANG Qing-lin *, SONG Ming * (College of Horticulture and Landscape Architecture,Southwest University,Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions,Ministry of Education,Key Laboratory of Olericulture,Chongqing ,China) Abstract:Taking cabbage(brassica oleracea L.)E1 as materials,we extracted total RNA from capullo,reverse transcribed cdna. According to SPT gene sequence of Arabidopsis,primers were designed and bp SPT gene with bp open reading frame(orf)was cloned by homology cloning techniques. The deduced BoSPT protein contained 353 amino acids,with a molecular weight of kd and pi of After double enzyme of EcoRI and KpnI restriction enzymes, and then construct the recombinant plasmids pet43.1a-bospt. After transformation to E. coli Rosetta (DE3),the expression of recombinant proteins were detected via SDS-PAGE. The structural analysis of BoSPT though Smart-embl showed that it contained bhlh family domain,which located at the position of amino acid residues,the phylogenetic tree indicated that the BoSPT had 收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 国家重点基础研究发展计划项目 (2012CB113900), 国家自然科学基金项目 ( ), 重庆市自然科学基金项目 (2011BA1002), 中央高校基本科研业务费专项 (XDJK2012B020), 国家大学生创新项目 ( ) 作者简介 : 杨朴丽, 女, 专业研究生, 专业方向 : 蔬菜遗传育种与生物技术, yangpuli2008@163.com * 通讯作者 (Corresponding authors): 汤青林, 男, 副研究员, 硕士生导师, 专业方向 : 蔬菜遗传育种与发育调控, swutql@163.com; 宋明, 男, 教授, 硕士生导师, 专业方向 : 蔬菜遗传育种与生物技术, swausongm@163.com 中国蔬菜学术论文下载

2 2013 年 (20) 杨朴丽等 : 结球甘蓝雌蕊调控转录因子 SPT 基因的克隆与序列分析 25 close genetic relationship with AtSPT and AlSPT. Prokaryotic expression showed that the molecular mass of BoSPT protein was purified. Key words:cabbage;pistil;spt;moclecular cloning;sequence analysis 雌蕊是种子植物的雌性繁殖器官, 由心皮花柱和子房组成并最终发育形成果实, 其生长发育情况对作物的产量质量都有决定性的影响, 同时雌蕊发育的好坏对植物是否能够繁殖也起到至关重要的作用 SPATULA(SPT) 是第一个被发现在植物花器官发育过程中起到重要作用的基因 (Alvarez & Smyth,1999) Heisler 等 (2001) 应用原位杂交技术得出,SPT 基因在花分生组织的顶部就开始表达, 此部位随后发育成雌蕊原基,SPT 基因在雌蕊原基中部表达最强 ; 随着雌蕊原基的生长发育, 随后继续分化出隔膜柱头花柱和输送管, 在此发育过程中不同组织中都有 SPT 基因的表达直至开花前, 在隔膜和柱头上 SPT 基因的表达才消失, 但在角果瓣片上却可检测到 SPT 基因的表达, 然后随着发育的进程,SPT 基因表达渐渐集中到瓣片边缘, 此部位会进一步发育成瓣片分裂区, 保证果实正常开裂在拟南芥中发现,SPT 功能缺失会导致隔膜和顶端心皮融合缺陷, 以及传输束丧失和柱头组织发育的减少 (Heisler et al.,2001; Alvarez & Smyth,2002) 由此推断,SPT 基因在整个雌蕊发育过程中是必不可少的拟南芥心皮发育还受到花器官确定基因 AGA(AGAMOUS) 和 MADS-box 成员 CRABS CLAW(CRC) 基因的调控 (Alvarez & Smyth,1999,2002) Alvarez 和 Smyth(1999) 发现 CRC 可抑制正在发育的雌蕊的横向生长, 促进其轴向生长 CRC 基因的突变将引起雌蕊呈现较宽而短的结构, 且使两心皮在顶点处呈非融合状态 (Fourquin et al.,2007) AGA 基因在花器官建成中为 C 组的基因, 对于维持心皮生长发育特性以及花柱顶端的生长是不可缺少的 (Gloz & Hudson,2002) 有研究发现这 3 个基因在心皮的发育过程中是平行起作用的, 而并非上下游关系, SPT 与这两个基因的并联行为调节成熟雌蕊所有元件, 也有遗传学的证据表明 CRC 可以增进 SPT 与 AGA 的功能 (Alvarez & Smyth,1999;Fourquin et al.,2005) Gremski 等 (2007) 研究发现 SPT 与其他 bhlh 编码的转录因子 HECATE(HEC) 在隔膜传输束和柱头重叠表达形成二聚体调控雌蕊生长发育同时研究发现在拟南芥中 SPT 除了可以调控雌蕊的发育外, 在子叶 (Josse et al.,2011) 叶片(Jorgensen & Tyers,2004;Ichihashi et al.,2010) 根(Makkena & Lamb,2013) 果实(Girin et al.,2011;groszmann et al.,2011) 等器官中都有作用, 同时对种子的萌发也起到了一定的作用 (Penfield et al.,2005) 所以可以说 SPT 的功能贯穿了植物的整个生命周期, 但是 SPT 的主要功能是在雌蕊受精之前影响花器官的发育因此对雌蕊调控转录因子 SPT 的研究是有重要意义的近年来,SPT 在模式植物拟南芥中已有深入的研究, 然而在其他作物中的报道还相对较少拟南芥和甘蓝 (Brassica oleracea L.) 同为十字花科草本植物, 不同的是甘蓝为芸薹属中重要的蔬菜作物目前, 赵燕等 (2009) 从荠菜 (Capsella bursapastoris) 中克隆到了与 SPT 相关的同样影响雌蕊发育过程的 CRC 基因, 但甘蓝 SPT 基因的研究至今仍未见报道本试验根据拟南芥 SPT 基因设计引物, 通过同源克隆法从试验材料结球甘蓝 E1 中得到了 SPT 基因进一步对其进行序列分析及同源性对比, 结合原核体外表达技术, 为后续在甘蓝中 SPT 与其他蛋白如 HEC 的相互作用调控雌蕊生长发育的研究奠定基础 1 材料与方法 1.1 试验材料结球甘蓝 E1 由重庆市蔬菜学重点实验室提供种子播种和植株生长均在 RXZ 型智能人工中国蔬菜学术论文下载

3 26 中国蔬菜 CHINA VEGETABLES 2013 年 10 月 ( 下 ) 气候箱中, 采用 20 /16 h 光照与 18 /8 h 黑暗的光周期, 成苗后移栽于试验田, 经过冬季低温春化 2013 年 3 月取盛花期自交不亲和系花柱于 -80 冻存, 用于 RNA 提取根据拟南芥 SPT 基因序列 (NCBI 登录号 NM_ ) 设计引物对 SPT-F:5 -GCG GA ATTCATGGGAGATAAGAAATTGAT-3 ;5 为带保护碱基的 EcoRⅠ 酶切位点 ;SPT-R:5 -GCG GGTACCATGGATTCTGACATAATGAACA-3 ;5 为带保护碱基的 KpnⅠ 酶切位点 1.2 花蕾 SPT 基因的 cdna 和 gdna 的克隆与序列分析根据拟南芥基因保守区域设计 PCR 扩增引物 BoSPT-F 和 BoSPT-R 用于 cdna 序列的扩增, RT-PCR 扩增体系为 ddh 2 O 15.4 μl,10 PCR 缓冲液 2.5 μl,2 mmol L -1 dntp 2.5 μl,25 mmol L -1 MgSO μl,bospt-f/bospt-r 各 1 μl,kod DNA 聚合酶 0.5 μl, 模板 DNA 0.5 μl PCR 扩增程序为 94 3 min;94 30 s,50 30 s,72 30 s,38 个循环 ;72 5 min 回收目的片段分别连接到 peasy-blunt simple 载体, 转化至 E.coli JM109 感受态细胞, 进行蓝白斑筛选后, 挑取阳性克隆进行酶切鉴定并送测序 1.3 表达质粒的构建与体外表达使用 OMEGA Plasmid Miniprep 试剂盒提取 SPT 目的基因质粒, 分别经 EcoR Ⅰ/Kpn Ⅰ 双酶切后定向插入原核表达载体 pet43.1a, 重组质粒转化大肠杆菌 JM109 提取重组质粒并命名为 pet43.1a-bospt 分别经 EcoRⅠ/KpnⅠ 双酶切鉴定和华大基因公司测序验证将重组质粒 pet43.1a-bospt 转化表达表 1 IPTG 诱导原核表达条件的正交设计菌株 E. coli Rosetta (DE3) 挑取单菌落, 接编号处理 A 温度 / B 浓度 /mmol L -1 C 时间 /h 种于 5 ml 含有 50 μg ml -1 氨苄青霉素的 LB 液体培养基,37 振荡培养过夜次日, 1 2 A 1 B 1 C 1 A 1 B 2 C 过夜培养物按扩大培养, 当 OD 600 在 3 A 1 B 3 C A 2 B 1 C ~1.0 时加入异丙基 -β-d- 硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG), 按照 L 9 (3 4 ) 正交设计筛选融合蛋白表达条件 ( 表 1) A 2 B 2 C 1 A 2 B 3 C 2 A 3 B 1 C 融合蛋白纯化由 1.3 中确定的最佳条件培养含有 8 A 3 B 2 C A 3 B 3 C pet43.1a-bospt 的 E. coli Rosetta (DE3), 并按 TOYOBO MagExtractor-His-tag- 蛋白纯化试剂盒说明纯化其体外表达的重组蛋白产物诱导结束后离心收集菌体, 使用 Ni 2+ -NTA 柱 (Qiagen) 纯化融合蛋白, 以转化 pet43.1a DNA 空载体的 E. coli Rosseta 作为对照,SDS-PAGE 电泳检测目的蛋白 2 结果与分析 2.1 BoSPT 基因克隆提取花蕾 RNA( 图 1) 反转录 cdna, 设计引物克隆得到 BoSPT 基因 cdna 序列, 全长 bp, 开放阅读框 (ORF)1 062 bp( 图 2),GC 含量 54.37% 根据其 cdna 序列推导得到 BoSPT 蛋白共 353 个氨基酸残基序列, 预测分子量为 kd, 等电点为 BoSPT 基因序列分析通过 SignalP 分析 ( services/signalp-2.0/) 该蛋白不含信号肽, PSORT 及 (TargetP services/targetp/) 软件预测亚细胞定位表明, BoSPT 蛋白位于细胞核中的可能性最大, 在其他部位可能性较小, 说明 BoSPT 蛋白是一种核蛋白且由 7 个外显子组成, 编码 353 个氨基酸中国蔬菜学术论文下载

2013 年 (20) 杨朴丽等 : 结球甘蓝雌蕊调控转录因子 SPT 基因的克隆与序列分析 27 图 1 甘蓝总 RNA 电泳图谱 1,2- 甘蓝 E1 的花蕾总 RNA 图 2 SPT 基因 cdna PCR 产物电泳图谱 M:Trans2K plus DNA marker;1:spt 基因 cdna 目标条带在线预测分析 (http://smart.embl-heidelberg.

分别位于第 169~172 位氨基酸和第 182~184 位氨基酸处, 该区域对 SPT 功能非常重要 Beta 链位于第 222~230 位氨基酸处跨膜域分析表明 (http://genome.cbs. dtu.

4 2013 年 (20) 杨朴丽等 : 结球甘蓝雌蕊调控转录因子 SPT 基因的克隆与序列分析 27 图 1 甘蓝总 RNA 电泳图谱 1,2- 甘蓝 E1 的花蕾总 RNA 图 2 SPT 基因 cdna PCR 产物电泳图谱 M:Trans2K plus DNA marker;1:spt 基因 cdna 目标条带在线预测分析 ( 表明,BoSPT 蛋白具有 bhlh 家族结构域, 位于第 173~221 位氨基酸处, 两亲性螺旋位于 (DEISLFLRHII) 第 34~44 位氨基酸残基, 是蛋白 - 蛋白相互作用的位点, 且保守的两亲性螺旋可能也与共激活子蛋白作用酸性结构域 (ETDGYDCESEEGVE) 位于第 139~152 位氨基酸处, 富含酸性残基两个核定位信号 (KRCR KRRR) 分别位于第 169~172 位氨基酸和第 182~184 位氨基酸处, 该区域对 SPT 功能非常重要 Beta 链位于第 222~230 位氨基酸处跨膜域分析表明 ( dtu.dk/services/ TMHMM/), 该蛋白不含跨膜区, 且位于膜外 ( 图 3) GCGGAATTC 1 ATG GGA GAT AAG AAA TTG ATT CCA TCT TCT TCT TCA ACT ACA TCG ATT TAC GAT ACT CGT M G D K K L I P S S S S T T S I Y D T R 61 AGT AGT AAT AAT AGC AAT CAT CAT CCA CCC TCT TCT TCC GAC GAG ATT TCT CTG TTT CTC S S N N S N H H P P S S S D E I S L F L 121 CGG CAT ATT ATC AAC CGT TCT TCT TCT CCT TTA CCC TCT CAC TAT TCT CAG GCG ACG GCT R H I I N R S S S P L P S H Y S Q A T A 181 TCT ACC GCG GAG ATA GGA GTT AAC GCA GAC CCG CAT GCA GAC AAC CCG AGA TGT TTC GTT S T A E I G V N A D P H A D N P R C F V 241 TCT CCT CAA ACG TCG AAG CGC GCA GCT GAT TAC TCT GAG GTT TTG ATA GGC TCC GGC GTT S P Q T S K R A A D Y S E V L I G S G V 301 GGA TCA AGC TCC GCC GCC GCG TGT TAT GGT TTC TCC GGT GGT GGT GGC AAT AAC GTT GCT G S S S A A A C Y G F S G G G G N N V A 361 CAA GGA AAC AGC TCA GGG ACT CGT GTT TCG TCT TCT TCG TTT GGA GCT AGC GGG AAT GAG Q G N S S G T R V S S S S F G A S G N E 421 ACC GAC GGG TAT GAT TGC GAA AGC GAG GAA GGA GTA GAA GCA GTG GTT GAC GAT GAA CTT T D G Y D C E S E E G V E A V V D D E L 481 CTC TGC AAG TCT CGT ACC TCA TCA AAG AGA TGC AGA GCT GCT GAA GTT CAT AAT TTA TCT L C K S R T S S K R C R A A E V H N L S 541 GAG AAG AGA AGA AGA AGT AGG ATC AAC GAA AAG ATG AAA GCT TTA CAA AGT CTC ATC CCT E K R R R S R I N E K M K A L Q S L I P 601 AAT TCA AAT AAG ACG GAT AAG GCT TCA ATG CTT GAT GAA GCC ATA GAG TAT CTG AAACAG N S N K T D K A S M L D E A I E Y L K Q 661 CTT CAG CTC CAA GTT CAG ATG TTG ACA ATG AGG AAT GGG GTA AAC TTA CAT CCT CTG TGC L Q L Q V Q M L T M R N G V N L H P L C 721 TTA CCT GGA ACT ACA TTA CAC CCA TTG CAA CTC TCT CAG CTC CGA CCT GGT GTT CCT CCA L P G T T L H P L Q L S Q L R P G V P P 781 GAA GCA ACC AAT GAT TCT CTG TTT AAT CAC ACC AAT CAT TTT GCT TCC ACT TCT AAT GCA E A T N D S L F N H T N H F A S T S N A 841 CCT GCA ATG GTC AAC ACC GTG GCT TCT TCA TAC GCG TTG GAA CCT TCC ATT CGC AGT CAC P A M V N T V A S S Y A L E P S I R S H 901 TTT GGA CCT TTC CCT CTC CTT ACT TCA CCT GCG GAG ATG AGT GGT GAA GGA GGG TTA ACT F G P F P L L T S P A E M S G E G G L T 961 CAT CCA AGG TTG AAT ATT GGT CAT TCC AAC ACA AAC TTA ACC GAA TGT TTG GGG ATT TTT H P R L N I G H S N T N L T E C L G I F CAG GGA GAC AAG CTG TGT TTA ATG GGC AAC AAC CTG ACA TAA AAG ATC GAA TTA CTT GAG Q G D K L C L M G N N L T * GTACCCGC 图 3 SPT 核苷酸序列分析双下划线表示上下游引物, 细单下划线区域表示两亲性螺旋域, 浅灰色区域表示酸性结构域, 方框区域表示两个核定位信号, 深灰色区域是 bhlh 家族结构域,Beta 链位于粗单下划线区域处中国蔬菜学术论文下载

5 28 中国蔬菜 CHINA VEGETABLES 2013 年 10 月 ( 下 ) 2.3 BoSPT 磷酸化位点预测用 NetPhos 2.0 Serve 软件预测 BoSPT 基因翻译后修饰, 结果显示 BoSPT 蛋白有可能发生磷酸化的位点共有 36 个 ( 图 4) 丝氨酸(Ser) 有可能发生磷酸化的位点有 31 个, 分别在肽链的第位和第 314 位氨基酸处 ; 苏氨酸 (Thr) 可能发生磷酸化的位点有 3 个, 分别在肽链的第位和第 263 位氨基酸处 ; 酪氨酸 (Tyr) 可能发生磷酸化的位点有 2 个, 分别在肽链的第 91 位和第 144 位氨基酸处图 4 BoSPT 磷酸化位点分析 2.4 BoSPT 进化树分析经氨基酸序列 NCBI 比对,BoSPT 属于转录因子超家族序列分析结果显示 BoSPT 具有动植物转录因子特有的 bhlh 结构域从 NCBI 数据库检索到部分与 BoSPT 氨基酸序列同源性较高的高等植物蛋白家族氨基酸序列, 经 ClustalX2 比对, 通过 MEGA5 软件构建系统发生树 ( 图 5), 结果表明, 结球甘蓝 BoSPT 与拟南芥 AtSPT(NM_119857) 和筷子芥 AlSPT (XP_ ) 位于相同的进化枝上, 与两者的同源性最高 ( 图 5) 图 5 SPT 蛋白分子进化树分析 2.5 表达质粒的构建与鉴定构建的表达质粒 pet43.1a-bospt, 经 EcoRⅠ/KpnⅠ 双酶切可得到 bp 左右条带 ( 图 6), 表达质粒送华大基因公司双向测序, 结果插入 pet43.1a 载体的位点和方向完全正确中国蔬菜学术论文下载

2013 年 (20) 杨朴丽等 : 结球甘蓝雌蕊调控转录因子 SPT 基因的克隆与序列分析 29 2.6 重组蛋白的诱导表达与 SDS-PAGE 检测表达产物的 SDS-PAGE 结果 ( 图 7) 显示, 有 pet43.1a-bospt 重组蛋白表达的特异条带出现 ( 图 7,1~9 泳道 ), 其蛋白质相对分子量均与预期值 103.

1a-bospt 酶切电泳图谱 M:Trans2K plus II DNA marker;1,2:ecor I/Kpn I 双酶切量相近, 而 1 5 泳道的表达量相对较弱本试验选用第 7 泳道 ( 对应表 1 中第 7 组的诱导条件, 即 0.

1a-spt 不同诱导条件的 SDS-PAGE 电泳图谱 M:protein marker B (TaKaRa);0: 未诱导对照 ;1~9: 不同 IPTG 诱导条件对应表 1 中编号 1~9 图 8 纯化的 pet43.1a-bospt 融合蛋白 SDS-PAGE 电泳图谱 M:protein marker B (TaKaRa);1: 未诱导对照 ;2: 优化条件下诱导的 pet43.

6 2013 年 (20) 杨朴丽等 : 结球甘蓝雌蕊调控转录因子 SPT 基因的克隆与序列分析重组蛋白的诱导表达与 SDS-PAGE 检测表达产物的 SDS-PAGE 结果 ( 图 7) 显示, 有 pet43.1a-bospt 重组蛋白表达的特异条带出现 ( 图 7,1~9 泳道 ), 其蛋白质相对分子量均与预期值 kd 相符, 而未诱导的菌液 ( 对照 ) 不见此条带 ( 图 7,0 泳道 ) 由此证明表达质粒 pet43.1a-bospt 构建正确, 且融合蛋白在大肠杆菌中成功表达由图 7 看出在不同的诱导条件下, 该融合蛋白均有较高的表达量, 第泳道的表达图 6 pet43.1a-bospt 酶切电泳图谱 M:Trans2K plus II DNA marker;1,2:ecor I/Kpn I 双酶切量相近, 而 1 5 泳道的表达量相对较弱本试验选用第 7 泳道 ( 对应表 1 中第 7 组的诱导条件, 即 0.1 mmol L -1 IPTG 在 37 诱导 2 h, 融合蛋白表达量最高, 该条件为最佳培养条件 ), 采用 TOYOBO MagExtractor-His-tag- 蛋白纯化试剂盒纯化体外表达的融合蛋白 pet43.1a- BoSPT, 纯化后可得到目的条带图 7 pet43.1a-spt 不同诱导条件的 SDS-PAGE 电泳图谱 M:protein marker B (TaKaRa);0: 未诱导对照 ;1~9: 不同 IPTG 诱导条件对应表 1 中编号 1~9 图 8 纯化的 pet43.1a-bospt 融合蛋白 SDS-PAGE 电泳图谱 M:protein marker B (TaKaRa);1: 未诱导对照 ;2: 优化条件下诱导的 pet43.1a-bospt;3: 纯化的 pet43.1a- BoSPT 2.7 融合蛋白纯化检测根据 2.6 得出的结果确定含有 pet43.1a-bospt 的 E. coli Rosetta (DE3) 的最佳培养条件, 并按 TOYOBO MagExtractor-His-tag- 蛋白纯化试剂盒说明纯化其体外表达的重组蛋白产物诱导结束后离心收集菌体, 使用 Ni 2+ -NTA 柱 (Qiagen) 纯化融合蛋白, 以转化 pet43.1a DNA 空载体的 E. coli Rosseta 作为对照, 通过 SDS-PAGE 电泳检测目的蛋白, 如图 8 所示, 纯化的 pet43.1a-bospt 融合蛋白目标条带准确清晰, 目标条带预期值 kd 3 结论与讨论本试验通过同源克隆的方法从甘蓝中获得了 SPT 基因, 编码了 353 个氨基酸经 ClustalX2 比对, 通过 MEGA5 软件构建系统进化树, 可以看出, 结球甘蓝 BoSPT 与拟南芥 AtSPT (NM_119857) 和筷子芥 AlSPT(XP_ ) 的同源性最高从而在一定程度上说明了这 3 个物种可能是由一个共同祖先进化而来将试验中克隆得到的 SPT 基因所编码的 BoSPT 蛋白进行 NCBI 比对, 发现 BoSPT 属于转录因子超家族序列分析结果显示在第 173~221 位氨基酸处 BoSPT 具有动植物转录因子特有的 bhlh 结构域 bhlh 区域含有两个保守结构域 : 一个保中国蔬菜学术论文下载

7 30 中国蔬菜 CHINA VEGETABLES 2013 年 10 月 ( 下 ) 守的两亲性分子螺旋和一个酸性域, 还带有两个保守的在 bhlh 域 N 末端重叠的核定位序列及一个 Beta 链因为 bhlh 家族结构域可能具有与蛋白或 DNA 结合成二聚体的能力, 所以在不同的器官中所结合的蛋白与基因可能是不相同的这便可以在一定程度上解释了为何叶片与心皮为同源组织, 但在 spt 突变体中, 叶片形状和叶片不同组织发育完整没有缺陷, 而在花的心皮边际却有特异性组织发育缺陷 (Alvarez & Smyth,1999;Fourquin et al.,2005;ichihashi et al., 2010) BoSPT 蛋白在第 139~152 位氨基酸处具有酸性结构域 (ETDGYDCESEEGVE), 富含酸性残基, 而 SPT 的酸性结构域是心皮发育所必需的 (Groszmann et al.,2008) 已有研究表明 SPT 酸性结构域是转录助激活剂的作用位点基础转录机制是间接激活而不是直接激活当然在一些转录因子中, 酸性域也被鉴定为直接的激活子, 但是这一类转录因子只是富含酸性残基, 而不拥有严格的保守序列和结构 (Ptashne & Gann,1997) 两亲性螺旋位于(DEISLFLRHII) 第 34 ~ 44 位氨基酸残基, 两亲性螺旋结构在心皮的发育过程中所起的作用并不像酸性结构域那样是必须的, 但其对酸性结构域起到支持作用 (Groszmann et al.,2008) 两个核定位信号(KRCR KRRR) 分别位于第 169~172 位氨基酸和第 182~184 位氨基酸处,Beta 链位于第 222~230 位氨基酸处, 有研究表明在与保守 Beta 链相邻的 bhlh 的 C 末端的一个突变导致 SPT 功能缺失 (Mitsuda & Ohme-Takagi,2009) 位于 C 端与 bhlh 域毗邻的 Beta 链的延伸对 SPT 心皮功能也是相当重要, 因其位于参与二聚化作用的 bhlh 域下游, 可能提供额外的二聚化接触点它与 bhlh-zip 蛋白的亮氨酸拉链结构域的作用可能是平行的 (Blackwood & Eisenman,1991), 都具有促进其二聚搭档特异性的作用 (Soucek et al.,1998) 目前, 有研究报道显示 SPT 和另一个 bhlh 转录因子 HEC 蛋白之间存在相互作用, 形成二聚体可能调控下游的目标基因 (Gremski et al.,2007), 然而, 是否还存在其他能与 SPT 相互作用的蛋白还需进一步的研究近年来国内外的学者在拟南芥的雌蕊发育调控机制方面接连取得重大进展这为其他作物, 尤其是瓜果蔬菜等经济类作物的研究带来了便利 ( 蒋励和张小兰,2013) 本试验从结球甘蓝中克隆得到甘蓝雌蕊调控转录因子 SPT 基因并对其蛋白进行体外原核表达检测, 可得到纯化的 pet43.1a-bospt 融合蛋白且目标条带准确清晰表明 SPT 能在体外表达下一步将对 SPT 基因所表达的蛋白与其他蛋白的相互作用进行进一步的研究, 更加深入地了解 SPT 基因调节雌蕊发育的分子机制为全面了解甘蓝开花调控机制, 并通过分子生物学方法来调控结球甘蓝的雌蕊发育使达到生产育种目标奠定了理论基础参考文献蒋励, 张小兰植物果实发育调控的分子机理研究进展. 中国蔬菜,(6):9-16. 赵燕, 黄丽华, 蒋向, 张学文荠菜 CRABS CLAW 的克隆与拟南芥遗传转化. 西北植物学报,29(11): Alvarez J,Smyth D R.1999.CRABS CLAW and SPATULA,two Arabidopsis genes that control carpel development in parallel with AGAMOUS.Development,126: Alvarez J,Smyth D R.2002.CRABS CLAW and SPATULA genes regulate growth and pattern formation during gynoecium development in Arabidopsis thaliana.plant Sci,163: Blackwood E M,Eisenman R N.1991.Max:a helix-loop-helix zipper protein that forms a sequence specific DNA -binding complex with Myc.Science,251: Fourquin C,Vinauger-Douard M,Fogliani B,Dumas C,Scut C P.2005.Evidence that CRABS CLAW and TOUSLED have conserved their roles in carpel development since the ancestor of the extant angiosperms.proceedings of the National Academy of Sciences of the USA,102: Fourquin C,Vinauger-Douard M,Chambrier P,Berne-Dedieu A,Scutt C P.2007.Functional conservation between CRABS CLAW orthologues from widely diverged angiosperms.annals of Botany,100: Girin T,Paicu T,Stephenson P,Fuentes S,Korner E,O Brien M,Sorefan K,Wood T A,Balanza V,Ferrandiz C,Smyth D 中国蔬菜学术论文下载

8 2013 年 (20) 杨朴丽等 : 结球甘蓝雌蕊调控转录因子 SPT 基因的克隆与序列分析 31 R,Østergaarda L.2011.INDEHISCENT and SPATULA interact to specify carpel and valve margin tissue and thus promote seed dispersal in Arabidopsis.Plant Cell,23(10): Gloz J F,Hudson A.2002.Signalling in plant lateral organ development.the Plant Cell,14: Gremski K,Ditta G,Yanofsky M F.2007.The HECATE genes regulate female reproductive tract development in Arabidopsis thaliana.development,134: Groszmann M,Paicu T,Smyth D R.2008.Functional domains of SPATULA,a bhlh transcripttion factor involved in carpel and fruit development in Arabidopsis.The Plant Journal,55: Groszmann M,Paicu T,Alvarez J P,Swain S M,Smyth D R.2011.SPATULA and ALCATRAZ,are partially redundant,functionally diverging bhlh genes required for Arabidopsis gynoecium and fruit development.the Plant Journal,68(5): Heisler M G,Atkinson A,Bylstra Y H,Walsh R,Smyth D R.2001.SPATULA,a gene that controls development of carpel margin tissues in Arabidopsis,encodes a bhlh protein.development,128(7): Ichihashi Y,Horiguchi G,Gleissberg S,Tsukaya H.2010.The bhlh transcription factor SPATULA controls final leaf size in Arabidopsis thaliana.plant Cell Physiol,51(2): Jorgensen P,Tyers M.2004.How cells coordinate growth and division.current Biology,14: Josse E M,Gan Y,Bou-Torrent J,Stewart K L,Gilday A D,Jeffree C E,Vaistij F E,Martínez-García J F,Nagy F,Graham I A, Halliday K J.2011.A DELLA in disguise:spatula restrains the growth of the developing Arabidopsis seedling.plant Cell, 23(4): Makkena S,Lamb R S.2013.The bhlh transcription factor SPATULA regulates root growth by controlling the size of the root meristem.bmc Plant Biol,13:1.doi: / Mitsuda N,Ohme-Takagi M.2009.Functional analysis of transcription factors in Arabidopsis.Plant Cell Physiol,50(7): Penfield S,Josse E M,Kannangara R,Gilday A D,Halliday K J,Graham I A.2005.Cold and light control seed germination through the bhlh transcription factor SPATULA.Current Biology,15(22): Ptashne M,Gann A.1997.Transcriptional activation by recruitment.nature,386: Soucek L,Helmer-Citterich M,Sacco A,Jucker R,Cesareni G,Nasi S.1998.Design and properties of a Myc derivative that efficiently homodimerizes.oncogene,17(19): 欢迎订阅 2014 年农药农药是由沈阳化工研究院主办的全国性综合农药技术刊物,1958 年创刊, 月刊, 中文核心期刊, 中国科技核心期刊, 美国化学文摘信息源期刊, 国内外公开发行农药杂志遵循研究推广农药技术, 推动农药科技进步, 提高农业环保意识, 促进农业可持续性发展的办刊宗旨, 本着普及与提高相结合的原则, 报道农药科研生产加工分析应用等方面的成果技术信息动态经验以及农药生产过程的三废治理及副产物的综合利用, 国内外农药新品种新剂型和新用法, 国内病虫草害发生趋势, 农药药效试验田间应用使用技术改进及毒性作用机制残留动态等内容农药多年来深受科研生产及植保工作者的厚爱, 成为农药研究生产销售应用部门的知心朋友荣获全国石油和化工行业优秀报刊一等奖全国各地邮局订阅 : 邮发代号 8-60, 每册订价 20 元, 全年 240 元编辑部订阅 : 沈阳市铁西区沈辽东路 8 号农药编辑部邮编 : 电话 ( 传真 ): nongyao@sinochem.com 开户行 : 工行北京复外支行账号 : 单位名称 : 沈阳化工研究院有限公司中国蔬菜学术论文下载

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