1498 研究论文 (FGF2) were artificially synthesized. The coding sequence for the signal peptide of human immunoglobulin (Igκ) responsible for protein secre

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筑裴郦
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1 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2014, 36(11): DOI: /cjcb 同时表达活化型 IGF1 EGF 和 FGF2 的慢病毒载体的构建郑丹丹 1# 叶景佳 2# 杨蓓蓓 1* 曹江 2* ( 1 浙江大学医学院附属第二医院耳鼻咽喉科, 杭州 ; 2 浙江大学医学院附属第二医院临床研究中心, 杭州 ) 摘要共培养体系及添加外源性生长因子是诱导干细胞向内耳样细胞分化研究中的常用手段为了将两种方法结合用于研究, 该实验设计了一种可同时表达三种活化型生长因子的慢病毒载体活化型表皮生长因子 (epidermal growth factor, EGF) 编码序列采用 RT-PCR 方法从 SW620 人大肠癌细胞中克隆, 活化型胰岛素样生长因子 1(insulin-like growth factor 1, IGF1) 和成纤维细胞生长因子 2(fibroblast growth factor 2, FGF2) 编码序列为人工合成用 PCR 方法分别从 psectag2a 和 pires2-egfp 质粒中克隆出引导分泌的免疫球蛋白 Igκ 链信号肽编码序列和引导翻译的内部核糖体进入位点 (internal ribosome entry site, IRES) 序列将 Igκ 链信号肽和三种因子的编码序列分别融合由 IRES 间隔并克隆到带绿荧光蛋白报告基因的慢病毒表达质粒 plvx-ires-zsgreen1 上并包装获得慢病毒将慢病毒感染 HEK293T 细胞, 通过有限稀释法筛选出稳定表达绿荧光蛋白的单细胞克隆用 Western blot 检测单细胞克隆的 IGF1 EGF 和 FGF2 的表达, 并通过促进肺癌 A549 细胞生长实验验证了分泌的生长因子的活性该研究成功构建了导入细胞后可同时表达活化型 IGF1 EGF 和 FGF2 的慢病毒载体, 为今后设计可表达这三种因子的共培养工程细胞用于干细胞诱导分化提供了有力的工具关键词 IGF1; EGF; FGF2; 慢病毒表达载体 Construction of A Lentiviral Vector Simultaneously Expressing Active IGF1, EGF and FGF2 Zheng Dandan 1#, Ye Jingjia 2#, Yang Beibei 1 *, Cao Jiang 2* ( 1 Department of Otorhinolaryngology, the 2 nd Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou , China; 2 Clinical Research Center, the 2 nd Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou , China) Abstract Co-culture system and exogenous growth factors are commonly used in induction of directional differentiation of stem cells towards sensory hair cells. In order to combine these two strategies in further work, we designed a lentiviral vector which could simultaneously express active IGF1, EGF and FGF2. The coding sequence for active epidermal growth factor (EGF) was cloned by RT-PCR with RNA from human colorectal cancer SW620 cells, and the coding sequences for active insulin-like growth factor 1 (IGF1) and fibroblast growth factor 2 收稿日期 : 接受日期 : 浙江省医药卫生科技计划项目 ( 批准号 : 2011ZDA012) 资助的课题 # 共同第一作者 * 通讯作者 Tel: , yangbb1959@sina.com; Tel: , caoj@zju.edu.cn Received: July 7, 2014 Accepted: August 28, 2014 This work was supported by the Medical Science and Technology Project of Zhejiang Province (Grant No.2011ZDA012) # These authors contributed equally to this work *Corresponding authors. Tel: , yangbb1959@sina.com; Tel: , caoj@zju.edu.cn 网络出版时间 : :02 URL:

2 1498 研究论文 (FGF2) were artificially synthesized. The coding sequence for the signal peptide of human immunoglobulin (Igκ) responsible for protein secretion and sequence for internal ribosome entry site (IRES) responsible for translation initiation were cloned from plasmids psectag2a and pires2-egfp, respectively. The coding sequences for Igκ and three growth factors were fused respectively with IRES spacers in between, cloned into a lentiviral expression plasmid with green fluorescent protein (GFP) reporter, plvx-ires-zsgreen1, and packaged into recombinant lentiviruses. HEK293T cells were infected by the lentiviruses and screened for single cell clones with GFP expression by limited dilution. The expression of IGF1, EGF and FGF2 were examined by Western blot, and proliferation assay of human lung cancer A549 cells was used to evaluate the activity of the secreted growth factors. In conclusion, we successfully constructed a lentiviral vector which could simultaneously express functionally active IGF1, EGF and FGF2 when introduced into mammalian cells in this work, providing a powerful tool for designing engineered cells expressing these three growth factors used in co-culture system to induce directional differentiation of stem cells. Key words IGF1; EGF; FGF2; lentiviral expression vector 感音神经性耳聋是一种常见的感觉障碍性疾病, 先天性严重耳聋的发生率为千分之一, 严重困扰着人类的健康生活与交流多种致病因素可引起毛细胞及相关的螺旋神经节神经元细胞损伤或死亡, 从而引起感音神经性聋非哺乳类脊椎动物其毛细胞在损伤和死亡后可以再生, 但哺乳动物的毛 [1-2] 细胞一旦损伤不能自然再生近年来, 感音神经性聋的发病率呈明显上升趋势, 但现有的治疗手段却很有限, 主要是助听器和电子耳蜗植入, 但这些治疗手段却不能从根本上恢复耳蜗的生理结构, 逆转患者的听力水平而干细胞在修复和再生受损的器官和细胞方面展现出了巨大 [3-5] 的潜能, 这也为内耳细胞的修复带来了希望干细胞是一类未分化的具有无限自我更新与增殖分化能力的细胞, 在一系列调节因子参与下, 通过模拟内耳正常发育过程, 可被诱导分化为毛细胞神经元和支持细胞等内耳细胞其中, IGF1(insulinlike growth factor 1) EGF(epidermal growth factor) 和 FGF2(fibroblast growth factor 2) 三种生长因子参与内耳的发育成熟过程, 在内耳细胞中可检测到三 [6-8] 种因子及其受体的表达它们是强有力的促有丝分裂原, 促进内耳细胞的分裂增殖, 诱导特定的细胞表型研究表明, 干细胞在添加有三种生长因子的 [9-11] 培养基中生长, 有助于其向内耳样细胞分化利用耳蜗相关组织与干细胞共培养也是诱导干细胞向 [12-14] 内耳样细胞分化的重要手段共培养是采用具有半透膜的细胞培养池, 将两种或两种以上细胞共同培养于同一环境中, 细胞之间不相互接触, 但上室细胞分泌的因子可透过半透膜, 从而诱导下室细胞向另一种细胞分化成年老鼠的嗅觉干细胞在与耳蜗细胞共培养后表达了毛细胞的特异型标记 [12] 骨髓间充质干细胞与胚胎 3 d 的鸡听囊细胞共培养 21 d 后, 其毛细胞相关标记的表达量增加 [18] 因此, 我们可以通过结合共培养体系和添加生长因子的方法以达到诱导干细胞向内耳细胞分化的目的但是, 由于细胞生长对生长因子的持续消耗, 人为添加生长因子不能稳定持续作用, 加之生长因子本身价格昂贵, 因此如果能够构建一种稳定表达 IGF1 EGF 和 FGF2 三种生长因子的慢病毒载体, 将其导入到合适的工程细胞中使其持续稳定地分泌生长因子而无需另外人为添加, 再利用工程细胞与干细胞进行共培养从而诱导干细胞向内耳细胞分化, 这对于研究生长因子对干细胞的诱导分化作用以及对于感音神经性聋的生物治疗都具有重要意义基于上述设想, 本工作设计构建了一种能够同时表达活化型 IGF1 EGF 和 FGF2 的慢病毒表达载体, 并用 HEK293T 细胞验证了该慢病毒载体能够成功表达活化型生长因子, 为今后在不同应用性研究中选择不同的细胞以建立相应的工程细胞用于与干细胞进行共培养打下了基础 1 材料与方法 1.1 质粒菌种和细胞株 pgem-t Easy Vector System 购自 Promega 公司, 慢病毒质粒系统 plvx-ires-zsgreen1 pmd2g 和 pspax2 及 pires2-egfp 质粒购自 Clontech 公司,

3 郑丹丹等 : 同时表达活化型 IGF1 EGF 和 FGF2 的慢病毒载体的构建 1499 psectag2a 质粒购自 Invitrogen 公司, 大肠杆菌 DH5α 菌种由本实验室保存, 人大肠癌细胞 SW620 人胚肾细胞 HEK293T 及人肺癌细胞 A549 购自 ATCC 公司 1.2 试剂中量质粒抽提试剂盒 Plasmid Midi Kits 转染试剂 Attractene Transfection Reagent 及胶回收试剂盒 QIAquicK Gel Extraction Kit 购自 QIAGEN 公司, 限制性内切酶碱性磷酸酶 (CIP) 购自 New England Biolabs 公司, RNA 提取试剂 TRIZOL 购自 Life Technologies 公司, 逆转录酶 M-MLV Reverse Transcriptase T4 DNA 连接酶 GoTaq DNA 聚合酶购自 Promega 公司, DMEM( 高糖 ) RPMI-1640 培养液购自 BOSTER 公司, 胎牛血清购自 Gibco 公司, Polybrene 购自 Sigma 公司, 蛋白酶抑制剂 Complete TM Protease Inhibitor Cocktail Tablet EGF 抗体 IGF1 抗体和 FGF2 抗体购自 Santa Cruz 公司, DC 蛋白定量试剂盒购自 Bio-Rad 公司, 化学发光底物 Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate 购自 Millipore 公司, CCK-8 试剂购自贝博生物公司 1.3 引物合成所有引物均由上海英骏生物技术有限公司合成 1.4 方法表达载体的设计及片段克隆表达载体采用由 CMV 启动子启动表达的慢病毒载体 plvx- IRES-ZsGreen1, 插入的外源序列为分别编码活化型 IGF1 EGF 和 FGF2 的三个独立开放阅读框 (opening reading frame, ORF) 序列, 在三个生长因子编码序列前均引入 Kozak 序列 ( 增强翻译 ) 和免疫球蛋白 Igκ 链的信号肽 ( 引导因子分泌 ) 编码序列, 同时为保证同一个 RNA 转录产物上的三个独立的编码框均能翻译, 在三个序列之间分别接入内部核糖体进入位点 (internal ribosome entry site, IRES) 图 1 为插入的外源序列设计示意图我们采用的 Kozak 序列为 TAG CCA CC, 免疫球蛋白 Igκ 链的信号肽编码序列克隆自 psectag2a 质粒, IRES 序列克隆自 pires2-egfp 质粒, 活化型 EGF IGF1 和 FGF2 编码序列根据 Genbank 收录的全长编码区序列并参考各自活化型因子氨基酸序列进行确定其中, 活化型 EGF 编码序列通过 RT-PCR 方法从大肠癌细胞 SW620 中克隆, 活化型 IGF1 和 FGF2 编码序列分别通过化学合成多个寡聚核苷酸片段后以 PCR 方法拼接获得构建过程中各 DNA 片段之间通过 Spe I 和 Xba I 这一对同尾酶产生的黏性末端相互连接且不可再切开采用 PCR 方法从 pires2-egfp 质粒中克隆出 IRES 引物分别为 IRES-F: 5 -ACT AGT GCC CCT CTC CCT CCC CCC-3, IRES-R: 5 -TCT AGA TGT GGC CAT ATT ATC ATC GTG-3 ( 下划线部分分别为引入的 Spe I 和 Xba I 酶切位点 ) PCR 扩增条件是 94 C 变性 5 min; 然后 94 C 变性 30 s 58 C 退火 30 s 72 C 延伸 30 s, 共 30 个循环 ; 最后 72 C 延伸 7 min 扩增产物 (597 bp) 通过 2% 琼脂糖凝胶电泳鉴定, 并按照 QIAGEN 的 QIAquicK Gel Extraction Kit 说明书进行切胶回收取 3 μl 切胶回收产物与 pgem-t Easy Vector 连接, 在 T4 DNA 连接酶作用下 16 C 连接过夜连接产物转化到 DH5 感受态细胞中, 氨苄青霉素抗性平板筛选培养, 挑取阳性克隆, 经 EcoR I 酶切鉴定正确后测序验证 Igκ-EGF 片段的克隆过程如下 : 首先, 采用 PCR 方法从 psectag2a 质粒中克隆出 Igκ 信号肽编码序列引物分别为 Igκ-F: 5 -ACT AGT TAG CCA CCA TGG AGA CAG AC-3 ( 下划线部分为引入的 Spe I 酶切位点, 斜体加粗部分为引入的 Kozak 序列 ); Igκ-R: 5 -GTC ACC AGT GGA ACC TGG AA-3 PCR 扩增条件同上, 扩增片段大小为 77 bp, 同上方法克隆并测序验证再以 TRIZOL 法提取大肠癌细胞 SW620 Kz Igκ IGF1 IRES Kz Igκ EGF IRES Kz Igκ FGF2 Kz: Kozak 序列 ; Igκ: 免疫球蛋白 Igκ 链信号肽 ; IRES: 内部核糖体进入位点 ; IGF1: 胰岛素样生长因子 1; EGF: 表皮生长因子 ; FGF2: 成纤维细胞生长因子 2 Kz: Kozak sequence; Igκ: signal peptide of immunoglobulin Igκ chain; IRES: internal ribosome entry site; IGF1: insulin-like growth factor 1; EGF: epidermal growth factor; FGF2: fibroblast growth factor 2. 图 1 活化型 IGF1 EGF FGF2 表达载体插入片段示意图 Fig.1 Illustration of inserted fragment for active forms of IGF1, EGF and FGF2 expression vector

4 1500 研究论文的总 RNA, 采用 Promega 公司的逆转录酶 M-MLV Reverse Transcriptase 逆转录合成 cdna, 再以此 cdna 为模板, PCR 扩增出 EGF 编码序列引物分别为 EGF-F: 5 -TTC CAG GTT CCA CTG GTG ACA ATA GTG ACT CTG AAT GTC CCC-3 ( 斜体加粗部分为引入的 Igκ 信号肽下游互补序列 ), EGF-R: 5 - TCT AGA TTA GCG CAG TTC CCA CCA CTT CA- 3 ( 下划线部分为引入的 Xba I 酶切位点, 斜体加粗部分为引入的终止密码 ), PCR 扩增条件同上, EGF 片段大小为 188 bp, 同上方法克隆并测序验证最后, 以 Igκ 信号肽和 EGF 编码序列片段为模板, 分别以 Igκ-F [15] 和 EGF-R 为上下游引物进行 overhang PCR 扩增, 扩增条件同上, 扩增获取 245 bp Igκ-EGF 目的片段, 同上方法克隆 PCR 产物并测序验证 IGF1 和 FGF2 编码序列通过如下方式合成带有 Kozak 序列和 Igκ 信号肽编码序列的活化型 IGF1 和 FGF2 序列分别由上海英骏生物技术有限公司直接合成, 利用 PCR 将合成的 Oligo 拼接成完整的基因序列将合成好的序列装入 pmd19-t Simple 载体并转化至感受态细胞 DH5α 测序验证重组克隆中插入序列是否与要求相一致 IGF1 序列 : 5 -ACT AGT TAG CCA CCA TGG AGA CAG ACA CAC TCC TGC TAT GGG TAC TGC TGC TCT GGG TTC CAG GTT CCA CTG GTG ACG GAC CGG AGA CGC TCT GCG GGG CTG AGC TGG TGG ATG CTC TTC AGT TCG TGT GTG GAG ACA GGG GCT TTT ATT TCA ACA AGC CCA CAG GGT ATG GCT CCA GCA GTC GGA GGG CGC CTC AGA CAG GCA TCG TGG ATG AGT GCT GCT TCC GGA GCT GTG ATC TAA GGA GGC TGG AGA TGT ATT GCG CAC CCC TCA AGC CTG CCA AGT CAG CTT AAT CTA GA-3 (296 bp, 下划线部分分别为引入的 Spe I 和 Xba I 酶切位点, 斜体加粗部分为引入的 Kozak 序列, 斜体下划线部分为引入的 Igκ 信号肽编码序列 ); FGF2 序列 : 5 -ACT AGT TAG CCA CCA TGG AGA CAG ACA CAC TCC TGC TAT GGG TAC TGC TGC TCT GGG TTC CAG GTT CCA CTG GTG ACG CAG CCG GGA GCA TCA CCA CGC TGC CCG CCT TGC CCG AGG ATG GCG GCA GCG GCG CCT TCC CGC CCG GCC ACT TCA AGG ACC CCA AGC GGC TGT ACT GCA AAA ACG GGG GCT TCT TCC TGC GCA TCC ACC CCG ACG GCC GAG TTG ACG GGG TCC GGG AGA AGA GCG ACC CTC ACA TCA AGC TAC AAC TTC AAG CAG AAG AGA GAG GAG TTG TGT CTA TCA AAG GAG TGT GTG CTA ACC GTT ACC TGG CTA TGA AGG AAG ATG GAA GAT TAC TGG CTT CTA AAT GTG TTA CGG ATG AGT GTT TCT TTT TTG AAC GAT TGG AAT CTA ATA ACT ACA ATA CTT ACC GGT CAA GGA AAT ACA CCA GTT GGT ATG TGG CAC TGA AAC GAA CTG GGC AGT ATA AAC TTG GAT CCA AAA CAG GAC CTG GGC AGA AAG CTA TAC TTT TTC TTC CAA TGT CTG CTA AGA GCT GAT AAT CTA GA-3 (551 bp, 下划线部分分别为引入的 Spe I 和 Xba I 酶切位点, 斜体加粗部分为引入的 Kozak 序列, 斜体下划线部分为引入的 Igκ 信号肽编码序列 ) 慢病毒表达载体的构建将上述片段分别与 pgem-t Easy Vector 连接并测序验证正确后, 按照图 1 的设计顺序, 用内切酶 Spe I 和 Xba I 酶切将上述已获得的各个片段依次连接并克隆至 pgem-t Easy Vector 上, 形成的载体命名为 pgem-t-3gf pgem- T-3GF 用 Spe I 和 Xba I 双酶切, 慢病毒载体质粒 plvx- IRES-ZsGreen1 用 Xba I 单酶切, 将整个目的片段克隆至慢病毒载体质粒 plvx-ires-zsgreen1 中, 用内切酶 EcoR I 和 Xba I 双酶切鉴定插入片段的方向正确插入的质粒命名为 plvx-3gf 慢病毒包装用 QIAGEN Plasmid Midi Kits 提取质粒 plvx-3gf pmd2g 和 pspax2, 分别各取 10 μg 稀释于 1 ml 不含血清不含抗生素的高糖 DMEM 中, 轻柔混匀, 再加入 30 μl Attractene Transfection Reagent 于上述培养基中, 轻柔混匀后室温静置 20 min 以形成转染复合物人胚肾 HEK293T 细胞常规培养于含 10% 胎牛血清的高糖 DMEM 培养基中, 于 37 ºC 5% CO 2 的饱和湿度培养箱中培养将 1 ml 消化离心后的 HEK293T 细胞悬液和 1 ml 转染复合物轻轻混匀后加入到 10 cm 培养皿中, 于 37 ºC 5% CO 2 的饱和湿度培养箱中培养, 6 h 后补足培养液至 10 ml 分别在转染 48 h 及 72 h 后, 收集含病毒的培养液上清, 用 0.45 μm 滤器过滤, 4 ºC 保存备用慢病毒感染 HEK293T 细胞接种 HEK293T 细胞于 3.5 cm 培养皿中 ( 培养液不含抗生素 ), 24 h 后 ( 细胞达到 70% 汇合度 ) 吸去培养液, 加入 500 μl 含病毒颗粒的上清和 0.4 μl Polybrene( 贮备液 10 mg/ml,

郑丹丹等 : 同时表达活化型 IGF1 EGF 和 FGF2 的慢病毒载体的构建 1501 终浓度 8 μg/ml), 6 h 后补足培养液, 24 h 后更换新鲜培养液, 细胞继续培养 48 h 后, 荧光显微镜下观察感染情况, 并采用有限稀释法 (1 个细胞 / 孔接种到 96 孔板中 ) 筛选可表达绿色荧光蛋白的稳定感染的细胞克隆, 将稳定感染的细胞克隆命名为 HEK293T/3GF 1.

5 郑丹丹等 : 同时表达活化型 IGF1 EGF 和 FGF2 的慢病毒载体的构建 1501 终浓度 8 μg/ml), 6 h 后补足培养液, 24 h 后更换新鲜培养液, 细胞继续培养 48 h 后, 荧光显微镜下观察感染情况, 并采用有限稀释法 (1 个细胞 / 孔接种到 96 孔板中 ) 筛选可表达绿色荧光蛋白的稳定感染的细胞克隆, 将稳定感染的细胞克隆命名为 HEK293T/3GF Western blot 法检测感染后目的蛋白的表达细胞中因子检测 : 收获 HEK293T/3GF 细胞及未感染的 HEK293T 对照细胞, PBS 洗涤 3 次, 离心收集细胞, 加入冰预冷的裂解液 (25 mmol/l Tris-HCl, ph7.6, 150 mmol/l NaCl, 1% NP-40, 1% 脱氧胆酸钠, 0.1% SDS, 含蛋白酶抑制剂 Complete TM Protease Inhibitor Cocktail), 并置于冰上裂解 30 min, r/min 4 ºC 离心 15 min 收集上清, 用 DC 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度, 取 20 μg 总蛋白进行 20% SDS-PAGE 凝胶电泳后转膜, 10% 牛奶室温封闭 1 h 后, 分别加入 EGF FGF2 和 IGF1 三种抗体 (1:500), 4 ºC 孵育过夜 TBST(TBS 加 0.1% Tween20) 洗膜 3 10 min, 加过氧化物酶标记的二抗 (1:5 000) 室温孵育 2 h, 洗膜 3 10 min, 化学发光法检测信号培养液中因子检测 : 收集 HEK293T/3GF 细胞及未感染的 HEK293T 对照细胞的培养液各 10 ml, 离心去除细胞碎片, 80 ºC 冷冻干燥, 溶于 500 μl ddh 2 O, 各取 20 μl 进行 20% SDS-PAGE, 同上转膜后检测因子表达 A549 细胞增殖实验 HEK293T/3GF 细胞及 HEK293T 对照细胞常规培养于含 10% 胎牛血清的高糖 DMEM 培养基中, 于 37 ºC 5% CO 2 的饱和湿度培养箱中培养待细胞长至 80% 汇合度后再培养 48 h 后收集上清, 作为条件培养液人肺癌 A549 细胞以每孔细胞接种于 96 孔板, 实验组加入 50 μl HEK293T/3GF 细胞的条件培养液和 50 μl 新鲜的含 10% 胎牛血清的 1640 培养液, 对照组加入 50 μl HEK293T 细胞的条件培养液和 50 μl 新鲜的含 10% 胎牛血清的 1640 培养液继续培养 48 h 后, 每孔加入 10 μl CCK-8 试剂, 在培养箱内孵育 2 h 后用酶标仪检测 450 nm 吸光度值 1.5 统计学分析采用 SPSS 18.0 软件进行统计分析计量数据以 mean±s.e.m. 表示, 两组均数比较采用 t 检验 ; P<0.05 认为差异有统计学意义 2 结果 2.1 IRES Igκ EGF 片段的克隆以 pires2-egfp 质粒为模板, 以 IRES-F 及 IRES-R 为上下游引物, 经 PCR 扩增出目的片段, 电泳结果与预期目的片段大小相符, 为 597 bp( 图 2A) 以 psectag2a 质粒为模板, 以 Igκ-F 及 Igκ-R 为上下游引物, 经 PCR 扩增出目的片段, 电泳结果与预期目的片段大小相符, 为 77 bp( 图 2A) 以大肠癌细胞 SW620 的总 RNA 为模板, 逆转录后以 EGF-F 和 EGF-R 为上下游引物, PCR 扩增出目的片段, 电泳结果与预期目的片段大小相符, 为 188 bp( 图 2A) 三段序列经测序验证均正确 2.2 Igκ-EGF 片段的克隆以 Igκ 信号肽和 EGF 片段为模板, 以 Igκ-F 和 EGF-R 为上下游引物进行 PCR 扩增, 扩增产物电泳 (A) bp M (B) 1 M bp bp bp 77 bp 245 bp A: Igκ 信号肽 IRES 和 EGF 片段的 PCR 产物 1: Igκ 信号肽片段 ; 2: IRES 片段 ; 3: EGF 片段 ; M: DL2000 marker B: Igκ-EGF 片段的 PCR 产物 1: Igκ-EGF 片段 ; M: DL2000 marker A: PCR products of Igκ signal peptide, IRES and EGF. 1: the Igκ signal peptide fragment; 2: the IRES fragment; 3: the EGF fragment; M: DL2000 marker. B: PCR product of Igκ-EGF. 1: the Igκ-EGF fragment; M: DL2000 marker. 图 2 Igκ 信号肽 IRES EGF 及 Igκ-EGF 序列的 PCR 克隆 Fig.2 Cloning of Igκ signal peptide, IRES, EGF and Igκ-EGF sequences by PCR

4 细胞感染及稳转细胞构建慢病毒感染HEK293T细胞48 h后, 荧光显微镜下观察感染后绿色荧光信号图中较多细胞表达绿色荧光, 表明慢病毒载体成功感染HEK293T细胞(图 4A) 后通过有限稀释法筛选, 获得稳定表达目的基因的细胞克隆, 图中所有细胞均表达绿色荧光, 细胞 M bp 10 000 8 000 1 8.

6 研究论文 1502 结果显示与Igκ-EGF预期大小相符, 为245 bp(图2b), EGF(6.2 kda) IGF1(6 kda)和fgf2(17.2 kda), 表明经测序验证正确 HEK293T/3GF细胞成功表达三种生长因子并可将 2.3 慢病毒载体的构建按照图1的设计, 将以上各个片段依次连接并克隆至慢病毒载体中, 构建成表达载体质粒pLVX3GF 获得的质粒用内切酶EcoR I和Xba I双酶切鉴定插入片段方向, 正向插入时片段大小为8.2 Kb和 bp(图3), 表明构建成功生长因子分泌到培养液上清中 2.4 细胞感染及稳转细胞构建慢病毒感染HEK293T细胞48 h后, 荧光显微镜下观察感染后绿色荧光信号图中较多细胞表达绿色荧光, 表明慢病毒载体成功感染HEK293T细胞(图 4A) 后通过有限稀释法筛选, 获得稳定表达目的基因的细胞克隆, 图中所有细胞均表达绿色荧光, 细胞 M bp Kb bp 经传代培养后所有细胞仍全部表达荧光, 说明成功获得了稳定感染的细胞(图4B) 2.5 Western blot检测三种生长因子的表达分别收集HEK293T/3GF细胞及其培养液进行Western blot检测EGF IGF1和FGF2的表达, 如图5所示, 在6~18 kda之间分别检测到了目的蛋白 M: 10 Kb plus DNA ladder marker; 1: plvx-3gf质粒, EcoR I和Xba I 双酶切 M: 10 Kb plus DNA ladder marker; 1: EcoR I and Xba I double digestion of plvx-3gf plasmid. 图3 慢病毒载体的构建及鉴定 Fig.3 Construction and characterization of lentiviral vector (A) 1 2 (B) 1 2 A: 慢病毒感染后HEK293T细胞(100 ) 1: 明场下视野; 2: 荧光下视野; B: 稳定感染HEK293T/3GF细胞克隆(200 ) 1: 明场下视野; 2: 荧光下视野 A: HEK293T cells after lentivirus infection (100 ). 1: microscopy under bright field; 2: microscopy under fluorescent field; B: stablely infected HEK293T/3GF cells (200 ). 1: microscopy under bright field; 2: microscopy under fluorescent field. 图4 慢病毒感染HEK293T细胞 Fig.4 Lentivirus infected HEK293T cells

郑丹丹等 : 同时表达活化型 IGF1 EGF 和 FGF2 的慢病毒载体的构建 1503 IGH1 (6.2 kda) 1 2 3 4 0.45 0.40 * EGF (6 kda) 0.35 FGF2 (17.2 kda) 0.

7 郑丹丹等 : 同时表达活化型 IGF1 EGF 和 FGF2 的慢病毒载体的构建 1503 IGH1 (6.2 kda) * EGF (6 kda) 0.35 FGF2 (17.2 kda) 0.30 GAPDH (36 kda) 1: HEK293T/3GF 细胞裂解液 ; 2: HEK293T 细胞裂解液 ; 3: HEK293T/ 3GF 培养液上清 ; 4: HEK293T 培养液上清 1: lysate of HEK293T/3GF cells; 2: lysate of HEK293T cells; 3: culture medium of HEK293T/3GF cells; 4: culture medium of HEK293T cells. 图 5 Western blot 检测生长因子表达 Fig.5 Expression of growth factors detected by Western blot 2.6 分泌的生长因子功能验证 IGF1 EGF 和 FGF2 三种生长因子均促进人肺癌 A549 细胞的生长 CCK-8 检测的实验结果表明, 和 HEK293T 对照条件培养液相比, HEK293T/3GF 细胞条件培养液确实能够明显促进 A549 细胞的生长, 差异有统计学意义 (P<0.05), 说明 HEK293T/3GF 细胞分泌的生长因子确实是具有活性的能够促进 A549 细胞生长的生长因子 ( 图 6) 3 讨论遗传突变病毒细菌感染耳毒性药物噪音和衰老等多种致病因素可引起毛细胞及与之相联系的螺旋神经损伤或死亡, 而哺乳动物的毛细胞一旦损伤不能自然再生, 从而引起感音神经性聋因此, 重建受损的听觉生理结构, 修复和再生内耳感觉细胞对于感音神经性聋的治疗至关重要通过诱导干细胞产生内耳细胞在感音神经性聋的治疗方面显示出了巨大的优势干细胞是一类能进行自我更新的多潜能细胞, 在一定条件下可诱导分化成为多种组织细胞类型干细胞定向诱导分化为内耳样细胞已经在胚胎干细胞 [10,16-17] 诱导多能干细胞 [16] 骨髓间充质干细胞 [18-20] 神经干细胞 [21] 和嗅觉干细胞 [12,22] 中得到应用而相关研究表明, 胰岛素样生长因子 1(IGF1) 表皮生长因子 (EGF) 和成纤维细胞生长因子 2(FGF2) 三种因子对于干细胞诱导分化为毛细胞样细胞是非常重要的 Saffer 等 [6] 用 RT-PCR 的方法在大鼠椭圆囊的感觉表皮组织中检测到 EGF 受体 (EGFR) FGF2 受体 (FGF2R) 和 IGF1 受体 (IGF1R) 在 mrna 水平上的表达而 Malgrange 等 [7] 和 Pickles 等 [8] 用同样的方法分别在大鼠和鸡的耳蜗组织中检测到三种因 D : HEK293T/3GF 条件培养液组 ; 2: HEK293T 条件培养液组 *P<0.05 1: HEK293T/3GF-conditioned medium group; 2: HEK293T-conditioned medium group. *P<0.05. 图 6 CCK-8 检测 A549 细胞增殖 Fig.6 Proliferation of A549 cells by CCK-8 assay 子及其受体的表达在内耳胚胎发育过程中, 三种生长因子与其表面受体结合, 促进内耳细胞有丝分裂, 诱导特定的细胞表型, 参与内耳的发生发展 Li 等 [9] 研究发现, 胚胎干细胞在添加有三种因子的培养基生长一段时间后, 可表达毛细胞标志物, 并且可整合到发育的鸡胚胎内耳中, 分化成为毛细胞样细胞 EGF 是由 53 个氨基酸残基组成的单链多肽, 能够有效促进内耳感觉上皮细胞分裂增殖和分化研究证明, EGF 和 TGFβ1 可诱导新生耳蜗产生额外的毛细胞 [23] Doetzlhofer 等 [18] 发现, 在 EGF 和耳周间质细胞共同作用下, 内耳前体细胞被诱导分化成为成熟的内耳毛细胞, 若无 EGF, 内耳毛细胞则不能生成 FGF2 是一种促有丝分裂的肝素结合蛋白, 可诱导多种细胞增殖和分化, 在神经系统早期发育中起重要作用 FGF2 和 IGF1 可以促进内耳支持细胞的增殖, 而支持细胞是再生毛细胞的一种重要的内源性细胞椭圆囊中的毛细胞还可产生 FGF2, FGF2 是毛细胞生长维持和再生的一种生理性生长因子 [25] Low 等 [26] 发现, FGF2 可以保护内耳感觉细胞, 使内耳细胞免受氨基糖苷类药物的损害 IGF1 是一种在分子结构上与胰岛素类似的多肽蛋白物质, 也是内耳一种强大的促有丝分裂原, 通过诱导 DNA 合成, 刺激有丝分裂, 从而促进听泡和耳蜗前庭螺旋神经元的生长 [27-28] 在 IGF1 基因敲除的小鼠中, 其耳蜗及

8 1504 研究论文耳蜗螺旋神经元的体积均缩小, 盖膜形态发生改变, 听觉神经元的大小和数量均明显减少, IGF1 对于耳 [29] 蜗的成熟和分化是必不可少的研究表明, 干细胞在向内耳样细胞分化过程中, 三种生长因子发挥着重要的作用, 但是, 由于培养过程中细胞对生长因子的持续消耗, 人为地添加因子不够稳定, 加之因子价格昂贵, 因此, 我们可通过构建稳定感染的工程细胞, 使其持续稳定地分泌三种因子, 再与干细胞共培养, 通过因子作用使干细胞向内耳样细胞诱导分化在真核细胞中, 目的基因表达主要受到转录翻译两个水平的调控慢病毒表达载体 plvx- IRES-ZsGreen1 含有强大的 CMV 启动子, 可以有力启动基因转录, 但如何进一步提高翻译效率显得更加重要真核生物蛋白翻译过程中, 起始密码子周边序列 (Kozak 序列 ) 起到重要作用 Kozak 序列是位于真核生物 mrna 5 端帽子结构后面的一段核酸序列, 如为 GCC ACC ATG G 时, 转录和翻译效率最高, 其中, 3A/G +4G 的作用尤为关键核糖体可识别这段序列, 并借助它搜寻第一个起始密码子起始翻译 Kozak 对胰岛素前体蛋白的基因点突变实验证实了在起始密码子前面的 Kozak 序列能够提高基 [30] 因的表达水平我们在每段目的基因前都添加了 Kozak 序列以此增强外源基因的表达生长因子表达后需要分泌到细胞外才能发挥作用, 而 Igκ 信号肽有较好的促进蛋白分泌作用周 [31] 淑萍等用三种不同的信号肽引导蛋白分泌, 发现只有来自小鼠 Igκ 链的信号肽能够高效引导 HPO 蛋白从细胞中分泌出来因此, 我们将 Igκ 信号肽序列与三种生长因子基因序列构成融合基因, 构建高效分泌型生长因子真核表达载体真核生物大多数蛋白质合成采用了依赖帽子结构的翻译起始方式但微小 RNA 没有帽子位点, 其蛋白质合成起始是依赖其 5 端非翻译区一段较短的 RNA 序列, 这类 RNA 序列能折叠成类似于起始 trna 的结构, 介导核糖体与 RNA 结合, 起始蛋白质翻译, 这段非翻译 RNA 被称为内部核糖体进入位点序列 (IRES) 将 IRES 与外源 cdna 融合, 发现 IRES 能独立地起始翻译利用这一特性, IRES 目前已被广泛应用于多元表达载体的构建, 由其连接的多个基因的表达率相同, 而翻译出来蛋白各具独立的空间结构和生理活性, 而不是融合蛋白 IGF1 EGF 和 FGF2 三种生长因子对于干细胞向内耳细胞的诱导分化具有重要的作用, 为了使三种生长因子同时作用于干细胞并且分泌到胞外发挥作用, 我们设计构建了一种能同时表达三种生长因子的慢病毒载体, 并感染 HEK293T 细胞构建成稳转细胞本研究将三个目的片段通过 IRES 连接以使其同时表达, 并在每个片段前添加 Igκ 信号肽引导蛋白分泌, 由慢病毒载体导入到 HEK293T 细胞中, Western blot 结果显示, IGF1 EGF 和 FGF2 在 HEK293T 细胞中成功表达为了进一步验证这些因子是否分泌到胞外, 我们选取了人肺癌 A549 细胞, 此细胞对三种生长因子都较为敏感, 在加入了 HEK293T/3GF 细胞条件培养液后, 与对照组相比生长明显增快, 说明我们构建的稳转细胞分泌的生长因子确实具有活性且能促进 A549 细胞的生长, 进一步说明慢病毒表达载体构建成功, 为后面选择更加合适的工程细胞与干细胞共培养打下了基础这样, 我们就获得了同时稳定表达三种生长因子慢病毒表达载体及稳定转染的 HEK293T/3GF 细胞, 能够持续稳定分泌三种生长因子, 与人工添加生长因子相比更加持久稳定, 并且不需要反复添加因子, 节省了人力物力在本工作基础上将可以根据研究选择合适的细胞以建立相应的工程细胞, 利用 ELISA 方法定量检测分泌的生长因子的水平, 利用因子受体结合实验和受体激酶活性检测分泌的生长因子的生物学活性, 从而筛选出可稳定分泌不同量的活化型生长因子的细胞用于不同需求的研究本研究为后续的工程细胞与干细胞共培养进而向内耳细胞的诱导分化工作奠定了基础, 同时也为需要持续性添加多种其他种类的外源活化型因子的研究提供了思路参考文献 (References) 1 Corwin JT, Cotanche DA. Regeneration of sensory hair cells after acoustic tmuma. Science 1988; 240(4860): Stone JS, Cotanche DA. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. Int J Dev Biol 2007; 51(6/7): Laflamme MA, Murry CE. Heart regeneration. Nature 2011; 473(7347): Leong KG, Wang BE, Johnson L, Gao WQ. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature 2008; 456(7223): Horner PJ, Gage FH. Regenerating the damaged central nervous system. Nature 2000; 407(6807): Saffer LD, Gu R, Corwin JT. An RT-PCR analysis of mrna for growth factor receptors in damaged and control sensory epithelia of rat utricles. Hear Res 1996; 94(1/2): Malgrange B, Rogister B, Lefebvre PP, Mazg-Servais C, Welcher

9 郑丹丹等 : 同时表达活化型 IGF1 EGF 和 FGF2 的慢病毒载体的构建 1505 AA, Bonnet C, et al. Expression of growth factors and their receptors in the postnatal rat cochlea. Neurochem Res 1998; 23(8): Pickles JO, van Heumen WR. The expression of messenger RNAs coding for growth factors, their receptors, and eph-class receptor tyrosine kinases in normal and ototoxically damaged chick cochlea. Dev Neurosci 1997; 19(6): Li H, Roblin G, Liu H, Heller S. Generation of hair cells by stepwise differentiation of embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100(23): Chen W, Johnson SL, Marcotti W, Andrews PW, Moore HD, Rivolta MN. Human fetal auditory stem cells can be expanded in vitro and differentiate into functional auditory neurons and hair cell-like cells. Stem Cells 2009; 27(5): Chen W, Jongkamonwiwat N, Abbas L, Eshtan SJ, Johnson SL, Kuhn S, et al. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors. Nature 2012; 490(7419): Doyle KL, Kazda A, Hort Y, McKay SM, Oleskevich S. Differentiation of adult mouse olfactory precursor cells into hair cells in vitro. Stem Cells 2007; 25(3): Lin Z, Perez P, Sun Z, Liu JJ, Shin JH, Hyrc KL, et al. Reprogramming of single-cell-derived mesenchymal stem cells into hair cell-like cells. Otol Neurotol 2012; 33(9): Coleman B, Fallon JB, Pettingill LN, de Silva MG, Shepherd RK. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Exp Cell Res 2007; 313(2): 贾振宇, 伏晓敏, 金爱华, 曹江. 人 Leptin 基因的 cdna 的克隆和表达. 生物工程学报 (Jia Zhenyu, Fu Xiaomin, Jin Aihua, Cao Jiang. cdna cloning of human leptin and its expression. Chinese Journal of Biotechnology) 2003; 19(4): Oshima K, Shin K, Diensthuber M, Peng AW, Ricci AJ, Heller S. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell 2010; 141(4): Koehler KR1, Mikosz AM, Molosh AI, Patel D, Hashino E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature 2013; 500(7461): Jeon SJ, Oshima K, Heller S, Edge AS. Bone marrow mesenchymal stem cells are progenitors in vitro for inner ear hair cells. Mol Cell Neurosci 2007; 34(1): Boddy SL, Chen W, Romero-Guevara R, Kottam L, Bellantuono I, Rivolta MN. Inner ear progenitor cells can be generated in vitro from human bone marrow mesenchymal stem cells. Regen Med 2012; 7(6): Durán Alonso MB, Feijoo-Redondo A, Conde de Felipe M, Carnicero E, García AS, García-Sancho J, et al. Generation of inner ear sensory cells from bone marrow-derived human mesenchymal stem cells. Regen Med 2012; 7(6): Iguchi F, Nakagawa T, Tateya I, Kim TS, Endo T, Taniguchi Z, et al. Trophic support of mouse inner ear by neural stem cell transplantation. Neuroreport 2003; 14(1): Pandit SR, Sullivan JM, Egger V, Borecki AA, Oleskevich S. Functional effects of adult human olfactory stem cells on earlyonset sensorineural hearing loss. Stem Cells 2011; 29(4): Chardin S, Romand R. Factors modulating supernumerary hair cell production in the postnatal rat cochlea in vitro. Int J Dev Neurosci 1997; 15(4/5): Doetzlhofer A, White PM, Johnson JE, Segil N, Groves AK. In vitro growth and differentiation of mammaiian sensory hair cell progenitors: A requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol 2004; 272(2): Zheng JL, Helbig C, Gao WQ. Induction of cell proliferation by fibroblast and insulin-like growth factors in pure rat inner ear epithelial cell cultures. J Neurosci 1997; 17(1): Low W, Dazert S, Baird A, Ryan AF. Basic fibroblast growth factor (FGF-2) protects rat cochlear hair cells in organotypical culture from aminoglycoside injury. J Cell Physiol 1996; 167(3): León Y, Vazquez E, Sanz C, Vega JA, Mato JM, Giraldez F, et al. Insulin-like growth factor-i regulates cell proliferation in the developing inner ear, activating glycosyl-phosphatidylinositol hydrolysis and Fos expression. Endocrinology 1995; 136(8): Oesterle EC, Tsue TT, Rubel EW. Induction of cell proliferation in avian inner ear sensory epithelia by insulin-like growth factor-i and insulin. J Comp Neurol 1997; 380(2): Camarero G, Avendano C, Fernandez-Moreno C, Villar A, Contreras J, de Pablo F, et al. Delayed inner ear maturation and neuronal loss in postnatal Igf-1-deficient mice. J Neurosci 2001; 21(19): Kozak M. Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell 1986; 44(2): 周淑萍, 王清明, 吴祖泽. 有效引导肝细胞生成素分泌的外源信号肽的确定. 中国病理生理杂志 (Zhou Shuping, Wang Qingming, Wu Zuze. Selection of the exogenous signal peptide that conducts the secretion of Hevatopoietin. Chinese Journal of Pathophysiology) 2008; 24(7):

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分子生物学实验专题手册.ai >> 2002 Piscataway CRO OptimumGene TM CloneEZ ONE-HOUR Western TM THE TM Epitope Tag 36 36 39 40 41 41 41 45........................ 47 47 47 47 48............... 19 19 20 21 22............... 23 23 24