中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2014, 36(1): 5 11 DOI: /cjcb 特约综述本实验室对体外培养的胚胎干细胞和体内的着床前胚胎进行研究, 以加深对维持和建立多能性 (pluripote

Size: px

Start display at page:

Download "中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2014, 36(1): 5 11 DOI: /cjcb 特约综述本实验室对体外培养的胚胎干细胞和体内的着床前胚胎进行研究, 以加深对维持和建立多能性 (pluripote"

印邬
4 years ago
Views:

1 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2014, 36(1): 5 11 DOI: /cjcb 特约综述本实验室对体外培养的胚胎干细胞和体内的着床前胚胎进行研究, 以加深对维持和建立多能性 (pluripotency) 分子机制的理解, 进而改进现有的建立和维持多能性干细胞的方法主要研究方向包括 : (1) 小鼠胚胎干细胞维持多能性的分子机制 ; (2) 小鼠胚胎早期发育中调控发育潜能和细胞命运决定的机制 DNA 剪刀 TALEN 和 CRISPR/Cas 倪培凌刘畅陈凌懿 * ( 南开大学生命科学学院, 生物活性材料教育部重点实验室, 天津 ) 摘要对基因组中特定位点进行修饰的实验手段称为基因组编辑它在研究基因的功能和基因修复以及细胞替代治疗上有广泛的应用前景该文将回顾基因组编辑技术的最新进展和应用, 着重介绍两种最新出现的序列特异核酸酶 TALEN 和 CRISPR/Cas 在基因组编辑技术中的应用关键词基因组编辑 ; TALEN; CRISPR/Cas DNA Scissors TALEN and CRISPR/Cas Ni Peiling, Liu Chang, Chen Lingyi* (College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin , China) Abstract Genome editing refers to the experimental technique which could modify the DNA sequence at a certain region in the genome. It has important application value in studying the function of genes, as well as gene correction and cell replacement therapy. In this paper, we summarize the recent progress and application of genome editing technology, with emphasis on two sequence-specific nucleases TALEN and CRISPR/Cas. Key words Genome editing; TALEN; CRISPR/Cas 研究基因生物学功能的主要手段是通过对其进行修饰以影响其功能, 这些修饰包括基因敲除突变或过表达传统的正向遗传学, 通过化学诱变或转座子介导的突变来研究基因功能, 但是这些筛国家自然科学基金 ( 批准号 : ) 国家重点基础研究发展计划( 批准号 : 2010CB833603) 教育部 2013 新世纪优秀人才支持计划和国家基础学科人才培养基金 ( 批准号 : J ) 资助的课题 * 通讯作者 Tel: , lingyichen@nankai.edu.cn This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No ), the National Key Basic Research and Development Program of China (Grant No.2010CB833603), the Program for New Century Excellent Talents and the Funds for National Basic Science Personnel Training (Grant No.J ) *Corresponding author. Tel: , lingyichen@nankai.edu.cn 网络出版时间 : :35 URL:

2 6 特约综述选最主要的限制因素就是不能进行特定位置的修饰而同源重组介导的基因敲除或敲入, 虽然可以准确地对特定基因进行修饰, 但其操作步骤多, 且效率偏低, 在应用上有一定的局限性因此, 遗传学家们一直期待一种可高效地编辑任何基因序列的实验手段基因组编辑 (genome editing) 近几年来, 基因组编辑的实验技术得到了快速的发展我们将在此综述中总结基因组编辑技术的最新进展及其应用, 着重介绍转录激活子样效应因子核酸酶 (transcription activator-like effector nuclease, TALEN) 和 CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/crispr-associated pro tein) 这两种技术现在的基因组编辑技术主要依赖于一些识别特定序列的核酸酶在 DNA 上切割, 产生双链 DNA 断点, 然后通过非同源末端连接机制 (non-homologous end joining, NHEJ) 或同源重组机制 (homologous recombination) 来修复 DNA 断点, 与此同时, 对 DNA 断点附近的序列进行编辑 ( 图 1) 非同源末端连接修复机制可以将断裂的双链末端直接连接起来, 在修复的过程中容易出现插入或缺失突变 : 如果造成移码突变, 则会使基因的功能遭到破坏, 从而实现基因的敲除 ; 如果删除或插入的 DNA 片段的碱基数正好是 3 的整数倍, 则在蛋白水平上导致氨基酸残基的缺失或增加, 也可能对蛋白的功能有影响双链 DNA 断点产生后, 若同时引入模板 DNA 序列, 通过同源重组的作用, 可以根据所设计的模版, 插入特定的一段序列 (knock in) 删除特定的序列(knock out) 或突变特定的碱基或序列引入的模版序列可以是单链 DNA, 也可以是带有长的同源臂的双链 DNA 同源重组修复机制和传统意义上的同源重组介导的基因敲除和敲入没有本质的区别, 但是因为双链 DNA 断点的存在, 可大大提高在 DNA 断点处同源重组的概率, 从而保证了基因组编辑的效率同源重组修复机制发生的概率要比非同源末端连接修复机制低, 但由于该机制在修复的过程中有同源链作为模板, 因此可以实现精确的突变目前, 已成功应用于基因组编辑技术的序列特异性的核酸酶包括锌指核酸酶 (zinc-finger nuclease, ZFN) TALEN 和 CRISPR/Cas 锌指核酸酶技术利用一个锌指结构域可识别三个 DNA 碱基的原理来设计, 可以对基因组上特定位点进行精确的修饰, 但因为锌指结构域识别 DNA 的特异性不高, 导致其成功率低, 需要构建多个 ZFNs, 并从中筛选特异性和切割效率均高的 ZFNs [1-2] 所以, 随着 TALEN 和 CRISPR/Cas 技术的出现, 更多的科学家选择了 TALEN 和 CRISPR/Cas 来进行基因组编辑 1 转录激活子样效应因子核酸酶 (transcription activator-like effector nuclease, TALEN) 转录激活子样效应因子 (transcription activatorlike effector, TALE) 最初是在植物致病菌黄单胞杆菌属 (Xanthomonas) 中发现的这类植物致病菌通过 Ⅲ 型分泌系统将 TALE 蛋白注射到植物细胞质中, 然后 TALE 被转运到细胞核中, 模拟真核细胞的转录因子指导宿主细胞基因转录 [3-5] TALE 的结构包括几个重要功能部分 : 核定位信号和 C- 端的酸性激活区, 位于中间的结合 DNA 的串联重复区域 [6-7] 中间的 DNA 结合区域由一系列数目可变的可重复单元构在序列特异核酸酶 ( 包括 ZFN TALEN 或 CRISPR/Cas) 的作用下, 在特定位点上造成双链 DNA 断点, 然后此断点通过非同源末端连接或者通过同源重组进行修复不正确的非同源末端连接修复后在基因组 DNA 可导致插入或删除突变, 但插入或删除的 DNA 大小不可控 ; 同源重组介导的修复需要供体同源模板 DNA( 可以是双链或单链 DNA), 根据不同的模板进行修复可导致与模板 DNA 一致的插入或点突变 DSB: 双链 DNA 断点 ; NHEJ: 非同源末端连接 ; HDR: 同源重组介导的修复 ; Indel: 插入或删除 Double strand break (DSB) is generated by sequence-specific nucleases, including ZFNs, TALENs and CRISPR/Cas. Subsequently, DSB is repaired either through non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed recombination (HDR). Imperfect NHEJ repair leads to insert or delete (indel) at the DSB site. HDR requires homologous DNA donor, and the insertion or point mutation introduced to the DSB site is identical to donor DNA. DSB: double strand break; NHEJ: nonhomologous end joining; HDR: homology directed repair; Indel: insert or delete. 图 1 现有基因组编辑技术的基本原理 Fig.1 The mechanism of current genome editing technology

3 倪培凌等 : DNA 剪刀 TALEN 和 CRISPR/Cas 7 成, 天然 TALE 的可重复单元数目一般为 8.5~28.5 个, 常见的为 17.5 个 [7-8] 每个重复单元包括 33~35 个氨基酸, 特异识别一种碱基在这 33~35 个氨基酸中, 位于第 12 和第 13 位的两个相邻的氨基酸决定了这个重复单元所特异识别的碱基, 这两个氨基酸被称为重复可变双残基 (repeat variable di-residue, RVD) [9], 这两个氨基酸决定了每个重复单元所识别的 DNA 碱基, 例如 : HD 识别 C NI 识别 A NG 识别 T NN 识别 A 或 G [7,10] 基于每个重复单元对应一个碱基, 可将不同的重复单元串联起来, 通常为 14~20 个重复单元, 使之识别特定的 DNA 序列然后在 N- 端加上核定位信号, 并在 C- 端融合上 Fork I 核酸内切酶的切割区, 就构建成了 TALE 核酸酶 (TALE nuclease, TALEN)( 图 2A) 由于 Fork I 需要形成二聚体发挥切割作用, 因此需要一对 TALEN 共同起作用两个 TALEN 识别的 DNA 位点之间的 DNA 序列片段称为 spacer, 一般为 14~18 bp [8] 两个 TALEN 结合到各自的 DNA 序列上, 此时, 两个 TALEN 中 Fork I 核酸内切酶结构域可在 spacer 处形成二聚体, 将 DNA 进行切割, 形成双链 DNA 断点 ( 图 2B) [11] 而 TALEN 切割位点的特异性由两个 TALEN 的识别序列共同决定如每个 TALEN 识别 16 个碱基的 DNA 序列, 那么 TALEN 的切割点的特异性就由 32 个碱基长度的 DNA 序列决定因此, TALEN 切割 DNA 的特异性高, 这在许多实验中也得到了证实 [12-13] Fork I A: TALEN 的重要功能区包括氮端的核定位信号 (NLS), 中部重复区和碳端的 Fork I 酶催化区 ; B: 两个 TALEN 结合到双链 DNA 相近的两个位点上, 此时, Fork I 酶催化区形成二聚体并切割双链 DNA A: a TALEN is composed of three important functional regions, a nuclear localization signal (NLS) at the N-terminus, a central repeat domain and a Fork I catalytic domain at the C-terminus; B: two TALENs bind to two neighboring DNA sites allowing Fork I domains to dimerize and cleave DNA. 图 2 TALEN 的结构和作用机制 Fig.2 The structure and mechanism of TALEN 相比 ZFN 技术, TALEN 的 DNA 识别序列由串联的重复单元决定, 一个重复单元对应一个碱基, 因此, TALEN 的设计思路简单, 而且靶向更长的 DNA 序列以保证切割位点的特异性 [14-15] 因此, TALEN 技术出现后很快被众多实验室采用 2 CRISPR/Cas 系统 CRISPR/Cas 技术是最近兴起的一项基因编辑技术 CRISPR 的全称为成簇的规律间隔的短回文重复序列 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 早在 1987 年, 科学家就已经发现在细菌中存在 CRISPR 序列, 但该序列一开始并没有引起人们足够的重视随着研究的深入, 科学家已经在许多细菌和古生菌中发现了 CRISPR 序列和 CRISPR 相关 (Cas) 基因 CRISPR/Cas 系统是细菌和古细菌中的一种免疫保护机制, 该系统可以介导外源 DNA 的降解, 从而抵御病毒等外来入侵者 [16-17] 目前, 已发现了三种类型的 CRISPR/Cas 系统每种 CRISPR-Cas 系统均包含具有核酸酶活性的 CRISPR 相关 (Cas) 基因和决定切割位点特异性的非编码 RNA [18-21] II 型 CRISPR/Cas 系统在发挥功能时仅需要一种蛋白, 即 Cas9 核酸酶参与 ; 而 I III 型 CRISPR/Cas 系统则需要多种蛋白形成复合物才能行使功能 [20] 因此, II 型 CRISPR/Cas 系统比其他两种 CRISPR 系统更为简便, 因此最适合在基因组编辑中应用现在基因组编辑中 CRISPR/Cas 技术也主要是应用 Cas9 系统 Cas9 核酸酶复合体由 Cas9 蛋白和两个非编码的 RNA-crRNA 前体 (precursor CRISPR RNA, pre-crrna) 和 trans-activating crrna (tracrrna) 组成在酿脓链球菌 (Streptococcus pyogenes) 中, pre-crrna 和 tracrrna 均由 CRISPR 位点上转录而来, 然后 pre-crrna 通过其含有的重复序列 (direct repeat) 和 tracrrna 形成 RNA 异二聚体, 并结合到 Cas9 蛋白上, Cas9 蛋白再对 pre-crrna 进行剪切以获得成熟的 crrna, 成熟的 crrna 上长度为 20 个碱基的向导序列 (guide sequence) 通过与目的 DNA 的序列互补来引导整个 Cas9 复合体去切割目的 DNA( 图 3A) 除了成熟的 crrna 上的向导序列外, 在向导序列的 3 端, Cas9 识别的 DNA 位点还必须有一个 PAM(protospacer adjacent motif) 区域在酿脓链球菌的 CRISPR 系统里, 紧跟于靶序列后的 PAM 序列是 5 -NGG [22] 而 Cas9 识别位点的特异性就由

8 特约综述 20 个碱基的向导序列和 3 个碱基的 PAM 序列共同决定这样的 CRISPR/Cas 系统应用于基因组编辑时, 就需要表达 Cas9 蛋白 pre-crrna 和 tracrrna 三个组分 [23] 研究发现, 将 pre-crrna 和 tracrrna 构建成一个融合 RNA(single-guide RNA, sgrna) 来模拟成熟的 crrna 和

4 8 特约综述 20 个碱基的向导序列和 3 个碱基的 PAM 序列共同决定这样的 CRISPR/Cas 系统应用于基因组编辑时, 就需要表达 Cas9 蛋白 pre-crrna 和 tracrrna 三个组分 [23] 研究发现, 将 pre-crrna 和 tracrrna 构建成一个融合 RNA(single-guide RNA, sgrna) 来模拟成熟的 crrna 和 tracrrna, 同样可以与 Cas9 共同作用特异地切割目的 DNA, 从而将 CRISPR/Cas 系统简化成 Cas9 蛋白和 sgrna 两个组分 ( 图 3B) [22,24] 此外, 我们实验室应用 Cas9 系统时发现, 在大多情况下, Cas9 蛋白和 sgrna 两个组分切割 DNA 的效率比 Cas9 蛋白 pre-crrna 和 tracrrna 三个组分的效率高 3 TALEN 和 CRISPR/Cas 的比较 TALEN 和 CRISPR/Cas 技术从设计原理上都很简单, 易于推广 TALEN 技术是根据一个重复单元对应一种碱基, 将多个重复单元串联在一起来决定识别序列的特异性而 CRISPR/Cas 技术则依赖于 crrna 或 sgrna 上 20 个碱基的向导序列与目的 DNA 的互补, 以及紧跟于靶序列后的 PAM 序列来决定切割位点的特异性整体来说, CRISPR/Cas 切割 DNA 的效率要高于 TALEN [23,25] 所以, 利用 CRISPR/Cas 系统的高效切割, 可同时对基因组的多个位点进行切割和修饰, 甚至用一次注射多个 sgrna 和模板 [26-28] DNA 获得条件敲除的小鼠从 TALEN 或 Cas9 的质粒构建上来看, CRISPR/ Cas 系统也相对简单 TALEN 技术中需要将多个重复单元通过分子克隆或是以固相为基础的 TALE 重 [12,14-15,29-31] 复组装方法串联起来 ; 而 CRISPR/Cas 系统中只需改变 sgrna 或 crrna 中 20 或 30 个碱基的向导 [23-24] 序列即可, 一步简单的分子克隆实验就可完成因为 sgrna 的长度仅仅为约 100 个碱基, 通过化学合成的方法也可获得但是, 从切割位点的特异性来说, TALEN 要比 CRISPR/Cas 系统更好 TALEN 切割位点的特异性由两个 TALEN 的识别序列共同决定如每个 TALEN 识别 16 个碱基的 DNA 序列, 那么 TALEN 的切割点的特异性就由 32 个碱基长度的 DNA 序列决定, 即在 4 32 ( ) 个碱基长度的随机 DNA 序列中才会发现一个 TALEN 切割位点而 CRISPR/Cas 的特异性取决于 20 个碱基的向导序列和 PAM 序列 ( 如 Cas9 的 5 -NGG), 那么在 4 22 ( ) 个碱基长度的随机 DNA 序列中就会发现一个 Cas9 的切割位点此 (A) Mature Guide sequence (B) PAM sgrna Guide sequence A: crrna 与 tracrrna 形成复合物介导 Cas9 蛋白切割目的 DNA 示意图 ; B: sgrna 介导 Cas9 蛋白切割目的 DNA 示意图 Cas9 复合体通过向导序列 (guide sequence, 图中用红色标注 ) 与 DNA 靶位点 ( 蓝色标注 ) 结合, 而且靶序列下游必须为 PAM 区域 ( 黄色标注 ) A: schematic illustration of the crrna: tracrrna complex-guided Cas9 nuclease; B: schematic illustration of the sgrna-guided Cas9 nuclease. The Cas9 complex recognizes its DNA target through the pairing between the guide sequence (marked with red) and the target DNA sequence (marked with blue) upstream of a PAM (marked with yellow). 图 3 RNA 介导 Cas9 蛋白切割目的 DNA 示意图 Fig.3 Schematic illustration of RNA-guided Cas9 nuclease

5 倪培凌等 : DNA 剪刀 TALEN 和 CRISPR/Cas 9 外, CRISPR/Cas 向导序列 5 端的若干个碱基与识别位点的互补的要求不严格, 突变向导序列 5 端的 1~3 个碱基只是降低了 Cas9 的切割效率, 并不完全阻止 Cas9 对错配 DNA 的切割 [23,28] 尽管 Cas9 切割位点还要求 PAM 序列 5 -NGG, 但 Cas9 仍能以一定的效率识别并切割序列为 5 -NAG 的 PAM 序列, 进一步降低了 Cas9 的特异性 [32] 即使 CRISPR/Cas 技术的特异性稍低, 但在对 CRISPR/Cas 介导获得的基因修饰小鼠和胚胎干细胞进行 DNA 序列分析后, 也只是发现少量的脱靶现象, 而且脱靶的位点主要是只含有 1~2 个错配碱基, 且错配碱基靠近 sgrna 识别位点 5 端 [28] 这样, 我们在选择 CRISPR/Cas 切割位点时, 可对全基因组序列进行全面的分析, 以降低脱靶的概率为了进一步提高 CRISPR/Cas 系统的特异性, 可通过对 Cas9 蛋白的突变来调控 Cas9 蛋白的核酸酶活性 Cas9 蛋白含有 HNH 和 RuvC 两个带核酸酶活性的结构域, 切割 DNA 时, HNH 结构域切割与 crrna 向导序列互补的 DNA 单链, 而 RuvC 结构域则剪切非互补 DNA 单链, 从而形成双链 DNA 断点 [22] 如果将 RuvC 结构域中一个天冬氨酸突变为丙氨酸 (D10A), 则可以使 RuvC 结构域失去核酸酶活性, 导致突变的 Cas9 蛋白 (Cas9n) 只能在双链 DNA 上产生单链缺口 (nick) 这样, Cas9 的内切酶活性就变为 Cas9n 的切口酶活性 (nickase) 为了在 DNA 上切割产生双链 DNA 断点, 就需要用 Cas9n 和一对 sgrna 分别在双链 DNA 的每条单链上切出单链缺口而只被一个 Cas9n 切割产生的单链缺口会被高保真性的碱基切除修复途径 (base excision repair, BER) 修复, 不会在基因组 DNA 上造成突变这时, 双链 DNA 断点的特异性就由两个 sgrna 的识别位点共同决定, 即在 ( ) 个碱基长度的随机 DNA 序列中才会发现一个同时被两个 Cas9n 切割的位点因此, 通过用两个 Cas9n 产生两个单链 DNA 缺口以造成双链 DNA 断点的策略, 可有效地提高 CRISPR/Cas 系统的特异性, 而且此方法并不降低双链 DNA 断点产生的效率 [33] 4 TALEN 和 CRISPR/Cas 的应用及前景 TALEN 和 CRISPR/Cas 都能有效地切割 DNA 以产生双链 DNA 断点, 是基因组编辑中可利用的有效工具, 改变了传统的基因敲除和敲入动物的构建方法传统的基因敲除和敲入需要在胚胎干细胞上完成基因组 DNA 的遗传修饰, 然后将修饰后的胚胎干细胞注射到囊胚中获得嵌合体后代, 再通过生殖系转移才能获得基因敲除或敲入动物这样的操作耗时长, 且成功率低而应用 TALEN 和 CRISPR/Cas, 可将编码 TALEN 的 mrna, 或将编码 Cas9 的 mrna 和 sgrna, 注射入受精卵中 TALEN 和 CRISPR/Cas 切割产生的双链 DNA 断点, 如果通过 NHEJ 修复, 造成移码突变, 可导致基因功能的丧失, 则造成基因敲除 ; 在 TALEN 和 CRISPR/Cas 切割 DNA 的同时, 提供单链或双链的模板 DNA, 可通过同源重组修复断点以引入特定的突变或者是插入 DNA 片段利用 TALEN 或 CRISPR/Cas, 已经获得了基因敲除或敲入的大鼠小鼠斑马鱼家畜果蝇水稻小麦 [14,26-28,34-46] 烟草和拟南芥等因为 CRISPR/Cas 的高切割效率, CRISPR/Cas 技术可同步一次性地敲除两 [26-27] 个甚至多个基因更重要的是, CRISPR/Cas 系统可同时对两个位点切割, 然后在单链 DNA 模板的介导下进行同源重组, 在两个位点同时引入 LoxP 序列, 从而构建条件性敲除的位点, 这就大大缩短了构 [28] 建条件性敲除转基因动物的时间 TALEN 和 CRISPR/Cas 介导的基因敲除和敲入在细胞水平上也可实现, 不仅可促进基因功能的研究, 还可应用于疾病模型的建立和细胞替代治 [47] 疗在构建疾病模型上, Piganeau 等利用 TALEN 技术将细胞的两条染色上特定位置切断并重新结合, 模拟间发性大细胞淋巴癌 (anaplastic large cell lymphoma, ALCL) 相关的染色体易位在疾病治疗方面, 将病人来源的 ips 细胞中致病突变通过 TALEN 技术进行修正, 为诸如镰刀形红细胞贫血症和地中海贫血症这样的血液疾病的细胞替代治疗提供了可 [48-49] 能隐性营养不良性大疱性表皮松解(recessive dystrophic epidermolysis bullosa, RDEB) 是由 COL7A1 基因缺陷导致的, 通过 TALEN 介导的病人特异基因 [50] 突变的原位修正, 将可能治疗这种疾病除了基因组 DNA, TALEN 技术还可以消除突变的异常线 [51] 粒体, 治疗线粒体基因突变导致的疾病总之, TALEN 和 CRISPR/Cas 技术的出现, 大大提高了科学家对基因组序列进行修饰和编辑的能力, 这将推动对基因功能的研究, 也将促进细胞替代治疗的应用而作为两个新兴的基因组编辑的技术, TALEN 和 CRISPR/Cas 技术还处在不断发展的阶段,

6 10 特约综述技术的完善和优化, 将克服现有的一些缺点, 例如 CRISPR/Cas 技术的脱靶效应, 进一步提高 DNA 切割的效率, 使得 TALEN 和 CRISPR/Cas 技术有更广阔的应用除了改进切割 DNA 的核酸酶的效率和特异性外, 如何更好地激活细胞自身的同源重组活性, 进一步提高同源重组介导的基因组编辑效率, 也是基因组编辑技术发展中有待解决的问题参考文献 (References) 1 Collin J, Lako M. Concise review: Putting a finger on stem cell biology: Zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human pluripotent stem cells. Stem Cells 2011; 29(7): Urnov FD, Miller JC, Lee YL, Beausejour CM, Rock JM, Augustus S, et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature 2005; 435(7042): Kay S, Hahn S, Marois E, Hause G, Bonas U. A bacterial effector acts as a plant transcription factor and induces a cell size regulator. Science 2007; 318(5850): Romer P, Hahn S, Jordan T, Strauss T, Bonas U, Lahaye T. Plant pathogen recognition mediated by promoter activation of the pepper Bs3 resistance gene. Science 2007; 318(5850): Kay S, Bonas U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr Opin Microbiol 2009; 12(1): Gurlebeck D, Thieme F, Bonas U. Type III effector proteins from the plant pathogen Xanthomonas and their role in the interaction with the host plant. J Plant Physiol 2006; 163(3): Boch J, Scholze H, Schornack S, Landgraf A, Hahn S, Kay S, et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science 2009; 326(5959): Miller JC, Tan S, Qiao G, Barlow KA, Wang J, Xia DF, et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol 2010; 29(2): Boch J, Bonas U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: Discovery and function. Annu Rev Phytopathol 2010; 48: Moscou MJ, Bogdanove AJ. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science 2009; 326(5959): Smith J, Bibikova M, Whitby FG, Reddy AR, Chandrasegaran S, Carroll D. Requirements for double-strand cleavage by chimeric restriction enzymes with zinc finger DNA-recognition domains. Nucleic Acids Res 2000; 28(17): Huang P, Xiao A, Zhou M, Zhu Z, Lin S, Zhang B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol 2011; 29(8): Ding Q, Lee YK, Schaefer EA, Peters DT, Veres A, Kim K, et al. A TALEN genome-editing system for generating human stem cell-based disease models. Cell Stem Cell 2013; 12(2): Sander JD, Cade L, Khayter C, Reyon D, Peterson RT, Joung JK, et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol 2011; 29(8): Cermak T, Doyle EL, Christian M, Wang L, Zhang Y, Schmidt C, et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res 2011; 39(12): e Wiedenheft B, Sternberg SH, Doudna JA. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature 2012; 482(7385): Terns MP, Terns RM. CRISPR-based adaptive immune systems. Curr Opin Microbiol 2011; 14(3): Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science 2007; 315(5819): Brouns SJ, Jore MM, Lundgren M, Westra ER, Slijkhuis RJ, Snijders AP, et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science 2008; 321(5891): Makarova KS, Haft DH, Barrangou R, Brouns SJ, Charpentier E, Horvath P, et al. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol 2011; 9(6): Marraffini LA, Sontheimer EJ. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science 2008; 322(5909): Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-rna-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 2012; 337(6096): Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 2013; 339(6121): Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 2013; 339(6121): Ding Q, Regan SN, Xia Y, Oostrom LA, Cowan CA, Musunuru K. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell 2013; 12(4): Li W, Teng F, Li T, Zhou Q. Simultaneous generation and germline transmission of multiple gene mutations in rat using CRISPR-Cas systems. Nat Biotechnol 2013; 31(8): Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-Mediated genome engineering. Cell 2013; 153(4): Yang H, Wang H, Shivalila CS, Cheng AW, Shi L, Jaenisch R. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 2013; 154(6): Sakuma T, Hosoi S, Woltjen K, Suzuki K, Kashiwagi K, Wada H, et al. Efficient TALEN construction and evaluation methods for human cell and animal applications. Genes Cells 2013; 18(4): Reyon D, Tsai SQ, Khayter C, Foden JA, Sander JD, Joung JK. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nat Biotechnol 2012; 30(5): Kim Y, Kweon J, Kim A, Chon JK, Yoo JY, Kim HJ, et al. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nat Biotechnol 2013; 31(3): Hsu PD, Scott DA, Weinstein JA, Ran FA, Konermann S, Agarwala V, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol 2013; 31(9): Ran FA, Hsu PD, Lin CY, Gootenberg JS, Konermann S, Trevino

7 倪培凌等 : DNA 剪刀 TALEN 和 CRISPR/Cas 11 AE, et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell 2013; 154(6): Sung YH, Baek I-J, Kim DH, Jeon J, Lee J, Lee K, et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nature Biotechnology 2013; 31(1): Tesson L, Usal C, Ménoret S, Leung E, Niles BJ, Remy S, et al. Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs. Nature Biotechnology 2011; 29(8): Feng Z, Zhang B, Ding W, Liu X, Yang DL, Wei P, et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Res 2013; 23(10): Hwang WY, Fu Y, Reyon D, Maeder ML, Tsai SQ, Sander JD, et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol 2013; 31(3): Li JF, Norville JE, Aach J, McCormack M, Zhang D, Bush J, et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotechnol 2013; 31(8): Li D, Qiu Z, Shao Y, Chen Y, Guan Y, Liu M, et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol 2013; 31(8): Nekrasov V, Staskawicz B, Weigel D, Jones JD, Kamoun S. Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat Biotechnol 2013; 31(8): Jao LE, Wente SR, Chen W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci USA 2013; 110(34): Kondo T, Sakuma T, Wada H, Akimoto-Kato A, Yamamoto T, Hayashi S. TALEN-induced gene knock out in Drosophila. Dev Growth Differ 2013; doi: /dgd Carlson DF, Tan W, Lillico SG, Stverakova D, Proudfoot C, Christian M, et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proc Natl Acad Sci USA 2012; 109(43): Wefers B, Meyer M, Ortiz O, Hrabe de Angelis M, Hansen J, Wurst W, et al. Direct production of mouse disease models by embryo microinjection of TALENs and oligodeoxynucleotides. Proc Natl Acad Sci USA 2013; 110(10): Bedell VM, Wang Y, Campbell JM, Poshusta TL, Starker CG, Krug RG 2nd, et al. In vivo genome editing using a highefficiency TALEN system. Nature 2012; 491(7422): Zu Y, Tong X, Wang Z, Liu D, Pan R, Li Z, et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nat Methods 2013; 10(4): Piganeau M, Ghezraoui H, de Cian A, Guittat L, Tomishima M, Perrouault L, et al. Cancer translocations in human cells induced by zinc finger and TALE nucleases. Genome Res 2013; 23(7): Sun N, Zhao H. Seamless correction of the sickle cell disease mutation of the HBB gene in human induced pluripotent stem cells using TALENs. Biotechnol Bioeng 2013; doi: / bit Ma N, Liao B, Zhang H, Wang L, Shan Y, Xue Y, et al. TALENmediated gene correction in integration-free beta-thalassemia ipscs. J Biol Chem 2013; 288(48): Osborn MJ, Starker CG, McElroy AN, Webber BR, Riddle MJ, Xia L, et al. TALEN-based gene correction for epidermolysis bullosa. Mol Ther 2013; 21(6): Bacman SR, Williams SL, Pinto M, Peralta S, Moraes CT. Specific elimination of mutant mitochondrial genomes in patientderived cells by mitotalens. Nat Med 2013; 19(9):

692 Prog Biochem Biophys 2013; 40 (8) 1 CRISPR/Cas 5' tracrrna Cas Cas9 Cas1 Cas2 CRISPR/Cas ( 1) Csn2 3' CRISPR (Streptococcus pyogenes SF370) (space

692 Prog Biochem Biophys 2013; 40 (8) 1 CRISPR/Cas 5' tracrrna Cas Cas9 Cas1 Cas2 CRISPR/Cas ( 1) Csn2 3' CRISPR (Streptococcus pyogenes SF370) (space Reviews and Monographs Progress in Biochemistry and Biophysics 2013, 40(8): 691~702 wwwpibbaccn * CRISPR/Cas9 ( 100193) Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated

中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2014, 36(1): 5 11 DOI: /cjcb 特约综述 本实验室对体外培养的胚胎干细胞和体内的着床前胚胎进行研究, 以加深对维持和建立多能性 (pluripote

中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2014, 36(1): 5 11 DOI: /cjcb 特约综述本实验室对体外培养的胚胎干细胞和体内的着床前胚胎进行研究, 以加深对维持和建立多能性 (pluripote