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半飒伊
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1 0;() 南方医科大学学报 J South ed Univ 技术方法 8 转基因番茄 Zeneca B,Da,F 实时荧光定量 PCR 检测体系的建立麦荣嘉陈敏芳莫倩珍胡良勇黎事伦唐敏然顾晓敏蔡永洪周伦彬周晓红南方医科大学公共卫生与热带医学学院病原生物学系广东广州广州市计量检测技术研究院广东广州 0 摘要目的构建转基因番茄 Zeneca B,Da,F 品系的质粒标准分子及其实时荧光定量 PCR qpcr 检测体系方法基于反向遗传学原理构建分别含有番茄内标准基因 apx 检测序列 ERG-apx 转基因番茄 B,Da,F 品系 pg 基因的基因特异性序列及其构建特异性序列 CS-S CS-A 的番茄内参质粒标准分子 peasy-t-apx 转基因番茄 B,Da,F 品系的构建特异性质粒标准分子 peasy -T- A peasy-t-s 以 Beacon Designer. 设计用于定性 PCR 和 qpcr 检测的引物对和 Taqman 探针基于质粒标准分子建立了定性 PCR 和 qpcr 检测体系对方法的特异性敏感性重复性检测下限等指标进行评估使用 PicoGreen 试剂盒对质粒标准分子进行定量以质粒 peasy-t- APX 为背景 DNA 定量混有 peasy-t-a 或 peasy-t-s 制备成含量为 %和 0.% (w/w)的两组核酸标准物质进行所构建 qpcr 检测体系的定量性能评价结果锚定 qpcr 检测靶序列 ERG-apx 08 bp, 08 bp CS-S 09 bp CS-A 0 bp 酶切鉴定所构建的质粒标准分子均可得到预期大小的插入子片段所建立的实时荧光定量PCR qpcr 检测体系重复性的相对标准差 R 0.%~.% 检测下限 copies 标准曲线方程线性关系 R 值在 0.99~0.998 效率在 9.%~0.% 经换算系数 Cf 换算对 PicoGreen 定量的样品进行验证其实测值与真值的偏差是-9.%~.% 结论成功构建了转基因番茄 Zeneca B,Da,F 品系的质粒标准分子及其 qpcr 检测体系为转基因番茄 Zeneca B,Da,F 品系转基因成分的监测建立了可行的可供使用的定性与定量检测体系关键词质粒标准分子转基因番茄核酸检测技术荧光定量PCR 中图分类号 Q8 文献标志码 A 文章编号 Construction of quantitative real-time PCR detection system of transgenic tomato line Zeneca B,Da,F AI Rong-jia, CHEN in-fang, O Qian-zhen, HU Liang-yong, LI Shi-lun, TANG in-ran, GU Xiao-min, CAI Yong-hong, ZHOU Lun-bin, ZHOU Xiao-hong Department of Parasitology, School of Public Health and Tropical edicine, Southern edical University, Guangzhou,China; Guangzhou Institute of easurement and Testing, Guangzhou 0, China Abstract: To construct the plasmid reference molecules for detection of transgenic tomato line Zeneca B,Da,F using quantitative real-time PCR(qPCR). ethods Three plasmid reference molecules peasy-t-apx, peasy-t-a and peasy-t-s were cloned based on reverse genetics, which contain the target fragments of tomato endogenous reference gene apx (ERG-apx), gene-specific sequence of pg() and construct-specific sequence of vectors pjrs/ pjra (CS-S/CS-A) of Zeneca B,Da,F, respectively. Primers and Taqman probes were designed by Beacon Designer.. The specificity, sensitivity, reproducibility and the limit of detection(lod) of the qualitative and quantitative PCR system based on the plasmid reference molecules were evaluated. PicoGreen was used to measure the DNA concentration of the plasmid reference molecules. Two sets of samples containing % or 0.% (w/w) peasy-t-a or peasy-t-s mixed with peasy-t- APX as background DNA were prepared for evaluating the efficacy of the qpcr system. Results The target fragments for qpcr detection were anchored, ERG-apx 08 bp, 08 bp, CS-S 09 bp and CS-A 0 bp. The three plasmid reference molecules were confirmed at the expected sizes by restriction enzyme digestion. The qpcr results showed that the R of reproducibility were 0.% to.%, LOD was copies, R values for these standard curves were 0.99 ~0.998 and amplification efficiencies were 9.%~ 0.%.The bias between the test and true values of two sets of mixed samples ranged from -9.% to.% 收稿日期 00-- after adjusting by conversion factors(cf). Conclusion 基金项目国家科技支撑计划(008BAKB0) 国家自然科学基金 The plasmid reference molecules and qpcr system for (80, 808) 广东省自然科学基金() qualitative and quantitative detection of transgenic Supported by National Natural Science Foundation of China 80, tomato line Zeneca B,Da,F have been established 808. successfully. 作者简介麦荣嘉在读硕士研究生 winger0@.com Key words plasmid reference molecule; transgenic to通讯作者周晓红副教授博士电话 mato; nucleic acid testing; quantitative real-time PCR zhouxh@fimmu.com

2 88 南方医科大学学报 (J South ed Univ) 第卷自 99 年全球第例商品化的转基因番茄问世以来, 由转基因作物 (genetically modified crops, GCs) 加工的转基因食品和食品成分达 00 余种随着 GCs 的大规模种植和商业化生产, 其安全性问题受到广泛关注欧盟韩国日本等相继制定了转基因产品的标签制度 ; 我国于 00 年开始实施标签制度,00 年施行农业转基因生物标识管理办法, 将玉米大豆油菜棉花和番茄列为第一批实施标识管理的 GCs 转基因番茄, 一方面作为生物反应器, 用以生产医药用重组蛋白抗体的研发 ; 另一方面, 用于培育具有延熟抗虫等性能的的番茄良种品系 [] 其中已商品化的转基因番茄共有 Zeneca B, Da,F 番茄 Bioscein( 华番号, 商品名 : 百日鲜 ) 等九种品系目前, 我国番茄转基因成分的相关检测技术研究较玉米大豆等农作物略有滞后 [] 在九种商品化的转基因品 [] 系中只有 Bioscein 的检测研究较为全面我国国家质量监督检验检疫总局 00 年颁布了番茄中转基因成分的定性 PCR 检测方法行业标准 (SN/T8-00) [], 而转基因番茄的标准物质研究国内外尚未见报道 [] 转基因番茄 Zeneca B,Da,F 品系是由美国捷利康公司 (Zeneca Seeds) 研发 [],99 年在美国和 99 年在加拿大批准上市 B,Da,F 品系是利用根癌农杆菌介导转化技术培育而成, 目的基因是部分多聚半乳糖苷酶 (polygalacturonase, pg), 可抑制番茄自身 pg 表达而具有延 [-] 熟特性, 便于储藏和运输 Da,F 品系表达载体为 pjrs [], 内含部分正义的 pg 基因 ;B 品系表达载体是 pjra [], 内含部分反义的 pg 基因实时荧光定量 PCR (quantitative real-time PCR,qPCR) 广泛应用于转基因产 [8] 品的检测 qpcr 常通过对转基因产品的标准物质 (reference material, R) 进行梯度稀释, 而构建检测用标准曲线的方法来实现定量基于计算的 qpcr 定量, 实验证实质粒可以替代 GCs 的基因组作为核酸标准物质本研究运用反向遗传学原理制备用于转基因检测的具有 B,Da,F 品系的核酸靶标分子片段的质粒标准分子, 并构建该品系 qpcr 检测体系材料与方法. 材料.. 番茄益丰号, 益丰, 夏丰, 年丰和金丰的番茄种子, 购自广州蔬菜研究所.. 主要仪器 x0p qpcr 扩增仪 (Stratagene, 美国 ), 分光光度计 Smartspec T 00(Bio-Rad, 美国 ), 多通道微孔板检测仪 Infinite 00(TECAN, 瑞士 ).. 试剂 Premix Ex taq DNA 聚合酶 Easy dilution 和 DEPC 处理水 (Takara, 大连 ),Quant-iT T PicoGreen ds- DNA Reagent and Kits(Invitrogen, 美国 ), 植物基因组 DNA 提取试剂盒 DNAsecure Plant Kit 和质粒小提试剂盒 00( 天根生化有限公司, 北京 ),AxyPrep 质粒大量制备试剂盒 (Axygen, 美国 ),All-in-One T Q-PCR ix(gene- Copoeia, 广州 ),peasy-t Cloning Kit ( 全式金生物技术有限公司, 北京 ). 方法.. qpcr 的引物及 Taqman 探针的设计与合成... pg 基因的生物信息学分析以及设计基于文献复习和 NCBI 网络信息平台上海市转基因安全性检测评估共享服务平台 ( 转基因检测方法数据库 (GO Detection method Database GDD) [9] 转基因作物数据库 AGBIOS( php?action=gm_crop _database) 和美国食品药品监督管理局 (U.S. Food and Drug Administration,FDA) 对转基 [] 因番茄 Zeneca B,Da,F 品系的解除控制书中公布的 pg 基因序列, 应用 DNAAN 以及 Primer Premier 等软件对其进行生物信息学分析针对转基因番茄 Zeneca B, Da,F 品系表达载体中的目的基因 pg 的序列 [-], 利用软件 Beacon Designer. 设计 pg 基因的 qpcr 引物和 Taqman 探针... 转基因番茄 Zeneca B,Da,F 品系的构建特异性的生物信息学分析及设计构建特异性检测是指针对植物表达载体构建所特有的序列即其 T-DNA 区域内 (LB 与 RB 之间 ) 相邻两个元件间的连接区序列 ( 如 :pg-nos nptⅡp-nos 等 ) [] 根据上述的转基因作物的数据平台, 对 B, Da 品系的 pjra [] 的 CaVS 启动子和部分反义 pg 基因序列之间的连接区域序列 ps-partial antisense pg 和 F 品系 pjrs [] 的 CaVS 启动子和部分正义 pg 基因序列之间的连接区域序列 ps-partial sense pg 进行生物信息学分析, 锚定高度保守的特异性序列分别作为 Zeneca B,Da 及 F 品系的构建特异性核酸检测靶标 ( 表 ) 番茄内参基因 apx 的 qpcr 引物探针检测体系的构建另文报道表靶标序列的检测引物对与探针 Tab. Primers and Taqman probes designed for detection of the target fragments 检测靶基因 ERG-apx CS-A CS-S... 引物和 Taqman 探针由宝生物工程 ( 大连 ) 有限合成 Prime-F APX PG A S Prime-R APX PG A S 引物 / 探针名称 Probe APX-P(HEX- BHQ) PG-P(FA- ECLIPSE) A-P(ROX- ECLIPSE) S-P(ROX- ECLIPSE) 扩增片段 (bp) 转基因番茄 Zeneca B,Da,F 品系质粒标准分子的构建通过上海生工生物有限公司分别合成番茄内参基因 apx(endogenous reference gene, ERG-apx) 检测序列, 转基因番茄 Zeneca B,Da,F 的外源目的基因 pg 基因特异性序

3 第期麦荣嘉, 等. 转基因番茄 Zeneca B,Da,F 实时荧光定量 PCR 检测体系的建立 89 列 (Gene-specific sequence of pg, ), 植物载体 pjrs 以及 pjra 构建特异性的基因序列 (Construct-specific sequence of pjrs/pjra,cs-s/ CS-A), 并将其分别克隆到 peasy-t 的载体上, 构建三个含有不用元件的质粒标准分子 : 含有 ERG-apx 的质粒标准分子 peasy-t-apx; 含有 ERG-apx, 和 CS-A 的质粒标准分子 peasy-t-a; 含有 ERG-apx, 和 CS-S 的质粒标准分子 peasy-t-s.. 常规 PCR 反应体系反应体系 ( μl): 无菌水 0 倍含 g + 的缓冲液. mmol/l 的 dntp μl Ex Taq 酶 μl 0 μmol/l 的引物 μl 和 DNA 模板 ( 经 Apa Ⅰ 酶切纯化后线性化质粒标准分子 ) μl 扩增条件:98 预变性 0 min;98 s, s, s, 个循环 ; 充分延伸 0 min 扩增产物进行.% 琼脂糖电泳分析.. qpcr 反应体系反应体系 (0 μl): 无菌水 qpcr ix 酶 0 μl 0 μmol/l 的引物 0. μl 0 μmol/l 的探针 0. μl 模板 DNA( 线性化质粒标准分子 ) μl 空白对照是超纯水扩增条件 :9 预变性 0 min;9 0 s, 0 s 程序进行个循环在退火 0 s 时, x0p qpcr 扩增仪进行实时荧光信号收集.. 标准曲线的建立以及重复性分析标准曲线是通过 Ct(Threshold Cycle) 值和样品的初始浓度的对数值形成的线性曲线在标准曲线构建中, 使用 μl 连续稀释的 peasy-t-a 和 peasy-t-s 质粒标准分子, 其浓度为 0 到 0 copies/μl 以 0 倍倍比稀释的个梯度, 每个浓度做个平行定量检测体系的重复性是指不同时间段重复实验之间的差异, 用标准偏差 () 和相对标准偏差 (Relative standard deviation, R) 来表示本研究通过次重复实验对检测体系的进行评价.. 检测体系中换算系数计算方法换算系数 (Conversion factors,cf) [0], 考虑质粒标准分子中不同基因扩增效率不一致导致的差异, 这个可以通过 Cf 来换算 Cf 值计算如下 :Cf= 质粒标准分子外源基因 / 质粒标准分子内源基因, 转基因成分含量的计算如下 : 转基因成分含量 %=( 样品外源基因 00)/( 样品内源基因 Cf) 本研究中样品外源基因 /CS-S/ CS-A, 而样品内源基因是 ERG-apx 本研究运用质粒标准分子 peasy-t-a 和 peasy-t-s 作为样品, 通过使用 CS-S 和 CS-A 方法分别得到其 Ct 值的相对应的量与 ERG-apx 方法得到 Ct 值的相对应的量的比值, 从而计算 Cf.. 检测体系的特异性以及检测极限本研究使用的引物 PG 和 PG 分别对质粒标准分子 peasy- T-A 和 peasy-t-s 以及种番茄品种的常规 PCR 和 qpcr 的特异性检测在定量检测体系中, 检测极限 (Limit of Detection, LOD) 指的是定量分析过程的最低检测极限, 即被检测的样品被检测出的最低含量和质量本研究使用的引物 PG 和 PG 对浓度为 0 到 0 copies/μl 的质粒标准分子 peasy-t-a 和 peasy-t- 多次重复实验, 进行常规 PCR 和 qpcr 的 LOD 检测使用 CS-S 的引物 S 和 S 对浓度为 0 到 0 copies/μl 质粒标准分子 peasy-t-s, 而使用 CS-A 的引物 A 和 A 对浓度为 0 到 0 copies/μl 质粒标准分子 peasy-t-a 多次重复实验, 进行常规 PCR 和 qpcr 的 LOD 检测..8 检测体系中的定量分析在本研究中, 样品的定量分析是采用相对定量法, 即使用 /CS-S/CS-A 与 ERG-apx 含量的比值来表示检测样品中转基因成分的含量目前, 多个国家或地区对转基因的标识的阈值在 0.9%~% 不等本研究使用 PicoGreen 试剂盒对 peasy- T-APX peasy-t-a 和 peasy-t-s 质粒标准分子进行定量, 并以质粒 peasy-t-apx 为背景 DNA 混入比例为 % 和 0.%(w/w) 的 peasy-t-a 或 peasy-t-s, 制备成混合样品进行质粒标准分子构建的 qpcr 检测体系的定量功效评价结果. 转基因番茄 Zeneca B,Da,F 品系 pg 基因的生物信息分析结果 pg 基因广泛存在于植物之中, 番茄 pg 基因 (GenBank Accession No..) 全长 bp, 含有 9 个外显子和 8 个内含子番茄 pg 基因的 cdna(genbank Accession No.AK0.) 利用 DNAAN 对. AK0. 和 B,Da,F 品系导入的 pg 片段进行多序列比对, 从比对结果 ( 图 ) 可以看出, 导入的 pg 片段含有番茄 pg 基因的外显子的至的区域和部分的区域此外, 利用 DNAAN 比对 Da,F 品系表达载体为 pjrs 内部分正义的 pg 基因和 B 品系表达载体是 pjra [] 的内含部分反义的 pg 基因, 获取两者相同序列设计 B,Da,F 品系导入的 pg 片段的的引物和探针 ( 表 ). 番茄 DNA 和质粒 DNA 提取效果以植物基因组提取试剂盒提取的番茄 DNA 和以 AxyPrep 质粒大量提取试剂盒提取质粒标准分子, 经分光光度计测量 DNA 浓度为 ~00 ng/μl,od 0/OD 80 均在.~.8 之间. 质粒标准分子的克隆与鉴定经过分子克隆获得的质粒标准分子 peasy- T-A peasy-t-s 和 peasy-t-apx 质粒标准分子分别进行 EcoRⅠ 限制性内切酶消化 ( 图 ),peasy- T-APX 得到 08 bp 的片段, 而 peasy-t-a 和 peasy-t-s 分别得到 8 和的片段, 与预期片段大小相符

90 南方医科大学学报 J South ed Univ 第卷 ①番茄 pg 基因 0 ②番茄 pg 基因的 cdna 90 9 外显子 pjrs partial sense pg ③B,Da, F 吕系导入的 pg 片段内含子引物位置以及反向

产生 08 bp 的片段而非转基因番茄样品产生片段图 A 与 PG 和 PG 所在番茄基因组 (.

0 bp 和 09 bp 的片段其他均不见有扩增片段 qpcr结果与结果一致结果 00 未显示图质粒标准分子的酶切鉴定图 : 0 bp DNA 标准; : 质粒标准分子 peasy-t-a; 质在检测 LOD 中常规 PCR 均可以检测极限为

Identification of the plasmids reference molecules peasy-t-a, peasy-t-s and peasy-t-apx digest- 显示 ed with EcoR I.

bp标准; : 阴性对照; peasy-t-a, : peasy-t-s; -8: 益丰号/益丰/夏丰/年丰/金丰番茄基因组DNA.

4 90 南方医科大学学报 J South ed Univ 第卷 ①番茄 pg 基因 0 ②番茄 pg 基因的 cdna 90 9 外显子 pjrs partial sense pg ③B,Da, F 吕系导入的 pg 片段内含子引物位置以及反向 pjr-pg 80 序列方向 pira partial antisense pg 图番茄pg基因(GenBank Accession NO.. AK0.)与B,Da,F品系导入的pg片段的序列比对 Fig. Sequence alignment of., AK0. and pjr-pg.. CS-S和CS-A的特异性检测以及LOD 以种非转基因番茄样品的总 DNA 为模板采用本研究设计的引物和探针进行常规 PCR 以及 qpcr 反应常规 PCR 结果显示只有 peasy-t-a 和 peasyt-s 产生 08 bp 的片段而非转基因番茄样品产生片段图 A 与 PG 和 PG 所在番茄基因组 (.)对应扩增序列大小一致图同时 qpcr 结果只有 peasy-t-a 和 peasy-t-s 产生荧光信号其他样品都没有荧光信号另外在构建特异性基因 A 与 S 的普通 PCR 结果中只有 peasy-t-a 和 peasy-t-s 分别产生 0 bp 和 09 bp 的片段其他均不见有扩增片段 qpcr结果与结果一致结果 00 未显示图质粒标准分子的酶切鉴定图 : 0 bp DNA 标准; : 质粒标准分子 peasy-t-a; 质在检测 LOD 中常规 PCR 均可以检测极限为 00 粒标准分子pEasy-T-S; 质粒标准分子pEasy-T-APX copies/μl 图而qPCR检测极限 copies/μl 结果未 Fig. Identification of the plasmids reference molecules peasy-t-a, peasy-t-s and peasy-t-apx digest- 显示 ed with EcoR I.. 质粒标准分子pEasy-T-A与pEasy-T-S的标准曲线的构建以及重复性的分析 A B C 图 CS-A和CS-S特异性检测以及LOD分析 A: 特异性分析, :00 bp标准; : 阴性对照; peasy-t-a, : peasy-t-s; -8: 益丰号/益丰/夏丰/年丰/金丰番茄基因组DNA. B: LOD of, :00 bp marker; : 阴性对照; : 0~, copies/μl. C: LOD of CS-A, :00 bp marker; : 阴性对照; -: 0~, copies/μl. D: LOD of CS-S, : 00 bp marker; : 阴性对照; -: 0~,copies/μl Fig. Specificity and LOD analysis of CS-A and CS-S. D 以质粒标准分子 peasy-t-a 与 peasy-t-s 在优化后的 qpcr 的反应条件下对 peasy- 的 qpcr 中 ERG-apx CS-S 和 CS-A 的扩 T-A 与 peasy-t-s 质粒标准分子进行重复性测增曲线和由扩增曲线得来的定量标准曲线(图) 其扩试结果如表范围在0.0~0.之间而R范围增效率在9.%~0.% R 在0.99~0.998之间在0.%~.%之间表

5 C 0 B ROX Y=..X Eff.=0.% R= ROX Y=.9-.X Eff.=9.% R= FAY=.8-.8X Eff.=9.% R=0.99 A HEX Y=.9-.X Eff.=98.% R= 麦荣嘉, 等.转基因番茄 Zeneca B,Da,F 实时荧光定量 PCR 检测体系的建立第期 D 图 ERG-apx, 以及CS-A和CS-S的标准曲线的构建注用质粒标准分子 peasy-t-a 或 peasy-t-s 依次为 0, 0, 0, 0,and 0 copies/μl A 为 ERG-apx 的标准曲线 R=0.99 效率= 98.% B为的标准曲线 R=0.99 效率=9.% Cf为0.9. C为CS-A标准曲线 R=0.998 效率=0.% Cf为0.9. D为CS-S标准曲线 R=0.99 效率=9. Cf为0.9 Fig. Sensitivity analysis of quantitative detection of real-time PCR: amplification plot generated by serial dilutions of tomato DNA corresponding to 0, 0, 0, 0 and0 copies/μl. 表质粒标准分子pEasy-T-A与pEasy-T-S建立的qPCR的重复性分析 Tab. Reproducibility of peasy-t-a and peasy-t-s with qpcr assay ERG-apx 续表 CS-A CS-S 注 ean Ct 是次重复实验获得Ct值的平均值; : 标准偏离 R: 相对标准偏离. 基因特异性以及构建特异性的qPCR检测体系对混增效率的不一致导致实际操作 Cf 和理论 Cf 之间的不合样品的定量分析为了更准确地检测未知样品将质粒 peasy-t-a 或pEasy-T-S作为参照物加入到qPCR中从而计算出 Cf 理论上 ERG-apx 以及 CS-S 和 CS-A 在质粒标准分子中都是单拷贝的 Cf 等于但是由于扩同该体系对混合样品的检测经换算后获得的检测值与真实值的偏差来评价该体系的准确性定量结果的偏差在-9.%~.%之间相对标准差在.%~.8%范围内表

6 9 南方医科大学学报 (J South ed Univ) 第卷表混合样品的定量分析 Tab. Quantitative determination of mixed samples 混合样品 PCR 分析真实值 (%) 平均值 (%) 偏离值 (%) (%) peasy-t-a CS-A peasy-t-s CS-S 注 : 偏离值 = 平均值 - 真实值 )/ 真实值 00.: 标准偏离, R: 相对标准偏离讨论以 Taqan 荧光标记探针为基础的 qpcr, 其在 PCR 反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号积累实时检测 PCR 全过程, 最后以标准曲线对检测靶标进行定 [] 量分析评价标准曲线时, 在比较质粒和基因组还是比较内源基因和外源基因两者量的关系中, 两者的扩增效率和相关系数 R 越接近理论值, 越能反映两者之间的关 [-] 系 Cf 可用于质粒与基因组的扩增效率不一致而导致 [0] 的误差 ; 本研究发现优化引物以及探针浓度, 相同的质粒扩增不同的基因都存在效率不一致的现象, 所以引入 Cf 可用于减小不同基因的扩增效率不一致而导致的误差每次实验除了空白对照外, 加入已知量的质粒标准分子 peasy-t-a 或 peasy-t-s 为阳性对照并计算系数, 从而准确定量检测样品在构建 qpcr 定量检测体系中,R 用作阳性对照和配制不同浓度的定量检测的标准品, 用于对 GCs 混合水平进行量化和分析在转基因定量检测过程中,R 必须经过严格试验验证其均匀性稳定性和定值高纯度定值准确可靠良好的溯源性和系列性是有证标 [] 准物质的特点目前获得欧盟 IR(Institute for Reference aterials and easurements) 认证以及应用的有证标准物质 (certified reference material,cr) 的 GCs, 如含量为 0%,0.%,0.%,.0%,.0%,.0% 的转基因玉米 Bt- [] Bt- [-8] ON 80 [8-0] 和 NK0 [0] ; 含量为 0%,0.%,0.%,%,%,% 的转基因大豆 Roundup Ready ; 含量为 0%,0.%,0.%,%,.%,.% 的转基因玉米 GA; 含量为 % 的转基因棉花和土豆 EH9-- [] ; 含量为 0% 和 00% 的甜菜 H- 等, 已不能满足现阶段快速增长的 GCs 监控的需求质粒容易获得, 储存简单, 高稳定性以及普遍适用性等优点, 实验证实可以成为替代基因组的标准物质 ; 质粒不仅操作简单定量简单而且可以避免因为植物某些组织的基因结构不同而导致的转基因含量的不一致作为核酸标准物质, 质粒标准分子插入的内参基因与外源基因的比例是恒定 [] 的, 能够应用于在转基因的定量检测 Taverniers 等使用质粒标准分子与经欧盟 IR 鉴定含有转基因大豆的量提取的基因组分别制备的核酸标准物质, 两者在转基因大豆特有的 S 启动子检测并没有明显差异 00 年 Charels 等报道, 比较转基因玉米 ON 80 的基因组与质粒构建的标准曲线时, 斜率相关系数以及扩增效率接近理论值, 质粒标准分子作为核酸标准物质能有效的反映检测样品的量本研究使用 PicoGreen 试剂盒对 peasy-t-apx peasy-t-a 和 peasy-t- S 质粒定量, 并以质粒 peasy-t-apx 为背景 DNA 混入 % 和 0.% 的 peasy-t-a 或 peasy-t-s, 模拟非转基因番茄混入 B,Da,F 品系, 以替代番茄基因组制备转基因番茄 Zeneca B,Da,F 品系的核酸标准物质与基因组的标准物质相比, 含不同元件质粒可简单混合成含不同百分比的标准物质并且容易定值本方法不失为标准物质制备繁琐以及不足等问题而寻求探索解决的途径之一 009 年 Reiting [] 报道,GCs 亚麻品系 CDC Triffid FP9 ( 加拿大 University of Saskatchewan) 研发,99 年在加拿大 999 年在美国批准生产及流通, 在 00 年退市然而在 009 年在检测欧洲市场亚麻样品中,CDC Triffid 亚麻 FP9 构建特异性呈阳性反应这事件说明了尽管已退市的 GCs, 其外源基因有可能发生基因的逃逸等情况而可能对生态安全性造成影响所以, 对退市或者未获批准的转基因作物, 建立 [] 其国际标准化的检测体系都是必需的 Roning 等人在 00 年根据转基因玉米 Bt 品系的表达载体序列设计特异引物, 运用反向 PCR 技术扩增得到外源基因插入玉米基因在边界序列, 从而设计转基因玉米 Bt 品系特异性的引物和探针, 同时获得的序列与美国 FDA 在 [] 99 年对转基因玉米 Bt 品系品系的解除控制书中公布的表达载体的序列相吻合 Reiting [] 根据 GCs 数据库 AGBIOS 针对 CaVS 启动子和 NPTⅡ 基因序列之间的连接区域序列设计特异性引物和探针, 并能

7 第期麦荣嘉, 等. 转基因番茄 Zeneca B,Da,F 实时荧光定量 PCR 检测体系的建立 9 有效的检测如转基因玉米, 转基因棉花和转基因油菜等不同品系的 GCs 这些均证实 GCs 中外源基因在成功导入作物基因组后, 其导入序列是稳定, 此也即我们能针对插入序列建立 GCs 核酸检测的重要科学基础基于此, 本研究利用反向遗传学原理, 自美国 FDA [] 解除控制书以及转基因检测方法数据库 GDD [9] 和 GCs 数据库 AGBIOS 获取转基因番茄 Zeneca B,Da,F 品系的相关序列及载体结构信息, 合成构建具有 GCs 监测核酸靶标分子片段的质粒标准分子的方法, 不失为解决缺乏退市或未批准流通的 GCs 而确实缺乏实际基体样品的可行方法之一本文构建转基因番茄 Zeneca B,Da,F 品系检测体系中, 经常规 PCR 和 qpcr 验证, 该引物和探针都具有特异性扩增效率范围在 9.%~ 0.% 而 R 在 0.99~0.998, 证明该体系可以有效的反映 ERG-apx 与或 CS-S 或 CS-A 的量的关系所建立的 qpcr 方法可以检测含量低至 0.% 的和 CS-S 以及 CS-A, 经过换算后的偏差在 -9.%~.% 之间, 相对标准差在.%~.8% 范围内, 证明该方法能实现转基因成分的定量检测, 为转基因番茄 Zeneca B,Da,F 品系的监测建立了可供实验的定性与定量检测体系参考文献 : armiroli N, aestri E, Gulli, et al. ethods for detection of GOs in food and feed[j]. Anal Bioanal Chem, 008, 9(): 9-8. [] 顾晓敏, 黎事伦, 胡良勇, 等. 转基因番茄及其核酸检测技术研究进展 [J]. 中国测试, 009, (): 8-. [] Yang LT, Shen HF, Pan AH, et al. Screening and construct-specific detection methods of transgenic Huafan No tomato by conventional and real-time PCR[J].Food Agric, 00, 8(): 9-. [] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局. SN/T 番茄中转基因成分定性 PCR 检测方法 [S]. 北京 : 中国标准出版社, 00. [] Anne, Charles E. Petition for release from regulation for modified lines B, Da and F derived from T varieties of processing tomatoes. [] Smith CJS, Watson CF, Ray J, et al. Antisense RNA inhition of polygalacturonase gene expression in transgenic tomatoes[j]. Nature, 988, : -. [] Smith CJS, Watson CF, Bird CR, et al. Expression of a truncated tomato polygalacturonase gene inhibits expression of the endogenous gene in transgenic plants[j]. ol Gen Genet, 990, (): -8. [8] Deisingh AK, Badrie N. Detection approaches for genetically modified organisms in foods[j]. Food Res Int, 00, 8(): 9-9. [9] Dong W, Yang L, Shen K, et al. GDD: a database of GO detection methods[j]. BC Bioinformatics, 008, 9: 0. [0]Zhang HB, Yang LT, Guo JC, et al. Development of one novel multiple-target plasmid for duplex quantitative PCR analysis of roundup ready soybean[j]. Food Agric, 008, (): -0. [] 李金明. 实时荧光 PCR 技术 []. 北京 : 人民军医出版社, 00:. Charels D, Broeders S, Corbisier P, et al. Toward metrological traceability for DNA fragment ratios in G quantification.. Suitability of DNA calibrants studied with a ON 80 corn model[j]. Agric Food Chem, 00, (9): 8-. []Yang LT, Guo JC, Pan AH, et al. Event-specific quantitative detection of nine genetically modified maizes using one novel standard reference molecule[j]. Agric Food Chem, 00, (): -. []Rho JK, Lee T, Jung SI, et al. Qualitative and quantitative PCR methods for detection of three lines of genetically modified potatoes[j]. Agric Food Chem, 00, (): 9-. []Dalla CL, artinelli L. Development of a real-time PCR method based on duplo target plasmids for determining an unexpected genetically modified soybean intermix with feed components[j]. Agric Food Chem, 00, (): -. [] Official journal of the European Union, Commission regulation (EC) No /00 of April animalnutrition/labelling/reg_-00.pdf. []Isabel T, Pieter W, arc V, et al. Event-specific plasmid standards and real-time PCR methods for transgenic Bt, Bt, and GA maize and transgenic GT canola[j]. Agric Food Chem, 00, (8): -. [8]Yang LT, Guo JC, Pan AH, et al. Event-specific quantitative detection of nine genetically modified maizes using one novel standard reference molecule[j]. Agric Food Chem, 00, (): -. [9]Askild H, arc V, Luc D, et al. '-Nuclease PCR for quantitative event-specific detection of the genetically modified on80 aisgard maize[j]. Eur Food Res Technol, 00, (): 9-. [0]Huang HY, Pan T. Detection of genetically modified maize ON80 and NK0 by multiplex and real-time polymerase chain reaction methods[j]. Agric Food Chem, 00, (): -8. Charlotte BA, Arne HJ, Knut GB, et al. Equal performance of Taqan, GB, molecular beacon, and SYBR green-based detection assays in detection and quantification of roundup ready soybean[j]. Agric Food Chem, 00, (), 98-. [] Broothaerts W, Corbisier P, Emons H, et al. Development of a certified reference material for genetically modified potato with altered starch composition[j]. Agric Food Chem, 00, (): 8-. []Taverniers I, Van BE, De L. Cloned plasmid DNA fragments as calibrators for controlling GOs: different real-time duplex quantitative PCR methods[j]. Anal Bioanal Chem, 00, 8(): []Roning SB, Vatilingom, Berdal KG, et al. Event specific realtime quantitative PCR for genetically modified Bt maize (Zea mays)[j]. Eur Food Res Technol, 00, (): -. []Reiting R. Real-time PCR methods for the detection of DNA constructs with the nptii gene for the detection of genetically modified plants in food, feed and seed[j]. Verbr Lebensm, 00, : -90. []Williams DG. Petition for determination of Nonregulaterd Status for: insect protected corn(zea mays L)expressing the CryIA(b) gene from Bacilus thuringiensis var.kurstaki. org/docs/ pdf. ( 编辑 : 吴锦雅 )

标题

吉林农业大学学报２０１６３８１８７９１ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉｌｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｈｔｔｐｘｕｅｂａｏｊｌａｕｅｄｕｃｎＥｍａｉｌｊｌｎｄｘｂｖｉｐｓｉｎａｃｏｍ神经生长因子ｍｒｎａ在鹅等级前卵泡中的表达刘璐璐隋玉健朱海洋武惠岩杨辉孙永峰吉林农业大学动物科学技术学院长春１３０１１８