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1 346 中华骨科杂志 29 年 3 月第 39 卷第 6 期 Chin J Orthop, March 29, Vol. 39, No. 6 胸腺基质促淋巴细胞生成素介导 PI3K/Akt 通路抑制髓核细胞凋亡郑文凯黄智 2 达逸峰邢文华李峰辛大奇 2 刘胜祥杨学军祝勇获奖论文内蒙古医科大学第二附属医院胸腰椎脊柱外科, 呼和浩特 5; 2 内蒙古医科大学, 呼和浩特 3 通信作者 : 祝勇, @qq.com 摘要目的通过观察分析胸腺基质促淋巴细胞生成素 (thymic stromal lymphopoietin,tslp) 作用于小鼠腰椎髓核细胞, 明确胸腺基质促淋巴细胞生成素对小鼠髓核细胞生存活动的影响及机制方法从小鼠腰椎间盘分离获得髓核细胞, 培养获得小鼠髓核细胞株, 通过免疫荧光学染色鉴定细胞类型实验组分为 :, 添加等量 DMEM 培养液 ;2 TNF α 组 ( 阳性 ), 加入 5 ng/ml TNF α 诱导 ;3TSLP 组, 加入 ng/ml TSLP 诱导 ;4LY942 组 ( 阻断 PI3K), 加入 ng/ml μmol LY2942;5Embelin 组 ( 阻断 XIAP), 加入 ng/ml 5 μmol Embelin 均于恒温孵箱培养 24 h, 蛋白免疫印迹分析细胞内 Akt/PKB XIAP caspase 3 的表达变化流式细胞术检测观察小鼠髓核细胞凋亡率的变化结果荧光显微镜观察见所培养细胞 Ⅱ 型胶原蛋白染色阳性, 证实所培养细胞为髓核细胞蛋白表达及细胞凋亡率检测结果显示, 与相比,TSLP 组小鼠髓核细胞内 Akt 磷酸化明显增强, 差异有统计学意义 (t= 9.5,P=.),XIAP 表达增加, 差异有统计学意义 (t=8.85,p=.),caspase 3 变化不明显, 小鼠髓核细胞凋亡率变化不明显与 TSLP 组相比,LY942 组的 Akt 磷酸化减弱 (t=8.798,p=.),xiap 表达下降 (t=7.32,p=.2),cas pase 3 活化明显增强 (t=5.98,p=.4) 小鼠髓核细胞凋亡率明显升高, 差异有统计学意义 (t=2.268,p=.) Embelin 组 caspase 3 活化明显增强 (t=7.99,p=.) 小鼠髓核细胞凋亡率也明显升高(t=2.279,P=.) 结论 TSLP 具有通过激活小鼠髓核细胞内 PI3K/Akt 通路上调 XIAP 的表达, 抑制 caspase 3 的活化, 最终抑制髓核细胞的凋亡的作用, 其可通过激活 PI3K/Akt 通路抑制髓核细胞凋亡的作用关键词细胞培养技术 ; 细胞凋亡 ; 凋亡调节蛋白质类基金项目国家自然科学基金 (846332) DOI:.376/cma.j.issn The effect and mechanism of thymic stromal lymphopoietin on apoptosis of mouse nucleus pulposus cells Zheng Wenkai, Huang Zhi, Da Yifeng 2, Xing Wenhua, Li Feng, Xin Daqi, Liu Shengxiang 2, Yang Xuejun, Zhu Yong The Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 5, China; 2 Inner Mongolia Medical University, Hohhot 3, China Corresponding author: Zhu Yong, @qq.com Abstract Objective The aim of current study is to determine the effect and mechanism of thymic stromal lymphopoi etin on apoptosis of mouse nucleus pulposus cells by investigating the apoptotic activity and variation of intracellular phosphorylat ed protein kinase B (p Akt), X linkedinhibitor of apoptosis protein (XIAP),cysteinyl aspartate specific proteinase 3 (caspase 3), with the treatment of thymic stromal lymphopoietin. Methods Mouse lumbar nucleus pulposus cells were cultured and identified under a fluorescence microscope. Second or third passage cells maintained in monolayers were used for the following experiments. The groups were divided randomly into normal group, TNF α treated group, TSLP treated group, LY942 treated group and Embelin treated group. As a control, normal group was treated with PBS. TNF α treated group was treated with 5 ng/ ml TNF α as a positive control. TSLP treated group was treated with ng/ml rhtslp. LY942 treated group and Embelin treated group were treated with ng/ml TSLP with the pretreatment of different pathway inhibitors for 3 min in differ ent corresponding experiments, for which μmol LY2942 or 5 LY2942 responding experimentsreatment of different path way inhibitors formouse nucleus pulposus cells was detected by FACS.The expression levels of the intracellular p Akt, XIAP,cas pase 3 were investigated by Western blot analysis. Results As the culture cell type II collagen staining was positive observed by fluorescence microscopy, we confirmed that the cultured cells were nucleus pulposus cells. In comparison with negative control, the levels of p Akt, XIAP in TSLP treated group were elevated (t=9.5, P=.; t=8.85, P=.). Thecaspase 3 activity were slightly enhanced and the rate of cells apoptosis was no significance. Compared with TSLP treated group, downregulated level of p Akt and XIAPand upregulatedcaspase 3 activity in LY2942 treated group were observed (t=8.798, P=.; t=7.32, P=.2; t=5.98, P=.4). Upregulated caspase 3 activity were also observed in Embelin treated group (t=7.99, P=.). Furthermore, significant increased apoptotic cell rate was observed in TSLP + LY2942 or TSLP + Embelin treated groups (t=

2 中华骨科杂志 29 年 3 月第 39 卷第 6 期 Chin J Orthop, March 29, Vol. 39, No , P=.; t=2.279, P=.). Conclusion TSLP may have a potential anti apoptotic effect on mouse NP cells via upreg ulating XIAP in PI3K/Akt signaling pathway to restrain the activation of caspase 3. Key words Cell culture techniques; Aopotosis; Apoptosis regulatory proteins Fun program National Natural Science Foundation of China (846332) 椎间盘退行性疾病是临床较为常见, 可严重威胁和影响患者健康和生活, 其作为腰椎间盘突出症腰椎管狭窄症腰椎不稳症的病理基础, 也是引起腰背部疼痛和神经系统症状的始动性因素 [] 椎间盘退变过程中, 各种非生理因素导致的髓核细胞的过度凋亡会导致细胞外基质的主要成分蛋白聚糖和 Ⅱ 型胶原合成减少或成分改变, 加速椎间盘退变过程因此, 髓核细胞凋亡也是椎间盘退变的重要机制之一 [2-3] 故深入研究髓核细胞凋亡的具体机制将有助于更好的认识和理解椎间盘退变, 并为椎间盘退变相关疾病的诊断和治疗提供新思路椎间盘退变过程会激发局部的炎症反应, 产生一系列炎性介质参与椎间盘的退变 [4-6] 胸腺基质促淋巴细胞生成素 (thymic stromal lymphopoietin, TSLP) 是最初在大鼠胸腺基质细胞的上清液中发现的白介素 7(interleukin 7,IL 7) 样的促淋巴细胞生长因子 [7] TSLP 的功能性受体在造血和非造血细胞系中都有表达, 包括树突细胞,T 细胞,B 细胞, 单核细胞, 嗜酸性和嗜碱性粒细胞, 上皮细胞等 [8-] [] Ohba 等报告在鼠和人类的突出髓核组织中发现有 TSLP 表达, 并通过磷脂酰肌醇 3 激酶 / 蛋白激酶 B (phosphatidyl inositol 3 kinase/protein kinase B,PI3K/ Akt) 信号通路促进单核细胞趋化因子 (monocyte chemoattractant protein,mcp ) 生成诱导巨噬细胞趋化浸润, 促进突出的髓核重吸收 PI3K/Akt 信号通路中,Akt 也被称为蛋白激酶 B(protein kinase B, PKB), 是 PI3K 下游的直接靶激酶 [2] Akt 的磷酸化后上调抗凋亡蛋白表达, 抑制促凋亡蛋白活动, 进而保护细胞对抗凋亡 PI3K/Akt 信号通路是细胞内重要的信号转导通路之一, 广泛存在于各种组织细胞当中, 并在调节细胞增殖抑制细胞凋亡方面有着重要的作用 [3] PI3K/Akt 新的下游信号传递分子, 具有强力抗凋亡特性的 X 连锁凋亡抑制蛋白 (X linked inhibitor of apoptosis pro tein,xiap) XIAP 可通过泛素化作用促进细胞凋亡蛋白酶 9(caspase 9) 细胞凋亡蛋白酶 3(caspase 3) 蛋白的降解从而多途径抑制 caspase 3 活化, 参与抗凋亡活动 [4-5] Caspase 3 是 caspase 家族凋亡执行蛋白, 被认为是凋亡的关键蛋白酶 Caspase 3 [6-7] 的活化意味着细胞进入不可逆的凋亡阶段因此, 阻断 caspase 3 活化即可有效抑制细胞凋亡综上所述, 我们猜想 TSLP 在活化 PI3K/Akt 通路后, 是否会同时调节下游抗凋亡蛋白表达, 进而对髓核细胞的生存活动产生影响? 本研究通过观察 TSLP 作用于小鼠髓核细胞后, 通过蛋白免疫印迹分析及流式细胞术检测小鼠髓核细胞内 PI3K/Akt XIAP caspase 3 表达水平及小鼠髓核细胞凋亡率的变化, 目的在于探究 :TSLP 对髓核细胞生存活动及细胞内蛋白表达变化的影响 ;2TSLP 对小鼠髓核细胞生存活动影响的机制试验方法一材料与仪器 ( 一 ) 仪器 CO 2 恒温培养箱 (SANYO 公司, 日本 ), 超净工作台 ( 苏州集团安泰空气技术有限公司 ), 倒置显微镜荧光显微镜 (OLYMPUS 公司, 日本 ), 低速离心机 (Eppendorf 公司, 德国 ), 离心机 ( 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司 ), 水平摇床 ( 江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司 ),PH 计 (Metter Toledo GmbH 公司, 德国 ), 垂直电泳槽电转仪 ( 北京六一仪器厂 ), 酶标仪 (Thermo 公司, 美国 ), 流式细胞仪 (BD Biosci ences 公司, 美国 ) ( 二 ) 试剂与材料 DMEM/F2 培养基.25% 胰蛋白酶胎牛血清 (Gibco 公司, 美国 ); 抗生素 (Hyclong 公司, 美国 ); 多聚甲醛 ( 国药集团, 中国 ); 浓缩型正常山羊血清荧光 (Cy3) 标记羊抗兔 IgG Collagen II( 兔, 武汉博士德生物工程有限公司 ); 细胞凋亡检测试剂盒 ( 南京凯基生物有限公司 ); 磷酸缓冲盐溶液 (phosphate buffer saline,pbs, 国药集团化学试剂有限公司, 中国 ); 蛋白 marker(4 2KD, 北京全氏金生物技术有限公司 ); 电转液 (Biosharp 公司, 美国 );PVDF 膜 (Millipore 公司, 美国 ); 鼠抗 p Akt 兔抗 Akt 兔抗 XIAP( 武汉三鹰生物技术有限公司 );caspase 3 (Cell signaling technologies 公司, 美国 ); 兔抗 β ac tin 二抗 ( 武汉博士德生物工程有限公司, 中国 ); 磷酸酶抑制剂 PMSF RIPA lysate BCA 蛋白试剂盒

3 348 中华骨科杂志 29 年 3 月第 39 卷第 6 期 Chin J Orthop, March 29, Vol. 39, No. 6 DAPI Triton X ( 碧云天公司, 中国 ); 重组人 TSLP TNF α(peprotech 公司, 美国 );Embelin LY2942(Selleckchem 公司, 美国 ) 二小鼠髓核细胞分离培养本研究经内蒙古医科大学动物管理委员会审核并通过取二级雄性 8 周龄, 体重约 3 g 的雄性昆明小鼠 6 只 ( 小鼠购自西安交通大学医学部动物饲养中心 ), 颈椎脱臼法处死取出处死后小鼠的脊柱腰椎序列, 在解剖显微镜下切开纤维环收集胶状髓核组织,.25% 胰蛋白酶和含.2%Ⅱ 型胶原酶常温消化 2 min 后离心去上清将收集到的髓核细胞以 5 5 /ml 密度培养在含 DMEM/F2+2%FBS 培养液的 25 cm 2 培养瓶中进行培养, 小鼠髓核细胞附壁生长融合率达到 8% 时将细胞进行传代培养按 4 的比例传代扩大培养, 取第二三代小鼠髓核细胞进行后续试验三免疫荧光标记将培养好的成对数生长的小鼠髓核细胞胰蛋白酶消化处理后滴加在玻片上培养细胞附壁融合率达到 8% 时取出制备完成的玻片, 用 4% 多聚甲醛滴加固定玻片每张玻片上滴加足够量的兔抗小鼠 Ⅱ 型胶原抗体并放入湿盒,4 孵育过夜将荧光 (Cy3) 标记羊抗兔 IgG( ) 二抗滴加在玻片上, 将加好二抗的玻片置于湿盒中 2~37 条件下孵育 h 后 DAPI 对标本进行染核用含抗荧光淬灭剂的封片液封片, 然后在荧光显微镜下观察制备好的玻片并采集图像四实验分组取对数生长期生长良好的髓核细胞, 以每孔 4 5 个细胞接种在含 DMEM/F2+2%FBS 培养液的细胞培养 6 孔板中, 恒温培养箱中过夜,24 h 后根据不同处理因素分为阴性阳性 TSLP 组,TSLP + 抑制剂组 TSLP + 抑制剂组根据抑制剂不同分为 TSLP + 抑制剂组 TSLP + 抑制剂 2 组于 37 体积分数 5% 的 CO 2 孵箱培养 24 h 后, 阴性添加与 TSLP 组等量 DMEM 培养液 ; 2 阳性加入 5 ng/ml TNF α 诱导 ;3TSLP 组加入 ng/ml TSLP 诱导 ;4TSLP + 抑制剂组加入 ng/ml μmol LY2942,TSLP + 抑制剂 2 组加入 ng/ml 5 μmol Embelin 恒温孵箱培养 24 h, 流式细胞仪检测小鼠髓核细胞凋亡率蛋白免疫印迹法检测相关蛋白通路蛋白磷酸化的表达五蛋白印迹分析将药物处理后的小鼠髓核细胞置于 37 体积分数为 5% 的 CO 2 孵箱培养 24 h 后取出, 裂解 3 min 后收集至离心管, 于 4 下 2 rpm 离心 5 min 获取蛋白并稀释将 PBS 稀释过的蛋白样品稀释过的标准蛋白分别加入 96 孔板内, 使用 DG 322A 酶标仪测定 OD568 利用回归方程计算出样品蛋白浓度制备电泳胶, 选取各组 μg 蛋白样品, 用微量加样器将制备好的蛋白样品和 MAKER 加入上样孔加样后电泳.5 h 并进行转膜, 电转到 PVDF 膜上后, 在 4 条件下将 PVDF 膜分别与 β actin( 2) caspase3 ( 8) XIAP( 2) P AKT( 8) 和 AKT( 8) 抗体孵育过夜用 ECL 发光系统检测目的条带 BandScan 分析胶片灰度值, 以 β actin 作为内参蛋白, 计算蛋白的相对表达量六流式细胞术检测细胞凋亡各实验组细胞经处理孵育 24 h 后收集细胞, 根据凋亡检测试剂说明书, 用不含 EDTA 的.25% 胰酶消化细胞, 离心后重悬, 调整细胞浓度为 5 /ml, 并取 ml 转移至检测管中, 加入 5 μl An nexinv EGFP 并混匀, 避光水浴 2 min, 再加入 5 μl 碘化丙啶 (propidium iodide,pi), 混匀后避光反应 ~5 min, 将各组 AnnexinⅤ PI 双染后小鼠髓核细胞上机检测, 用四象限图表分析细胞凋亡率七统计学分析采用 SPSS 7.(SPSS 公司, 美国 ) 统计软件包进行统计学处理结果数据以均数 ± 标准差表示, 组间两两比较采用独立样本 t 检验 ; 多组数据采用单因素方差分析, 方差不齐时采用秩和检验进行分析检验水准 α 值取双侧.5 结果一免疫荧光检测鉴定髓核细胞分离培养的小鼠髓核细胞 7 d 时观察可见贴壁细胞开始增多, 细胞伸出细小生长突培养 2 周细胞密度增加, 可见细胞团形成细胞融合达到 8% 进行免疫荧光染色荧光显微镜下观察可见形态呈类圆形扇形不规则多角形的髓核细胞, 细胞折光性好细胞胞质丰富,Ⅱ 型胶原染色阳性, 核染色可见轮廓清晰的细胞核, 细胞分裂相明显参照 [8] 既往髓核细胞培养相关文献结果, 证实所获细胞为小鼠髓核细胞细胞生存状态良好, 满足实验条件 ( 图 ) 二 TSLP 激活 PI3K/Akt 通路的影响

349 中华骨科杂志 29 年 3 月第 39 卷第 6 期 Chin J Orthop, March 29, Vol. 39, No.

异有统计学意义 t=9.5 P=. XIAP 蛋白表达明显上调差异有统计学意义 t= 8.85 P=. caspase 3 活化水平无明显变化与 TSLP 组比较 LY942 处理组的 Akt 蛋白磷酸化水平及 XIAP 蛋白表达水平明显降低差异均具有统计学意义 t=8.798 P=.

4 图 2 三 XIAP 抑制 caspase 3 的活化 Western Blot 结果显示相比于 TSLP 处理组的 caspase 3 的活化水平变化不明显而相比 TSLP 组 Embelin 处理组的 caspase 3 的活化水平明显升高 t=7.99 P=.

47%± B A Akt p-akt β-actin p-akt/akt相对表达量图免疫荧光检测鉴定髓核细胞图荧光显微镜下观察细胞质染色可见呈类圆形扇形不规则多角形的髓核细胞细胞折光性好细胞胞质丰富 Ⅱ型胶原染色阳性细胞核染色可见轮廓清晰的细胞核细胞分裂相明显 2 4.5 4. 3.5 3. 2.5 2.

4 349 中华骨科杂志 29 年 3 月第 39 卷第 6 期 Chin J Orthop, March 29, Vol. 39, No. 6 本研究设立凋亡组的原因为设立凋亡细胞的阳性对照大量的 TNF α 刺激组织细胞从而引发 TNF 受体凋亡途径引起典型的细胞凋亡改变和 caspase 3 水平的变化 Western Blot 结果显示与正常培养组相比 TSLP 处理组的小鼠髓核细胞内 Akt 蛋白磷酸化明显增强差异有统计学意义 t=9.5 P=. XIAP 蛋白表达明显上调差异有统计学意义 t= 8.85 P=. caspase 3 活化水平无明显变化与 TSLP 组比较 LY942 处理组的 Akt 蛋白磷酸化水平及 XIAP 蛋白表达水平明显降低差异均具有统计学意义 t=8.798 P=. t=7.32 P=.2 caspase 3 的活化水平明显升高差异有统计学意义 t=5.98 P=.4 图 2 三 XIAP 抑制 caspase 3 的活化 Western Blot 结果显示相比于 TSLP 处理组的 caspase 3 的活化水平变化不明显而相比 TSLP 组 Embelin 处理组的 caspase 3 的活化水平明显升高 t=7.99 P=. 图 3 说明 TSLP 调控 XIAP 表达对小鼠髓核细胞内 caspase 3 的活化具有抑制作用四 TSLP 激活 PI3K/Akt 通路对小鼠髓核细胞生存活动的影响流式细胞检测结果显示与正常 8.47%± B A Akt p-akt β-actin p-akt/akt相对表达量图免疫荧光检测鉴定髓核细胞图荧光显微镜下观察细胞质染色可见呈类圆形扇形不规则多角形的髓核细胞细胞折光性好细胞胞质丰富 Ⅱ型胶原染色阳性细胞核染色可见轮廓清晰的细胞核细胞分裂相明显 LY942组 XIAP caspase-3 β-actin LY942组 p-akt/akt相对表达量 3. XIAP LY942组 caspase LY942组图 2 Western Blot 检测 p Akt/Akt 和 XIAP caspase 3 阻断 PI3K 表达示意图 A Western Blot 检测 p Akt/Akt 表达比值阻断 PI3K 中与正常培养组相比 TSLP 处理组的 Akt 蛋白磷酸化明显增强 t=9.5 P=.), 与 TSLP 组比较 LY942 处理组的 Akt 蛋白磷酸化水平下降 t=8.798 P=. B Western Blot 检测 XIAP caspase 3 表达阻断 PI3K 中与相比 TSLP 处理组的 XIA 表达上调 t=9.5 P=. 与 TSLP 组比较 LY942 处理组的 XIAP 表达下降 t=8.798 P=. caspase 3 的活化水平明显升高 t=5.98 P=.4

35 中华骨科杂志 29 年 3 月第 39 卷第 6 期 Chin J Orthop, March 29, Vol. 39, No. 6.39% 相比较 TSLP 处理组的髓核细胞凋亡率 7.48%±.53%未见明显改变 TNF α 组细胞凋亡率为 28.5%±.45%显著高于 TSLP 组差异有统计学意义 t=39.45 P=. 与对照组 t=37.

5 35 中华骨科杂志 29 年 3 月第 39 卷第 6 期 Chin J Orthop, March 29, Vol. 39, No. 6.39% 相比较 TSLP 处理组的髓核细胞凋亡率 7.48%±.53%未见明显改变 TNF α 组细胞凋亡率为 28.5%±.45%显著高于 TSLP 组差异有统计学意义 t=39.45 P=. 与对照组 t=37.56 P=. 图 4 加入 PI3K 阻断剂和 XIAP 阻断剂的 TSLP + LY942 组和 Embelin 组的髓核细胞凋亡率分别为 8.64%±.%和 9.2%±.93% 明显高于差异均有统计学意义 t=9.369 P=. t= P=. 亦高于 TSLP 组差异均有统计学意义 t=2.268 P=. t=2.279 P=. 图 5 结合蛋白免疫印迹结果分析说明 TSLP 通过 PI3K/ caspase-3 β-actin Embelin组 p-akt/akt相对表达量 Embelin组图 3 Western Blot 检测 caspase 3 阻断 XIAP 的表达示意图相比 TSLP 处理组的 caspase 3 的活化水平变化不明显相比 TSLP 组 Embelin 处理组的 caspase 3 的活化水平明显升高 t=7.99 P= 异硫氰酸荧光素 2 异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素 LY942组图 4 流式细胞术检测细胞凋示意图阻断 PI3K 与正常 8.47%±.39%相比较 TSLP 处理组的髓核细胞凋亡率 7.48%±.53%未见明显改变 TNF α 组细胞凋亡率为 28.5%±.45%显著高于 TSLP 组 t=39.45 P=. 与 t=37.56 P=.

6 35 中华骨科杂志 29 年 3 月第 39 卷第 6 期 Chin J Orthop, March 29, Vol. 39, No 异硫氰酸荧光素 2 3 异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素 Embelin组图 5 流式细胞术检测细胞凋示意图阻断 XIAP 加入 PI3K 阻断剂和 XIAP 阻断剂的 LY942 组和 Embelin 组的髓核细胞凋亡率分别为 8.64%±.%和 9.2%±.93% 明显高于差异均有统计学意义 t=9.369 P=. t=9.798 P=. 亦高于 TSLP 组差异均有统计学意义 t=2.268 P=. t=2.279 P=. Akt 通路调节 XIAP 表达进而抑制髓核细胞凋亡讨论椎间盘退变过程本质上是多因素协同作用导致的椎间盘中各组织的细胞老化变性凋亡的过程其中髓核细胞的凋亡变化对椎间盘退变的影响明显 9 退变椎间盘中髓核细胞凋亡率可达 53%~73% 远高于人正常凋亡髓核细胞的 28% 2 髓核细胞过度凋亡造成的髓核细胞减少直接导致细胞外基质合成分解代谢失衡加速了椎间盘退变大量的研究表明退变的椎间盘组织能产生炎症介质提示椎间盘的退变与其局部的炎症反应及炎性细胞因子有关 2-24 一 TSLP 抑制髓核细胞凋亡的作用 TSLP 最初由 Friend 等 7 在小鼠胸腺细胞株的上清液中发现并证明其能够促进小鼠淋巴 B 细胞株 NAG8/7 的生长增强胸腺细胞的增殖随着研究深入人们发现 TSLP 还广泛参与了与炎症细胞浸润相关的疾病 Tian 等 24 通过 TSLP 对女性子宫蜕膜 γδt 细胞的影响证明了 TSLP 能够抑制蜕膜 γδt 细胞的凋亡调节孕早期蜕膜 γδt 细胞的生存活动 TSLP 的这种促进免疫细胞生长分化的能力提示其可能具有生长因子的特性在之前的研究基础上通过本研究我们发现相比 TNF α 组 TSLP 作用下的小鼠髓核细胞凋亡率变化并不明显而阻断 PI3K/Akt 通路或 XIAP 时小鼠髓核细胞凋亡率明显升高说明 TSLP 激活 PI3K/ Akt 通路在小鼠髓核细胞有抗凋亡作用

7 352 中华骨科杂志 29 年 3 月第 39 卷第 6 期 Chin J Orthop, March 29, Vol. 39, No. 6 二 TSLP 激活 PI3K/Akt 通路上调 XIAP 的表达并抑制了 caspase 3 的活化和髓核细胞的凋亡 PI3K/Akt 信号通路广泛存在细胞中, 是促进细胞生长增殖的信号转导通路在人退行性变的椎间盘组织中 PI3K/Akt 信号通路是显著激活的 [26] [26] Pratsinis 等发现一些生长因子通过 PI3K/Akt 信号通路促进了椎间盘细胞的增殖活动细胞外信号激活的 PI 3K/Akt 信号通路参与了抑制髓核细胞凋亡的过程 [27-28] XIAP 是 PI3K/Akt 信号通路下游的促凋亡蛋白,PI3K/Akt 通路通过磷酸化作用使 XIAP 免于泛素化和自动泛素化, 增强其稳定性并提高细胞内表达水平 [29] XIAP 抗凋亡作用的发挥主要凭借其特有的结构学基础 XIAP 的 N 端含有 3 个 BIR 结构域,C 端为一段锌指结构域 N 端的 3 个 BIR 区域能够竞争性结合 caspase 3 其活化, 参与抗凋亡活动 [, 3] 细胞内表达增加的 XIAP 通过多途径阻断凋亡信号传导, 使凋亡执行蛋白 caspase 3 的活化受到抑制, 可有效抑制细胞凋亡本研究 Western Blot 结果显示,TSLP 作用下的小鼠髓核细胞中,Akt 磷酸化及 XIAP 表达水平升高时,caspase 3 的活化水平并没有下降而当阻断 PI3K/Akt 通路或 XIAP 后,caspase 3 活化明显增强, 而且髓核细胞凋亡明显升高这说明 TSLP 是通过 PI3K/Akt 上调 XIAP 表达来抑制 caspase 3 活化, 并最终抑制了小鼠髓核细胞的凋亡当髓核细胞突出后, 机体首先启动了炎症 / 免疫机制 (TSLP PI3K/Akt MCP 巨噬细胞 ) 对其进行重吸收, 本研究我们旨在验证 TSLP 激活 PI3K/Akt 通路的同时是否参与了髓核细胞的生存活动通过本次试验研究, 我们认为 TSLP 具有通过激活 PI3K/ Akt/XIAP 来抑制 caspase 3 的活化和小鼠髓核细胞的凋亡的作用这提示在椎间盘退变过程中 TSLP 作为一个多效型的细胞因子, 可能在调节突出髓核组织的重吸收的同时影响着髓核细胞的生存活动, 保护髓核细胞不进入凋亡程序, 保证机体在参与椎间盘退变过程中对不同状态的髓核细胞进行选择性地调节, 而不是一棒子打死的启动凋亡程序需要注意的是, 椎间盘退变过程是一个多因素通过多途径参与的, 伴有一系列生物学改变发生的复杂过程髓核细胞所处的微环境又非常特殊 TSLP 在椎间盘退变过程中对不同条件下的髓核细胞生存活动具体产生何种影响就更值得关注我们也将在后续的实验研究中进一步模拟 TSLP 对不同环境下小鼠髓核细胞的生物学影响, 以求对 TSLP 的功能及对其椎间盘退变机制的更全面的认识参考文献 []Van Tulder MW, Scholten RJ, Koes BW, et al. Nonsteroidal anti inflammatory drugs for low back pain: a systematic review within the framework of the Cochrane Collaboration Back Review Group [J]. Spine (Phila Pa 976), 2, 25(9): [2]Ding F, Shao ZW, Xiong LM. Cell death in intervertebral disc de generation[j]. Apoptosis, 23, 8(7): DOI:.7/s [3]Kermani HR, Hoboubati H, Esmaeili Mahani S, et al. Induction of intervertebral disc cell apoptosis and degeneration by chronic unpredictable stress[j]. J Neurosurg Spine, 24, 2(5): DOI:.37/24..SPINE3466. [4]Igarashi A, Kikuchi S, Konno S. Correlation between inflammato ry cytokines released from the lumbar facet joint tissue and symp toms in degenerative lumbar spinal disorders[j]. J Orthop Sci, 27, 2(2): [5]Kitya D, Punchak M, Bajunirwe F. Role of Conventional Myelog raphy in Diagnosis and Treatment of Degenerative Spine Disease in Low Income Communities: Prospective Study[J]. World Neuro surg, 27, 4: DOI:.6/j.wneu [6]Rydevik B, Brisby H. The Role of Cytokines in the Degenerative [J]. Spine, 2, 35: [7]Friend SL, Hosier S, Nelson A, et al. A thymic stromal cell line supports in vitro development of surface IgM+ B cells and produc es a novel growth factor affecting B and T lineage cells[j]. Exp He matol, 994, 22(3): [8]Fontenot D, He H, Hanabuchi S, et al. TSLP production by epithe lial cells exposed to immunodeficiency virus triggers DC mediat ed mucosal infection of CD4+ T cells[j]. Proc Natl Acad Sci U S A, 29, 6(39): DOI:.73/pnas [9]Levin SD, Koelling RM, Friend SL, et al. Thymic stromal lympho poietin: a cytokine that promotes the development of IgM+ B cells in vitro and signals via a novel mechanism[j]. J Immunol, 999, 62(2): []Brittany W, Gauvreau GM. Thymic stromal lymphopoietin: a cen tral regulator of allergic asthma[j]. Expert Opin Ther Targets, 24, 8(7): DOI:.57/ []Ohba T, Haro H, Ando T, et al. A potential role of thymic stromal lymphopoietin in the recruitment of macrophages to mouse inter vertebral disc cells via monocyte chemotactic protein induction: implications for herniated discs[j]. Arthritis Rheum, 28, 58(): DOI:.2/art [2]Milburn CC, Deak M, Kelly SM, et al. Binding of phosphatidylino sitol 3, 4, 5 trisphosphate to the pleckstrin homology domain of protein kinase B induces a conformational change[j]. Biochem J, 23, 375(Pt 3): [3]Song G, Ouyang G, Bao S. The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survival[j]. J Cell Mol Med, 2, 9(): [4]Kaufmann T, Strasser A, Jost PJ. Fas death receptor signalling:

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环球中医药 2016 年 5 月第 9 卷第 5 期摇 Global Traditional Chinese Medicine, May 2016,Vol 郾 9, No 郾 5 摇 557 两种电针对脊髓损伤 14 天后大鼠运动功能神经元及 MEK2 p 鄄 ERK1 表达的影响论著宋良玉摇吕威摇景泉凯摇莫雨