第 24 卷第 6 期 2012 年 6 月生命科学 Chinese Bulletin of Life Sciences Vol. 24, No. 6 Jun., 2012 文章编号 : (2012) 技术与应用表观遗传学新视点 DNA 羟甲基化王学静, 黄

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1 第 24 卷第 6 期 2012 年 6 月 Chinese Bulletin of Life Sciences Vol. 24, No. 6 Jun., 2012 文章编号 : (2012) 技术与应用表观遗传学新视点 DNA 羟甲基化王学静, 黄庆, 黄君富, 府伟灵 * ( 第三军医大学西南医院检验科, 重庆 ) 摘要 :5- 羟甲基胞嘧啶 (5hmC) 是新发现的一种的修饰碱基, 以低水平存在于哺乳动物的多种细胞类型中 5hmC 是易位 (TET) 家族的酶通过氧化 5- 甲基胞嘧啶 (5mC) 产生的 5hmC 不仅能够降低 MeCP 蛋白的甲基化结合结构域 (MBD) 与甲基化 DNA 的亲和性, 具有潜在的参与基因表达调控的转录调节功能, 而且参与了 DNA 去甲基化过程因此关于 5hmC 的研究日益受到学者们的青睐, 随着 5hmC 甲基化分析和检测方法学日益发展, 发现 5hmC 分布具有组织特异性, 并且 5hmC 在肿瘤组织中含量显著降低, 可能成为某些肿瘤早期诊断的分子标志物关键词 : 表观遗传学 ;DNA 羟甲基化 ; 肿瘤中图分类号 :Q344 文献标志码 :A A new sight of epigenetics 5-hydroxymethylcytosine WANG Xue-Jing, HUANG Qing, HUANG Jun-Fu, FU Wei-Ling* (Department of Laboratory Medicine, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing , China) Abstract: 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) is a new modified base, and presents at low levels in diverse cell types in mammals. 5hmC is generated by the TET(ten-eleven translocation, TET) family of enzymes through oxidation of 5-methylcytosine (5mC). 5hmC can decrease the affiliation between the methyl-cpg binding domain(mbd) of methylcytosine binding proteins(mecp) and methlated DNA, revealing it has the potential function of epigenetic gene regulation. 5hmC also has been proposed as a potential intermediate in active DNA demethylation. Therefore, 5hmC has attracted increasing attention from researchers and more techniques and methods are used to detect 5hmC. Studies report that 5hmC differes in different tissues and is significantly decreased in tumor tissues, which suggest it may be used as a useful molecular marker for tumor diagnosis. Key words: epigenetics; 5-hydroxymethylcytosine; tumor 甲基化胞嘧啶 (5-methylated cytosine, 5mC) 被称之为人类 DNA 的第 5 种碱基已有的研究结果表明, 人类基因组 CpG 岛 (CpG islands) 的 5mC 可以通过影响染色质的结构与功能而影响相关基因的表达水平, 在发育与疾病发生过程中具有重要作用 [1-4] 最近, 研究者又在哺乳动物中发现了被称之为 DNA 第 6 种碱基的一种表观遗传学新修饰, 即 5- 羟甲基胞嘧啶 (5-hydroxymethylcytosine, 5hmC) 目前,5hmC 的生物学功能尚不是很清楚, 但是, 初步研究结果表明, 它在基因表达的调控过程中具有较为重要的作用, 正在成为当前表观遗传学领域的研究热点之一 [5] 1 5hmC 研究的重要性 1.1 5hmC 与 5mC 的相关性 DNA 甲基化是在 DNA 甲基化转移酶 (DNA methytransferase, DNMT) 的作用下, 在基因 DNA 序列 CpG 二核苷酸 (CpG dinucleotides, 基因序列中 5' 3' 方向紧随相连的 CG 碱基, 即 5'-CG-3') 的胞嘧啶 5'- 碳位共价键结合一个甲基基团 (methyl 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( , ) * 通信作者 : weilingfu@yahoo.com

2 522 第 24 卷 group, -CH3) 而形成 5mC [6] 5-hmC 是 5-mC 的羟基化形式,1952 年在噬菌体 DNA 中首次发现 [7] 5mC 转变成 5hmC 的关键酶是易位 (ten-eleven translocation, TET) 家族蛋白 [8] TET 蛋白具有加氧酶 (dioxygenase) 结构域, 在铁离子 (Fe 2+ ) 与 α 酮戊二酸 (2-oxoglutarate, 2OG) 存在的条件下, 可以把 5mC 氧化为 5hmC [9-10] 动物实验发现, 在 DNMT1 或 Np95/Uhrf1 基因敲除的小鼠胚胎干细胞 (embryonic stem, ES) 中 5hmC 含量显著少于野生型小鼠 ES 细胞, 而在 DNMT1 DNMT3a 及 DNMT3b 三基因敲除的小鼠 ES 细胞中 5hmC 几乎全部消失, 提示并证实了 5hmC 来源于之前存在的 5mC [11-14] 1.2 5hmC 的生物学功能预测自 1952 年 Wyatt 和 Cohen [7] 在噬菌体 DNA 中首次发现 5hmC 以来,5hmC 的功能研究一直围绕着它对于噬菌体 DNA 的保护作用 [15] 直至最近, 研究者才发现它在人和小鼠大脑以及胚胎干细胞中广泛存在,5hmC 的功能研究也成为当前表观遗传学领域的研究热点之一 5hmC 的功能还知之甚少, 但普遍认为它参与了 DNA 基因表达调控或去甲基化 [16-17] DNA 甲基化所致相关基因沉默的机制之一是甲基化胞嘧啶结合蛋白 (methylcytosine binding proteins, MeCP) 与甲基化 DNA 结合并形成复合物, 该复合物诱导染色质组蛋白脱乙酰基 (deacetylation) 而导致染色质构象改变, 最终抑制基因转录 [18-19] 5hmC 能够降低 MeCP 蛋白的甲基化结合结构域 (methyl-cpg binding domain, MBD) 与甲基化 DNA 的亲和性, 提示 5hmC 具有潜在的参与基因表达调 [16, 控的转录调节功能 20-22] 目前多个实验室报道了 5hmC 与基因转录活性相关性研究结果, 但结论不一致 :5hmC 富含基因与其转录水平不相关相关 [14, 23-24] [12] 正或负相关 [13] 因此,5hmC 水平与相关基因转录活性之间的相关性还有待于进一步的研究与证实另外, 也有研究提示 5hmC 是 DNA 去甲基化过程中的中间产物 [25-27], 但因缺乏直接证据未得以证实近来 Guo 等 [17] 研究发现, 将 TET1 转染到细胞中进行表达, 某些 5mC 转化为了 5hmC, 而某些则逆转为普通的胞嘧啶 (cytosine, C) ; 将另一种脂蛋白 B mrna 编辑酶催化多肽 1 (apolipoprotein B mrna-editing enzyme-catalytic polypeptide-like 1, APOBEC1) 转染到细胞中表达时, 发现脱甲基化过程得以进一步增强随后,He 等 [28] 发现 DNA 中的 5mC 转化为 5hmC, 二者都可以被 TET 蛋白氧化为 5- 羧基胞嘧啶 (5-carboxylcytosine, 5caC), 而 5caC 又进一步被胸腺嘧啶 DNA 糖基化酶 (thymine- DNA glycosylase, TDG) 识别并切除, 进而通过 DNA 剪切修复途径替换为没有修饰的 C, 从而初步阐明了一条 DNA 主动去甲基化的途径 (5mC 5hmC 5caC C), 为研究 DNA 去甲基化作用及生理功能指明了方向 2 5hmC 检测的方法学目前尽管已经有检测 DNA 甲基化的多种分析技术, 如重亚硫酸盐修饰 (bisulfite modification) 和甲基化 DNA 免疫沉淀 (methylated DNA immunoprecipitation, MeDIP) 等, 但这些技术均不能区分 5mC 和 5hmC, 例如, 在重亚硫酸盐修饰过程中,5mC 和 5hmC 都会被转变成尿嘧啶, 从而在后续的检测 [21, 23, 方法中无法识别二者 29-32] 近年来, 随着分子生物学检测技术的不断发展, 目前, 不仅可探测特定位点的 5hmC, 而且还能分析基因组 5hmC 的水平及其分布特征 [13, 24, 33-35] 2.1 特定位点 5hmC 检测技术是一类可分析特定基因或序列位点 5hmC 状态的分析技术目前市场上出现了可探测特定位点 5hmC 商品化试剂盒, 主要是 NEB 公司的 EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit 和 Zymo Research 公司的 Quest 5-hmC Detection Kit 它们的检测原理大致相同, 均是首先将 5hmC 特异性地转变成 β- 葡萄糖基 -5 羟甲基胞嘧啶 (β-glucosyl-5-hydroxymethylcytosine, β-glu-5hmc or 5ghmC), 然后再基于甲基化敏感限制性内切酶 (methylation sensitive restriction enzyme, MSRE) 及其同裂酶识别和扩增 5-ghmC 和 5mC 所在基因片段具体步骤如下第一步是糖基化用 T4- 葡萄糖基转移酶 (T4-β-glucosyltransferases, T4-BGT) 处理基因组 DNA, 使所有 5hmC 的羟基上添加葡萄糖 (glucose) 转换为 5ghmC, 未修饰胞嘧啶或 5mC 则不受影响, 从而将 5ghmC 和 5mC 区分开来第二步的是限制性内切酶消化 MspI 和 HpaII 识别相同的序列 (CCGG), 但是对不同的甲基化状态敏感其中 MspI 识别并切割未修饰胞嘧啶或 5mC,5ghmC 除外,HpaII 则识别并切割未修饰胞嘧啶,5mC 和 5ghmC 则不受影响第三步是 PCR 扩增和分析不同限制性内切酶的消化产物基因组 DNA 先经糖基化, 接着 MspI 消化后检测到的是 5ghmC 含量,HpaII 消化后检测到的是 5mC 和 5ghmC 总量, 未经酶消化后检测的是 DNA

3 第 6 期王学静, 等 : 表观遗传学新视点 DNA 羟甲基化 523 总量上述两款试剂盒的区别在于前一款包含了 MspI, 而后一款不包含对 5-ghmC 敏感的限制性内切酶内切酶处理之后, 可开展多种下游分析, 如 qpcr 新一代测序 Southern 杂交芯片等此类试剂盒的优点是操作简便, 只需三步 2.2 全基因组 5hmC 检测技术全基因组 5hmC 检测检测技术目前主要有两类, 分别是依赖抗原 - 抗体免疫作用原理的沉淀检测技术和不依赖于上述原理的非沉淀检测技术依赖于免疫原理的沉淀检测技术是利用一些酶和化学反应的组合来分离出包含单个 5-hmC 的 DNA 片段, 然后采用沉淀或免疫沉淀技术可达到对 5hmC 的特异性分析该类技术主要包括 5hmC 免疫沉淀 (5hmC immunoprecipitation, 5hmC-IP) [24, 33-34] 抗 5- 亚甲基磺酸胞嘧啶 (antiserum to cytosine 5-methylenesulphonate, anti-cms) [13] 结合蛋白 J(J-binding protein, JBP) 沉淀 [35] 糖基化高碘酸氧化和生物素化 (glucosylation, periodate oxidation, biotinylation, GLIB) 处理等 [13] 5hmC-IP 是目前研究 5hmC 较为常用的方法之一, 也是较其他沉淀技术更为直接的方法 5hmC- IP 采用的 5hmC 特异抗体能够使 5hmC 直接免疫沉淀, 具有良好的灵敏性 [24] anti-cms 是基因组 DNA 经重亚硫酸氢钠, 将 5hmC 转换成 5- 亚甲基磺酸胞嘧啶 (cytosine 5-methylenesulphonate, CMS), 然后利用 CMS 特异抗体免疫沉淀 CMS DNA 序列 JBP 沉淀是 5hmC 在 T4-BGT 作用下转换为 β-glu- 5hmC, 然后磁珠偶联 JBP 将其沉淀 GLIB 是利用 T4-BGT 5hmC 转换为 5ghmC, 然后用高碘酸钠氧化葡萄糖, 它将邻近的羟基转化成醛基, 之后用醛基反应性探针进一步修饰, 在每个 5hmC 上添加两个生物素分子, 并利用链霉亲和素来沉淀与 5hmC-IP 相比, 选择性标记 5hmC 后再对标记物进行免疫沉淀则具有不依赖 5hmC 的浓度和更高灵敏度的特点 [13, 35-36] 不依赖于沉淀的检测技术主要包括薄层色谱法 (thin-layer chromatography) 高压液相色谱法 (highpressure liquid chromatography) 质谱法 (mass spectrometry) [37] 5hmC 葡萄糖基化定量测定 (Quantitative hmc glucosylation assay) [11] 单分子实时 DNA 测序 (single-molecule real-time DNA sequencing, SMRT) [38] 和选择性化学标记 SMRT 技术 [39] 前三种方法因不适用于大样本实验检测而受到限制 5hmC 葡萄糖基化定量测定是在 T4-BGT 作用下在 5hmC 上添加一个放射性标记 3 H 的葡萄糖, 然后采用液体闪烁计数器进行检测其特点是不依赖于特定的设备, 不产生序列偏倚, 并且所需样本量小 SMRT 技术采用的是对 DNA 聚合酶的工作状态进行实时监测的方法, 属于第三代核酸测序技术 DNA 聚合酶催化荧光标记的核苷酸掺入到互补的核酸链中, 核苷酸的掺入产生荧光脉冲, 然后依据荧光颜色鉴定出核苷酸, 当聚合酶切断连接在核苷酸末端的荧光基团时, 脉冲终止荧光脉冲的到达时间和持续时间与 DNA 聚合酶的动力学相关, 根据 5mC 和 5hmC 等各种修饰对聚合酶动力学的影响不一, 从而能够将它们区分和检测选择性化学标记 SMRT 是利用第三代单分子测序技术和 5hmC 的选择性化学标记方法来高通量检测 5hmC 首先 5hmC 在 T4- BGT 作用下转换为 N3-5-gmC, 之后通过生物素连接磁珠富集和二硫键断裂一系列反应生成 HS- N3-5-gmC, 最后 SMRT 测序与单纯 SMRT 技术检测 5hmC 相比, 由于动力学信号的大幅增加, 在单分子读取中可准确指定 5hmC 的位点, 而无需与未修饰的对照样品进行比较 3 5hmC 在人体组织学分布特征及其在疾病状态下的变化特征 Li 和 Liu [24] 首次对人体正常组织中 5hmC 分布进行研究, 发现人体不同类型组织中 5hmC 分布存在差异性, 在脑组织中含量最高 (0.67 ), 肝脏 (0.46 ) 肾脏 (0.38 ) 结肠 (0.45 ) 直肠 (0.57 ) 组织含量次之, 肺脏组织含量较低 (0.14 ), 胎盘 (0.06 ) 心脏乳腺 (0.05 ) 组织含量最低随后的研究也发现 5hmC 分布具有组织特异性, 脑组织 5hmC 含量十分丰富, 尤其是大脑皮质与 5hmC 在小鼠不同组织中的分布相似近,Nestor 等 [41] [33, 40-41] 这 [11, 37, 42] 最报道推测 5hmC 水平与组织增殖率有关, 低增殖能力组织中 5hmC 含量较高, 高增殖能力组织中 5hmC 含量较低 Haffner 等 [43] 研究发现,5hmC 水平与组织细胞分化程度存在相关性, 终末分化细胞中 5hmC 含量最高, 干细胞或者元祖细胞中 5hmC 含量较低 Szulwach 等 [44] 通过绘制小鼠在 3 个不同年龄阶段小脑和海马 2 个脑区域中 5hmC 的模式图谱, 揭示了在发育和衰老过程中 5hmC 是随着年龄维持在稳定状态或逐渐增长的分布模式 ; 该研究小组还发现,5hmC 水平与 MeCP 蛋白含量存在负相关性, 提示 5hmC 可能在雷特综合征 (Rett syndrome) 和孤独症等神经障碍性疾病的

4 524 第 24 卷发生发展起着重要作用 Li 和 Liu [24] 的研究还发现, 结肠癌和直肠癌组织中 5hmC 含量明显降低在 HeLa 宫颈癌细胞系 HCT116 和 SW620 结肠癌细胞系及 AN3CA 子宫内膜癌细胞系中几乎检测不到 5hmC 在后来的研究 [41, 43, 中相继发现在其他肿瘤组织中 5hmC 含量降低 45] Jin 等 [45] 报道肺癌组织中 5hmC 含量降低, 大脑肿瘤组织中 5hmC 水平减少更为明显, 几乎不到正常组织含量的 1/30, 同时在皮肤癌乳腺癌子宫癌胰腺癌小肠癌肝癌和肾脏肿瘤组织中 5hmC 含量也明显降低, 结果推测肿瘤组织 5hmC 含量降低与肿瘤细胞高增殖率有关, 并且肿瘤组织中 5hmC 生成与消除过程存在着异常 Haffner 等 [43] 发现前列腺癌乳腺癌和结肠癌组织中 5hmC 水平显著降低, 研究结果提示 5hmC 可能在肿瘤发生和发展过程中起一定阻碍作用, 其机制可能为 5hmC 通过改变 DNA 甲基化状态来阻止肿瘤抑制基因和凋亡基因失活,5hmC 水平的降低使得上述基因缺乏保护导致肿瘤发生 4 结论 5hmC 是 TET 家族的酶通过氧化 5mC 产生的, 可能参与了 DNA 去甲基化或基因表达调控, 具有重要的生物学作用但 5hmC 与肿瘤关系的研究尚处于初步探索阶段, 肿瘤组织中 5hmC 水平显著降低, 并且不同肿瘤组织中 5hmC 含量变化不同, 说明其可能在肿瘤发生和发展过程中起一定作用, 在不同来源的肿瘤发生过程中发挥作用的方式及调控机制可能不同目前确切的作用和分子机制尚不十分清楚,5hmC 在肿瘤组织中含量的改变可能与其在肿瘤细胞甲基化率及增殖率等机制的调控有关随着 5hmC 甲基化分析和检测方法学的发展, 人们将进一步揭示 5hmC 与肿瘤发展进程的相关性 5hmC 作为一种表观遗传学新修饰, 在肿瘤中的特异性使其有望成为肿瘤早期诊断和肿瘤患者预后的标志物 [ 参考文献 ] [1] Baylin SB, Herman JG. DNA hypermethylation in tumorgenesis: epigenetics joins genetics. Trends Gent, 2000, 16(4): [2] Reik W, Dean W, Walter J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science, 2001, 293(5532): [3] Jubb AM, Quirke P, Oates AJ. DNA methylation, a biomarker for colorectal cancer: implications for screening and pathological utility. Ann N Y Acad Sci, 2003, 983: [4] Carmona FJ, Esteller M. DNA methylation in early neoplasia. CancerBiomark, 2011, 9(1-6): [5] Münzel M, Globisch D, Carell T. 5-Hy droxymethylcytosine, the sixth base of the genome. Angew Chem Int Ed Engl, 2011, 50(29): [6] Bestor TH. The DNA methyltransferases of mammals. Hum Mol Genet, 2000, 9(16): [7] Wyatt GR, Cohen SS. A new pyrimidine base from bacteriophage nucleic acids. Nature, 1952, 170(4338): [8] Tahiliani M, Koh KP, Shen Y, et al. Conversion of 5- methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science, 2009, 324 (5929): [9] Ito S, D'Alessio AC, Taranova OV, et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature, 2010, 466 (7310): [10] Iyer LM, Tahiliani M, Rao A, et al. Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids. Cell Cycle, 2009, 8(11): [11] Szwagierczak A, Bultmann S, Schmidt CS, et al. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res, 2010, 38(19): e181 [12] Williams K, Christensen J, Pedersen MT, et al. TET1 and hydroxymethylcytosine in transcription and DNA methylation fidelity. Nature, 2011, 473 (7347): [13] Pastor WA, Pape UJ, Huang Y, et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature, 2011, 473(7347): [14] Ficz G, Branco MR, Seisenberger S, et al. Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation. Nature, 2011, 473(7347): [15] Wyatt GR, Cohen SS. The bases of the nucleic acids of some bacterial and animal viruses: the occurrence of 5-hydroxymethylcytosine. Biochem J, 1953, 55(5): [16] Valinluck V, Tsai HH, Rogstad DK, et al. Oxidative damage to methyl-cpg sequences inhibits the binding of the methyl-cpg binding domain (MBD) of methyl-cpg binding protein 2 (MeCP2). Nucleic Acids Res, 2004, 32(14): [17] Guo JU, Su Y, Zhong C, et al. Hydroxylation of 5- methylcytosine by TET1 promotes active DNA demethylation in the adult brain. Cell, 2011, 145(3): [18] Meehan RR, Lewis JD, McKay S, et al. Identification of a mammalian protein that binds specifically to DNA containing methylated CpGs. Cell, 1989, 58(3): [19] Lewis JD, Meehan RR, Henzel WJ, et al. Purification, sequence, and cellular localization of a novel chromosomal protein that binds to methylated DNA. Cell, 1992, 69(6):

5 第 6 期王学静, 等 : 表观遗传学新视点 DNA 羟甲基化 525 [20] Illingworth RS, Bird AP. CpG islands--'a rough guide'. FEBS Lett, 2009, 583(11): [21] Jin SG, Kadam S, Pfeifer GP. Examination of the specificity of DNA methylation profiling techniques towards 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine. Nucleic Acids Res, 2010, 38(11): e125 [22] Frauer C, Hoffmann T, Bultmann S, et al. Recognition of 5-hydroxymethyl-cytosine by the Uhrf1 SRA domain. PLoS One, 2011, 6(6): e21306 [23] Huang Y, Pastor WA, Shen Y, et al. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One, 2010, 5(1): e8888 [24] Li W, Liu M. Distribution of 5-hydroxymethylcytosine in different human tissues. J Nucleic Acids, 2011, 2011: [25] Liutkeviciute Z, Lukinavicius G, Masevicius V, et al. Cytosine-5-methyltransferases add aldehydes to DNA. Nat Chem Biol, 2009, 5(6): [26] Loenarz C, Schofield CJ. Oxygenase catalyzed 5-methylcytosine hydroxylation. Chem Biol, 2009, 16(6): [27] Wu SC, Zhang Y. Active DNA demethylation: many roads lead to Rome. Nat Rev Mol Cell Biol, 2010, 11(9): [28] He YF, Li BZ, Li Z, et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science, 2011, 333(6047): [29] Esteller M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nat Rev Genet, 2007, 8(4): [30] Hahn MA, Pfeifer GP. Methods for genome-wide analysis of DNA methylation in intestinal tumors. Mutat Res, 2010, 693(1-2): [31] Tost J. DNA methylation: an introduction to the biology and the disease-associated changes of a promising biomarker. Methods Mol Biol, 2009, 507: 3-20 [32] Nestor C, Ruzov A, Meehan R, et al. Enzymatic approaches and bisulfite sequencing cannot distinguish between 5-methylcytosine and 5-hydroxymethyl-cytosine in DNA. Biotechniques, 2010, 48(4): [33] Jin SG, Wu X, Li AX, et al. Genomic mapping of 5- hydroxymethylcytosine in the human brain. Nucleic Acids Res, 2011, 39(12): [34] Ko M, Huang Y, Jankowska AM, et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature, 2010, 468(7325): [35] Robertson AB, Dahl JA, Vågbø CB, et al. A novel method for the efficient and selective identification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res, 2011, 39(8): e55 [36] Song CX, Szulwach KE, Fu Y, et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Biotechnol, 2011, 29(1): [37] Kriaucionis S, Heintz N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science, 2009, 324(5929): [38] Flusberg BA, Webster DR, Lee JH, et al. Direct detection of DNA methylation during single-molecule, real-time sequencing. Nat Methods, 2010, 7(6): [39] Song CX, Clark TA, Lu XY, et al. Sensitive and specific single-molecule sequencing of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Methods, 2011, 9(1): 75-7 [40] Kinney SM, Chin HG, Vaisvila R, et al.tissue-specific distribution and dynamic changes of 5-hydroxymethylcytosine in mammalian genomes. J Biol Chem, 2011, 286(28): [41] Nestor CE, Ottaviano R, Reddington J, et al. Tissue type is a major modifier of the 5-hydroxymethylcytosine content of human genes. Genome Res, 2012, 22(3): [42] Globisch D, Münzel M, Müller M, et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethyl-cytosine and search for active demethylation intermediates. PloS One, 2010, 5(12): e15367 [43] Haffner MC, Chaux A, Meeker AK, et al. Global 5-hydroxymethylcytosine content is significantly reduced in tissue stem/progenitor cell compartments and in human cancers. Oncotarget, 2011, 2(8): [44] Szulwach KE, Li X, Li Y, et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat Neurosci, 2011, 14(12): [45] Jin SG, Jiang Y, Qiu R, et al. 5-Hydroxymethylcytosine is strongly depleted in human cancers but its levels do not correlate with IDH1 mutations. Cancer Res, 2011, 71(24):

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第 24 卷第 6 期 2012 年 6 月 生命科学 Chinese Bulletin of Life Sciences Vol. 24, No. 6 Jun., 2012 文章编号 : (2012) 技术与应用 表观遗传学新视点 DNA 羟甲基化 王学静, 黄

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