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1 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2013, 35(6): DOI: /cjcb 研究论文 TGF-β1 诱导人前列腺癌 PC3 细胞上皮间叶化的研究陈丹扬刘浩王昊王险峰杜军 * ( 中山大学药学院微生物与生化药学实验室, 广州 ) 摘要上皮细胞间叶化 (epithelial-mesenchymal transition, EMT) 与肿瘤侵袭转移密切相关, 转化生长因子 -β(transforming growth factor-beta, TGF-β) 已被证实为肿瘤 EMT 的主要诱导剂该研究旨在探讨 TGF-β1 对人前列腺癌 PC3 细胞 EMT 发生的诱导作用经 TGF-β1 处理的 PC3 细胞, 在相差倒置显微镜下观察到细胞形态由上皮型向间叶型转化 ; 细胞划痕和 Transwell 实验检测细胞的迁移能力较对照组显著增强 ; Real-time PCR Western blot 和细胞免疫荧光验证 TGF-β1 能上调间叶型标记蛋白的表达及下调上皮型标志蛋白的表达进一步发现, TGF-β1 对转录因子 Snail 的表达没有明显的影响, 但是能促进 Snail 的入核, 干扰 Snail 能逆转 TGF-β1 对 PC3 细胞 EMT 发生的诱导作用该研究表明, TGF-β1 能够介导 Snail 的入核而激活 Snail, 促进前列腺癌 PC3 细胞的发生关键词 TGF-β1; 上皮细胞间叶化 ; Snail; 前列腺癌 TGF-β1-induced Epithelial-mesenchymel Transition in Human Prostate Cancer Cells PC3 Chen Danyang, Liu Hao, Wang Hao, Wang Xianfeng, Du Jun* (Department of Microbial and Biochemical Pharmacy, School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou , China) Abstract It has been proved that epithelial-mesenchymal transition (EMT) is correlated with tumor invasion and metastasis. Transforming growth factor-beta (TGF-β) has been identified as a main inducer of EMT. The aim of this study is to investigate the effects of TGF-β1 on EMT in human prostate cancer PC3 cells. We found that TGF-β1 treatment could induce morphological alteration of PC3 cells from epithelial morphology to mesenchymal morphology. Wound healing assay and Transwell assay showed that TGF-β1 significantly increases the migration of PC3 cells. Real-time PCR, Western blot and immunoflurescence staining demonstrated that TGF-β1 up-regulates the expression of mesenchymal makers and down-regulates epithelial markers. Furthermore, TGF-β1 treatment does not alter the expression of Snail, but promotes Snail nuclear localization. Interestingly, knockdown of Snail by sirna dramatically attenuates TGF-β1-induced EMT. These results demonstrated that TGF-β1 could induce EMT in PC3 cells by promoting Snail nuclear localization. Key words TGF-β1; EMT; Snail; prostate cancer 收稿日期 : 接受日期 : 国家重点基础研究发展计划 (973) 项目 ( 批准号 : 2011CB935803) 和国家自然科学基金 ( 批准号 : ) 资助的课题 * 通讯作者 Tel/Fax: , dujun@mail.sysu.edu.cn Received: January 15, 2013 Accepted: March 19, 2013 This work is supported by the State Key Development Program for Basic Research of China (Grant No.2011CB935803) and the National Natural Science Foundation of China (Grant No , ) *Corresponding author. Tel/Fax: , dujun@mail.sysu.edu.cn 网络出版时间 : :02 URL:

2 陈丹扬等 : TGF-β1 诱导人前列腺癌 PC3 细胞上皮间叶化的研究 769 前列腺癌 (prostate cancer, PCa) 是发生于男性前列腺组织中的恶性肿瘤, 其发病率与死亡率均逐年增加, 而骨转移则是前列腺癌的重要临床特征及致死原因 [1] 前列腺癌的发生发展依赖于基质与上皮细胞通过旁分泌调控的相互作用转化生长因子 -β (transforming growth factor-beta, TGF-β) 主要由前列腺基质细胞产生, 是一种具有多种生物学活性的多肽类细胞因子, 以旁分泌的方式调控前列腺上皮细胞的增殖与分化研究发现, TGF-β 在前列腺癌的发生发展中具有双重作用其可抑制正常前列腺上皮和早期前列腺癌细胞的增殖, 而在进展期则可促进肿瘤的侵袭转移 [2] TGF-β 可通过多种机制促进前列腺癌的进展, 如促血管新生抑制宿主免疫系统诱导细胞自身及周围基质微环境改变等 [3] 上皮细胞间叶化 (epithelial-mesenchymal transition, EMT) 是指呈现上皮样表型的细胞失去极性, 表现出增强的活动能力, 在细胞基质间能够自由移动且呈现纤维样表型的转化过程 [4] 最近研究表明, EMT 在肿瘤侵袭转移过程中起重要作用, TGF-β 已被证实为多种肿瘤 EMT 发生的主要诱导剂, 进而促进肿瘤侵袭转移 [5] 研究表明, 前列腺癌细胞中 TGF-β 的家族成员 TGF-β1 的表达水平与肿瘤细胞的侵袭能力正相关 [6], 且前列腺癌中 TGF-β1 高表达, 往往与临床预后不良有关 [7] 本文旨在探讨 TGF-β1 对人前列腺癌 PC3 细胞 EMT 发生的诱导作用及作用机制, 为阐明前列腺癌细胞侵袭转移机制以及前列腺癌的防治提供新线索 1 材料与方法 1.1 材料人前列腺癌 PC3 细胞购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库 DMEM 培养基胎牛血清胰蛋白酶购自 Gibco 公司 ; TGF-β1 购自 Peprotech 公司 ; E-cadherin Vimentin N-cadherin Fibronectin(FN) 和 β-actin α-tubulin 抗体购自 Santa Cruz 公司 ; Snail 抗体购自 CST 公司 ; 预染蛋白质 Marker 购自 Fermentas 公司 ; HRP 标记山羊抗鼠 IgG 山羊抗兔 IgG 购自北京鼎国生物技术有限公司 ; FITC 标记的羊抗小鼠 IgG DAPI 转染试剂 Lipofectamine TM 2000 购自 Invitrogen 公司 ; ECL 化学发光底物试剂盒购自 Pierce 公司 ; Quick Start Bradford 蛋白定量试剂购自 Bio-Rad 公司 ; 反转录试剂盒 RT-PCR 试剂盒购自 TaKaRa 公司 ; PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成 ; 其余试剂均为国产分析纯以上 1.2 细胞培养人前列腺癌 PC3 细胞用含 10% 胎牛血清 (fetal calf serum, FBS) 的 DMEM 培养液, 于 37 C 5% CO 2 的饱和湿度培养箱内培养 1~2 d 换液, 每 3~4 d 传代 1 次, 实验时选用对数生长期细胞 1.3 细胞划痕实验收集细胞, 用胰酶消化成单细胞悬液, 按 /ml 的密度接种于 6 孔板, 37 C 5% CO 2 培养箱中培养 12 h 取一个干净的 20 µl 无菌枪头, 用其尖端分别在 6 孔板的各组细胞上划痕 PBS 清洗细胞 3 次, 去除划下的细胞, 加入含 0.1% FBS 的 DMEM 培养基倒置显微镜下观察, 取各组细胞培养孔中划痕宽度相等的位置拍照将细胞放置于 37 C 5% CO 2 的恒温培养箱中继续培养, 48 h 后观察同一位置的细胞并拍照应用 Image-Pro Plus 软件计算各组细胞的划痕宽度, 并做柱状图分析细胞迁移情况 1.4 Transwell 肿瘤细胞迁移实验将 Transwell 小室放入培养板中, 在上室加入 300 µl 预温的无血清培养基, 室温下静置 15~30 min, 使基质胶再水化消化细胞, 用 PBS 洗 2 遍, 用无血清培养基重悬调整细胞密度至 /ml 取细胞悬液 200 µl 加入 24 孔板 Transwell 小室 24 孔板下室加入 500 µl 含 FBS 的培养基对种在 24 孔板 Transwell 小室的细胞进行处理继续培养 48 h 后, 对下室细胞进行苏木素染色, 每组随机取 5 个视野进行计数, 并做柱状图分析 TGF-β1 对细胞侵袭能力的影响 1.5 Real-time PCR 按照 Trizol(Invitrogen) 说明书方法提取细胞总 RNA, 按 Primescript RT reagent Kit 反转录试剂盒 (TaKaRa) 说明书将 RNA 反转录为 cdna 引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成, 引物序列如下, Vimentin 上游引物 : 5 -TGA GTA CCG GAG ACA GGT GCA G-3, 下游引物 : 5 -TAG CAG CTT CAA CG GCA AAG TTC-3 ; E-cadherin 上游引物 : 5 -TAC ACT GCC CAG GAG CCA GA-3, 下游引物 : 5 -TGG CAC CAG TGT CCG GAT TA-3 ; FN 上游引物 : 5 - GGA GCA AAT GGC ACC GAG ATA-3, 下游引物 : 5 -GAG CTG CAC ATG TCT TGG GAA C-3 ; Snail

770 研究论文上游引物 : 5 -GAC CAC TAT GCC GCG CTC TT-3, 下游引物 : 5 -TCG CTG TAG TTA GGC TTC CGA TT-3 ; GAPDH 上游引物 : 5 -GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3, 下游引物 : 5 -TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3 Real-time PCR

3 770 研究论文上游引物 : 5 -GAC CAC TAT GCC GCG CTC TT-3, 下游引物 : 5 -TCG CTG TAG TTA GGC TTC CGA TT-3 ; GAPDH 上游引物 : 5 -GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3, 下游引物 : 5 -TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3 Real-time PCR 反应体系及条件参照 SYBR Premix Ex Tap TM 试剂盒 (TaKaRa), 2 ΔΔCT 法计算 mrna 的相对表达量, 以 GAPDH 作为内参每个实验组重复 3 次 1.6 RNA 干扰实验采用 DMEM 培养基 ( 含 10% FBS) 培养接种于 6 孔板的 PC3 细胞, 细胞密度达 70% 时, 参照 Lipofectamne TM 2000 转染试剂说明书进行转染, 用不含血清的 opti-mem 培养基培养 6 h 之后, 更换 DMEM 培养基, 加入 TGF-β1 处理, 连续培养 48 h Western blot 检测细胞 EMT 标记物的表达情况 1.7 蛋白提取和 Western blot 分析收集实验细胞, 经 PBS 洗涤后用三去污裂解液 [50 mmol/l Tris-HCl(pH8.0) 150 mmol/l NaCl 0.2 g/l 叠氮钠 100 mg/l Aprotin 100 mg/l PMSF 1 g/l SDS 10 g/l NP-40 5 g/l 去氧胆酸钠 ] 裂解, 离心后收集上清, 用 Bradford 法测定蛋白浓度 ; 等量蛋白样品经 10% 的 SDS-PAGE 电泳分离后, 转印至 PVDF 膜上, 5% 脱脂奶粉室温封闭 2 h, E-cadherin Vimentin N-cadherin FN Snail β-actin α-tubulin 一抗均以 1:1 000 比例稀释, 4 C 孵育过夜经 PBST 洗涤后, 加入 HRP 标记的特异性二抗以 1:5 000 比例稀释, 室温下孵育 2 h, 最后用 ECL 化学发光试剂对 X 光片显影, 扫描图片 1.8 激光共聚焦免疫荧光分析 PC3 细胞以 /ml 的密度接种于 35 mm 激光共聚焦培养皿中, 经 TGF-1 处理 72 h 后, 用冰冷的 PBS 洗 3 次, 4% 多聚甲醛固定 30 min, 正常山羊血清封闭 30 min, E-cadherin Vimentin Snail 一抗以 1:200 比例稀释, 4 C 孵育过夜 PBS 洗涤之后, 再以 FITC 标记的羊抗小鼠 IgG 以 1:500 比例稀释, 室温孵育 1 h, PBS 洗 3 次, 用 100 ng/ml 的 DAPI 复染 10 min, ZEISS LSM710 激光共聚焦显微镜下观察并拍照 1.9 统计学方法每组实验重复 3 次, 应用 GraphPad Prism 5.0 软件进行统计学分析, 组间比较用单因素方差分析 (One-way analysis of variance), P<0.05 表示有统计学差异 2 结果 2.1 TGF-β1 诱导对 PC3 细胞形态及细胞迁移能力的影响 TGF-β1 处理 72 h 后, 倒置相差显微镜观察 PC3 细胞形态的变化结果发现, 对照组细胞呈多角形铺路石样, 细胞之间连接紧密 TGF-β1 处理条件下的 PC3 细胞呈梭形间叶细胞样, 散在生长 ( 图 1A) 进一步采用细胞划痕实验和 Transwell 实验检测 PC3 细胞的迁移能力 TGF-β1 处理 48 h 后, 处理组细胞中间的划痕间隙与对照组相比明显变窄 ( 图 1B) Transwell 实验结果显示, TGF-β1 处理组细胞穿过 Transwell 小室的数量比对照组显著性增多 (P<0.05)( 图 1C) 因此, 通过肿瘤细胞划痕实验及 Transwell 实验, 我们初步证实 TGF-β1 诱导能增强 PC3 细胞的迁移能力 (A) (B) (C) A: 相差显微镜观察 TGF-β1 诱导的 PC3 细胞形态变化 ; B: 划痕实验检测 TGF-β1 诱导的 PC3 细胞迁移能力的变化 ; C: Transwell 实验检测 TGF-β1 诱导的 PC3 细胞迁移能力的变化标尺 =100 µm A: phase contrast images of PC3 cells treated with or without TGF-β1 (10 ng/ml) for 72 h; B: wound healing assay of PC3 cells treated with or without TGF-β1(10 ng/ml) for 48 h; C: Transwell cell migration assay of PC3 cells treated with or without TGF-β1(10 ng/ml) for 48 h. Bar=100 µm. 图 1 TGF-β1 诱导 PC3 细胞形态及迁移能力的变化 Fig.1 The change of cell morphology and migration in TGF-β1 induced PC3 cells

陈丹扬等 : TGF-β1 诱导人前列腺癌 PC3 细胞上皮间叶化的研究 771 (A) (B) (C) A: TGF-β1 诱导下, PC3 细胞 EMT 标记物 mrna 表达水平的变化 ; B: TGF-β1 诱导下, PC3 细胞 EMT 标记物蛋白表达水平的变化 ; C: 免疫荧光染色检测 TGF-β1 诱导下的 PC3 细胞 EMT 标记物表达的变化, 红色 :

4 陈丹扬等 : TGF-β1 诱导人前列腺癌 PC3 细胞上皮间叶化的研究 771 (A) (B) (C) A: TGF-β1 诱导下, PC3 细胞 EMT 标记物 mrna 表达水平的变化 ; B: TGF-β1 诱导下, PC3 细胞 EMT 标记物蛋白表达水平的变化 ; C: 免疫荧光染色检测 TGF-β1 诱导下的 PC3 细胞 EMT 标记物表达的变化, 红色 : E-cadherin, 绿色 : vimentin, 蓝色 : 细胞核 ; 标尺 =20 µm A: mrna expression of EMT markers in PC3 cells treated with or without TGF-β1 (10 ng/ml) for 72 h; B: protein expression of EMT markers in PC3 cells treated with or without TGF-β1 (10 ng/ml) for 72 h; C: immunofluorescence staining of EMT markers in PC3 cells with TGF-β1 treatment, Red: E-cadherin, Green: vimentin, Blue: nuclei; bar=20 µm. 图 2 TGF-β1 诱导引起 PC3 细胞 EMT 标记物表达的变化 Fig.2 The change in EMT markers expression in PC3 cells induced by TGF-β1 2.2 TGF-β1 诱导对 PC3 细胞 EMT 相关标志物表达的影响 TGF-β1 处理 PC3 细胞 72 h 后, 分别提取细胞总 RNA 和细胞总蛋白, Real-time PCR Western blot 检测细胞内上皮型蛋白标志物 E-cadherin 间叶型蛋白标志物 Vimentin N-cadherin 和 FN 的表达变化如图 2 所示, TGF-β1 能够明显地抑制 E-cadherin mrna 和蛋白的表达促进 Vimentin N-cadherin 以及 FN mrna 和蛋白的表达 ( 图 2A 和图 2B) 此外, 通过细胞免疫荧光实验也证实了 Western blot 的结果, E-cadherin 蛋白表达明显下调, 而 Vimentin 蛋白表达明显上调 ( 图 2C) 2.3 Snail 在 TGF-β1 诱导 PC3 细胞 EMT 发生中的作用为了进一步解释 TGF-β1 诱导 PC3 细胞 EMT 发生的分子机制, 我们对 EMT 过程中关键转录因子 Snail 进行了检测结果发现 TGF-β1 处理的 PC3 细胞, Snail 的 mrna 和蛋白表达与对照组相比没有明显的

772 研究论文 (A) (B) (C) A: Snail 在 TGF-β1 诱导的 PC3 细胞中 mrna 和蛋白水平的变化 ; B: 免疫荧光染色检测 TGF-β1 诱导的 PC3 细胞中 Snail 的入核, 绿色 : Snail, 蓝色 : 细胞核, 标尺 =20 µm; C: 干扰 Snail 之后, EMT 标记物在 TGF-β1 诱导下的蛋白水平的变化 A: mrna and

5 772 研究论文 (A) (B) (C) A: Snail 在 TGF-β1 诱导的 PC3 细胞中 mrna 和蛋白水平的变化 ; B: 免疫荧光染色检测 TGF-β1 诱导的 PC3 细胞中 Snail 的入核, 绿色 : Snail, 蓝色 : 细胞核, 标尺 =20 µm; C: 干扰 Snail 之后, EMT 标记物在 TGF-β1 诱导下的蛋白水平的变化 A: mrna and protein expression of Snail in PC3 cells treated with or without TGF-β1(10 ng/ml) for 72 h; B: immunofluorescence staining of Snail nuclear localization in PC3 cells with TGF-β1 treatment, Green: Snail, Blue: nuclei, bar=20 µm; C: protein expression of EMT markers in TGF-β1- induced PC3 cells transfected with Snail sirna for 48 h. 图 3 TGF-β1 诱导 PC3 细胞发生 EMT 的机制 Fig.3 The mechanism of TGF-β1-induced EMT in PC3 cells 变化 ( 图 3A) 然而, 免疫荧光实验发现 TGF-β1 能显著促进 Snail 的入核 ( 图 3B) 进一步采用 RNA 干扰技术干扰细胞内 Snail 的表达再进行 TGF-β1 处理, 结果发现干扰 Snail 能明显逆转 TGF-β1 对 PC3 细胞上皮型蛋白标志物 E-cadherin 的抑制作用, 以及对间叶型蛋白标志物 N-cadherin FN 的诱导作用 ( 图 3C) 3 讨论前列腺癌骨转移是恶性前列腺癌的主要特征之一, 是导致前列腺癌患者死亡的首要因素研究表明, 前列腺癌中 TGF-β 表达水平与临床预后不良密切相关, TGF-β 可通过促血管新生抑制宿主免疫系统诱导细胞自身及周围基质微环境改变等多 [3] [8] 种机制促使前列腺癌进展丁国芳等检测前列腺癌组织中 TGF-β 的表达, 结果显示前列腺癌组织 TGF-β 的表达率明显高于癌旁正常组织, 低分化癌转移癌 TGF-β 表达的阳性率明显高于高分化癌, 提示 TGF-β 可促进前列腺癌的生长, 增强前列腺癌的侵袭能力, 从而导致前列腺癌的转移 EMT 是上皮细胞与周围间质相互作用过程中逐渐获得某些间叶细胞特有表型, 目前被认为是肿瘤转移的关键启动步骤, 参与包括前列腺癌在内

6 陈丹扬等 : TGF-β1 诱导人前列腺癌 PC3 细胞上皮间叶化的研究 773 [9] 的多种肿瘤的侵袭转移过程近年来, 在肿瘤发生发展及某些纤维化疾病的过程中, TGF-β 作为 [5] EMT 的主要诱导剂备受关注研究发现, TGF-β 同 [10] 样参与了前列腺癌 EMT 过程 Ao 等发现, TGF-β 可抑制非致瘤性前列腺细胞株 BPH1 的生长, 但可诱导致瘤性的前列腺细胞株 BPH1CAFTD1 BPH1- [11] CAFTD3 BPH1CAFTD5 发生 EMT Yang 等发现, TGF-β 超家族成员 BMP7 可诱导人前列腺癌细胞株 PC3 发生 EMT 我们发现, 未处理的前列腺癌 PC3 细胞呈典型的上皮细胞形态, 经 TGF-β1 处理后大部分细胞形态向长梭形间叶细胞样转变, 细胞间连接也变得疏松, 细胞散在分布, 同时细胞的迁移能力明显增强通过检测 EMT 相关基因和蛋白表达分析, 证实了前列腺癌 PC3 细胞经过 TGF-β1 诱导后确实发生了 EMT, 其中上皮型标志蛋白 E-cadherin 显著下降, 间叶型标志蛋白 N-cadherin Vimentin 和 FN 显著增加, 从而导致 PC3 细胞渐渐失去了上皮细胞的特性和功能肿瘤 EMT 发生主要受一类转录抑制因子超家族成员调控, 其中 Snail 是肿瘤 EMT 发生的一个重要 [12] 的调节者众多研究表明, Snail 在肿瘤组织中被异常活化, 通过调控肿瘤细胞发生 EMT 的改变从而 [13-14] 赋予肿瘤细胞移动和侵袭的能力我们发现, 干扰 Snail 转录因子明显逆转 TGF-β1 对 PC3 细胞 EMT 的诱导作用, 说明 Snail 转录因子是 TGF-β1 诱导 PC3 细胞 EMT 发生的关键分子此外, TGF-β1 虽然不能促进 Snail 的表达, 但是能显著促进 Snail 的入核而激活 Snail, 进而发挥其对 EMT 标志蛋白的转录调控作用, 使 E-cadherin 等上皮型蛋白标志物的表达下调, Vimentin 等间叶型蛋白标志物的表达上调, 最终导致 EMT 的发生和肿瘤转移总之, 我们研究发现 TGF-β1 能够通过介导 Snail 的入核而激活 Snail, 促进前列腺癌 PC3 细胞的发生以及增强细胞浸润和转移能力, 为靶向抑制前列腺癌 EMT 发生和转移提供重要的理论基础参考文献 (References) 1 Sturge J, Caley MP, Waxman J. Bone metastasis in prostate cancer: Emerging therapeutic strategies. Nat Rev Clin Oncol 2011; 8(6): Danielpour D. Functions and regulation of transforming growth factor beta in the prostate. Eur J Cancer 2005; 41(6): Jones E, Pu H, Kyprianou N. Targeting TGF-beta in prostate cancer: Therapeutic possibilities during tumor progression. Expert Opin Ther Targets 2009; 13(2): Książkiewicz M, Markiewicz A, Zaczek AJ. Epithelial-mesenchymal transition: A hallmark in metastasis formation linking circulating tumor cells and cancer stem cells. Pathobiology 2012; 79(4): Wendt MK, Allington TM, Schiemann WP. Mechanisms of the epithelial-mesenchymal transition by TGF-beta. Future Oncol 2009; 5(8): Shahrokh FS, Michael WK, Traxel E, Andrews B, Zhu K, Wheeler TM, et al. Association of pre- and post-operative plasma levels of transforming growth factor-beta(1) and interleukin 6 and its soluble receptor with prostate cancer progression. Clin Cancer Res 2004; 10(6): Wikstrom P, Damber JE, Bergh A. Role of transforming growth factor-beta 1 in prostate cancer. Microsc Res Tech 2001; 52(4): 丁国芳, 徐银峰, 杨最素. TGF-β1 在前列腺癌中的表达及其与生存率关系的研究. 浙江医学 (Ding Guofang, Xu Yinfeng, Yang Zuisu. The expression of TGF-β1 in prostate cancer and its relation with survival rat of patients. Zhejiang Yi Xue) 2006; 28(9): Thiery JP. Epithelial-mesenchymal transitions in tumor progression. Nat Rev Cancer 2002; 2(6): Ao M, Williams K, Bhowmick NA, Hayward SW. Transforming growth factor-beta promotes invasion in tumorigenic but not in nontumorigenic human prostatic epithelial cells. Cancer Res 2006; 66(16): Yang S, Zhong C, Frenkel B, Reddi AH, Roy-Burman P. Diverse biological effect and smad signaling of bone morphogenetic protein7 in prostate tumor cells. Cancer Res 2005; 65(13): Batlle E, Sancho E, Francí C, Domínquez D, Monfar M, Baulida J, et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nat Cell Biol 2000; 2(2): Lee MY, Chou CY, Tang MJ, Shen MR. Epithelial-mesenchymal transition in cervical cancer: Correlation with tumor progression, epidermal growth factor receptor overexpression, and snail upregulation. Clin Cancer Res 2008; 14(15): Shin NR, Jeong EH, Choi CI, Moon HJ, Kwon CH, Chu IS, et al. Overexpression of Snail is associated with lymph node metastasis and poor prognosis in patients with gastric cancer. BMC Cancer 2012; 12: 521.

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot

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