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- 翩柘凯 费
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1 Hybridoma Technique 單株抗体 Monoclonal Antibody mab 1 m 3 m 2 m m 4
2 牛頓 (1985) no. 23 p.100 細胞融合 融合瘤 National Geographic
3 單株抗體 可生產有用抗體的淋巴細胞若與癌細胞融合, 則形成穩定而可培養的細胞株 癌細胞 NS-1 可培養生長 都是白血球 漿細胞 B cell 可分泌抗体 一個 B cell 只產生一種抗體 Y Y Y Y Y Y Y Y Y 細胞融合 兩組染色体混在一起 Y Y Y Y Y Y Y Y Y 融合瘤 Hybridoma 也可以培養生長產生專一性抗體
4 迷爾使呆與突魔大王
5 外在環境的許多物質可引發免疫反應 過敏 污染 食物 移植 動物 藥物 植物 輸血 花粉 細菌 昆蟲 病毒 Ballanti (1985) Immunology III. p.198
6 免疫系統脊椎動物體內有催毀外來入侵物體的免疫系統 兩大系統 先天免疫系統後天免疫系統 兩種方式 細 胞 分子 巨噬細胞 (Macrophage, mφ) 自然殺手細胞 (Natural killer cell, NK) 干擾素 (Interferon) 溶菌脢 (Lysozyme) T 細胞 (T H, T S, T K ) B 細胞 生 產 抗体 (Antibody, Ab) 兩大系統 警察系統 (+ 調察局 ) 軍事系統
7 Lennart Nilsson / Everyday Science Explained. p.214 巨噬細胞 以變形運動捕捉細菌 Lennart Nilsson / Goldsby et al (2000) Kuby Immunology. p.42
8 自然殺手細胞監視並摧毀癌細胞 接觸活化消滅 Boehringer Ingelheim / Everyday Science Explained. p
9 誘生干擾素 病毒入侵 干擾素 白血球受病毒侵害後誘導產生可刺激其他細胞防禦病毒並增加自然殺手細胞的活性 Roitt et al (1985) Immunology. 1.3 釋出干擾素 刺激細胞 牛頓 (1985) no. 25 p.11 抵抗病毒 活化自然殺手細胞 干擾素 刺激細胞抵抗病毒
10 Lysozyme 溶菌脢 脊骨 分子全貌 + 基質 細菌細胞壁 ( 小部份 ) Watson et al. (1987) Mol Biol Gene, Plate 3
11 免疫系統脊椎動物體內有催毀外來入侵物體的免疫系統 兩大系統 先天免疫系統後天免疫系統 兩種方式 細 胞 分子 巨噬細胞 (Macrophage, mφ) 自然殺手細胞 (Natural killer cell, NK) 干擾素 (Interferon) 溶菌脢 (Lysozyme) T 細胞 (T H, T S, T K ) B 細胞 生 產 抗体 (Antibody, Ab) 兩大系統 警察系統 (+ 調察局 ) 軍事系統
12 後天免疫反應的四個階段 1 遭遇 巨噬細胞把抗原分解, 專一地表現給 T H 細胞 2 動員 T H 細胞動員 T K 細胞及 B 細胞, 後者生產抗體 抗體及 T K 3 掃蕩 細胞攻擊入侵的抗原, 並清除乾淨 4 休止 完成清除抗原後, 免疫細胞休息, 但保持記憶
13 病毒 遭遇 T-Helper 細胞 確認 National Geographic
14 動員 B 細胞活化生產抗體 T-Helper 細胞增生 T-Killer 細胞活化增生 National Geographic
15 抗體抓住病毒 巨噬細胞吞噬之 T-Killer 細胞掃蕩感染細胞 掃蕩 National Geographic
16 休止 T-Suppressor 抑制各種免疫細胞 記憶細胞 National Geographic
17 免疫反應的兩個階段 抗原 初級反應 Primary response 抗原 次級反應 Secondary response 免疫反應 初次入侵 再次入侵 時間 Adapted from Roitt et al (1985) Immunology. 1.9
18 免疫增幅 抗原 初次入侵 作用細胞 記憶細胞 初級反應 抗原 再次入侵 次級反應 作用細胞 記憶細胞 Adapted from Roitt et al (1985) Immunology. 2.5
19 後天免疫反應的兩大特點 Specificity 專一性 由甲抗原所誘導的免疫反應只對甲抗原有效 Memory 記憶性 痊瘉後若甲抗原再度入侵, 可迅速動員掃蕩
20 免疫系統漫畫
21 B 細胞分泌抗體 凝集細菌 如何凝集 Boehringer Ingelheim / Everyday Science Explained. p.215
22 抗體是一種蛋白質 Davies et al (1977) PNAS / Roitt et al (2001) Immunology. p.73 IgG Immunoglobulin 抗體由四條蛋白質長短鍊所組成 ( 兩長兩短 ) 抗體分子上有兩個抗原結合區 ( 二者相同 ) 抗體與抗原結合是專一性的 (lock & key) IgG 是單一個抗體分子, 另有 IgM ( 五元體 ) 及 IgA ( 二元體 ) 步兵單兵裝甲兵兩棲部隊
23 IgM 五元體 IgA 二元體 Roitt et al (1985) Immunology
24 抗體結合區 Poliak (1986) Science / Roitt et al (2001) Immunology. p.72
25 抗體與抗原的結合面有如互補的積木 抗原 OK 抗體 X Ballanti (1985) Immunology III. p.84
26 Epitope, Antigenic determinant 抗原決定基 一個抗原分子上可能有數個抗原決定基 每個抗原決定基至少誘生一種專一性抗体 蛋白質性抗原決定基含有六個以上胺基酸
27 抗體攻擊病毒 Olson Scripps Clinic and Research Foundation / Watson et al (1987) Molecular Biology of the Gene. plate.7
28 Male et al (1987) Advanced Immunology. 9.4 病毒表面分子 上有許多個 抗體結合區
29 一個 B 細胞只能生產一種抗体, 對付某一抗原決定基 B 親和力成熟 B Y 若有許多抗原決定基, 則需許多株 B 細胞分別生產許多抗体 1 抗原決定基 B Y 2 Y Y B Y 3 Y Y B Y 4 抗原
30 Adapted from Milstein (1980) Scientific American, Oct. p.58 抗原 免疫 傳統抗血清 所有抗體混合 BA LB/c 脾臟 淋巴結 B 細胞
31 傳統抗血清的交叉反應 專一性反應 交叉反應 沒有反應 Ag A Ag A x y z Ag B +? - Adapted from Roitt et al (1985) Immunology. 6.7
32 抗原 免疫 BA LB/c x m m m m 取出脾細胞 + 癌細胞 細胞融合 傳統抗血清 所有抗體混合 單株抗體 各抗體分開 Adapted from Milstein (1980) Scientific American, Oct. p.58
33 實驗步驟 細胞融合法 Cell Fusion 細胞融合 初步篩選 專一性篩選 單株化 抗体生產 PEG HAT ELISA Limiting dilution Ascites fluid
34 為科學犧牲受苦的小白鼠 BALB/c mouse 對所有為科學犧牲受苦的實驗動物們祝禱
35 BA LB/c 小白鼠免疫流程 wk BALB/c Antigen (50 μg/mouse) Emulsified in 0.5 ml Freund's Complete Adjuvant At least three booster shots, same dose in 0.5 ml Freund's Incomplete Adjuvant Booster shots might be reduced if TiterMax is use as adjuvant Trial Bleeding Final booster (soluble antigen) Cell fusion 加佐劑製成乳劑 試採血 Titer Determination
36 免疫後取出脾臟 取出脾臟
37 脾臟為 B 細胞集中地 取出脾臟內細胞
38 Dennis Kunkel / Everyday Science Explained. p.243
39 癌細胞可以在培養基中長久生長 但是 骨髓癌細胞 NS-1 無法在 HAT 中生長
40 以化學試劑將細胞融合 加入 PEG 細胞融合 2 min
41 96 槽細胞培養盤 把融合後的細胞均分在培養盤的小槽中
42 迷爾使呆的研究日誌 Kohler & Milstein (1984)
43 剛融合完成 融合後的細胞生長情形 一個癌細胞與兩個脾細胞 National Geographic 經過數次分裂後 穩定的細胞群落
44 脾細胞 m3 m 2m m 4 PEG m m m m m m 癌細胞 細胞融合 1 m 2 3 m 4 2 m 3 4 m 1 HAT 初步篩選 m m 1 ELISA 抗體篩選
45 酵素免疫分析法 ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EIA Enzyme Immunoassay 酵素免疫分析法可偵測專一性抗原或抗體
46 以酵素免疫分析法檢測樣本中的專一性抗體 酵素呈色加入基質 不相關抗體 二次抗體 連結酵素 E 2 抗原 ELISA Plate 固相擔體 專一性抗體
47 細胞穩定後擴大至 T-25 細胞瓶 在 T-75 培養小瓶中擴大細胞數目
48 單株抗体的生產與純化 小鼠腹水誘導 細胞培養液 純化方法 硫酸銨分劃 (40% 飽和度 ) 離子交換法 (DEAE) 膠体過濾法 (Sepharose) 親和層析法 (Protein A) Ig IgG IgM IgG
49 以單株抗體來清除體內癌細胞 National Geographic
50 單株抗體的高度專一性有很多用途 單株抗体是對其抗原有極強專一性的 魔彈 (Magic bullet) 或巡弋飛彈 研究 醫療 檢驗 以免疫轉印法偵測特定抗原 以毒素連結抗体攻擊病變細胞 以 ELISA 偵測特定病原体
51 魔彈 再起 Scientific American (2001) October, p. 28
52 SARS-CoV 製備抗 SARS 的單株抗體及應用 (+) RNA, 29,727 nt, 11 ORF Science (2003) May
53 免疫前要先把抗原作成乳劑 X 如何製備單株抗體 免疫產生專一性 B 細胞 BALB/c Antigen 抗原 約在兩個月內注射五到八次 Immunization 免疫 免疫後的脾臟 a b Ag X 抗原通常有多個抗原決定基 Antigenic determinat (Epitope) 抗原決定基 b c d Spleen 脾臟產生各種 B 細胞 -a -b -c -d 採血後可得傳統抗血清 已建立之小鼠骨髓癌細胞株 Antibody 抗體 由脾臟收集 B 細胞 -a -b -c -d Polyclonal antibodies (antiserum) 傳統抗體 ( 抗血清 ) 是所有抗體的混和
54 骨髓癌細胞 NS-1 HAT -a 如何製備單株抗體 以細胞融合產生融合瘤 細胞融合 -a -b -c -d PEG Cell fusion -b B cell Hybridoma cells 融合瘤細胞 分株培養篩選 -c 篩選 -d Subcloning 單株化 ( 確定只有一種細胞 ) 脾細胞 ELISA -d 單株抗體 傳統抗體 ( 抗血清 ) 對抗原的反應 d -d a b c d Ag X d 舊有抗原 無法分辨 完全不同 a b c d Ag X + X d - 試驗專一性 d 新的抗原
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