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借欲吕
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1 Gene Therapy ( 基因治療 ) 徐松錕 (Song-Kun Shyue ) Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica 中央研究院生物醫學科學研究所 skshyue@ibms.sinica.edu.tw 基因治療介紹基因治療的原理 Non-viral vector ( 非病毒載體 ) Viral vector (how to design a replication deficient viral vector) ( 病毒載體製備 ) Retrovirus, Lentivirus Adenovirus, AAV, HSV-1 Applications 臨床試驗介紹 1 2 Gene Therapy and Transfer 基因治療與基因傳遞傳遞一個具有治療效果的基因到特定的位置或細胞體細胞基因治療 (Somatic gene therapy) 取代有問題的基因增加保護功能的基因, 做短期或長期的治療僅限於嚴重的疾病 ( 未知的副作用 ) 生殖細胞的基因治療的危險性基因治療的方法 DNA( 可以表達蛋白質 ) 或 RNA 攜帶基因的載體 : 直接植入 DNA 用特殊物質將基因包裹住, 以增加基因傳遞的效果非病毒 : 微脂體 (liposome), 基因槍 (gene gun) 病毒 : 無法自我複製的各種病毒 3 4 基因治療的理想與現實理想 : 利用基因來治療疾病取代損壞的基因 ( 遺傳性疾病 ) 利用基因產物來保護身體打一針就 OK! 可以到特定器官做治療無副作用 ( 理想 : 還做不到的事物 ) 現實進入動物體, 全都不一樣! 細胞實驗與動物實驗的不同感染效率接受體 (receptor) 表達量不同生理上的差異 : 不同蛋白表達人體實驗的嚴重副作用 : 死亡白血病改善中, 仍須努力 ( 創造就業機會 ) 還有很長的路要走! 5 6

Vectors for Gene Transfer Non-viral vectors ( 非病毒類載體 ) Naked DNA ( 單純 DNA) Liposome( 微脂體 ): Lipid/DNA

腺病毒 ), Adenoassociated virus (AAV) ( 腺相關病毒 ), HSV-1 ( 泡疹病毒 ) Other viral vectors Ex Vivo( 體外 ) In Vivo(

8 Naked DNA Purified DNA ( 沒有大小限制 ) hydro-gel ( 效率很低 ): 可以增加肢體末端缺氧的血液供應用 pvegf (Isner et al.

Gene therapy DNA vaccination 9 10 Bio-Rad Liposomes 脂質體 Cationic liposome/dna complex; 帶正電脂質內包 DNA

2 Vectors for Gene Transfer Non-viral vectors ( 非病毒類載體 ) Naked DNA ( 單純 DNA) Liposome( 微脂體 ): Lipid/DNA complex Viral vectors ( 病毒類載體 ) RNA virus ( 反轉錄病毒 ): Retrovirus, Lentivirus (HIV) DNA virus: Adenovirus ( 腺病毒 ), Adenoassociated virus (AAV) ( 腺相關病毒 ), HSV-1 ( 泡疹病毒 ) Other viral vectors Ex Vivo( 體外 ) In Vivo( 體內 ) Patient 7 Desnick RJ, Schuchman EH. Acta Paediatr Jpn Jun;40(3): Naked DNA Purified DNA ( 沒有大小限制 ) hydro-gel ( 效率很低 ): 可以增加肢體末端缺氧的血液供應用 pvegf (Isner et al., 1996) VEGF: 血管內皮細胞生長因子停止血液流動, 可以增加基因傳遞效果 Gene gun ( 基因槍 ) DNA vaccine, with electric pulse( 電擊 ) Limited delivery area (e.g., 血管內皮細胞肌肉細胞 ) Gene Gun 基因槍 Helios Gene Gun DNA or RNA and gold carriers Require small amount of DNA Gene therapy DNA vaccination 9 10 Bio-Rad Liposomes 脂質體 Cationic liposome/dna complex; 帶正電脂質內包 DNA Controlled toxicity; 毒性可以控制 Unlimited DNA size;dna 大小沒有限制 Very low integration; 插入染色體機率低 Very low transfected efficient, below 1%; 基因傳遞效率低 Understanding gene therapy N.R. Lemoine 1999

Liposomes Applications 不同特性熱敏感性 (Thermo-sensitive) 酸鹼敏感性 (ph-sensitive) Immunoliposome 基因傳遞效率低, 安全性高 Cancer gene therapy human trails ( 癌症的基因治療臨床實驗 ) 13 14 動物病毒載體數千萬年來與動物同時演化 ;

viral vectors available High titer preparation is possible for many vectors ( 有些已可以高濃度製備 ) Longer expression period with DNA integration, 2 nd generation Ad and helper dependent Ad.

Possible of integration mutation (AAV and retrovirus), risk of cancer or other genetic diseases( 嵌入性突變的可能危險 ).

3 Liposomes Applications 不同特性熱敏感性 (Thermo-sensitive) 酸鹼敏感性 (ph-sensitive) Immunoliposome 基因傳遞效率低, 安全性高 Cancer gene therapy human trails ( 癌症的基因治療臨床實驗 ) 動物病毒載體數千萬年來與動物同時演化 ; 病毒演化去感染動物動物演化來避免被病毒感染可以有效的感染動物細胞, 將基因物質傳遞到細胞內以表達蛋白 ; 小而精美 ( 簡單及複雜的架構 ); Good and Bad of Viral Vectors Advantages ( 好處 ) High efficiency( 高感染效率 ) Replication deficient( 無法自我複製 ) viral vectors available High titer preparation is possible for many vectors ( 有些已可以高濃度製備 ) Longer expression period with DNA integration, 2 nd generation Ad and helper dependent Ad. ( 長時間的表達, 數週到數年 ) Disadvantages 缺點 May exert immune response against viral vector or viral transfected cells, second administration limited ( 病毒蛋白的免疫反應限制第二次的病毒注射治療效果 ) Possible of integration mutation (AAV and retrovirus), risk of cancer or other genetic diseases( 嵌入性突變的可能危險 ). 直接注射時會到處擴散感染 : 副作用較大 Viral Vectors Retrovirus (~ 10 kb): 反轉錄病毒 Lentivirus (HIV base, ~ 10 kb) Adenovirus (5, 7, or 35 kb): 腺病毒 Adeno-Associated Virus (~ 5kb or 2.5kb dsaav): 腺相關病毒 Herpes Simplex Virus-1 (human): 泡疹病毒 SV40, Sandi Virus, and other viruses 17 18

4 Viral vector 的比較 AAV 可感染的種類, 可否感染分裂細胞? 嵌入細胞的染色體? Viral DNA 是部分或全部拿掉? 製造的容易程度 ( 好不好製造 )? 同型病毒的種類 :Ad5, Ad2; AAV2, AAV3, 副作用, 安全性, 基因表達時間, Retrovirus ( 反轉錄病毒 ) Moloney murine leukemia virus (MMLV) Clontech 反轉錄病毒傳遞系統 RNA virus Infect primary, dividing cells ( 可感染初始培養分裂中的細胞 ) 5 LTR as promoter, ( 啟動子 ) 3 LTR as terminator ( 終止信號 ) 病毒會釋放到溶液裡, 需收集後再純化 ; 濃度低, 較難純化成高濃度 Clontech 23 24

Replication-incompetent( 無法自我複製 )retrovirus gag and pol expressing cell Co-transfect with pvsv-g Clontech 25 Clontech 26 ( 骨髓 or 臍帶血 ) Retrovirus for

2003 Apr;9(4):463-8 (Cord blood) SCID: 1990 Houston, 2 patients: ADA 基因缺陷 ; 沒有 T 細胞並且有自體免疫的問體基因改正過的自體的 T 細胞, 利用 retrovirus Patient 1: receive total 11

Disease ( 第一個成功的例子 ) Science Vol 288:669 (2000); A.

5 Replication-incompetent( 無法自我複製 )retrovirus gag and pol expressing cell Co-transfect with pvsv-g Clontech 25 Clontech 26 ( 骨髓 or 臍帶血 ) Retrovirus for human gene therapy 反轉病毒用於人的基因治療 Desnick RJ, Schuchman EH. Acta Paediatr Jpn Jun;40(3): Nat Med Apr;9(4):463-8 (Cord blood) SCID: 1990 Houston, 2 patients: ADA 基因缺陷 ; 沒有 T 細胞並且有自體免疫的問體基因改正過的自體的 T 細胞, 利用 retrovirus Patient 1: receive total 11 infusions, transduced T cells have remained essentially constant for the past 5 ½ years 11 more patients on trail Gene Therapy of Human SCID-X1 Disease ( 第一個成功的例子 ) Science Vol 288:669 (2000); A. Fisher, 法國巴黎 Mutation at c cytokine receptor subunit ( 細胞激素受體的部分單體 c 的突變 ) 1 st 成功的基因治療例子 (two patients) CD34+ cells; Retrovirus; 19 and 17 x 10E6 CD34+ cells 注射回病人 ~ 20 to 40% of cells 表現 c transgene Leave protection at 3 months 治療後 10 月 : 正常數目的 T, B, and NK cells: Full correction ( 完全治療 ) 29 30

SCID-X1 gene therapy 11 more patients 30 月後, 一個病人得了 leukemia ( 白血病 ) Inserted into more than 40 sites in the genome of different repopulating cells ( 可以在至少 40 處發現有

個治療過的小孩得到白血病 ) May insert near Lmo2 in 1/100,000 Millions of bone marrow cells are modified and returned 數以萬計的骨髓細胞受到感染, 並植回病人 Many projects on hold London UK: it would

Both c and Lmo2 致癌基因 ; collaborating oncogenes( 致癌基因 ): 合作效應 double hits 大部分的基因並不會引起癌症改進 gene therapy: 不要去啟動周圍的基因?

6 SCID-X1 gene therapy 11 more patients 30 月後, 一個病人得了 leukemia ( 白血病 ) Inserted into more than 40 sites in the genome of different repopulating cells ( 可以在至少 40 處發現有 retrovirus 嵌入 ) 不正常 T-cell: 在 Lmo-2 基因附近插入 Nature Medicine 8:1189 (November 2002) SCID-X1 gene therapy Three of the 11 boys treated developed leukemia ( 有 3 個治療過的小孩得到白血病 ) May insert near Lmo2 in 1/100,000 Millions of bone marrow cells are modified and returned 數以萬計的骨髓細胞受到感染, 並植回病人 Many projects on hold London UK: it would treat X-SCID if death was otherwise inevitable Bad and Good News for Gene therapy The gc gene can act as an oncogene ( 致癌基因 )when under control of the retroviral promoter Both c and Lmo2 致癌基因 ; collaborating oncogenes( 致癌基因 ): 合作效應 double hits 大部分的基因並不會引起癌症改進 gene therapy: 不要去啟動周圍的基因? Lentiviral vector 複雜的 retrovirus (lente: slow) Infect dividing and non-dividing cells (MLV retrovirus can only infect dividing cells) 病毒 RNA 做成的 DNA 可以進入細胞核, 無須細胞分裂嵌入細胞的染色體 HIV( 愛滋病毒 ) , 3: 97ps

Lentiviral vector for SCID-XI 可以感染不分裂的血液幹細胞嵌入細胞的染色體 : 長時間表達 Self Inactivating (SIN) Lentiviral Vector 安全性可以克服? 人體實驗中 1. http://www.

gov/ct2/show/nct03311503 Adenovirus (Ad, 腺病毒 ) Well studied Double stranded DNA ~36 kb, 70~100 nm 50 or more 確定的 serotypes ( 免疫血清型 ) Ad5

seropositive of Ad5 in Taiwan, 台灣幾乎每人都被感染過 : 治療時需考慮免疫反應 High transfer efficiency in a wide variety of cell types and tissues;

7 Lentiviral vector for SCID-XI 可以感染不分裂的血液幹細胞嵌入細胞的染色體 : 長時間表達 Self Inactivating (SIN) Lentiviral Vector 安全性可以克服? 人體實驗中 Adenovirus (Ad, 腺病毒 ) Well studied Double stranded DNA ~36 kb, 70~100 nm 50 or more 確定的 serotypes ( 免疫血清型 ) Ad5 and Ad2 are less oncogenic ( 致癌性 ); less safety concerns ( 安全性較高 ) Infect both dividing and nondividing cells Adenovirus ~100% seropositive of Ad5 in Taiwan, 台灣幾乎每人都被感染過 : 治療時需考慮免疫反應 High transfer efficiency in a wide variety of cell types and tissues; 可感染許多不同種類的細胞及器官 Very high titer: up to 10E12 PFU/ml 大量複製相對簡單 Low integration frequency, 10E-6 (in vitro) Titer: 力價 : 數目單位 Cell 1993; 75: Fundamental virology, 4 th ed

8 ptp POL ITR ssdbp E1 Late genes E2 E3 E4 ITR Recombinant Ad construction (First-generation, E1 and/or E3 deleted) E1 100/0 pbrx E1 pjm17 (0~1.3%) ITR Ad5 (9.25%-16%) p cdna pa pad-pgk-cdna pbr322 pbr322 Late gene Packaging expression ITR pa p cdna pa 293 cells (0% ~ 12% of Ad5); Homologous recombination rad-cdna [E1 and E3 (partial) deleted] ITR Second-Generation Ad 第二代腺病毒載體 Remove E2a, E2b, or one of the ORF of E4 plus the E1/E3 Less immune response 增長基因表現時間從 2 到 6 週到 2 到 6 月以上 Ad Gene Therapy on Trial 9/17/1999: Dr. J. Wilson, Univ. Penn. in Phil. Jesse Gelsinger (OTC deficiency) died with 38 trillion (3.8 x ) Ad particles, directly liver injection ( 肝門靜脈直接注射 ) E1 and E4 deleted Ad( 第二代病毒 ) Died from a massive immune response to Ad vector ( 死於強烈的免疫反應 ) 持續高濃度的 IL-6 紅血球先驅細胞被清除了, 可能時先前有感染其他病毒? Ad Gene Therapy on Trial Ad 的受體在肝臟較少, 所以需要較高的劑量來感染肝臟? 25 癌症病人用同樣濃度, 但都沒有如此問題, 空的病毒可以引起免疫反應 Patient was very sick and not qualified for gene therapy ( 病人的病情不適合做基因治療, 醫學倫理的問題?) Hybrid vectors 組合型 ( 子母彈 ) 病毒 47 Nat. Biotechinol. (1997) 15,

9 AAV serotypes and infection efficacy ( 血清型與感染效率 ) AAV8 efficient delivers genes to muscle and heart Nature Biotechnology 23, (2005) AAV 治療眼睛疾病 Gene therapy (2003) 10:2105; 10:2112 Efficiently package dsaav after mutating one ITR. Saudi Journal of Ophthalmology (2013) 27, AAV 治療聽覺問題 Clinical trials 臨床試驗 53 Over 1200 clinical trials have been conducted or are underway More than 6000 patients ~65% are cancer related Immuno-modulation, tumor associated antigen, tumor vaccine: 免疫調節與癌症疫苗 Suicide genes and prodrugs: 自殺基因 Tumor suppressor genes: 抑癌基因 Anti-angiogenesis genes: 抑制血管生成 Conditional replicative adenovirus: 有條件的複製病毒 54

10 Gene therapy clinical trials worldwide Indications Vectors Used 旁觀者效應 (Bystander Effect) altrial.htm php Anti-angiogenesis: VEGF inhibition 抑制血管生成 Over express extracellular domain of VEGF receptor in a remote organ ( 大量表現 VEGF 受體的細胞外的部分蛋白 ) Ad-VEGF-ExR: 與免疫蛋白 IgG 的 Fc 結合受體蛋白從細胞分泌出來, 與 VEGF 結合, 藉以抑制 VEGF 與內皮細胞的 VEGF 受體結合病毒打到肌肉細胞 Injected into skeletal muscle 3 週後受體蛋白可以在血液中偵測到, 之後 10 天可以偵測到腫瘤逐漸變小. Cardiovascular gene therapy 心血管疾病 ( 保護增進血管生成 ) Angiogenesis ( 血管生成 ) gene therapy VEGF, FGF-1, FGF-2, Endothelial progenitor cells (EPCs) ( 內皮母細胞 ) Bone marrow derived EPCs Stimulate hematopoietic progenitor cells ( 造血母細胞 ) with GM-CSF 59 60

治療心血管疾病與癌症的困境 Heart disease 增加血管生成 Cancer 抑制血管生成 Increase blood

Antitumor Therapy Anti-vascular genesis 61 62 63 64 The Future (

Safe and efficient gene transfer: high percentage of transfection;

在特定位置嵌入插入染色體 Regulated either by administered agents or by the

Cost-effective; 經濟上的考量 Our imagination is the limit; 多思考, 多幻想

11 治療心血管疾病與癌症的困境 Heart disease 增加血管生成 Cancer 抑制血管生成 Increase blood flow Cardiovascular Therapy Vascular genesis Block blood flow Antitumor Therapy Anti-vascular genesis The Future ( 未來發展 ) Can be injected: 打一針就好 Target to specific cells; 鎖住特定器官 Safe and efficient gene transfer: high percentage of transfection; 安全高效率 Insert themselves into appropriate regions of the genome; 在特定位置嵌入插入染色體 Regulated either by administered agents or by the body s own physiological signals; 由病人的身體情況或藥物來控制基因的表達 Cost-effective; 經濟上的考量 Our imagination is the limit; 多思考, 多幻想實驗數據可以信嗎? 小鼠實驗, 有數千種藥物可以有效的抑制, 甚至治療癌症,but? 白鳳豆治療癌症? 鴨肉會致癌? 香菇會致癌? 用極高劑量的純化物所做的動物實驗! 特定細胞, 特定動物的實驗 65 66

塑化劑沒有好的, 盡量避免 67 68 被嚇死的比真正致死得多非常多核能電廠在大都市附近, 被核能的可能危害嚇死的人很多 ; 但一般人對空污 (PM2.5 等等 ) 對身心的危害與開採煤礦的傷亡沒感覺心理的壓力 : 生病的主要原因快樂的過日子! 聳動的新聞標題 : 日本福島核災軸射能量為廣島核爆 168 倍? 為何沒有人死於輻射傷害?

12 電磁波的危險性? 因為用低劑量的電磁波沒有顯著的危害, 所以提高 10 倍, 若沒有作用, 再提高 10 倍, 再 10 倍到某一個劑量一定會有不良反應 ( 包含熱效應 ): 結論 : 所以電磁波有害!? 吃食鹽的危險性? 因為用低劑量的食鹽沒有顯著的危害, 所以提高 100 倍, 若沒有作用, 再提高 10 倍, 再 10 倍到某一個劑量一定會有不良反應 ( 腎臟衰竭 ) 結論 : 所以吃食鹽有害? BPA 的故事 : 酚甲烷 (Bisphenol A) 稱為雙酚 A, 需要害怕嗎? 不知道, 就沒有問題? 塑化劑沒有好的, 盡量避免被嚇死的比真正致死得多非常多核能電廠在大都市附近, 被核能的可能危害嚇死的人很多 ; 但一般人對空污 (PM2.5 等等 ) 對身心的危害與開採煤礦的傷亡沒感覺心理的壓力 : 生病的主要原因快樂的過日子! 聳動的新聞標題 : 日本福島核災軸射能量為廣島核爆 168 倍? 為何沒有人死於輻射傷害? 釋放至大氣中數種放射性物質之能量 : 銫 137: 核能發電廠會產生, 但為核爆的稀有核種! 銫 137: 福島核災 1 號至 3 號機為 1 萬 5000 兆貝克, 而廣島核爆為 89 兆貝克, 福島為廣島的約倍北方人的食量是南方人的 100 倍!?( 麵食 ) 媒體的特質 : 斷章取義危言聳聽知識的霸凌 Gene therapy for inherited genetic defects ( 遺傳性缺陷的基因治療 ) 改變細胞內的特定基因 Targeted gene correction by AAV Nat Biotechnol Aug;24(8): Nat Biotechnol Aug;24(8): Nat Biotechnol Aug;24(8):

Vasoprotective Molecules and Adenovirus Gene Therapy

Vasoprotective Molecules and Adenovirus Gene Therapy Gene Therapy ( 基因治療 ) 徐松錕 (Song-Kun Shyue ) Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica 中央研究院生物醫學科學研究所 skshyue@ibms.sinica.edu.tw 1 基因治療介紹基因治療的原理 Non-viral vector ( 非病毒載體 ) Viral vector (how to