FOREGENE RT Easy Instruction Manual RT Easy TM I (For first-strand cdna synthesis) Fast and highly sensitive reverse transcription system for generati

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笼男季
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1 RT Easy TM I (For first-strand cdna synthesis) Fast and highly sensitive reverse transcription system for generating first-strand cdna using pg-level RNA RT Easy TM II (First-strand cdna synthesis for Real Time PCR) Fast and highly sensitive reverse transcription system for generating first-strand cdna for use in Real Time PCR Research use only Store at -20 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 1 / 20

2 目录产品介绍产品特点试剂盒应用产品质量控制试剂盒内容试剂盒组分信息运输及储存条件注意事项 RT Mix 耐受性酒精耐受性分析胍盐耐受性分析逆转录引物用量 RNA 模板用量操作前准备事项实验材料和设备自备试剂安全性操作指南 RT Easy TM I 操作步骤 RT Easy TM II 操作步骤反应实例操作示意图问题分析指南 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 2 / 20

3 产品介绍 2 RT Easy TM Mix 2 RT OR-Easy TM Mix 合成第一链 cdna 的温度高达 50,65 温度下仍具有活性, 有利于复杂二级结构 RNA 模板进行逆转录反应实验室纯化获得的 RNA 常有酒精及胍盐残留, 对大多数逆转录酶有很强的抑制性, 导致逆转录效果不理想或逆转录效率低而 2 RT Easy TM Mix 2 RT OR-Easy TM Mix 对酒精和胍盐显示出极高的耐受性, 对 RNA 样品中酒精的最高耐受为 45%(2 RT Easy TM Mix) 60%(2 RT OR-Easy TM Mix), 胍盐的最高耐受为 750mM 即使不纯的 RNA 也可用 2 RT Easy TM Mix 2 RT OR-Easy TM Mix 进行逆转录反应独特的反应体系, 使得 RT 反应更加简便快捷高效,25min 即可完成第一链 cdna 的合成 2 RT OR-Easy TM Mix 是专为 Real Time PCR 而研发的快速逆转录试剂, 该体系逆转录效率高, 无需添加任何引物, 可对少量 RNA 模板进行良好的逆转录反应独特的反应体系, 使得 RT 反应更加简便快捷高效,20min 即可完成第一链 cdna 合成此产品可与 Foregene 公司的荧光定量产品 Real Time PCR Easy TM 配合使用, 能获得高质量的实验结果产品特点高效的逆转录体系, 只需 25min 即可完成第一链 cdna 的合成高灵敏的逆转录体系,pg 级别的模板也可以得到高质量的 cdna 逆转录体系热稳定性高, 该体系通常反应温度高达 50, 在 65 仍具有良好的逆转录性能即使不纯的 RNA 样品 ( 酒精可达 45%, 胍盐可达 750mM) 也可进行逆转录反应 2 RT OR-Easy TM Mix 已添加了优化配比的逆转录引物 (Random Primer Oligo(dT) 18 Primer) Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 3 / 20

4 试剂盒应用 RT Easy TM I(For first-strand cdna synthesis) 常规 RT-PCR 合成 cdna, 用于克隆和表达研究转录起始位点的引物延伸法分析 RACE(cDNA 末端快速扩增 ) 线性 RNA 扩增芯片标记 RT Easy TM II(First-strand cdna for Real Time PCR) 直接用于 Real Time PCR 定量分析基因的表达可以快速准确地对 RNA 病毒等微量 RNA 进行分析高 GC 含量或具有复杂二级结构 RNA 模板的逆转录产品质量控制按照福际生物试剂盒质量检测体系标准 ( s Total Quality Management System),RT Easy TM I(For first-strand cdna synthesis) 和 RT Easy TM II(First-strand cdna for Real Time PCR) 试剂盒都严格进行多次测试, 确保每一批次试剂盒质量的可靠性和稳定性 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 4 / 20

5 试剂盒内容 RT Easy TM I(For first-strand cdna synthesis) 试剂盒组成 RT RT 次 (20μl 体系 ) 100 次 (20μl 体系 ) 2 RT Easy TM Mix 0.25ml 1ml Random Primer (50μM) 50μl 200μl Oligo(dT)18 Primer (50μM) 50μl 200μl RNase-Free ddh 2 O 1.7ml 1.7ml 说明书 1 份 1 份 RT Easy TM II(First-strand cdna for Real Time PCR) 试剂盒组成 RT RT 次 (10μl 体系 ) 200 次 (10μl 体系 ) 2 RT OR-Easy TM Mix 0.25ml 1ml RNase-Free ddh 2 O 1.7ml 1.7ml 说明书 1 份 1 份试剂盒组分信息 2 RT Easy TM Mix:Foregene Reverse Transcriptase RNase Inhibitor dntps 反应缓冲液优化剂和稳定剂 2 RT OR-Easy TM Mix:Foregene Reverse Transcriptase RNase Inhibitor dntps 稳定剂增强剂优化剂及优化配比的逆转录引物 (Random Primer Oligo(dT)18 Primer) Random Primer (50μM):6 个寡聚核苷酸的随机引物, 其浓度为 50μM Oligo(dT)18 Primer (50μM): 具有 18 个 dt 的引物, 其浓度为 50μM Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 5 / 20

6 运输及储存条件 1. 输运条件全程低温冰盒运输, 保证试剂盒处于 <4 状态 2. 保存条件 RT Easy TM I 保存于 -20 产品收到后立即存放于-20 恒温冰箱中如果存储条件适当, 产品在 1 年有效期内不会降低任何性能 RT Easy TM II 保存于 -20 产品收到后立即存放于-20 恒温冰箱中如果存储条件适当, 产品在 1 年有效期内不会降低任何性能注意事项 :( 请务必在使用试剂盒前仔细阅读注意事项 ) 模板建议使用新鲜样品提取的或 -80 条件下保存的 RNA(RNA 应避免反复冻融 ) 为避免 RNase 污染, 实验操作请在 RNase-Free 空间进行 ; 所用的枪头 PCR 离心管都必须保证是 RNase-Free 的 ; 并佩戴一次性手套和口罩使用前, 将 2 RT Easy TM Mix 或者 2 RT OR-Easy TM Mix 置于冰上使其完全融化, 轻弹混匀后使用 ; 体系的配制请在冰浴上操作, 以提高试剂盒性能, 提高 PCR 扩增的特异性 RT Easy TM I 没有添加逆转录引物, 需要根据实验要求自行添加适当浓度的 Random Primer 或 Oligo(dT)18 Primer 或特异引物 RT Easy TM II 已经添加了优化配比的逆转录引物, 无需再额外添加任何引物 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 6 / 20

7 RT Mix 耐受性经测试分析,2 RT Easy TM Mix 和 2 RT OR-Easy TM Mix 对酒精和胍盐显示出极高的耐受性实验室纯化获得的 RNA 常有酒精及胍盐残留, 对逆转录有很强的抑制性, 导致逆转录效果不理想或逆转录效率低 Foregene RT Easy 系列产品对酒精及胍盐的耐受能力使得逆转录更容易的高效率的进行注意 : 下图活性测试所使用 RNA 量与 2 RT Easy TM Mix 或 2 RT OR-Easy TM Mix 比例为 1:1, 即直接使用 RNA 将 2 RT Easy TM Mix 或 2 RT OR-Easy TM Mix 稀释至 1 酒精耐受性分析 2 RT Easy TM Mix 2 RT OR-Easy TM Mix Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 7 / 20

9 逆转录引物用量 RT Easy TM I 需要添加逆转录引物, 请根据实验需要按下表建议加入适当浓度的引物引物名称适用范围引物用量 Random Primer 适用于长的或具有二级构造的 RNA, 包括 rrna mrna trna 等在内的所有 RNA 的反转录反应都可使用本引物 50 pmol 适用于具有 Poly (A) 尾的 RNA Oligo(dT)18 Primer 注意 : 原核生物的 RNA 真核生物的 rrna trna 以及某些种类的真核生物的 mrna 等不具有 Poly (A) 50 pmol 特异性下游引物必须与模板序列互补, 需了解靶序列 2 pmol 模板 RNA 用量模板 RNA 最好使用新鲜样品提取的或是 -80 条件下保存的 RNA(RNA 应避免反复冻融 ) RT Easy TM I:(0.1pg-5μg total RNA or 0.01pg-0.5μg mrna)/20μl 体系 RT Easy TM II:(0.1pg-0.5μg total RNA or 0.01pg-0.05μg mrna)/10μl 体系 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 9 / 20

10 操作前准备事项强烈建议用户在本试剂盒使用前仔细阅读说明书 RT Easy 系列试剂盒操作简单方便快捷, 说明书提供了整个试剂盒的正确使用方法请在使用前准备好必要的实验材料和设备实验材料和设备 PCR 扩增仪或金属浴微量移液器 RNase-Free 枪头 RNase-Free tube 冰浴自备试剂 RNA 模板基因特异引物安全性本产品仅供科研使用, 请勿用于医药临床医疗食品及化妆品等用途使用化学品时, 穿戴合适的实验服, 手套, 防护眼镜等 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 10 / 20

11 操作指南 RT Easy TM I(For first-strand cdna synthesis) 操作步骤 A: 材料及试剂准备 1. 准备制备好的 RNA 模板 ( 建议使用 Foregene Total RNA Isolation Kit 系列试剂盒提取纯化 RNA) 及相关耗材仪器注意 : 作为模板的 RNA, 请确定 RNA 没有降解或是使用新近提取的 RNA 2. 取出 2 RT Easy TM Mix 置于冰浴上, 使其自然融化, 轻弹管壁几次, 混匀待用 ; 取出 RNase-Free ddh 2 O 融化后置于冰浴上待用 ; 根据需要取出 Random Primer 或 Oligo(dT)18 Primer 或特异引物融化后置于冰上待用 B:RT 体系配制 2 RT Easy TM Mix 使用方便快捷, 最大程度上避免操作过程中的污染以及多次配制反应体系带来的实验误差使用时只需取反应体系一半体积 ( 如 : 反应体系为 20μl, 则取 10μl 2 RT Easy TM Mix 溶液 ), 加入 RNA 模板和逆转录引物, 并加 RNase-Free ddh 2 O 补足体积 20μl 具体的 RT 反应体系配制可参考下表 1 表 1:RT 体系配制 RT 体系添加内容用量 2 RT Easy TM Mix 10μl Random Primer(50μM) or Oligo(dT)18 Primer(50μM) or Specific Primer(2μM) Template(RNA) RNase-FreeddH 2 O Total Volume 1μl 1μl 1μl Xμl (Total RNA:<5μg/mRNA:<0.5μg) (9-X)μl 20μl Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 11 / 20

12 C:RT 反应程序设置 1. 参照上表配制好 RT 体系后, 轻轻混匀 ( 可使用枪头轻轻吹打 ; 也可在涡旋仪上瞬时混匀并瞬时离心收集散落在管壁或管盖的液体, 放置于冰盒上待用 ) 2. 参照 RT 反应程序设置 ( 表 2 设置反应的温度时间等注意 : 为了保证 2 RT Easy TM Mix 的活性和提高其扩增效率, 最好待金属浴达到设置的反应温度 ( 逆转录温度 50 或 65 ) 之后再进行 RT 反应体系的配制, 以便体系配制完成后立即进入反应程序也可以在 PCR 仪上进行 RT 反应 3. 反应产物可直接用于后续试验, 或储存 -20 长达一周长期储存建议 -70 条件下, 避免反复冻融表 2:RT 反应程序设置步骤温度时间内容 1 50 或 min 逆转录 min 失活注意 : 使用 Random primer 时, 在第一步反应前, 应先进行 25,10min 预热反应以上程序仅作参考, 实际反应条件视模板引物等的结构条件不同而各异对具有复杂二级结构的 RNA 模板, 第一步反应温度建议使用 65, 其他 RNA 模板建议采用 50 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 12 / 20

13 RT Easy TM II(First-strand cdna synthesis for Real Time PCR) 操作步骤 A: 材料及试剂准备 1. 准备制备好 RNA 模板 ( 建议使用 Foregene Total RNA Isolation Kit 系列试剂盒提取纯化 RNA) 及相关的耗材仪器注意 : 作为模板的 RNA, 请确定 RNA 没有降解或是新近提取的 RNA 2. 取出 2 RT OR-Easy TM Mix 置于冰浴上, 使其自然融化, 并轻揉混匀待用 ; 取出 RNase-Free ddh 2 O 融化后置于冰浴上待用 B:RT 体系配制 2 RT OR-Easy TM Mix 使用方便快捷, 最大程度上避免操作过程中的污染以及多次配制反应体系带来的实验误差使用时只需取反应体系一半体积 ( 如 : 反应体系为 10μl, 则取 5μl 2 RT OR-Easy TM Mix 溶液 ), 加入 RNA 模板, 并加 RNase-Free ddh 2 O 补足体积 10μl 具体的 RT 反应体系配制可参考下表 3 表 3:RT 体系配制 RT 体系添加内容用量 2 RT OR-Easy TM Mix 5ul Template(RNA) RNase-FreeddH 2 O Total Volume Xμl (Total RNA:<0.5μg /mrna:<0.05μg) (5-X)μl 10μl C:RT 反应程序设置 1. 参照上表配制好 RT 体系后, 轻轻混匀 ( 可使用枪头轻轻吹打 ; 也可在涡旋仪上瞬时混匀并瞬时离心收集散落在管壁或管盖的液体, 放置于冰盒上待用 ) 2. 参照下面 RT 反应程序设置反应的温度时间等 ( 表 4) 注意 : 为了保证 2 RT OR-Easy TM Mix 的活性和提高其扩增效率, 最好待金属浴达到设置的反应温度 ( 逆转录温度 50 或 65 ) 之后再进行 RT 反应体系的配制, 以便体系配制完成后立即进入反应程序也可以在 PCR 仪上进行 RT 反应 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 13 / 20

14 3. 反应完成之后, 置于冰上直接用于 Real Time PCR, 或 -20 储存长达一周, 长期储存应置于 -70 条件下, 避免反复冻融表 4:RT 反应程序设置步骤温度时间内容 1 50 或 min 逆转录 min 失活注意 : 以上程序仅作参考, 实际反应条件视模板引物等的结构条件不同而各异对具有复杂二级结构的 RNA 模板, 在第一步反应温度建议使用 65, 其他 RNA 模板建议采用 50 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 14 / 20

反应实例本实验采用两步法 RT-qPCR, 从小鼠细胞中所提取的 Total RNA 模板为使用 RT Easy TM I 试剂盒进行逆转录, 以反应液为模板利用荧光定量方法检测 actb 基因的表达验结果可见溶解曲线出现单一峰, 有良好的特异性, 同时标准曲线线性关系良好, 能够很地检测到 0.

15 反应实例本实验采用两步法 RT-qPCR, 从小鼠细胞中所提取的 Total RNA 模板为使用 RT Easy TM I 试剂盒进行逆转录, 以反应液为模板利用荧光定量方法检测 actb 基因的表达验结果可见溶解曲线出现单一峰, 有良好的特异性, 同时标准曲线线性关系良好, 能够很地检测到 0.1ng~100 ngtotal RNA 扩增曲线标准曲线 FAM Efficiency (%)=95.5 R^2=0.997 Slope y-intercept=7.593 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 15 / 20

18 问题分析指南以下针对 RT Easy 系列试剂盒在使用中可能遇到的问题进行分析, 希望能对您的实验有所帮助另外, 对于在操作说明和问题以外的其他实验或技术上的问题, 我们设有专门的技术支持帮助您如有任何需要可联系我们 : 或 RT-PCR 未出现目的片段 1. RNA 被降解建议 : 提取 RNA 的材料尽量新鲜, 应用高质量高纯的的 RNA 2. RNA 含有抑制剂建议 : 逆转录抑制剂一般包括 SDS 胍盐 EDTA 等, 建议通过 70% 的乙醇对 RNA 沉淀进行清洗, 除去抑制剂 3. 引物设计问题建议 : 按照引物设计原则, 重新设计引物进行检查 RT-PCR 产物出现非特异性条带 1. RNA 中有基因组 DNA 污染建议 : 使用扩增级的 DNase I 进行处理, 设置没有逆转录的对照检测 DNA 污染 2. 退火温度不适建议 : 对引物做梯度 PCR, 选择合适的退火温度 3. 形成引物二聚体建议 : 减少引物使用量, 或更加模板使用量, 设计 3 端没有互补序列的引物 4. 镁离子浓度过高建议 : 优化反应体系中镁离子浓度 5. 模板加入量过多建议 : 可用水或 TE Buffer 将裂解液进行 10~100 倍稀释后, 再作为模板进行 PCR Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 18 / 20

19 产生弥散带 1. PCR 中 cdna 添加过多建议 : 减少 PCR 中模板 cdna 使用量 2. 退火温度过低建议 : 提高退火温度, 防止非特异性的起始和延伸 3. PCR 引物污染建议 : 重新合成引物空白对照出现目的条带 1. 操作工具或试剂污染建议 : 实验所有试剂或器材均应高压灭菌操作时应小心轻柔, 防止将 DNA 样品吸入加样枪内或溅出离心管外 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 19 / 20

目录产品介绍产品特点试剂盒应用产品质量控制试剂盒内容运输及储存条件试剂盒组分信息 Foregene Revers

目录产品介绍产品特点试剂盒应用产品质量控制试剂盒内容运输及储存条件试剂盒组分信息 Foregene Revers RT-PCR Easy TM II(Two Step) Cat.No.RT-02021/02022 Two-step RT-PCR Master Mix For research use only Store at -20 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 1 / 14 目录产品介绍........ 3 产品特点...........