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垒扬尚
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1 118 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷第 1 期 215 年 1 月千斤拔属药用植物 DNA 条形码鉴定研究张忠廉 1, 宋美芳 1, 李海涛 1, 管燕红 1, 牛迎凤 1, 马小军 2*, 张丽霞 1. 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所云南分所, 西双版纳州傣药南药重点实验室, 云南景洪中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所, 北京 * 摘要 : 目的筛选一种可准确高效鉴别千斤拔属 Flemingia Roxb. ex Ait. et Ait. f. 药用植物的 DNA 条形码序列方法对 4 种 14 份千斤拔属药用植物的 rbcl psba-trnh 序列进行扩增和测序, 同时查找 NCBI 数据库中千斤拔属植物的相应序列, 共计 7 种 2 份, 比较不同序列的扩增效率及测序成功率, 并对其进行种内种间变异分析,barcoding gap 检验及 NJ 聚类图分析, 以评估不同序列对千斤拔属植物的物种鉴别能力结果测序成功率方面, 与 rbcl 序列对所分析样品的测序成功率为 1%,psbA-trnH 的测序成功率为 85.71%;3 条序列中, 只有在 barcoding gap 检验中具有显著 gap; 从 NJ 聚类图来看, 可明显区分千斤拔属植物的不同物种 ( 除 F. philippinensis 与 F. stricta 外 ) 结论序列能准确鉴别千斤拔属药用植物, 可作为千斤拔药材基原植物鉴定的条形码序列关键词 : 千斤拔属 ;DNA 条形码 ;;rbcl;psba-trnh 中图分类号 :R 文献标志码 :A 文章编号 : (215) DOI: 1.751/j.issn Identification of DNA barcoding on medicinal plants in Flemingia Roxb. ex Ait. et Ait. f. ZHANG Zhong-lian 1, SONG Mei-fang 1, LI Hai-tao 1, GUAN Yan-hong 1, NIU Ying-feng 1, MA Xiao-jun 2, ZHANG Li-xia 1 1. Key Laboratory of Dai and Southern Medicine of Xishuangbanna Dai Autonomous Prefecture, Yunnan Branch of Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Jinghong 6661, China 2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 1193, China Abstract: Objective To screen a DNA barcoding sequence that can identify the medicinal plants of Flemingia Roxb. ex Ait. et Ait. f. accurately and efficiently. Methods Four species and 14 individuals of Flemingia Roxb. ex Ait. et Ait. f. were collected, the (second internal transcribed spacer, ) of ribosomal DNA, rbcl, psba-trnh of chloroplast DNA were amplified and sequenced. Meanwhile, the NCBI data were retrieved and the according sequence was downloaded. The total numbers of species and individuals were six and twenty. The PCR amplification and sequencing efficiency, barcoding gap, and NJ trees were used to evaluate the efficiency of species identification. Results The sequencing success rates of, rbcl, and psba-trnh were 1%, 1%, and 85.71%, respectively; Among the three DNA barcoding sequences, only has remarkable barcoding gap; could distinguish every species of Flemingia Roxb. ex Ait. et Ait. f. (except F. philippinensis and F. stricta). Conclusion could identify the medicinal plants of Flemingia Roxb. ex Ait. et Ait. f. accurately and efficiently, and could be used as an ideal DNA barcoding of species identification for medicinal materials of Flemingia Roxb. ex Ait. et Ait. f. Key words: Flemingia Roxb. ex Ait. et Ait. f.; DNA barcoding; ; rbcl; psba-trnh 收稿日期 : 基金项目 : 云南省应用基础研究计划 (211FZ31); 中国医学科学院药用植物研究所创新团队研究计划 : 热带名贵药用植物种质创新与繁育 (12136) 作者简介 : 张忠廉 (1982 ), 男, 助理研究员, 研究方向为热带药用植物资源及分子生物学 Tel: zzl65@163.com * 通信作者张丽霞, 副研究员 @qq.com 马小军, 研究员 mayixuan1@163.com

2 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷第 1 期 215 年 1 月 119 千斤拔 Flemingiae Philippinensis Radix 始载于植物名实图考, 具有祛风除湿舒筋活络强筋壮骨消炎止痛等功效, 适用于风湿痹痛腰肌劳损气虚脚肿肺虚久咳白带过多月经不调跌打损伤等症 [1], 被广泛用于治疗妇科病风湿痹痛等类型的中成药生产中 ; 近年来又发现因其富含植物雌激素而在治疗妇女更年期综合征方面有很好的疗效据统计, 我国共有 1 多个中成药生产企业使用千斤拔原料生产中成药, 年需求量超过 1 t, 且有逐年上升趋势 [2] 由于目前千斤拔药材资源以野生资源为主, 长期的肆意采挖使得千斤拔野生资源日益匮乏, 药材市场供不应求现象日益严重中 [3] 国药典 21 年版所收载千斤拔药材基原植物有 3 种, 分别为豆科 (Flemingia) 植物千斤拔 Flemingia philippinensis Merr. et Rolfe 大叶千斤拔 F. macrophylla (Willd.) Prain 或锈毛千斤拔 F. ferruginea Wall. ex Benth. 然而, 千斤拔属 Flemingia Roxb. ex Ait. et Ait. f. 植物在我国共分布有 16 种及 1 变种, 其中约 1 种可作药用 [1], 随着千斤拔野生资源的日益匮乏, 药材市场以同属植物替代千斤拔正品药材的混用代用现象日益严重, 药材品质不一, 其质量保障及用药安全问题令人堪忧又因千斤拔药用部位为根, 仅依靠传统的显微鉴别理化鉴别等方法无法准确鉴别千斤拔药材的基原植物物种, 化学指纹图谱等方法又因其操作繁琐, 难以普及应用因此, 寻找一种快速准确的千斤拔药材鉴定方法对于千斤拔药材的质量控制及安全使用意义重大 DNA 条形码 (DNA barcoding) 是利用基因组中一段公认的标准短序列进行物种鉴定的分子诊断新技术 [4-6], 该技术自 23 年由加拿大动物学家 Hebert [7] 首次提出后, 现已发展成为生物分类学研究的热门方向和前沿技术, 通过建立生物 DNA 条形码系统能够实现快速准确和自动化的物种鉴定 1 多年间, 研究者们曾提出过 1 余条植物候选 DNA 条形码序列 [8], 并在不同的科属种群中对各候选条形码序列的鉴定能力进行了考察, 但到目前为止, 研究者们仍未达成一致意见 29 年, Consortium for the Barcode of Life(CBOL) 植物工作组提出使用 rbcl+matk 复合序列作为植物界的通用条形码序列 [9], 但由于扩增效率鉴定成功率等问题, 其在植物界的通用性受到质疑 213 年, 陈士林课题组建立以为核心,psbA-trnH 为辅的植物类中药材 DNA 条形码鉴定体系 [1], 并建议将该方法纳入中国药典本研究对近几年研究较热门的 DNA 条形码候选序列 ( 如 psba-trnh 及 rbcl) 在千斤拔属植物间的鉴别能力进行了比较分析, 考察不同 DNA 条形码候选序列在千斤拔属药用植物鉴定中的能力, 以期建立一种千斤拔属药用植物的高效鉴定方法 1 材料与方法 1.1 材料共收集千斤拔属实验材料 4 种 14 份, 均来自中国医学科学院药用植物研究所云南分所南药园内, 经本单位张丽霞副研究员鉴定为千斤拔 Flemingia philippinensis Merr. et Rolfe 大叶千斤拔 F. macrophylla (Willd.) Prain 长叶千斤拔 F. stricta Roxb. ex Ait. 宽叶千斤拔 F. latifolia Benth, 凭证标本保存于中国医学科学院药用植物研究所云南分所标本馆内实验材料见表 1 此外, 为了在更为广泛的范围内考察千斤拔属药用植物的 DNA 条形码鉴别能力, 从 GenBank 数据库中获得千斤拔属相关条形码序列用于物种的鉴定效率分析, 所引用序列的序列号见表 2 表 1 材料信息及其编号 Table 1 Specimen information and their code numbers 编号植物名编号植物名 1 宽叶千斤拔 8 长叶千斤拔 2 宽叶千斤拔 9 大叶千斤拔 3 宽叶千斤拔 1 千斤拔 4 宽叶千斤拔 11 千斤拔 5 宽叶千斤拔 12 千斤拔 6 宽叶千斤拔 13 千斤拔 7 长叶千斤拔 14 大叶千斤拔表 2 NCBI 数据库中的千斤拔属植物条形码序列 Table 2 Barcoding sequences of plants in Flemingia Roxb. ex Ait. et Ait. f. from NCBI database 序列序列号种名 JX 大叶千斤拔 FJ98288 大叶千斤拔 JX54629 球穗千斤拔 FJ98289 腺毛千斤拔 GQ 腺毛千斤拔 JX 千斤拔 rbcl KF 大叶千斤拔 GQ 大叶千斤拔 GQ 腺毛千斤拔 psba-trnh GQ 腺毛千斤拔 GQ 大叶千斤拔

3 12 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷第 1 期 215 年 1 月 1.2 仪器与试剂 DNA 提取试剂盒,Tiangen(DP35); 引物, 上海生工生物技术有限公司合成 ;rtaq DNA 聚合酶 ( 大连宝生物工程有限公司,DR1B), 包括 : TaKaRa TaqDNA 聚合酶 (5 U/μL),1 缓冲液 (Mg 2+ free),dntp mixture( 各 2.5 mmol/l),mgcl 2 (25 mmol/l);marker 购于北京鼎国生物技术有限公司 (B31); 其他试剂均为分析纯扩增仪 (Biometra Professional Standard), 电泳仪 (Biometra 公司 ), 凝胶成像系统 (Uvitec 公司 ) 1.3 样品 DNA 的提取 PCR 扩增和测序采集样品新鲜嫩叶并用水及 7% 乙醇擦洗表面后, 取样约.1 g, 液氮充分研磨并用 DNA 提取试剂盒 (DP35, 天根生化 ) 提取基因组 DNA 继而用特定引物扩增相应的序列片段,PCR 反应体系为 2 μl, 具体体系为 ddh 2 O,1 PCR 缓冲液 ( 含 1.5 mmol/l MgCl 2 ),dntp(.2 mmol/l), 正向反向引物 ( 各.2 μmol/l),taq DNA 聚合酶 (1.5 U), DNA(1~3 ng) 所用引物序列及扩增体系如表 3 所示特定条形码序列扩增成功后经 PCR 纯化试剂表 3 所用引物序列及相应 PCR 反应条件 Table 3 Sequences of used primers and correspounding PCR reaction conditions 引物名称引物序列 (5-3 ) PCR 反应条件 rbcl psba-trnh F: ATGCGATACTTGGTGTGAAT 94,5 min R: GACGCTTCTCCAGACTACAAT s,55 45 s,72 1 min,35 个循环 72 1 min F: ATGTCACCACAAACAGAAAC 94 5 min R: TCGCATGTACCTGCAGTAGC s,55 45 s,72 1 min,35 个循环 72 1 min F: GTTATGCATGAACGTAATGCTC 94 5 min R: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC s,55 45 s,72 1 min,35 个循环 72 1 min 盒 (AXYGEN, 美国 ) 纯化, 使用 ABI373XL 测序仪 (Applied Biosystems Co., 美国 ) 进行双向测序 1.4 数据处理测序峰图采用序列拼接软件 CodonCode Aligner V 2.6(CodonCode Co., 美国 ) 校对, 去除低质量序列及引物区, 后用 contig 软件拼接及 ClustalX V2. (Higgins D. G.) 进行多序列比对并查错对于序列, 拼接得到一致序列后使用基于隐马尔可夫模型的 HMMer 注释方法, 去除两端 5.8 S 和 26 S 区段获得间隔区序列 [11] ; 比对数据经 MEGA v 4.1 [12] 软件处理计算 K2P 遗传距离, 并采用 NJ (neighboring joining) 法构建系统进化树 ; 为评价各候选序列的物种鉴别能力, 利用 Taxon DNA [13] 统计不同序列种间种内遗传距离的分布频度, 评价不同 DNA 条形码候选序列的 barcoding gap 2 结果与分析 2.1 序列信息 PCR 扩增效率和测序成功率所扩增 3 条 DNA 条形码序列长度及 GC 统计结果见表 4, 其中序列长度最短, 为 21 bp, rbcl 序列最长, 达 66 bp; 各序列 GC 量也不同, 表 4 不同条形码序列的序列信息及测序成功率 Table 4 Sequence information and sequencing success rates of different barcodings 条形码平均序列 GC / PCR 扩增测序成信息位点数 / 序列长度 /bp % 效率 /% 功率 /% 变异位点数 /43 rbcl /385 psba-trnh /27 的 GC 量最高, 为 58.9%,psbA-trnH 的 GC 量最低, 仅有 38.2% PCR 扩增效率及测序成功率是评价 DNA 条形码序列的一个重要指标, 所分析 3 条 DNA 条形码序列在所分析样品中的扩增成功率均为 1%; 在测序成功率方面, 与 rbcl 序列的扩增成功率为 1%, 而 psba-trnh 序列的扩增成功率为 85.71% 变异位点及信息位点数可反映所分析材料的碱基变异程度, 统计 3 条候选序列的变异位点及信息位点可知,rbcL 的变异位点最多 (385 个 ), 但其中信息位点仅为 5 个, 所提供的物种鉴别信息极为有限 ; 对于 psba-trnh 序列, 其变异位点及信息位点数均比较多 (148/27), 说明其种间变

4 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷第 1 期 215 年 1 月 121 异及种内变异均比较丰富, 一个理想的 DNA 条形码序列, 其种间变异应明显大于种内变异, 根据 psba-trnh 序列的变异位点数及信息位点数, 初步判断 psba-trnh 序列对千斤拔属的物种鉴定能力有限 ; 而对于, 其变异位点共 43 个, 说明在千斤拔属植物间碱基变异较少, 相对保守, 而其信息位点却可达到 36 个, 说明其在千斤拔属植物的物种鉴定方面可提供较多信息综合比较序列长度 GC 量及序列扩增测序成功率, 再结合序列变异位点及信息位点数, 初步认为, 在所分析 3 条序列间, 序列为最合适条形码序列 2.2 不同 DNA 条形码候选序列 barcoding gap 检验理想的 DNA 条形码序列, 其种间遗传变异应明显大于种内变异, 并在两者之间存在显著差异, 形成一个明显的间隔区, 即 barcoding gap [14-15] 千斤拔属植物不同 DNA 条形码的 barcoding gap 见图 1 由图 1 可知,rbcL psba-trnh 序列的种间种内变异重叠明显, 无明显 barcoding gap, 无法准确鉴百分率 /% 百分率 /% 百分率 /% ~.1.1~.2.2~.3.3~.4.4~.5.5~.6.6~.7.7~.8.8~.9.9~.1.1~.11.11~.12.12~.13.13~.14.14~.15.15~.16.16~.17.17~.18.19~.2.~.1.~.1.1~.2.1~.2.2~.3.2~.3.3~.4.3~.4 rbcl.4~.5.4~.5.5~.6 psba-trnh.5~.6 图 1 种内种间变异相对分布图 Fig. 1 Relative distribution of inter-specific divergence and intra-specific variation.6~.7.6~.7 遗传距离.7~.8.7~.8.8~.9.8~.9.9~.1.9~.1 种内变异种间变异 >1. >1. 定物种 ; 而序列的种间种内变异明显分离, 存在明显 barcoding gap, 有利于千斤拔属植物的物种鉴定 2.3 系统进化分析聚类树状图也是评估候选 DNA 条形码序列物种鉴别能力的方法之一为增加条形码序列的物种鉴别分析可靠性, 将 GenBank 数据库中的千斤拔属相关条形码序列加入物种鉴定效率分析中利用 MEGA v4.1 软件的 NJ 法构建各序列的聚类树状图, 由图 2 可知, 序列构建的聚类图能很好地将所分析物种的同种样品聚在一起, 而不同种间的分支又能很好地分开 ( 除 F.philippinensis 与 F. stricta 外, 其聚类分支无法明显分开 ), 充分说明对于千斤拔属植物具有很好地物种鉴别能力 ; 而利用 rbcl 及 psba-trnh 序列构建的系统进化树显示无法很好地反映不同种间的遗传变异及同种样品间的同源性由图 2 可知, 大叶千斤拔与宽叶千斤拔长叶千斤拔与千斤拔亲缘关系较近,2 分支聚合后又与球穗千斤拔聚在一起, 最后与腺毛千斤拔聚合该分析结果与植物传统分类学中千斤拔属植物形态特征差异性结果基本一致, 说明分析结果可靠性较高 JX FJ98288 JX JX54629 GQ FJ98289 图 2 基于序列构建的 NJ 系统进化树 Fig. 2 NJ tree based on sequences 3 讨论 3.1 候选 DNA 条形码序列对千斤拔属植物鉴别能力的分析比较理想的 DNA 条形码应满足以下条件 :(1) 具有显著的种间变异, 同时具有足够小的种内变异 ; (2) 有高度保守的引物设计区, 便于设计通用引物以扩增相应片段序列 ;(3) 片段应足够短, 以便于 DNA 提取和 PCR 扩增, 尤其是对部分降解 DNA 的

5 122 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷第 1 期 215 年 1 月扩增对千斤拔属 3 条候选序列进行比较分析, 综合 PCR 扩增和测序成功率 barcoding gap 和聚类图的分析结果可知, 较其他条形码序列,PCR 扩增和测序成功率均为 1%, 具有相对较明显的 barcoding gap, 且从聚类图可知, 对千斤拔属植物具有较好的鉴别能力综上所述, 对于千斤拔属植物, 是比较理想的 DNA 条形码序列 29 年,CBOL 植物工作组通过大量实验发现, rbcl+matk 复合序列是较理想的植物 DNA 条形码序列组合, 其鉴定能力可达 72% 在实验过程中发现, 对于千斤拔属植物, 其 matk 序列的扩增成功率极低, 而 rbcl 序列的扩增成功率及测序成功率均为 1%, 但其序列较保守, 缺乏足够的信息位点 ( 序列长度为 66 bp, 但仅含 5 个信息位点 ), 无法鉴别千斤拔属植物 ; 因此,CBOL 所推荐的 rbcl+matk 复合序列无法在千斤拔属植物间成功应用 213 年, 陈士林课题组建议建立以为核心,psbA-trnH 为辅的植物类中药材 DNA 条形码鉴定体系 [1] 结果显示, 对于千斤拔属植物, 是较为理想的 DNA 条形码序列, 其 psba-trnh 序列较其他序列, 测序成功率低, 且因种内变异较大, 无法成功鉴别所分析样品, 因此, 与单一片段相比较, +psba-trnh 序列组合对于千斤拔属植物鉴定能力的改善无明显作用 3.2 序列对千斤拔药材准确鉴定的适用性及其意义序列作为 DNA 条形码候选序列具有以下特点 :(1) 序列足够短, 降低了 DNA 提取扩增和测序的难度, 尤其对那些已发生 DNA 降解的样品 ( 如药材蜡叶标本等 ) 的分析鉴定工作具有重要意义 ;(2) 序列两端的 5.8 S 和 26 S 序列 [16] 都很保守, 便于通用引物的设计 ;(3)Schultz 等建立的数据库能够预测二级结构并对间隔区进行注释, 极大地提高了序列的处理和分析的准确性可靠性本研究结果显示, 对千斤拔属植物具有很好的鉴别能力因千斤拔药材以根入药, 传统的性状鉴别显微鉴别理化鉴别无法达到快速准确鉴定的目的, 而化学指纹图谱等方法又因操作繁琐专业背景要求高等特点, 无法满足中药材鉴别的实际应用因此, 将序列作为千斤拔药材基原植物鉴定的条形码序列对于千斤拔药材的资源保护及安全用药具有重要意义随着分子生物学技术的快速发展, 高通量测序等技术的不断进步,DNA 条形码技术的应用不断拓展 ; 因中药研究的特殊性, 其应用安全性种源确定资源评价及濒危物种的保护问题日益成为中药发展不可避免的问题, 若 DNA 条形码技术能在药用植物鉴定中发挥作用, 必将对中药事业的发展起到至关重要的作用参考文献 [1] 吴征镒. 新华本草纲要 [M]. 上海 : 上海科学技术出版社, [2] 张丽霞, 彭建明, 马洁. 千斤拔研究进展 [J]. 中药材, 27, 3(7): [3] 中国药典 [S]. 一部. 21. [4] Kress W J, Wurdack K J, Zimmer E A, et al. Use of DNA barcodes to identify flowering plants [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 25, 12(23): [5] 俞超, 梁孝祺, 陈金金, 等. DNA 条形码技术鉴定贝母属植物 [J]. 中草药, 214, 45(11): [6] Han J P, Liu C, Li M H, et al. Relationship between DNA barcoding and chemical classification of salvia medicinal herbs [J]. Chin Herb Med, 21, 2(1): [7] Hebert P D N, Ratnasingham S, de Waard J R. Barcoding animal life: cytochrome coxidase subunit 1 divergences among closely related species [J]. Proc Biol Sci, 23(27): [8] Ning S P, Yan H F, Gang H, et al. Current advances of DNA barcoding study in plants [J]. Biodiv Sci, 28, 16(5): [9] CBOL Plant Working Group. A DNA barcode for land plants [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 29, 16(31): [1] 陈士林, 姚辉, 韩建萍, 等. 中药材 DNA 条形码分子鉴定指导原则 [J]. 中国中药杂志, 213, 38(2): [11] Keller A, Schleicher T, Schultz J, et al. 5.8 S-28 S rrna interaction and HMM-based annotation [J]. Gene, 29, 43(1/2): [12] Kumar S, Nei M, Dudley J, et al. MEGA:a biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences [J]. Brief Bioinform, 28, 9(4), [13] Meier R, Kwong S, Vaidya G, et al. DNA Barcoding and taxonomy in Diptera: a tale of high intraspecific variability and low identification success [J]. Syst Biol, 55(5), [14] Lahaye R, Bank M, Bogarin D, et al. DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 28, 15(8): [15] Meyer C P, Paulay G. DNA barcoding: error rates based on comprehensive sampling [J]. PloS Biol, 25, 3(12): e422. [16] Schultz J, Müller T, Achtziger M, et al. The internal transcribed spacer 2 database-a web server for (not only) low level phylogenetic analyses [J]. Nucl Acids Res, 26, 34:

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Syngene GBOXHR Retsch MM400 KQ DE Eppendorf Table 1 The sources of Astragali Radix and Hedysarum Radix No. 1 AMM2011_NMGTY Astr PCR 龙平, 崔占虎, 李虔全, 徐建平, 张春红, 周立社 * *, 李旻辉 ( 包头医学院, 内蒙古包头 014060) DNA 30 28 DNA trnl-trnf PCR PCR 136 bp 323 bp 10% PCR PCR Astragalus membranaceus Fisch. Bge. var. mongho- licus Bge. Hsiao A. membranaceus