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1 酵素分析方法 蛋白質定量 酵素活性分析 膠體電泳法 免疫轉印法 Proteomics 也是根基於分子構造有催化活性的巨分子 SDS vs ativepage 應用抗體的專一性解開基因序列之後

2 + 蛋白質構造的骨架 group 3 + α α α α

3 各種蛋白質定量法原理 5 Specific 3 Binding Group nm (carbonyl) 280 nm (aromatic) UV Absorbance Tyr eme M 活性區 u 2+ u + 4 Blue = S 3 Phosphomolybdicphosphotungstate oomassie Brilliant G S 3 S 3 Fe = S 3 Metal.. Lys 3 + S 3 S 3 1 Biruet Methods (carbonyl) Lowry Methods Arg 2 尿素 urea 2

4 Bradford Method oomassie Brilliant Blue G250 BG 是一種指示劑 470 nm 595 nm 加入蛋白質 酸性環境下呈茶色 與蛋白質結合變藍色

5 不同蛋白質的定量差異 A BSA IgG μg Protein

6 各種蛋白質定量法的比較 定量方法 靈敏度 準確度 其它說明 Biuret mg 高 呈色快速有腐蝕性銨離子干擾大 Lowry mg 中 呈色較慢多種離子有干擾 Absorbance 280 nm mg 低 樣本可回收其它物質干擾大 Absorbance 205 nm mg 高 樣本可回收氧分子干擾極大 Bradford Dyebinding mg 中高 呈色快雜質干擾多顏色不易洗除

7 精確 Bradford Method 精確 + 準確 206 nm 吸光度 準確 Lowry Method Biuret Method 不精確 + 不準確 280 nm 吸光度

8 酵素反應及偵測方法 移除生成物並轉成可測量者 使用大量反應物 10 x K m 生成物可能有回饋抑制 酵素 AD + 直接測量 AD 反應物 生成物 耦合反應能否直接測量? 把生成物再轉換成可被測量的生成物

9 酵素活性的測定 酵素量要適中 基質 要過量 10 x Km E t vo = P t 生成物 要能測得 酸鹼度 反應時間恰當 溫度

10 測定時間內反應速率需成線性 Product 正確速率 不正確速率 p v = p t t Time t

11 GUS 酵素活性的測定 反應物 生成物 GUS + 2 pitrophenyl βdglucuronide (ppg) βdglucuronic acid pitrophenol (yellow) 415 nm

12 電泳形式的演進 濾紙電泳 ellulose Protein Denatured 薄層電泳 (TLE) ellulose acetate Partial Denatured + 膠體電泳 Starch Gel

13 膠體的聚合反應 Ammonium persulfate (free radical initiator) 2 ( 4SS 4) 自由基的生成者 Acrylamide (monomer) 成膠的基本單位 Bis(acrylamide) (bridge) 架橋使聚合產生分枝 TEMED (catalyst) 2 S 4 幫助傳遞自由基的催化劑 SDS (Sodium dodecyl sulfate) = 2 Acrylamide 有毒性! 澱粉加高熱會誘生?

14 單體聚合反應鑄膠反應架橋物造成分枝 聚合反應 free radical Bis 交錯連結 端點自由基可再延續 Bis 自由基形成

15 SDS 在蛋白質表面均勻敷上一層負電 SDS 原態蛋白質 boiling 變性蛋白質成一線狀分子 並且均勻帶上一層負電荷 極性頭部 非極性尾部

16 電泳膠體系統的組成 電泳系統緩衝液 p 膠體濃度 1 上層 ( 負極 ) 緩衝液 Trisglycine 樣本溶液 Trisglycine 膠 焦集膠體 Trisl 體 分離膠體 Trisl 8.3 5% 7.5~20% 5 下層 ( 正極 ) 緩衝液 Trisglycine 8.3 膠體不連續性有焦聚樣本的作用

17 直立式電泳裝置 電泳開始 100~150 V Upper chamber Lower chamber + Stacking Gel ooling Water unning Gel +

18 焦集膠體對蛋白質分子的焦集作用分樣焦集膠體離膠體8.3 本 離子缺乏空間 A B + +

19 三種不同性質蛋白質的電泳比較 Protein Quaternary Structure Molecular Weight pi ative PAGE Mobility SDS PAGE X Tetramer (40,000)x4 5.8 Slow Fast Y Z Monomer 88,000 Monomer 60, Fast Upward Slow Medium + X Y Z

20 ativepage X Y Z + SDS + SDSPAGE X Y Z 分子量及淨電荷密度均影響泳動率 只有分子量影響泳動率

21 單元體分子量的測定 : SDSPAGE Mol mass kd kd kd Migration ( f ) Pharmacia: Molecular Markers for electrophoresis

22 各種蛋白質染色法機制 金屬銀沈澱 Ag (ys) + 2 Glu 還原 Lys + 1 Ammoniacal silver 3 Ag 3 2 Ag Glutaraldehyde Lys 3 + oomassie Brilliant Blue S 3 S 3 S 3 S 3 = S 3 = S 3 Arg

23 電泳槽及相關設備 轉印三明治 轉印槽 電泳槽 鑄膠器 供電器

24 轉印及免疫染色流程 A 轉印三明治 B 免疫染色流程及結果 塑膠夾板 Filter Paper 轉印 E 抗體 + Gel itrocellulose 海綿墊 電泳膠體 oomassie Blue Staining 轉印膜 Ponceau Staining 抗體偵測呈色

25 免疫轉印的種類與呈色機制 2 E S E Antigen Antibody Second Antibody adioactive Tracer 1. orse adish Peroxidase (P) 2. Alkaline Phosphatase (AP) Biotin Streptavidin Biotin P AP 轉印紙 E E Au S E IA EIA E P 2 S S S 2 2 S S S E S S S S S P E P P P P P P P P P E P P P S S S P 基質 生成物 S Au olloidal Gold 生成物堆積

26 擔體免疫沈澱的原理及應用 擔體免疫沈澱 A A A A A 離心分離後以 SDSPAGE 電泳檢定 抗原有輕鏈及重鏈各兩條 抗原可能有兩個次體 L A 細胞粗抽取液

27 澱粉磷解 染色方法比較 硝酸銀 活性染色 免疫轉印 SDSPAGE DiscPAGE 膠體過濾法各分劃

28 等電焦集法的焦集方式 Ampholyte 在低 p 處帶正電被排斥 焦集在等電點 在高 p 處帶負電被排斥

29 3.3.2 等電焦集法原理 樣本分子在一已知 p 梯度中焦集 168 cm 169 cm 167 cm

30 等電焦集的雙性離子構造 組合不同數目胺基與酸基可合成多種 pi 的混合物

31 等電點標準校正線 : IEF 9 pi SS Migration (cm)

32 二次元電泳 kd 100 p 4 Isoelectric focusing SDS PAGE

33 二次元電泳操作流程 (1) IEF 等電焦集電泳 p 3 10 (2) SDSPAGE 分離膠體 Juang (2004) Proteomics (3) 染色脫色

34 蛋白質體可綜觀蛋白質的消長與身分 Proteolytic digestion Sample 2D electrophoresis Pure protein Proteolytic fragments Mass spectrum MALDITF apillary Electrophoresis PL GG Database searching Amino acid sequencing

35 質譜儀可檢定蛋白質身分 Unknown protein Protease digestion P1 P2 P3 P4 MALDITF MW4 MW2 MW3 MW1 m/z Search Database andidate protein Digestion Simulation alculate Mol wt MW4 MW2 MW3 MW1 比對各片段分子量可確定該蛋白質身分

36 質譜儀可進行蛋白質序列分析 Unknown protein Protease digestion P1 P2 P3 P4 L P4 ESIMass/Mass G K G S W V GKGSWV 質譜儀可直接定序 Phosphorylated protein Protease digestion P1 P2 P3 P4 L ESIMass/Mass P P4 P 也可定出磷酸化位置

37 現代蛋白質科技的特點 高產能 ighthrough put 快速 微量 ighspeed Microscaled

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