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亭野桑
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1 中国农业科学 2006,39(4): Scientia Agricultura Sinica 小麦糖原合成酶激酶 (TaGSK1) 的亚细胞定位及功能鉴定 1, 吴立柱 2, 赵宝存 1, 齐志广 1, 葛荣朝 1, 马闻师 1, 沈银柱 1, 黄占景 1 ( 1 河北师范大学生命科学学院, 石家庄 ; 2 河北农业大学生命科学学院, 保定 ) 摘要 : 目的对小麦糖原合成酶激酶(TaGSK1) 进行亚细胞水平定位以及功能鉴定方法构建 Tagsk1-gfp 融合基因表达载体并转化拟南芥, 以仅携带 gfp 基因的拟南芥作为对照, 利用共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白在转基因植株根部细胞的分布 ; 利用含不同浓度 NaCl 的 MS 培养基对携带有融合基因的拟南芥和 Columbia 型拟南芥进行耐盐性鉴定, 观察主根生长量和侧根生长数目结果发现 TaGSK1 存在于细胞质内, 且该激酶在根尖分生组织和与侧根发生有关的中柱鞘细胞中分布较多 ; 耐盐性鉴定结果表明, 转 Tagsk1-gfp 融合基因的植株的平均主根生长量和侧根生长数目与 Columbia 型拟南芥植株的差异均达到极显著水平 (P<0.01) 结论 TaGSK1 定位于细胞质内, 该激酶具有促进细胞分裂及提高转基因拟南芥抗渗透抗胁迫的能力关键词 : 小麦糖原合成酶激酶 ; 绿色荧光蛋白 ; 拟南芥 ; 盐胁迫 ; 抗渗透 Localization and Function Analysis of Wheat Glycogen Syntheses Kinase (TaGSK 1) WU Li-zhu 1, 2, ZHAO Bao-cun 1, QI Zhi-guang 1, GE Rong-chao 1, MA Wen-shi 1, SHEN Yin-zhu 1, HUANG Zhan-jing 1 ( 1 College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang ; 2 College of Life Science, Hebei Agricultural University, Baoding ) Abstract: Objective The localization and function of wheat glycogen synthase kinase (TaGSK1) in plant cells was studied. Method Tagsk1 gene linked with gfp gene was transformed into Arabidopsis via Agrobactiria. Arabidopsis containing gfp was used as control, the distribution of TaGSK1 in root cells was observed with laser confocal microscope. Different transgenic plants were planted in MS medium containing different concentrations of NaCl for screening salt-tolerant plants. Using the wild type Arabidopsis as control, the length of taproots was measured on the seventh day and the lateral roots number was counted on the ninth day. Result It was found that the green fluorescence of fused protein TaGSK-GFP distributed in cytoplasm of the transgenic plant cells, and mainly in root meristem and stelar sheath, where new roots would develop. Significant difference (P<0.01) existed between transgenic plants and their control plants about the root number and length. Conclusion It is suggested that TaGSK1 localized in cytoplasm and could improve cell proliferation, development, anti-osmotic and anti-stress ability of transgenic plants. Key words: TaGSK1; GFP; Arabidopsis; Salt tolerance; Anti-osmotic 0 引言 [1] 本研究的重要意义前文报告,Chen 等从小麦耐盐突变体 RH 中分离克隆的小麦糖原合成酶激酶基因 (Tagsk1, GenBankAF525086), 该激酶属于 Ser/Thr 蛋白激酶, 用其转化大肠杆菌能提高受体菌的耐盐性 [2] 前人研究进展植物中的 GSK 家族是一个由多基因家族编码, 具有 Ser/Thr 激酶活性, 收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( ) 和河北省自然科学基金资助项目 (301103) 作者简介 : 吴立柱, 赵宝存同为第一作者吴立柱 (1977- ), 男, 河北景县人, 硕士研究生, 研究方向为植物分子生物学赵宝存 (1971- ), 女, 河北大城人, 副教授, 博士, 研究方向为植物分子生物学通讯作者黄占景 (1957-), 男, 河北深县人, 教授, 博士, 研究方向为植物分子生物学 Tel: ;Fax: ; huangzhanjing@ sohu.com

2 4 期吴立柱等 : 小麦糖原合成酶激酶 (TaGSK1) 的亚细胞定位及功能鉴定 843 [3~5] 且参与许多信号传导途径的庞大家族 GSK/SHAGGY- like 激酶广泛参与了细胞分化 [6] 凋亡 [3] 渗透胁迫 [7] 花的发育油菜素内酯的信号传导 [8] 盐胁迫应答机制以及损伤修复等多种生物学过 [4, 9, 程 10] [11] Piao 等通过对酵母盐敏感型的钙调蛋白磷酸酶突变株进行功能互补试验, 分离得到了拟南芥中编码与 GSK/SHAGGY-like 同源的蛋白激酶 AtGSK1, 并发现 AtGSK1 受 NaCl 诱导表达, 且与拟南芥的耐盐能力呈正相关本研究的切入点目前, 尚未见关于小麦糖原合成酶激酶的亚细胞定位及其在真核生物中功能鉴定的报道近年来绿色荧光蛋白 (GFP) 被广泛应用于活体定位观察蛋白质定位细胞间物质运输及运输的动力学研究 [12] 拟解决的关键问题本文利用绿色荧光蛋白基因 (gfp) 与小麦的 Tagsk1 基因构建成融合基因, 经农杆菌介导转化 Columbia 型拟南芥, 对 TaGSK1 进行了组织及细胞水平上的定位, 并对转基因拟南芥进行了耐盐性鉴定 1 材料与方法 1.1 材料 pgem-t-tagsk1( 小麦糖原合成酶激酶基因 Tagsk1 的克隆载体, 本研究室保存 ),pbinmgfp 4 Columbia 型拟南芥 ( 由武汉大学吕应堂教授惠赠 ), 根癌农杆菌 GV3101( 由河北师范大学细胞实验室毛国红教授惠赠 ) 由上海生工生物有限公司合成以下引物 : SP1: 5 GCTGGATCCATGGGCAATATGAGCA- TA 3 AP1: 5 GCTGGATCCCCCATCCTACAAAGGC- AC 3 SP2: 5 GAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATA- CG 3 AP2: 5 CATCCATGCCATGTGTAATCCCAGC- AG 方法双元表达载体 (pbin-ta-gfp) 的构建以 SP1 AP1 为特异引物, 以质粒 pgem-t-tagsk1 为模板扩增得到小麦糖原合成酶激酶基因 (Tagsk1) 的 ORF 序列, 并将该序列插入载体 pbinmgfp 4 的 BamHI 位点, 与绿色荧光蛋白基因构建成 Tagsk1-gfp 融合基因, 并与 35S 启动子连接, 构建成双元表达载体 pbin- Ta-GFP 农杆菌转化拟南芥主要参照 Clough S L [13] 等的方法并稍有改动在转化植株恢复正常培养 3 d 后, 用大口径的吸管吸取相应的新鲜转化液, 逐个醮沾花蕾以提高转化率转基因植株纯合体的获得将转化后所收获的拟南芥种子 (T 1 ) 种植在含有 kan(50 μg ml -1 ) 的筛选培养基上,7 d 后挑选抗性植株移栽至培养基质 ( 蛭石与营养土 3:1) 中, 正常培养将收获的 T 1 植株的种子 (T 2 ) 在含有 kan(50 mg L -1 ) 的培养基上筛选并统计分离比将成活株数与死亡株数之比符合 3:1 的转基因株系中的抗性植株移栽至上述培养基质中, 单株收获 T 3 种子并在 MS 培养基 (50 mg L -1 Kan) 上筛选纯合体, 提取转基因拟南芥基因组 DNA, 对其进行分子鉴定小麦糖原合成酶激酶 (TaGSK1) 的亚细胞定位以仅携带 gfp 基因的拟南芥 AGFP 作为转有融合基因的拟南芥 ATaGFP 的对照, 进行 TaGSK1 的定位为避免拟南芥叶片自身荧光的干扰, 笔者选取正常条件培养下生长 6 d 的转基因拟南芥 AGFP 和 ATaGFP 的根部细胞, 利用共聚焦显微镜观察绿色荧光在根部细胞的分布, 以此确定目的蛋白在转基因植株根部细胞的分布转基因植株的耐盐性鉴定以 Columbia 型拟南芥 (WT) 为对照, 将转有融合基因的转基因拟南芥 ATaGFP T 3 纯合株系和对照的种子消毒后种植于含 70 mmol L -1 和 120 mmol L -1 NaCl 的 MS 培养基上, 于 7 d 后统计主根的生长量,9 d 后统计侧根的生长数量, 并进行 SSR(shortest significant ranges) 统计分析 [14] 2 结果与分析 2.1 双元表达载体 pbin-ta-gfp 的构建结果将以 SP1 AP1 为特异引物扩增得到的小麦糖原合成酶激酶基因 (Tagsk1) 的 ORF 区连接于 P GEM-T 载体后测序, 结果显示所得 ORF 序列与笔者已登录的序列 (AF525086) 完全一致通过 BamHI 酶切, 将小麦糖原合成酶激酶基因 (Tagsk1) 的 ORF 序列插入载体 pbinmgfp 4 的相应酶切位点与 gfp 融合, 构建成双元表达载体 pbin-ta-gfp 经测序检测 Tagsk1 及 gfp 基因的阅读框均未发生改变 2.2 阳性植株的筛选及转基因植株的 PCR 鉴定经含 50 mg ml -1 Kan 的 MS 固体培养基筛选,T 1 阳性植株真叶健康, 呈深绿色, 根系发育良好, 而非

844 中国农业科学 39 卷转化植株则枯萎死亡统计结果表明, 采用改进的浸花法 (floral dip) 转化 Columbia 型拟南芥, 共计得到 94 株阳性植株 (T 1 ) 将收获的 T 1 植株的种子 (T 2 ) 按不同株系分别种植于含 50 mg L -1 Kan MS 筛选培养基上,7 d 后表现出抗性分离将抗性苗与非抗性苗比值符合 3:1

拟南芥根部细胞质壁分离前的荧光图, 荧光主要分布于细胞核和细胞膜上 ; 2. 拟南芥根部细胞质壁分离后的荧光图, 细胞壁上没有荧光 ( 质壁分离液 :1.3 mol L -1 蔗糖 ); 标尺 :10μm 1.

3mol L -1 sucrose), there was not any fluorescence in cell wall; Bar: 10μm 图 2 绿色荧光蛋白 (GFP) 在拟南芥根部细胞中的定位 Fig. 2 Localization of GFP in Arabidopsis root cell 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 WT M 1~8.

3 844 中国农业科学 39 卷转化植株则枯萎死亡统计结果表明, 采用改进的浸花法 (floral dip) 转化 Columbia 型拟南芥, 共计得到 94 株阳性植株 (T 1 ) 将收获的 T 1 植株的种子 (T 2 ) 按不同株系分别种植于含 50 mg L -1 Kan MS 筛选培养基上,7 d 后表现出抗性分离将抗性苗与非抗性苗比值符合 3:1 分离比的株系移栽至培养基质中, 按单株收获种子 (T 3 ) 并种植于 MS 培养基 (50 mg L -1 Kan) 上, 选取对 Kan 抗性不分离的株系 ( 纯合体 ), 分别提取它们的基因组 DNA, 以特异引物 SP1 SP2 和 AP2 进行 PCR 扩增检测, 结果表明所选取的 T 3 转基因植株全部为阳性植株 ( 图 1) 拟南芥根部细胞质壁分离前的荧光图, 荧光主要分布于细胞核和细胞膜上 ; 2. 拟南芥根部细胞质壁分离后的荧光图, 细胞壁上没有荧光 ( 质壁分离液 :1.3 mol L -1 蔗糖 ); 标尺 :10μm 1. Fluorescence photo before root cell plasmolyzed, fluorescence focus on the nucleus and cell membrane; 2. Fluorescence photo after root cell plasmolyzed (1.3mol L -1 sucrose), there was not any fluorescence in cell wall; Bar: 10μm 图 2 绿色荧光蛋白 (GFP) 在拟南芥根部细胞中的定位 Fig. 2 Localization of GFP in Arabidopsis root cell WT M 1~8. T 3 ATaGFP 单株 ; 9. 空载质粒 pbinmgfp 4 ; 10. 重组质粒 pbin-ta-gfp; WT. 未转基因的 Columbia 型拟南芥 ; M. λ-ecot14 I marker 1-8. T 3 ATaGFP; 9. pbinmgfp 4 ; 10. pbin-ta-gfp; WT. Columbia Arabidopsis; M. λ-ecot14i marker 图 1 T3 转基因植株的 PCR 鉴定 Fig.1 Identification of T 3 transgenic plants by PCR 2.3 亚细胞定位分别随机选取 T 3 的 ATaGFP 和 AGFP 各 15 个株系进行正常光照培养,6 d 后利用共聚焦荧光显微镜观察其根部细胞的绿色荧光, 根据绿色荧光在细胞中的分布确定目的蛋白在细胞中的分布转有空载质粒 pbinmgfp 4 的对照转基因拟南芥 AGFP, 其荧光主要位于细胞的细胞核和细胞膜等部位 ( 图 2-1); 利用 1.3 mol L -1 蔗糖溶液处理 15 min 后发生质壁分离, 更明确显示绿色荧光蛋白 GFP 主要分布于细胞的细胞核和细胞膜上, 而细胞壁及其它部位 [15] 没有发现荧光 ( 图 2-2) 该结果与 Haseloff 等报道的 GFP 在转基因拟南芥细胞中具有亲核亲膜的特征相一致转有 pbin-ta-gfp 的拟南芥 ATaGFP, 利用 1.3 mol L -1 蔗糖溶液处理 15 min 后没有发生质壁分离现象, 而利用 2.0 mol L -1 蔗糖溶液处理 15 min 后, 仅个别根部细胞发生了质壁分离, 其绿色荧光主要分布于细胞质内, 细胞膜部位有微弱荧光, 而其它部位没有荧光 ( 图 3) 由此可见, 小麦糖原合成酶激酶 TaGSK1 主要分布于植物细胞的细胞质内, 同时也说明 TaGSK1 能够提高转基因拟南芥根部细胞的抗胁迫抗渗透能力 2.4 TaGSK1 在转基因拟南芥根部的分布利用共聚焦显微镜对转基因拟南芥根部进行观察, 发现转基因植株 ATaGFP 的绿色荧光主要分布于根尖的分生组织 (RT), 而在根尖的根冠部分 (RC) 没有绿色荧光 ( 图 4-1) 此外, 笔者还发现在侧根的基部 (LRC)( 图 4-2), 以及与侧根发生有关的中柱鞘细胞 (SS)( 图 4-3) 亦有较多的绿色荧光存在特别令人兴奋的是转基因拟南芥 ATaGFP 的绿色荧光在根毛细胞 (RH) 内呈区域化分布 ( 图 4-4), 但在对照组拟南芥 AGFP 中未发现上述现象从而说明糖原合成酶激酶主要分布于根尖分生组织侧根基部以及与侧根发生有关的中柱鞘细胞 2.5 功能鉴定将转基因拟南芥 ATaGFP 和对照 Columbia 型拟南芥 WT 的种子消毒后分别种植在含 70 mmol L -1 和 120 mmol L -1 NaCl 的 MS 培养基上 ( 图 5),7 d 后测量上述两类幼苗主根的生长量, 统计结果表明在含 70 mmol L -1 NaCl 的培养基上平均生长量分别为 cm 和 cm, 二者之间的差异达显著水平 (P<0.05); 而在含 120 mmol L -1 NaCl 的培养基上, 二者依次为 cm 和 cm, 差异达极显著水平 (P<0.01)( 表 ) 9 d 后统计各供试植株的侧根生长

4 期吴立柱等 : 小麦糖原合成酶激酶 (TaGSK1) 的亚细胞定位及功能鉴定 845 1 2 3 1. 拟南芥根部细胞质壁分离前的荧光图 ;2.

0 mol L -1 蔗糖 ); 标尺 :10 μm Fluorescence photo before root cell plasmolyzed; 2.

Merge of the fluorescence photo and transmission photo after root cell plasmolyzed (2.

3 Localization of TaGSK1-GFP fused protein in Arabidopsis root cell RT RC LRC SS RH 1 2 3

Root tip (RT); 2. Basal part of lateral root cell (LRC); 3. Stellar sheath (SS); 4.

4 Fluorescence analysis of transgenic Arabidopsis ATaGFP 转基因植株 Transgenic plants (ATaGFP)

直接种植于含盐培养基 (70 mmol L -1 NaCl)9d 后观察根的侧根生长数量 1.

Count the lateral root number after seeding 9 days on salt MS medium (70 mmol L -1 NaCl)

5 Root growth analysis of transgenic Arabidopsis ATaGFP 数目, 结果表明在含 70 mmol L -1 NaCl

4 4 期吴立柱等 : 小麦糖原合成酶激酶 (TaGSK1) 的亚细胞定位及功能鉴定拟南芥根部细胞质壁分离前的荧光图 ;2. 拟南芥根部细胞质壁分离后的荧光图 ( 箭头所指为发生质壁分离的细胞 );3. 拟南芥根部细胞质壁分离后荧光图与细胞投射图叠加效果图 ( 质壁分离液 :2.0 mol L -1 蔗糖 ); 标尺 :10 μm Fluorescence photo before root cell plasmolyzed; 2. Fluorescence photo after root cell plasmolyzed (arrows show plasmolyzed cell); 3. Merge of the fluorescence photo and transmission photo after root cell plasmolyzed (2.0mol L -1 sucrose); Bar: 10 μm 图 3 TaGSK1-GFP 融合蛋白在拟南芥根部细胞的定位 Fig. 3 Localization of TaGSK1-GFP fused protein in Arabidopsis root cell RT RC LRC SS RH 根尖细胞荧光图 ;2. 侧根基部细胞的荧光图 ;3. 中柱鞘细胞荧光图和透射图的叠加效果图 ;4. 根毛细胞荧光图 ; 标尺 :10 μm 1. Root tip (RT); 2. Basal part of lateral root cell (LRC); 3. Stellar sheath (SS); 4. Root hair (RH); Bar: 10 μm 图 4 转基因拟南芥 ATaGFP 的荧光观察 Fig.4 Fluorescence analysis of transgenic Arabidopsis ATaGFP 转基因植株 Transgenic plants (ATaGFP) 对照植株 Contral plants (Columbia) 直接种植于含盐培养基 (70 mmol L -1 NaCl)7d 后观察主根的生长量 ; 2. 直接种植于含盐培养基 (70 mmol L -1 NaCl)9d 后观察根的侧根生长数量 1. Measure the taproot growth after seeding 7 days on salt MS medium (70 mmol L -1 NaCl); 2. Count the lateral root number after seeding 9 days on salt MS medium (70 mmol L -1 NaCl) 图 5 转基因拟南芥根的观察 Fig.5 Root growth analysis of transgenic Arabidopsis ATaGFP 数目, 结果表明在含 70 mmol L -1 NaCl 的培养基上, 上述两类植株的平均侧根数目依次为条和条, 在含 120 mmol L -1 NaCl 的培养基上, 二者依次为条和条 ( 表 ), 两类植株侧根数目之间的差异均达到极显著水平 (P<0.01) 由此可见, 小麦糖原合成酶激酶 TaGSK1 能够增加转基因拟南芥在含盐培养基上的主根生长量和侧根的生长数量, 且在含较高浓度盐的培养基上其作用更加明显 3 讨论 3.1 TaGSK1 与细胞增殖利用共聚焦显微镜观察携带融合基因的转基因拟南芥 ATaGFP 的根部细胞, 发现绿色荧光主要分布在根尖分生组织侧根基部和与侧根发生有关的中柱鞘细胞 ( 图 ) 这一结果正好与本研究的转有

5 846 中国农业科学 39 卷表各类植株在不同含盐量培养基上的生长情况及新复极差测验分析结果 Table Root growth analysis of Arabidopsis on MS medium with different concentrations of NaCl by shortest significant ranges (SSR) test 含盐培养基 NaCl 浓度 Concentration of NaCl (mmol L -1 ) 植株类型检测株数主根生长量 n o =50(SE=0.5036) The length of taproots analysis 侧根数目 n o =50(SE=0.5036) The number of lateral roots analysis Plant type Plants tested 差异显著性差异显著性平均 (cm) 平均 Significant test Significant test Average Average 5% 1% 5% 1% ATaGFP a A a A WT b A bc BC ATaGFP c B b B WT d C c C 融合基因的转基因拟南芥 ATaGFP 在含盐培养基上的主根生长量和侧根生长数目明显多于对照, 其间差异达到显著和极显著水平的事实相对应由此推测小麦糖原合成酶激酶 TaGSK1 具有促进细胞增殖的作用 [8] 上述结果与 Yin 等人提出的 GSK 参与细胞生长发育调控, 并可激活相关细胞分裂因子, 促进细胞分裂的 [3] 理论相吻合 ; 也与 Dornelas 等人发现的 AtGSK11 和 AtGSK12 基因在花和花序的分生组织中表达的结论相一致 3.2 TaGSK1 与植物的抗渗透抗胁迫能力本研究对携带 gfp 基因及 Tagsk1-gfp 基因的拟南芥分别进行高渗处理, 发现用高浓度的蔗糖溶液 (2.0 mol L -1 ) 处理 15 min 时,ATaGFP 植株的根部细胞中仅个别细胞发生质壁分离 ( 图 3-2), 其抗渗透能力远高于携带 gfp 基因的转基因拟南芥由此说明,TaGSK1 能够提高根部细胞抗渗透的能力同时本研究对 WT 和 ATaGFP 植株在含不同浓度 NaCl 的培养基上进行培养, 结果显示,ATaGFP 的平均主根生长量和侧根生长数量远高于对照植株低盐浓度胁迫处理时, 二者差异分别达到显著水平 (P<0.05) 和极显著水平 (P<0.01), 随着盐浓度的升高主根生长量的差异亦达到了极显著水平 (P<0.01)( 表 ) 这显然是小麦糖原合成酶激酶 TaGSK1 提高了转基因植株耐盐能力的直 [4] 接结果上述结果为 Jonak 等人关于蛋白激酶家族 [16] 参与盐胁迫应答, 以及 Piao 等人关于 GSK 可以提高植物对盐和干旱的耐受力提供了又一佐证 3.3 TaGSK1 与细胞胁迫下的应答反应本研究结果表明, 小麦糖原合成酶激酶 TaGSK1 主要分布于细胞质内 ( 图 ), 对细胞增殖有促进作用, 且参与了盐胁迫下的应答反应其具体的生理功能表现为提高了转基因植物的抗渗透抗胁迫能力, 且使根分生组织活跃, 对转基因植物主根和侧根的分生有明显的促进作用这些结果与糖原合成酶激酶在根尖分生组织和与侧根发生有关的中柱鞘细胞分布较多有直接关系此外, 糖原合成酶激酶 TaGSK1, 在转基因植株的初生根毛细胞内呈区域化分布 ( 图 4-4), 也是该激酶参与植物细胞胁迫下应答反应的依据之一这是因为根毛是由根表皮细胞外壁向外延伸形成的, 具有吸收和固着作用, 是植物细胞从外界吸收各种离子最活跃的区域, 这一事实不仅再次说明该激酶主要分布于细胞质内, 也说明其参与了植物细胞胁迫下的应答反应综上所述, 本研究利用近年来用于标记的绿色荧光蛋白基因 gfp 与 Tagsk1 构建成的双元表达载体, 在将该激酶定位于细胞质内的同时, 对转基因植株 ATaGFP 进行了功能鉴定, 结果表明该激酶对细胞增殖有促进作用, 提高了转基因植株的抗渗透抗胁迫的能力, 参与了植物细胞胁迫下的应答反应但是在信号传导途径中, 上游信号 ( 渗透胁迫盐胁迫等 ) 是如何经过第二信使激活糖原合成酶激酶的, 后者又是通过何种途径最终表现出相应的生理功能的, 即具体与糖原合成酶激酶相互作用的上下游蛋白是今后研究应进一步解决的问题 4 结论 TaGSK1 定位于细胞质内该激酶具有促进细胞分裂及提高转基因拟南芥抗渗透抗胁迫的能力致谢 : 河北师范大学细胞生物学省重点实验室孙颖教授对本文进行了修改并提出了宝贵意见, 谨致谢忱! References [1] Chen G P, Ma W S, Huang Z J, Xu T, Xue Y B, Shen Y Zhu. Isolation and characterization of Tagsk1 involved in wheat salt

6 4 期吴立柱等 : 小麦糖原合成酶激酶 (TaGSK1) 的亚细胞定位及功能鉴定 847 tolerance. Plant Science, 2003, 165: [10] Shi H Z, Lee B H, Wu S J, Zhu J K. Overexpression of a plasma [2] 徐涛, 马闻师, 沈银柱, 张庆祝, 齐志广, 黄占景. 小麦糖原合 membrane Na + /H + antiporter gene improves salt tolerance in 成酶激酶 (Tagsk1) 表达载体的构建及原核表达. 中国农业科学, 2004, 37: Xu T, Ma W S, Shen Y Z, Zhang Q Z, Qi Z G, Huang Z J. Construction of Triticum aestium L. glycogen synthase kinase (TaGSK1) expression vector and its prokaryotic expression. Scientia Agricultura Sinica, 2004, 37: (in Chinese) [3] Dornelas M C, van Lammeren A A M, Kreis M. Arabidopsis thaliana SHAGGY-related protein kinases (AtSK11 and 12) function in perianth and gynoecium development. The Plant Journal, 2000, 21: [4] Jonak C, Beisteiner D, Beyerly J, Hirt H. Wound-induced expression and activation of WIG, a novel glycogen synthase kinase 3. The Plant Cell, 2000, 12: [5] Xiong L M, Schumaker K S, Zhu J K. Cell signaling during cold, drought, and salt stress. The Plant Cell, 2002: S165-S183. [6] Tavares R, Vidal J, van Lammeren A, Kreis M. Atskθ, a plant homologue of SGG/GSK-3 marks developing tissues in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology, 2002, 50: [7] Charrier B, Champion A, Henry Y, Kreis M. Expression profiling of the whole Arabidopsis Shaggy-like kinase multigene family by real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Plant Physiology, 2002, 130: [8] Yin Y H, Wang Z Y, Mora-Garcia S, Li J M, Yoshida S, Asami T, Chory J. BES1 Accumulates in the nucleus in response to Brassinosteroids to regulate gene expression and promote stem elongation. Cell, 2002, 109: [9] Fang X J, Yu S X, Lu Y L, Bast R C Jr, Woodgett J R, Mills G B. Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3 by Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology, 2003, 21: [11] Piao H L, Pih K T, Lim J H, Kang S G, Jin J B, Kim S H, Hwang I. An Arabidopsis GSK3/shaggy-like gene that complements yeast salt stress-sensitive mutants is induced by NaCl and abscisic acid. Plant Physiology, 1999, 119: [12] 夏平安, 刘维全, 江禹, 孙绍光, 杨淑艳, 王吉贵. 家蚕卵黄蛋白基因启动子区的克隆与活性分析. 遗传学报, 2004, 31: Xia P A, Liu W Q, Jiang Y, Sun S G, Yang S Y, Wang G J. Cloning and characterization of the promoter region of Musca domestica yolk protein-1 gene. Acta Genetica Sinica, 2004, 31: (in Chinese) [13] Clough S J, Bent A F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal, 1998, 16: [14] 陆建身, 赖麟. 生物统计学. 北京 : 高等教育出版社, 2003: Lu J S, Lai L. Biostatistics. Beijing: Higher Education Press, 2003: (in Chinese) [15] Haseloff J, Siemering K R, Prasher D C, Hodge S. Removal of a cryptic intron and subcellular localization of green fluorescent protein are required to mark transgenic Arabidopsis plant brightly. The Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 1997, 94: [16] Piao H L, Lim J H, Kim S J, Cheong G W, Hwang I. Constitutive over-expression of AtGSK1 induces NaCl stress responses in the absence of NaCl stress and results in enhanced NaCl tolerance in Arabidopsis. The Plant Journal, 2001, 27: protein kinase A. The Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2000, 97: ( 责任编辑孙雷心 )

材料方法载体构建转基因植株的获得

材料方法载体构建转基因植株的获得生物技术通报唐宏琨曾洪梅杨秀芬邱德文通过根癌农杆菌介导转化法将含有激发子基因的植物表达载体转化三生烟获得了转基因烟草植株用检测确认了阳性转化株用杂交和杂交进一步证实了基因的整合转录和表达对代转基因阳性株进行接种试验结果显示与非转基因对照相比表达的烟草叶片枯斑数量减少表明蛋白激发子基因的表达提高了转基因烟草对的抗性激发子基因烟草转化材料