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1 第 31 卷第 2 期大连海洋大学学报 Vol. 31 No 年 4 月 JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Apr DOI: / j. cnki. dlhyxb 文章编号 : (2016) 口虾蛄卵黄蛋白原 ( Vg) 基因的初步研究 1 刘海映 2 1, 张娜 2, 闫红伟 3 1, 刘奇 2 1, 邢坤 2 1, 陈雷 2, 隋宥珍 4, 林原 5, 李成久 5 5, 郭良勇 (1 郾大连海洋大学辽宁省海洋牧场工程技术研究中心, 辽宁大连 ; 2 郾大连海洋大学辽宁省海洋生物资源恢复与生境修 复重点实验室, 辽宁大连 ; 3 郾大连海洋大学水产与生命学院, 辽宁大连 ; 4 郾浙江省海洋水产研究所, 浙江舟 山 ; 5 郾辽宁省水产苗种管理局, 辽宁大连 ) 摘要 : 为研究口虾蛄 Oratosquilla oratoria 卵黄蛋白原 ( vitellogenin, Vg) 基因, 利用 cdna 末端快速扩增 (RACE) 技术克隆口虾蛄 Vg 基因 cdna 全长序列 (GenBank 登陆号 : KR422400), 并应用相对实时荧光定量 PCR 技术检测雌雄口虾蛄不同组织 不同发育时期卵巢 Vg mrna 的表达量 结果表明 : 口虾蛄 Vg 基因全长 7727 bp, 其中 5 忆端非编码区为 36 bp, 开放阅读框 (ORF) 为 7521 bp, 3 忆端非编码区为 170 bp, 共编码 2506 个氨基酸 ; 预测的氨基酸序列中存在 1 个长度为 20 个氨基酸的信号肽, 1 个类似于枯草蛋白酶的内切蛋白酶识别位点 (RSKR), 3 个潜在的 N- 连接糖基化位点, 1 个在无脊椎和脊椎动物卵黄蛋白原中都比较保守的 KALGNVG 基序 ; 对其结构域分析表明, 口虾蛄 Vg 蛋白含有 4 种保守结构域, 分别为卵黄蛋白原 N 端结构域 (Vitellogenin_ N) 血管性血友病因子 ( vwfd) 和两种未知功能结构域 ( domain of un 鄄 known function) DUF1943 与 DUF1081; 经 NCBI BLASTP 同源性比较, 口虾蛄 Vg 氨基酸序列与其他甲壳类的相似性为 46% ~ 52% ; 系统发育分析结果显示, 口虾蛄 Vg 单独聚为一支 ; 实时定量 PCR 结果显示, 口虾蛄 Vg 基因在性腺和肝胰腺中均有表达, 在肌肉中均不表达, 卵巢中 Vg mrna 的表达量显著高于其他组织 (P<0 郾 05), 且口虾蛄 Vg mrna 的相对表达量随着卵巢的发育不断增加 (P<0 郾 05), 在成熟期时达到最高值, 随后显著下降, Vg mrna 表达量在卵巢中的变化规律可以作为了解口虾蛄性腺发育的有效指标 本研究结果为口虾蛄 Vg 蛋白的功能研究奠定了基础 关键词 : 口虾蛄 ; 卵黄蛋白原 (Vg); 分子克隆 ; 荧光定量 PCR; 表达模式中图分类号 : S917 郾 4; S966 郾 1 摇摇摇摇文献标志码 : A 摇摇卵黄蛋白原 (vitellogenin, Vg) 是存在于非哺乳类卵生动物成熟雌性个体中的一种蛋白, 是几乎所有卵生动物卵黄蛋白 ( Vitellin, Vn) 的前体 Vg 在卵黄发生期迅速积累, 在卵子形成 胚胎发育和幼虫阶段都发挥十分重要的作用 在卵生动物中, Vg 不仅为成熟的卵母细胞发育成胚胎提供糖类 脂肪 蛋白质和其他营养物质 [1], 还能作为载体结合并携带金属离子 ( Zn 2+ Fe 3+ Cu 2+ Mg 2+ Ca 2+ ) 以及类胡萝卜素 甲状腺素 视黄醇 核黄素进入卵母细胞 [2-5] Vg 虽特异地存在于卵生成熟雌性动物体内, 但由于雄性及幼体动物体内也含有 Vg 基因 ( 通常不表达 ), 当环境中含有的具雌激素效应的内分泌干扰物 ( EDCs) 达到 一定剂量时, Vg 基因也会在雄性和幼体动物中进行表达 在环境毒理学上, 鱼类和水生无脊椎动物的 Vg 基因可以作为一种良好的生物指示物来监测环境雌激素的污染 [6] 此外, 关于 Vg 蛋白免疫学功能的研究在近些年也已成为研究热点 文昌鱼 Branchiostoma lanceolatum 的 Vg 可以抑制大肠杆菌的生长, 抑制率可达 90% 以上 [7] 埃及伊蚊 Aedes aegypti 的 Vg 可以特异性激活有效抗菌因子的大量表达, 从而抵御病原体的侵入 [8] 综上, Vg 既是卵生动物胚胎发育的重要营养物质, 也是重要的环境标志物, 还跟机体免疫防御密切相关, 因此, 对于 Vg 蛋白结构 表达模式和生物学功能等方面的研究, 是开展对水产动物人工繁育 病害防治和资 摇收稿日期 : 摇基金项目 : 辽宁省教育厅一般项目 (L ); 辽宁省科学技术计划项目 ( ); 农业部北方海水增养殖重点实验室开放课题 (2014-MSENC-KF-14); 大连海洋大学博士启动基金资助项目 ( ) 摇作者简介 : 刘海映 (1957 ), 男, 教授 hyliu@ dlou 郾 edu 郾 cn 摇通信作者 : 闫红伟 (1985 ), 女, 博士 yanhongwei@ dlou 郾 edu 郾 cn

2 132 大连海洋大学学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第 31 卷 源保护等工作的重要理论基础 在大多数的鱼类 两栖类 昆虫 甲壳动物和 少数软体动物中都开展了 Vg 基因的相关研究, 对 Vg 基因的结构和生物学功能也有了比较深入的了 解和认识 口虾蛄 Oratosquilla oratoria 俗称虾爬 子 螳螂虾等, 隶属于节肢动物门 Arthropoda 甲 壳纲 Crustacea 软甲亚纲 Eumalacostraca 口足目 Stomatopoda 虾蛄科 Squillidae 口虾蛄属 Oratos 鄄 quilla, 为口足类中的优势种群, 是中国沿海重要 的渔业品种 由于人为滥捕和海区环境被破坏等原 因, 口虾蛄资源量急剧减少, 为了对其进行人工繁 育和资源保护, 开展口虾蛄生殖生理学等方面的研 究显得尤为重要 目前, 有关口虾蛄 Vg 基因的研 究尚未见报道, 本研究中采用 cdna 末端快速扩增 (RACE) 技术首次成功克隆了口虾蛄 Vg cdna 全 长序列, 并对 Vg 基因的表达模式进行了分析, 以 期为其人工繁育 资源保护等提供理论基础 1 摇材料与方法 1 郾 1 摇材料 试验用口虾蛄采自大连近岸海域, 体长为 8 郾 5 ~ 16 郾 0 cm, 雌 雄各 30 尾, 在实验室控温循 环水槽中暂养一周, 水温为 25 益, 盐度为 30, 24 h 充气, 每天投喂新鲜菲律宾蛤仔 Ruditapes philip 鄄 pinarum 一次 动物总 RNA 快速抽提试剂盒 去 RNA 酶离心 管等均购自生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司 ; 3 忆 -Full RACE Core Set with PrimeScript TM RTase 试剂盒 5 忆 - Full RACE Kit with TAP 试剂盒 Prime 鄄 Script TM 域 High Fidelity RT - PCR 试剂盒 Prime 鄄 Script TM RT reagent 试剂盒 SYBR Premix Ex Taq TM 域 (Tli RNaseH Plus) 感受态大肠杆菌 Escherichia coli DH5 琢均购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ( TaKaRa ); peasy - T1 Simple Cloning 试剂盒 peasy - Blunt Simple Cloning 试剂盒 Trans1 - T1 Phage Resistant 感受态细胞均购自北京全式金生物 技术有限公司 ( TransGen Biotech); AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒 AxyPrep 质粒 DNA 小量试剂盒均 购自爱思进生物技术有限公司 ( AXYGEN Bio 鄄 tech) 试验用引物及 DNA 测序均由生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司和英潍捷基 ( 上海 ) 贸易有 限公司完成 1 郾 2 摇方法 1 郾 2 郾 1 摇样品的采集摇将口虾蛄麻醉后于冰上解剖, 取雌 雄口虾蛄的性腺 肝胰腺 肌肉组织 ( 各 组织取自 3 尾口虾蛄 ) 及 4 个不同发育时期 ( 参 [9] 照 Sohier 等的分期方法, 玉为未发育期, 域为卵 黄发生期, 芋为成熟期, 郁为消退期 ) 的卵巢组 织约 50 mg ( 各发育阶段的卵巢组织取自 3 尾口虾 蛄 ), 并迅速置于液氮中, 于超低温冰箱 ( -80 益 ) 中保存备用 1 郾 2 郾 2 摇总 RNA 的提取与 cdna 的合成摇按照动物 总 RNA 快速抽提试剂盒说明书进行总 RNA 提取 采用 12 g / L 琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 的完整 性, 并通过 K2800 核酸蛋白分析仪 ( 凯奥中国 ) 检测总 RNA 的纯度及其浓度, 然后置于冰箱 ( -80 益 ) 中保存备用 取总 RNA 10 滋 L ( 浓度为 330 ng / 滋 L), 按照 Full RACE Core Set with Prime 鄄 Script TM RTase 试剂盒和 PrimeScript TM 域 High Fideli 鄄 ty RT-PCR 试剂盒说明书分别进行反转录, 反转录 产物于 -20 益下保存, 分别用于后续 Vg 基因 cdna 两端序列和中间序列的克隆 按照 PrimeScript TM RT reagent 试剂盒说明书进行反转录获得荧光定量 PCR 用 cdna 1 郾 2 郾 3 摇口虾蛄 Vg cdna 全长序列的克隆摇从原有 已构建的口虾蛄肝胰腺转录组测序文库中筛选出和 其他卵生动物 Vg 基因同源的序列片段 7220 bp, 采 用 Primer 5 郾 0 软件设计 3 忆 RACE 特异性引物 (Vg3-1) 并合成 ( 表 1) 根据 3 忆 -Full RACE 试剂 盒说明书, 以雌性口虾蛄卵巢 cdna 为模板扩增 Vg cdna 的 3 忆端序列 Outer PCR 和 Inner PCR 反 应条件 (Outer 反应体系为 25 滋 L, Inner 反应体系 为 50 滋 L): 94 益下预变性 3 min; 94 益下变性 30 s, 56 益下退火 30 s, 72 益下延伸 45 s, Outer PCR 反应共进行 25 个循环, Inner PCR 反应共进行 30 个循环 ; 最后在 72 益下再延伸 10 min Inner PCR 产物经 12 g / L 琼脂糖凝胶电泳检测, 切胶回收 DNA 后, 与 peasy -T1 载体连接, 转化到 E 郾 coli DH5 琢感受态大肠杆菌中, 于 37 益下孵育 1 h 后涂 板于 LB / Amp + 固体培养基上, 再于 37 益下过夜培 养, 随机挑取阳性单克隆菌落于 LB / Amp + 液体培 养基中, 在 37 益 160 r / min 摇床上培养 12 h, 取 3 个平行菌液各 5 ml, 提取质粒后送往英潍捷基 ( 上海 ) 贸易有限公司测序, 将所得 3 忆端 cdna 序 列于 NCBI 中用 BLASTP 软件进行同源性分析 同理设计 5 忆 RACE 特异性引物 (Vg5-1) 并合 成 ( 表 1) 根据 5 忆 -Full RACE 试剂盒说明书扩增 Vg cdna 的 5 忆端序列, 反应条件同上 根据已得 的 Vg 3 忆端序列和 5 忆端序列结合口虾蛄转录组文库,

3 第 2 期 刘海映, 等 : 口虾蛄卵黄蛋白原 (Vg) 基因的初步研究 133 利用 Primer 5 郾 0 软件设计中间序列特异性引物 (GSP- F GSP - R) 并合成 ( 表 1) 根据 Prime 鄄 Script TM 域 High Fidelity RT-PCR 试剂盒说明书扩增 Vg cdna 的中间序列 PCR 反应条件 : 94 益下预 变性 2 min; 98 益下变性 10 s, 60 益下退火 15 s, 68 益下延伸 7 min, 共进行 30 个循环 ; 最后在 68 益下再延伸 10 min, 克隆载体为 Trans1 -T1 Phage Resistant 感受态细胞, 其他反应条件同上 将上述 所得到的测序结果结合文库序列进行人工拼接, 最 终得到口虾蛄 Vg cdna 的全长序列 引物 primer Tab 郾 1 摇 表 1 摇 试验用引物 Primer sequences used in this study 摇摇摇摇摇序列 摇摇摇 sequence (5 忆 -3 忆 ) 长度 / bp length Vg3-1 CTGTCAGAGTCTTGCC 16 Outer TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT 23 Inner CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG 32 Vg5-1 GAAGGAGGGAAGAGTGTTCTGGAG 24 Outer CATGGCTACATGCTGACAGCCTA 23 Inner CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCA- GTCGATG GSP-F GCCTCCTACCTCCAGAACAC 20 GSP-R GCTCCTGATCGTCGAAGTAAACCT 24 Vg-F1 CACGACCCTTAGCCTTGCCT 20 Vg-R1 TTGAGTTTCCTGCTTATTTT 20 Vg- F2 GCAAGTGGTCAAGGAGAA 18 Vg-R2 GAGGATGTTGGTGTCAGTA 19 茁 -actin-f CGTGGCTACTCCTTCACCAC 20 茁 -actin-r AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG 20 1 郾 2 郾 4 摇口虾蛄 Vg cdna 序列的生物信息学分析摇 在 NCBI 中应用 ORF Finder 程序寻找开放阅读框并 翻译成相应的氨基酸序列, 运用 ProtParam 程序 (http: / / expasy 郾 org / tools / 34 protparam 郾 html ) 进行 蛋白质理化性质分析, 利用 SignalP 4 郾 1 软件进行 信号肽预测, 通过 NCBI 网站以及 ScanProsite 软件 (http: / / prosite 郾 expasy 郾 org / ) 两种方法分别预测 蛋白质结构域, 使用 BLASTP 软件对氨基酸序列进 行同源性分析, 用 MEGA 5 郾 0 软件对甲壳动物 Vg 氨基酸序列采用 NJ ( Neighbor-Joining) 法构建系 统进化树 1 郾 2 郾 5 摇口虾蛄 Vg mrna 的表达分析摇根据获得的 口虾蛄 Vg cdna 全长序列设计荧光定量检测引物 Vg-F1 Vg-F2 和 Vg-R1 Vg-R2, 以茁 -actin 作内 参基因 ( 表 1), 试验按照 SYBR Premix Ex Taq TM 域 (Tli RNaseH Plus) 试剂盒说明书进行, 模板为雌 雄口虾蛄的性腺 肝胰腺 肌肉 3 个组织的 cd 鄄 NA 反应体系 ( 共 20 滋 L): 上 下游引物 (10 mol / L) 各 1 滋 L, SYBR Premix Ex Taq 域 ( Tli RNaseH Plus) (2 伊 ) 10 滋 L, ROX Reference Dye 域 (50 伊 ) 0 郾 4 滋 L, RNase-free H 2 O 5 郾 6 滋 L, 模板 cd 鄄 NA 2 滋 L PCR 反应采用两步法 : 95 益下预变性 30 s; 95 益下变性 5 s, 60 益下退火和延伸 34 s, 共进行 40 个循环 反应结束后对扩增产物进行溶解曲线分析以确保特异性扩增 设置 3 次重复, 以 ROX 作为校正荧光, 以不加 cdna 模板的反应体系作为阴性对照 采取同样的方法检测不同发育时期卵巢 Vg 基因的表达量, 条件同上 采用 ABI 7500 Real - Time PCR 仪 ( Applied Biosystems, 美国 ) 进行分析 1 郾 3 摇数据处理实时荧光定量数据以 2 - 驻驻 CT 法处理, Vg mrna 相对表达量以平均值依标准差 ( mean 依 S 郾 D 郾 ) 表示, 采用 SPSS 19 郾 0 软件进行单因素方差分析 (One-Way ANOVA) 和 Duncan 多重比较, 显著性水平设为 0 郾 05 2 摇结果与分析 2 郾 1 摇口虾蛄 Vg 基因的结构特征采用 5 忆 RACE 和 3 忆 RACE 分别获得 9 bp 的 5 忆端片段以及 550 bp 的 3 忆端片段, 并得到中间序列 6830 bp ( 图 1 图 2) 利用 BioEdit 软件拼接得到 7727 bp Vg 基因 cdna 全长序列 (GenBank 登录号 : KR422400), 经 ExPASy 软件分析得到包含 36 bp 的 5 忆端非编码区 ( 5 忆 untranslated region, 5 忆 UTR ) 7521 bp 的开放阅读框 ( open reading frame, ORF) 170 bp 的 3 忆端非编码区 (3 忆 untrans 鄄 lated region, 3 忆 UTR) 起始密码子 ATG 终止密码子 TAA 和转录终止信号 aataaa ( 图 3) 口虾蛄 Vg 的开放阅读框共编码 2506 个氨基酸, 用 Prot 鄄 Param 工具分析得到 Vg 成熟蛋白的相对分子质量为 , 理论等电点 pi 为 5 郾 42 SignalP 4 郾 1 Prediction 在线预测结果显示, 口虾蛄 Vg 蛋白含有一个长度为 20 个氨基酸的信号肽 ( 切割位点在 Gla20 和 Asp21 之间 ) 口虾蛄 Vg 氨基酸序列中含有 : 1 个类似于枯草蛋白酶的内切蛋白酶识别位点 R- X - R / K - R ( 氨基酸序列位置为 728 ~ 731, RSKR), 3 个潜在的 N- 连接糖基化位点 ( 氨基酸序列位置分别为 和 2284), 1 个在无脊椎和脊椎动物卵黄蛋白原中都比较保守的 KALGN 鄄 VG 基序 ( 氨基酸序列位置为 4 ~ 490) 用 Jpred 4 在线预测口虾蛄 Vg 蛋白质的二级结构, 得出该

4 134 大连海洋大学学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第 31 卷 注 : A 为 5 忆 RACE 扩增产物电泳结果 ; B 为 3 忆 RACE 扩增产物电泳结果 ; C 为中间片段扩增产物电泳结果 M 为 DL2000 或 DL10000 DNA Marker; 为目的产物 Note: A, 5 忆 RACE amplified fragment; B, 3 忆 RACE amplified fragment; C, Vg amplified fragment. M, DL2000 DNA Marker or DL10000 DNA Marker; 1, 2, 3, PCR products of target fragments 图 1 摇口虾蛄 Vg cdna 各部分扩增产物电泳结果 Fig 郾 1 摇 Amplified fragments of Vg cdna in mantis shrimp Oratosquilla oratoria 图 2 摇口虾蛄卵黄蛋白原序列的克隆策略 Fig 郾 2 摇 Clone strategy and schematic view of Vg in man 鄄 tis shrimp Oratosquilla oratoria 蛋白由琢 - 螺旋 38 郾 71% 延伸链 21 郾 71% 茁 - 转角 8 郾 26% 无规则卷曲 31 郾 32% 组成 通过 TM 鄄 PRED 在线软件分析表明, 口虾蛄 Vg 为跨膜蛋白, 含有两种跨膜结构, 分别为膜内到膜外结构 (6 ~ 20) 和膜外到膜内结构 (2441 ~ 2458) NCBI 结构域预测分析结果显示, 口虾蛄 Vg 蛋白含有 4 种结构域 ( 图 3), 其中 2 种与已知功能结构域相似, 分别为卵黄蛋白原 N 端结构域 ( Vitellogenin_ N, 也被认为是脂蛋白氨基末端区域 ) 和血管性血友病因子 (von Willebrand factor) D 型结构域 ( vw 鄄 FD), 其余 2 种分别为由茁折叠形成的未知功能结构域 ( domain of unknown function) DUF1943 和与家蚕载脂蛋白 ( apolipophorin) 同源的未知功能结构域 DUF 郾 2 摇口虾蛄 Vg 氨基酸序列的同源性及系统进化分析将推导得到的口虾蛄 Vg 氨基酸序列运用 NCBI 在线工具 BLASTP 软件进行同源性分析 结果表明, 口足目口虾蛄 Vg 氨基酸序列与十足目虾蟹类的一致性为 46% ~ 52%, 与脊尾白虾 Exopalaemon carinicauda 的一致性最大, 为 52%, 与罗氏沼虾 Macrobrachium rosenbergii 锈斑蟳 Charybdis feriata 的一致性最低, 均为 46% ( 表 2) 利用 MEGA 5 郾 0 软件的 NJ 法构建系统进化树, 选择欧洲大扇贝 Pecten maximus Vg 氨基酸序列作为外类群 结果表明, 口足目与十足目 Vg 聚为一大簇, 其中口虾蛄 Vg 单独为一分支, 十足目虾蟹类 Vg 聚为另一分支 十足目甲壳动物基本聚为四小簇 : 大蝼蛄虾与蟹类聚为一簇, 鳌虾类为一簇, 长额虾和真虾类聚为一簇, 对虾类为一簇 ( 图 4) 2 郾 3 摇口虾蛄 Vg mrna 在不同组织及发育阶段的表达采用实时荧光定量 PCR 对口虾蛄不同组织以及卵巢不同发育阶段的 Vg mrna 表达量进行了分析 分别以 3 个平行样本反转录得到的混合 cdna 作为模板, 每个时期 cdna 样品分别做 3 个荧光定量 Vg 重复和 3 个茁 -actin 重复, 在溶解曲线结果为单峰以及目的基因和扩增曲线图显示目的基因和内参基因的扩增效率一致的基础上, 采用 2 - 驻驻 CT 法对其相对表达量 ( 分别以雄性虾蛄的肝胰腺和玉期卵巢的 Vg mrna 表达量作为参照, 将其看作单位 1) 进行计算 结果表明, 雌 雄口虾蛄性腺和肝胰腺均有 Vg mrna 表达, 但肌肉中均不表达, 卵巢中的 Vg mrna 表达量显著高于其他组织 ( P < 0 郾 05) ( 图 5) 此外, 卵巢中 Vg mrna 的相对表达量随着卵巢的发育不断增加, 在成熟期的表达量是未发育期的 158 倍, 与其他 3 个发育期相比差异均显著 (P<0 郾 05); 而产卵后, 卵巢处于消退期, Vg mrna 的相对表达量急剧下降, 接近卵黄发生期的表达水平 ( 图 6) 3 摇讨论 3 郾 1 摇口虾蛄 Vg 基因的克隆及序列分析本研究中首次克隆得到了口虾蛄 Vg cdna 全长序列, 也是目前唯一进行研究的甲壳动物口足目种类的 Vg 克隆得到的口虾蛄 Vg cdna 全长为 7727 bp, 共编码 2506 个氨基酸, 预测的成熟蛋白相对分子质量为 , 与已报到的一些其他甲壳动物的肽链长度和分子量大小相近 [10-11] 生物信息学分析表明, 口虾蛄 Vg 为跨膜蛋

5 第 2 期 刘海映, 等 : 口虾蛄卵黄蛋白原 (Vg) 基因的初步研究 135 注 : 预测的信号肽 潜在 N- 糖基化位点以下划线标出 ; 起始密码子 (ATG) 类枯草蛋白内切酶位点 RSKR 和终止密码子 ( TAA) 分别以方框标出 ; Vitellogenin-N 结构域 未知功能结构域 DUF1943 与 DUF1081 vwfd 结构域 转录终止信号 aataaa 用阴影标出 Note: The putative signal peptide and the potential N-linked glycocylation sites are underlined; the start codon ( ATG), consensus cleavage site and stop codon (TAA) are shown in a box; Vitellogenin-N domain, domain of unknown function DUF1943 and DUF1081, vwfd domain and polyadenyla 鄄 tion site ( aataaa) are shaded 图 3 摇口虾蛄 Vg cdna 全长序列及其推导的氨基酸序列 Fig 郾 3 摇 Full-length cdna and deduced amino acid sequence of Vg gene in mantis shrimp Oratosquilla oratoria

6 136 大连海洋大学学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第 31 卷 表 2 摇口虾蛄与其他物种 Vg 氨基酸序列的同源性分析 Tab 郾 2 摇 Comparative identity of Vg amino acid sequence in mantis shrimp Oratosquilla oratoria with other spe 鄄 cies GenBank 登录号 摇摇摇摇摇摇摇物种 一致性 / % accession No 郾 摇摇摇摇摇摇摇 species identity ABC86571 郾 1 中国明对虾 Fenneropenaeus chinensis 50 BAD98732 郾 1 ACV32381 郾 1 AAL12620 郾 3 AAP76571 郾 2 ABO09863 郾 1 ABB89953 郾 1 AAN40700 郾 1 日本囊对虾 Marsupenaeus japonicus 墨吉明对虾 Fenneropenaeus merguiensis 短沟对虾 Penaeus semisulcatus 凡纳滨对虾 Litopenaeus vannamei 美洲螯龙虾 Homarus americanus 斑节对虾 Penaeus monodon 刀额新对虾 Metapenaeus ensis 注 : 标有不同小写字母者表示组间有显著性差异 ( P<0 郾 05), 标有相同小写字母者表示组间无显著性差异 (P>0 郾 05), 下同 Note: The means with different letters are significant differences at the 0 郾 05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences, et sequentia 图 5 摇雌 雄口虾蛄不同组织中 Vg mrna 的相对表达量 AAG17936 郾 1 红螯螯虾 Cherax quadricarinatus 49 Fig 郾 5 摇 Relative expression of Vg mrna in different tis 鄄 BAD11098 郾 1 ACU51164 郾 1 BAF91417 郾 1 高背长额对虾 Pandalus hypsinotus 日本仿长额对虾 Pandalopsis japonica 大蝼蛄虾 Upogebia major sues of female and male mantis shrimp Oratos 鄄 quilla oratoria AGM75775 郾 1 中华绒螯蟹 Eriocheir sinensis ABC41925 郾 1 蓝蟹 Callinectes sapidus BAB69831 郾 1 罗氏沼虾 Macrobrachium rosenbergii 46 ACO36035 郾 1 拟穴青蟹 Scylla paramamosain 47 AAX94762 郾 1 三疣梭子蟹 Portunus trituberculatus 47 AAU93694 郾 1 锈斑蟳 Charybdis feriata 46 AFM82474 郾 1 脊尾白虾 Exopalaemon carinicauda 52 图 4 摇口虾蛄与其他甲壳动物 Vg 的 NJ 系统发育分析 Fig 郾 4 摇 Phylogenetic analysis of Vg in mantis shrimp Oratosquilla oratoria and other crustaceans 白, 有利于其膜内外营养物质的运输, 与其在卵黄发生期作为载体结合并运输金属离子 类胡萝卜素 甲状腺素 视黄醇 核黄素等生物学功能相关 口虾蛄 Vg 氨基酸序列与其他甲壳动物具有很高的相似性, 都存在一个非常保守的 R-X-K / R-R 剪切位点, 它是一种类似枯草蛋白酶的内切蛋白酶 图 6 摇不同发育期口虾蛄卵巢 Vg mrna 的相对表达量 Fig 郾 6 摇 Relative expression of Vg mrna in ovary at dif 鄄 ferent developmental stages in mantis shrimp Oratosquilla oratoria 识别位点, 表明在此处口虾蛄卵黄蛋白能被水解成两个亚基, 与 Vg 蛋白在机体的运输 加工和修饰有关 [12] 此外, 在口虾蛄 Vg 蛋白的 N 端还发现一个在脊椎动物和无脊椎动物中都非常保守的 KALGNVG 序列, 这段序列被认为在卵黄发生期间起着十分重要的作用, 可能与卵母细胞的受体识别位点有关 [13] 对 Vg 蛋白结构域分析发现, 口虾蛄 Vg 氨基酸序列含有 4 种保守结构域, 分别为 Vitellogenin_ N vwfd 和两种未知功能结构域 DUF1943 与 DUF1081 Vitellogenin_ N 参与蛋白质与脂质的转运和金属的贮存, 广泛存在于卵黄蛋白原 微体甘油三酸酯转运蛋白和阿朴脂蛋白 B 中 [14] vwfd 结构域富含半胱氨酸, 是一个高度结构化的区域, 通过形成二硫键在寡聚体聚合过程中起到了重要作用, 不仅是血液凝集因子峪结合到 vwf 的必需区域, 也是 vwf 形成正常聚合所必需的 [15] Vitellogenin_ N 和 vwfd 保守结构域的存在, 可确

7 第 2 期 刘海映, 等 : 口虾蛄卵黄蛋白原 (Vg) 基因的初步研究 137 定 Vg 是一种脂转运蛋白, Vg 蛋白一般也只包含这两种保守结构域 但是, 在对贝类 甲壳动物的研究中又都发现了新的未知功能结构域 [16-20], 且 DUF1943 和 DUF1081 这两个区域只存在于甲壳动物及少数贝类当中, 而关于他们的准确功能尚不清楚, 说明 Vg 蛋白还有很多未被我们认知的其他生物学功能 本研究中还发现, 口虾蛄 Vg 氨基酸序列与大部分甲壳动物和贝类相似, 都缺乏多聚丝氨酸和卵黄高磷脂蛋白结构域 [21-22] 卵黄高磷脂蛋白和多聚丝氨酸结构域是指含有前后排列 串联在一起的多个丝氨酸残基的特殊结构, 被认为是昆虫和大多数脊椎动物 Vg 蛋白的显著特征, 可能是酪蛋白激酶域的磷酸化位点, 这种特殊的结构域可能参与昆虫受体介导的卵黄蛋白原进入卵母细胞的内吞过程 [23-24], 而对于脊椎动物, 它可能作为磷酸和金属离子的载体与骨的形成有关 [25] 本试验结果表明, 多聚丝氨酸和卵黄高磷脂蛋白结构域调控受体介导的方式不是口虾蛄 Vg 进入卵母细胞的唯一方式, 即口虾蛄可能存在不同于昆虫的其他卵黄蛋白原 - 受体识别结合机制, 今后可就卵黄蛋白原受体分离鉴定及 Vg 蛋白 - 受体结合的内在机制进行深入地研究 由甲壳动物卵黄蛋白原氨基酸序列得到的系统进化树显示, 口虾蛄 Vg 氨基酸序列与十足目虾蟹类的 Vg 为同一簇下的 2 个分支, 十足目虾蟹类的 Vg 主要分为虾类和蟹类两个亚组 虾类主要分为 3 个亚群 : 枝鳃亚目对虾总科 (M 郾 ensis M 郾 japonicus P 郾 monodon L 郾 vannamei P 郾 semisulcatus F 郾 chine - nsis F 郾 merguiensis ) 真虾下目 ( P 郾 japonica P 郾 hypsinotus M 郾 rosenbergii E 郾 carinicauda) 鳌虾下目 ( C 郾 quadricarinatus H 郾 americanus) 蟹类中短尾下目 ( P 郾 trituberculatus C 郾 sapidus S 郾 paramamosain C 郾 feriatus E 郾 sinensis ) 和海蛄虾下目 (U 郾 major) 的 Vg 属于一个亚组, 这些物种 Vg 的进化关系与甲壳动物最新分类系统一致 [26] 口虾蛄 Vg 的系统演化与口虾蛄酚氧化酶 ( propo) [27] 口虾蛄高血糖激素 ( CHH) [28] 在甲壳动物中的聚类分析结果一致 3 郾 2 摇口虾蛄 Vg 基因的表达分析 Vg 的合成部位和合成机制一直是卵黄蛋白研究的重点和热点 Vg 的合成途径有两种类型 : 内源性合成和外源性合成 鱼类 两栖类 鸟类等大多数的脊椎动物为外源性合成方式, 一般由肝脏合成, 然后通过血液的循环运送到卵巢, 卵母细胞通 过细胞内吞等方式将其吞入细胞内, 然后裂解为卵 黄蛋白 无脊椎动物 Vg 的合成比较复杂, 合成部 位也不一致 对于甲壳动物来说合成部位有 3 种 : 肝胰腺 脂肪体和卵巢 [29-31] 本试验中分析了口 虾蛄 Vg mrna 在不同组织及卵巢不同发育时期的 表达模式 结果表明, 雌性口虾蛄卵巢和肝胰腺均 有 Vg mrna 表达, 且卵巢中的表达量显著高于肝 胰腺, 表明口虾蛄的肝胰腺和卵巢都具有合成卵黄 蛋白原的能力, 并且主要合成部位可能在卵巢 在 甲壳类中, 对三疣梭子蟹 Portunus tritubercula 鄄 tus [32] 中华绒螯蟹 Eriocheir sinensis [14] 青蟹 Carc 鄄 inus maena [33] 小龙虾 Cherax quadricarinatus [34] 墨吉对虾 Penaeus merguiensis [35] 刀额新对虾 Metapenaeus ensis [36] 日本囊对虾 Marsupenaeus ja 鄄 ponicus [37] 等种类的研究结果都与对口虾蛄的研究 结果一致, 均在肝胰腺和卵巢中检测到 Vg 基因的 表达 绝大多数的研究表明, 幼体和雄性中虽然也 有卵黄蛋白原基因的存在, 但只有雌性个体能表达 该基因 有趣的是, 本研究中在口虾蛄精巢中也检 测到了 Vg mrna 的表达, 关于其原因目前尚不清 [38] 楚 Unuma 等采用免疫组化和免疫印迹的方法 检测到海胆 Pseudocentrotus depressus 雌 雄个体的 性腺中均有 Vg 基因的表达, 并且随着精巢的发育, 其表达量逐渐减少, 由此推断, 卵黄蛋白原可能作 为精子发育的营养物质被利用 而对真海鞘 Halo 鄄 cynthia roretzi 的研究发现 [39-40], Vg 蛋白的 C 端所 含有的结构域 vwfd 和 CT 可能定位在卵黄被 (vi 鄄 tellin coat) 与精子中的两个酶 ( HrProacrosin 和 HrSpermosin) 结合, 参与精子进入卵子的受精过 程 因此, 口虾蛄 Vg 基因在精巢中的表达可能是 作为精子发生的营养物质或者参与协助精子的受精 过程 口虾蛄 Vg 也与卵巢卵黄发育时期密切相关, 卵黄蛋白原 mrna 的表达量随着卵巢的发育显著 增加, 在消退期急剧减少 在卵巢发育过程中, 卵 巢需要为卵子的发生累积营养, 卵黄蛋白原是卵黄 蛋白的前体, 不仅能将所需的金属离子和其他营养 物质运送到卵母细胞, 同时卵黄蛋白原能自身水解 为卵黄蛋白, 在卵母细胞中累积, 促使卵母细胞的 生长和分化, 为胚胎的发育提供碳水化合物 脂 肪 氨基酸 维生素 磷 硫等营养素和功能性物 质, 所以在发育过程中卵黄蛋白原表达积极 ; 进入 成熟期, 卵母细胞中卵黄累积达到最大 ; 当卵巢排 卵后, 性腺停止发育, 此时新的卵母细胞还没开始 合成, 卵黄蛋白原的表达量很低 口虾蛄卵巢中卵 黄蛋白原 mrna 相对表达量的变化趋势与对其他

8 138 大连海洋大学学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第 31 卷 甲壳类的研究结果一致 [41] 今后的试验可就卵黄蛋白原的合成机制进行研究, 从而为口虾蛄的人工繁育和资源保护奠定理论基础 参考文献 : [1] 摇 Valle D. Vitellogenesis in insects and other groups:a review[ J]. Mem 佼 rias do Instituto Oswaldo Cruz,1993,88(1):1-26. [2] 摇 Taborsky G. Iron binding by phosvitin and its conformational conse 鄄 quences[ J ]. Journal of Biological Chemistry, 1980, 255 ( 7 ): [3] 摇 Babin P J. Binding of thyroxine and 3,5,3 忆 - triiodothyronine to trout plasma lipoproteins[j]. American Journal of Physiology-En 鄄 docrinology and Metabolism,1992,262(5):E712-E720. [4] 摇 Azuma M,Irie T,Seki T. Retinals and retinols induced by estrogen in the blood plasma of Xenopus laevis[ J]. Journal of Experimental Biology,1993,178: [5] 摇 Lachlan I M,Nimpf J,Schneider W J. Avian riboflavin binding pro 鄄 tein binds to lipoprotein receptors in association with vitellogenin [ J]. Journal of Biological Chemistry, 1994, 269 ( 39 ): [6] 摇 Matozzo V,Gagn 佴 F,Marin M G,et al. Vitellogenin as a biomarker of exposure to estrogenic compounds in aquatic invertebrates:a re 鄄 view[ J]. Environment International,2008,34(4): [7] 摇孙亚宁. 文昌鱼一种新卵黄蛋白原的纯化 鉴定及其免疫防御功能的研究 [D]. 青岛 : 中国海洋大学,2004:1-10. [8] 摇 Okumura T,Yamano K,Sakiyama K. Vitellogenin gene expression and hemolymph vitellogenin during vitellogenesis,final maturation, and oviposition in female kuruma prawn, Marsupenaeus japonicus [ J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A:Molecular & Integrative Physiology,2007,147(4): [9] 摇 Sohier S,El-Sherif A,Gihan M,et al. Ovarian cycle and scanning electron micrographs of the spawned egg of female mantis shrimp Oratosquilla massavensis ( Alexandria, Egypt) [ J]. The Journal of Basic and Applied Zoology,2012,65: [10] 摇杨帆. 三疣梭子蟹卵黄蛋白原的基因克隆及分子特征分析 [D]. 杭州 : 浙江大学,2005:1-20. [11] 摇 Chang C F,Jeng S R. Isolation and characterization of the femalespecific protein ( vitellogenin) in mature female hemolymph of the prawn Penaeus chinensis[j]. Comparative Biochemistry and Phys 鄄 iology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 1995, 112 (2): [12] 摇水燕, 周鑫, 徐增洪, 等. 虾蟹类卵黄蛋白原的研究进展 [ J]. 安徽农业大学学报,2012,39(2): [13] 摇 Spieth J,Nettleton M,Zucker-Aprison E,et al. Vitellogenin mo 鄄 tifs conserved in nematodes and vertebrates[j]. Journal of Molec 鄄 ular Evolution,1991,32(5): [14] 摇 Li K,Chen L Q,Zhou Z L,et al. The site of vitellogenin synthesis in Chinese mitten-handed crab Eriocheir sinensis[ J]. Compara 鄄 tive Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molec 鄄 ular Biology,2006,143(4): [15] 摇 Pauling L,Corey R B,Branson H R. The structure of proteins:two hydrogen-bonded helical configurations of the polypeptide chain [ J]. Proc Natl Acad Sci USA,1951,37(4): [16] 摇 Thompson J R,Banaszak L J. Lipid-protein interactions in lipovi 鄄 tellin[ J]. Biochemistry,2002,41(30): [17] 摇 Smolenaars M M W,Madsen O,Rodenburg K W,et al. Molecular diversity and evolution of the large lipid transfer protein superfam 鄄 ily[ J]. Journal of Lipid Research,2007,(3): [18] 摇 Hwang D S,Lee K W,Han J,et al. Molecular characterization and expression of vitellogenin ( Vg) genes from the cyclopoid cope 鄄 pod,paracyclopina nana exposed to heavy metals[ J]. Compara 鄄 tive Biochemistry and Physiology Part C:Toxicology & Pharmacol 鄄 ogy,2010,151(3): [19] 摇张倩. 华贵栉孔扇贝卵黄蛋白原基因克隆表达及其免疫功能的初步研究 [D]. 汕头 : 汕头大学,2012:1-20. [20] 摇邱凉, 刘红, 蔡生力. 中华绒螯蟹卵黄蛋白原基因 cdna 序列的克隆与结构分析 [ J]. 上海海洋大学学报,2013,22 (4 ): [21] 摇 Avarre J C,Michelis R,Tietz A,et al. Relationship between vitel 鄄 logenin and vitellin in a marine shrimp ( Penaeus semisulcatus) and molecular characterization of vitellogenin complementary DNAs[ J]. Biology of Reproduction,2003,69(1): [22] 摇 Tiu S H K,Hui J H L,He J G,et al. Characterization of vitelloge 鄄 nin in the shrimp Metapenaeus ensis:expression studies and hor 鄄 monal regulation of MeVg1 transcription in vitro [ J]. Molecular Reproduction and Development,2006,73(4): [23] 摇 Kuenzel E A,Mulligan J A,Sommercorn J,et al. Substrate speci 鄄 ficity determinants for casein kinase II as deduced from studies with synthetic peptides [ J ]. Journal of Biological Chemistry, 1987,262(19): [24] 摇 Meggio F,Pinna L A. Phosphorylation of phosvitin by casein ki 鄄 nase- 2 provides the evidence that phosphoserines can replace carboxylic amino acids as specificity determinants[ J]. Biochimica et Biophysica Acta,1988,971(2): [25] 摇 Wahli W. Evolution and expression of vitellogenin genes [ J]. Trends in Genetics,1988,4(8): [26] 摇刘瑞玉. 现生甲壳动物亚门( CRUSTACEA) 最新分类系统 简介 [C] / / 中国甲壳动物学会. 甲壳动物论文集. 北京 : 科学出版社,2003: [27] 摇刘海映, 刘连为, 姜玉声, 等. 口虾蛄 propo 基因全长 cdna 的克隆与组织表达 [J]. 生态学报,2013,33(6): [28] 摇张秀芹. 口虾蛄高血糖激素基因全长 cdna 序列的克隆及表达分析 [D]. 大连 : 大连海洋大学,2014:1-30. [29] 摇 Yano I,Chinzei Y. Ovary is the site of vitellogenin synthesis in kuruma prawn,penaeus japonicus[ J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Comparative Biochemistry,1987,86(2): [30] 摇 Chen Y N,Tseng D Y,Ho P Y,et al. Site of vitellogenin synthesis determined from a cdna encoding a vitellogenin fragment in the freshwater giant prawn,macrobrachium rosenbergii [ J]. Mol Re 鄄 prod Dev,1999,54(3): [31] 摇 Meusy J J. Vitellogenin,the extraovarian precursor of the protein yolk in crustacea:a review[ J]. Reprod Nutr Dev,1980,20(1A): 1-21.

9 第 2 期 刘海映, 等 : 口虾蛄卵黄蛋白原 (Vg) 基因的初步研究 139 [32] 摇 Fan Y,Xu H T,Dai Z M,et al. Molecular characterization and ex 鄄 pression analysis of vitellogenin in the marine crab Portunus tritu 鄄 berculatus[ J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology,2005,142(4): [33] 摇 Ding X,Nagaraju G,Novotney D. Yolk protein expression in the green crab,carcinus maenas[ J]. Aquaculture,2010,298: [34] 摇 Serrano-Pinto V,Landais I,Ogliastro M,et al. Vitellogenin mr 鄄 NA expression in Cherax quadricarinatus during secondary vitello 鄄 genic at first maturation females[ J]. Molecular Reproduction and Development,2004,69(1): [35] 摇 Phiriyangkul P,Utarabhand P. Molecular characterization of a cd 鄄 NA encoding vitellogenin in the banana shrimp, Penaeus merg 鄄 uiensis ( Litopenaeus) and sites of vitellogenin mrna expression [ J]. Molecular Reproduction and Development,2006,73 ( 4 ): [36] 摇 Tsang W S,Quackenbush L S,Chow B K C,et al. Organization of the shrimp vitellogenin gene:evidence of multiple genes and tis 鄄 sue specific expression by the ovary and hepatopancreas [ J]. Gene,2003,303(3): [37] 摇 Tsutsui N, Yi K K, Jasmani S,et al. The dynamics of vitellogenin gene expression differs between intact and eyestalk ablated kuru 鄄 ma prawn Penaeus ( Marsupenaeus) japonicus[ J]. Fisheries Sci 鄄 ence,2005,71(2): [38] 摇 Unuma T,Suzuki T,Kurokawa T,et al. A protein identical to the yolk protein is stored in the testis in male red sea urchin,pseudo 鄄 centrotus depressus[ J]. The Biological Bulletin,1998,194 ( 1 ): [39] 摇 Akasaka M,Harada Y,Sawada H. Vitellogenin C-terminal frag 鄄 ments participate in fertilization as egg- coat binding partners of sperm trypsin - like proteases in the ascidian Halocynthia roretzi [ J ]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2010,392(4): [40] 摇 Akasaka M,Kato K H,Kitajima K,et al. Identification of novel isoforms of vitellogenin expressed in ascidian eggs[ J]. Journal of Experimental Zoology Part B:Molecular and Developmental Evo 鄄 lution,2013,320(2): [41] 摇李媛媛, 蔡生力, 刘红. 实时荧光定量 PCR 检测凡纳滨对虾和罗氏沼虾卵黄蛋白原 mrna 在卵巢和肝胰腺中的表达 [ J]. 水产学报,2012,36(11): Vitellogenin( Vg) gene in mantis shrimp Oratosquilla oratoria LIU Hai-ying 1,2, ZHANG Na 1,2, YAN Hong-wei 3, LIU Qi 1,2, XING Kun 1,2, CHEN Lei 1,2, SUI You-zhen 4, LIN Yuan 5, LI Cheng-jiu 5, GUO Liang-yong 5 (1. Center for Marine Ranching Engineering Science Research of Liaoning Province, Dalian Ocean University, Dalian , China; 2. Key Labora 鄄 tory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province, Dalian Ocean University, Dalian , China; 3. College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian , China; 4. Institute of Ocean Fisheries, Zhoushan , China; 5. Fisheries Seedlings Authority of Liaoning Province, Dalian , China) Abstract: In the present study, the full length cdna of vitellogenin(vg) gene was cloned in mantis shrimp Ora 鄄 tosquilla oratoria using rapid amplification of cdna ends (RACE) (GenBank accession No. KR422400), and ex 鄄 pression levels of Vg gene mrna in various tissues, especially in ovary within different ovarian development stages, were investigated by qpcr. The results showed that the Vg gene was 7727 bp long, with 36 bp of 5 忆 untranslated region(utr), 170 bp of 3 忆 UTR and 7521 bp of the coding region encoding a size of 2506 amino acids predicted protein. The predicted protein contained a signal peptide(20 amino acids long), three N-glycosylation site, a con 鄄 sensus cleavage site RSKR and a conserved KALGNVG motif that was conservative in invertebrates and vertebrate. Moreover, there were 4 conserved domains, Vitellogenin_ N, vwfd, DUF1943 and DUF1081, in the predicted protein. The deduced amino acids sequence showed 46% -52% identity with other known decapods Vg by using BLASTP online analysis. Phylogenetic tree rvealed that the Vg formed a clade separated from the decapod species Vg. The qpcr indicated that the Vg mrna were found in both gonad and hepatopancreas, and had significantly higher expression level of Vg mrna in ovary than in other tissues (P<0. 05), without expression in muscle. In the ovary, however, the expression of Vg mrna was found to be significantly increased from immature stage to mature stage (P<0. 05), then dropped immediately (P<0. 05). The expression profile in ovary well was responding to the annual cycle of vitellogenesis. The findings will provide basic information for understanding of the whole function of Vg gene in the mantis shrimp. Key words: Oratosquilla oratoria; vitellogenin( Vg); molecular cloning; quantitative PCR; expression pattern