首先研究人员对一段 40 个碱基的 RNA 序列进行测序, 来检验这种方法大约一半 (48.5%) 的读长是 20 个核苷酸或更长最长的无误差读数是 38 个碱基随后他们将注意力转向酿酒酵母这种模式生物因为酿酒酵母的大部分 RNA 本身就存在聚腺苷酸化, 所以她们不需要在测序前再加上 pol

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陂缝欧阳
5 years ago
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1 新技术 : 破解 RNA 测序的方方面面自 2005 年以来, 以 Roche 公司的 454 技术 Illumina 公司的 Solexa 技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序技术相继诞生, 新一代测序技术又称作深度测序技术, 主要特点是测序通量高, 测序时间和成本显著下降把这种高通量测序技术应用到由 mrna 逆转录生成的 cdna 上, 从而获得来自不同基因的 mrna 片段在特定样本中的含量, 这就是 mrna 测序或 mrna-seq 同样原理, 各种类型的转录本都可以用深度测序技术进行高通量定量检测, 统称作 RNA-seq 或 RNA 测序随着新一代高通量 DNA 测序技术的快速发展,RNA 测序 (RNA-seq) 已成为基因表达和转录组分析新的重要手段, 并且随着 RNA 的重要性逐渐被认识, 研究人员也开发出多种方法来研究它但是许多方法仍需将 RNA 反转录成 cdna, 而这一步会引入错误, 且效率不高近期一些研究小组开发出了 RNA 测序新技术可消除转录组分析偏误的 RNA 测序技术了解基因组的功能输出 ( 一个细胞或细胞群中的全部信使 RNA, 被称为转录组 ), 是生物学研究过程中的一个必要步骤当前研究转录组的方法依赖于微阵列和测序方法, 它们需要合成互补 DNA, 之后再进行多种操作, 这样会引入偏误和潜在的人为结果研究人员利用单分子测序技术来进行 RNA 直接测序, 这将有助于更为详细地了解有多少基因组被转录每个基因产生了多少 RNA 变异这种转录组分析方法的局限是它需要成百上千的细胞研究人员为了让边合成边测序的反应适应直接的 RNA 测序, 优化了使用的聚合酶到缓冲液, 并利用专门的荧光核苷酸类似物, 从而能在 poly(dt) 包被的表面捕获聚腺苷酸化的 RNA, 并利用大肠杆菌 poly(a) 聚合酶 I 来进行边合成边测序的步骤

2 首先研究人员对一段 40 个碱基的 RNA 序列进行测序, 来检验这种方法大约一半 (48.5%) 的读长是 20 个核苷酸或更长最长的无误差读数是 38 个碱基随后他们将注意力转向酿酒酵母这种模式生物因为酿酒酵母的大部分 RNA 本身就存在聚腺苷酸化, 所以她们不需要在测序前再加上 poly-a 尾巴在这个实验中, 研究小组产生了个读数, 每个约为 20 个核苷酸或更长近一半 (48.4%) 的读数与酵母基因组配对 90% 以上的配对读数是位于已知的酵母开放读码框 3 端的 400 个核苷酸内实验过程中, 研究人员意外地检测到酵母 RNA 3 端的异质性她们还发现证据, 暗示至少有一些酵母核糖体 RNA 和小核仁 RNA(snoRNA) 是聚腺苷酸化的研究人员称这种 RNA 直接测序方法目前的错误率约为 4%, 大部分是黑暗碱基 (dark base) 引起的缺失插入的错误率为 1-2%, 而替换的概率只有 % 高通量 RNA 测序转录组提供了有关活性基因的功能调控和互相依赖的信息最近科学家们将高通量测序仪应用于转录组分析 (RNA-Seq), 新方法让研究人员能够更为详细地了解有多少基因组被转录每个基因产生了多少 RNA 变异这种转录组分析方法的局限是它需要成百上千的细胞研究人员将转录组分析方法应用到单个细胞的分析中, 并以前所未有的精度分析了取自四细胞胚胎和卵母细胞的单个老鼠细胞的转录组新方法不仅对发育生物学的研究至关重要, 而且也让科学家们能够在胚胎发育的早期深入研究单个细胞中全部基因表达研究复杂组织中的细胞异质性, 并在单个细胞的水平上分析疾病的发展 RNA 测序数据处理

3 RNA-seq 技术产生的海量数据为生物信息学带来了新的机遇和挑战, 有效地对测序数据进行针对性的生物信息学处理和分析, 成为 RNA-seq 技术能否在科学探索中发挥重大作用的关键很多 RNA-seq 实验的目的是为了比较两种或多种样本中基因表达或整个转录组的差异, 如比较癌症组织和正常组织的转录组差异等这些差异既包括通常意义下的差异表达基因, 也主要包括选择性剪接模式的差异剪接异构体表达的差异非编码转录本的差异等这些差异一般可以用一些统计假设检验方法检测, 但这种检验有时会受到测序深度基因长度等因素的影响, 需要对结果进行仔细分析, 消除可能的混杂因素, 必要时可以用读段的绝对表达值倍数变化 (fold-change) 来作为补充产品目前, 在已经推出的几种新一代测序平台中,Illumina/Solexa 测序平台上的 RNA-seq 应用较广,Illumina/Solexa 测序技术的基本原理是边合成边测序 (sequencing by synthesis,sbs), 即测序过程是以 DNA 单链为模板, 在生成互补链时, 利用带荧光标记的 dntp 发出不同颜色的荧光来确定不同的碱基, 新加入 dntp 的末端被可逆的保护基团封闭, 既保证单次反应只能加入一个碱基, 又能在该碱基读取完毕后, 将保护基团除去, 使得下一个反应可继续进行, 为了增加荧光强度, 使之更易被成像系统所采集, 该技术在测序之前还需要对待测片段做桥式扩增 (bridge amplification) 初期的 Illumina/Solexa 测序技术只能在较短的测序读长上 (20-30 碱基 ) 保证较高的正确率, 随着技术的改进, 目前的读长已经增加到 100 碱基以上同时, 随着双端测序 (paired-end,pe) 技术的成熟, 测序长度更可达到单端测序的 2 倍, 测序通量也随之增加这种测序技术是 Solexa 公司发展起来的,2007 年被 Illumina 公司收购, 因此现在通常被称为 Illumina/Solexa 测序技术

近两年来,Illumina/Solexa 测序平台不断升级, 相继推出了 GA(Genome Analyzer) GA IIx HiSeq 2000 等测序仪目前随着新一代高通量 DNA 测序技术快速发展, RNA-seq 技术的处理能力也逐步增强, 目前主要的流程包括, 首先, 用 Poly(T) 寡聚核苷酸从总 RNA 中抽取全部带 Poly(A) 尾的 RNA,

4 近两年来,Illumina/Solexa 测序平台不断升级, 相继推出了 GA(Genome Analyzer) GA IIx HiSeq 2000 等测序仪目前随着新一代高通量 DNA 测序技术快速发展, RNA-seq 技术的处理能力也逐步增强, 目前主要的流程包括, 首先, 用 Poly(T) 寡聚核苷酸从总 RNA 中抽取全部带 Poly(A) 尾的 RNA, 其中的主要部分就是编码基因所转录的 mrna 将所得 RNA 随机打断成片段, 再用随机引物和逆转录酶从 RNA 片段合成 cdna 片段然后, 对 cdna 片段进行末端修复并连接测序接头 (adapter), 得到将用于测序的 cdna 在以上过程, 将 RNA 随机片段化和采用随机引物进行反转录 ( 见下图 ) 有时为提高测序效率, 还会用电泳切胶法获取长度范围在 200bp(±25 bp) 的 cdna 片段, 再通过 RCR 扩增, 得到最终的 cdna 文库虽然 RNA 测序技术已经出现了将近 20 年, 但直到最近才开始构建克隆文库对人类小鼠以及其它重要模式生物进行全长基因克隆构建的科研项目需要几年的时间才能够完成但是有了最新的测序技术, 我们现在可以只需要花费几天, 仅用以往同类项目科研经费的很少一部分就能够得到一个比较满意的完整的细胞转录组

5 许多公司都提供了相应的 RNA 测序服务, 比如常见的 Illumina/Solexa 测序技术 (Solexa 公司 2007 年被 Illumina 公司收购, 因此现在通常被称为 Illumina/Solexa 测序技术 ) Illumina/Solexa 新测序技术基本原理是边合成测序 (sequencing by synthesis, SBS), 即测序过程是以 DNA 单链为模板, 在生成互补链时, 利用带荧光标记的 dntp 发出不同颜色的荧光来确定不同的碱基, 新加入 dntp 的末端被可逆的保护基团封闭, 既保证单次反应只能加入一个碱基, 又能在该碱基读取完毕后, 将保护基团除去, 使得下一个反应可继续进行, 为了增加荧光强度, 使之更易被成像系统所采集, 该技术在测序之前还需要对待测片段做桥式扩增 (bridge amplification) 最开始这一技术只能在较短的测序读长上 (20-30 碱基 ) 保证较高的正确率, 随着技术的改进, 目前的读长已经增加到 100 碱基以上同时, 随着双端测序 (paired-end,pe) 技术的成熟, 测序长度更可达到单端测序的 2 倍, 测序通量也随之增加 Illumina/Solexa 测序技术能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测, 在分析转录本的结构和表达水平的同时, 还能发现未知转录本和稀有转录本, 精确地识别可变剪切位点以及 csnp( 编码序列单核苷酸多态性 ), 提供全面的转录组信息并且这一方法相对于传统的芯片杂交平台,RNA 测序无需预先针对已知序列设计探针, 即可对任意物种的整体转录活动进行检测, 提供更精确的数字化信号, 更高的检测通量以及更广泛的检测范围 Illumina/Solexa 测序平台近期推出了 GA(Genome Analyzer) GAIIx HiSeq 2000 等测序仪, 扩充了 RNA 测序的效率其中 GA(Genome Analyzer) 采用的是边合成边测序技术和可逆中止化合物染料技术 (Reversible Terminator Chemistry), 提供高通量, 高精确度, 低成本的基因组测序利用 Illumina GA 测序技术在对基因组进行测序和注释的同时, 也可对基因表达调控, 基因功能, 蛋白 / 核酸相互作用展开研究

6 GA 测序方法的原理与上述基本相同, 利用这种方法可以在一个反应中同时加入四个标签, 减少因二级结构造成的一段区域的缺失并具有所需样品量少, 高通量, 高精确性, 拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点这一方法是一种全新独特的, 适用于各个物种的小 RNA 深度鉴定与定量分析研究平台通过大量的平行测序, 研究人员可以发掘鉴定并定量出任何物种全基因组水平的小 RNA 图谱应用这种低成本快速测定数百万标签序列的新方法, Illumina GA 提供了解密小 RNA 图谱独一无二的方法目前东盛生物正在进行 microrna 测序服务优惠活动, 并承诺测序失败不收任何实验费用, 如果有相关需要的实验人员, 不妨关注下由于 llumina/solexa 测序平台得到的读段一般存在片段较短且插入删除错误较少等特点, 如果要想获得表达量较高基因的 RNA 全长测序, 那就可以试一下 Roche454 的 GS FLX,GS FLX 400bp 的读长使得它形成较好的 contig, 但是对低表达丰度的基因, 可能需要多次测序才能找到足够的数据 GS FLX 主要适用于非编码区域功能研究 (Non-coding RNA 研究 microrna 前体研究等 ) 转录本结构研究 (UTR 鉴定 Intron 边界鉴定可变剪切研究 Start codon 鉴定等 ) ( 基因转录水平研究 ) 和全新转录区域研究主要技术路线如下 : 原文检索 : Brian J Haas & Michael C Zody. (2010) Advancing RNA-Seq analysis, Nature Biotechnology, 28(5):

为实斲这项收贩行劢, 雅培将支付 21.2 亿美元癿预付款, 而后在仍 2011 年开始癿 4 年里, 每年再支付 4 亿美元该仺制药部门主要在印度斯里兮卡和尼泊尔销售零售便利药品 4

为实斲这项收贩行劢, 雅培将支付 21.2 亿美元癿预付款, 而后在仍 2011 年开始癿 4 年里, 每年再支付 4 亿美元该仺制药部门主要在印度斯里兮卡和尼泊尔销售零售便利药品 4 2010 年国际医药并购事件 2010 生物医药产业盘点 2010 年癿国际医药市场风于发幻诺华雅培强生梯瓦百旪美斲贵宝赛诺菲安万特等全球知名药企癿一系列收贩行为丌断搅劢着全球医药市场, 诺华 516 亿美元买断爱尔康, 赛诺菲收贩