a DNA 分 子 被 随 机 切 割 成 小 片 段 b DNA 分 子 被 随 机 切 割 成 小 片 段 体 内 克 隆 扩 增 体 外 接 头 连 接 循 环 测 序 制 成 polony 芯 片 模 板 引 物 聚 合 酶 dntps 荧 光 标 记 的 ddntp 电 泳 ( 每 次 电

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1 生 命 奥 秘 三 新 一 代 DNA 测 序 技 术 DNA 测 序 技 术 已 广 泛 应 用 于 生 物 学 研 究 的 各 个 领 域, 很 多 生 物 学 问 题 都 可 以 借 助 高 通 量 DNA 测 序 技 术 予 以 解 决 过 去 三 年, 大 规 模 平 行 测 序 平 台 (massively parallel DNA sequencing platform) 已 经 发 展 为 主 流 的 测 序 技 术, 这 项 测 序 技 术 的 出 现 不 仅 令 DNA 测 序 费 用 降 到 了 以 前 的 百 分 之 一, 还 让 基 因 组 测 序 这 项 以 前 专 属 于 大 型 测 序 中 心 的 特 权 能 够 被 众 多 研 究 人 员 分 享 目 前, 新 的 测 序 技 术 及 手 段 还 在 不 断 涌 现, 比 如 最 新 的 进 展 就 包 括 建 立 序 列 数 据 库 建 立 序 列 数 据 分 析 新 方 法 以 及 设 计 测 序 试 验 等 等 新 一 代 DNA 测 序 技 术 有 助 于 人 们 以 更 低 廉 的 价 格, 更 全 面 更 深 入 地 分 析 基 因 组 转 录 组 及 蛋 白 质 之 间 交 互 作 用 组 的 各 项 数 据 今 后, 各 种 测 序 将 成 为 一 项 广 泛 使 用 的 常 规 实 验 手 段, 这 有 望 给 生 物 学 和 生 物 医 学 研 究 领 域 带 来 革 命 性 的 变 革 DNA 测 序 技 术 经 历 了 漫 长 而 曲 折 的 发 展 历 程 迄 今 为 止, 我 们 获 得 的 绝 大 部 分 DNA 序 列 都 是 基 于 Sanger 测 序 法 获 得 的 在 过 去 5 年 间, 人 们 至 少 从 以 下 四 个 方 面 刺 激 了 DNA 测 序 技 术 的 发 展 ( 表 2) 表 2 刺 激 DNA 测 序 技 术 发 展 的 四 个 方 面 人 类 基 因 组 计 划 的 出 现, 使 人 们 面 临 了 巨 大 的 经 费 问 题, 因 为 传 统 的 Sanger 测 序 法 无 论 如 何 优 化, 也 无 法 大 幅 度 降 低 测 序 费 用 ; 人 类 以 及 其 它 主 要 模 式 生 物 参 考 序 列 数 据 库 的 建 立 使 得 短 片 段 作 图 成 为 可 能, 这 极 大 地 促 进 了 短 片 段 测 序 技 术 的 发 展 ; 不 断 涌 现 的 新 型 分 子 生 物 学 技 术 极 大 地 促 进 了 分 子 生 物 学 的 发 展, 随 之 而 来 的 越 来 越 多 的 比 如 基 因 变 异 RNA 表 达 蛋 白 与 DNA 相 互 作 用 以 及 染 色 体 构 象 等 等 生 物 学 现 象 需 要 人 们 用 高 通 量 DNA 测 序 手 段 去 解 释, 这 也 极 大 地 促 进 了 新 型 测 序 技 术 的 发 展 ; 其 它 学 科 各 项 相 关 技 术 的 发 展, 例 如 显 微 镜 技 术 表 面 化 学 技 术 核 苷 生 化 技 术 聚 合 酶 工 程 技 术 计 算 机 技 术 数 据 储 存 及 分 析 技 术 等, 为 DNA 测 序 技 术 提 供 了 极 大 的 支 持 1. 具 有 代 表 性 的 新 一 代 DNA 测 序 仪 最 近 市 面 上 出 现 了 很 多 新 一 代 测 序 仪 产 品, 例 如 美 国 Roche Applied Science 公 司 的 454 基 因 组 测 序 仪 美 国 Illumina 公 司 和 英 国 Solexa technology 公 司 合 作 开 发 的 Illumina 测 序 仪 美 国 Applied Biosystems 公 司 的 SOLiD 测 序 仪 Dover/Harvard 公 司 的 Polonator 测 序 仪 以 及 美 国 Helicos 公 司 的 HeliScope 单 分 子 测 序 仪 所 有 这 些 新 型 测 序 仪 都 使 用 了 一 种 新 的 测 序 策 略 循 环 芯 片 测 序 法 (cyclic-array sequencing), 也 可 将 其 称 为 新 一 代 测 序 技 术 或 者 第 二 代 测 序 技 术 所 谓 循 环 芯 片 测 序 法, 简 言 之 就 是 对 布 满 DNA 样 品 的 芯 片 重 复 进 行 基 于 DNA 的 聚 合 酶 反 应 ( 模 板 变 性 引 物 退 火 杂 交 及 延 伸 ) 以 及 荧 光 序 列 读 取 反 应 2005 年, 有 两 篇 论 文 曾 对 这 种 方 法 做 出 过 详 细 介 绍 与 传 统 测 序 法 相 比, 循 环 芯 片 测 序 法 具 有 操 作 更 简 易 费 用 更 低 廉 的 优 势, 于 是 很 快 就 获 得 了 广 泛 的 应 用 4

2 a DNA 分 子 被 随 机 切 割 成 小 片 段 b DNA 分 子 被 随 机 切 割 成 小 片 段 体 内 克 隆 扩 增 体 外 接 头 连 接 循 环 测 序 制 成 polony 芯 片 模 板 引 物 聚 合 酶 dntps 荧 光 标 记 的 ddntp 电 泳 ( 每 次 电 泳 读 取 一 个 碱 基 信 息 ) 芯 片 循 环 测 序 ( 每 个 芯 片 可 以 获 得 长 度 超 过 10 6 bp 的 序 列 ) 芯 片 循 环 测 序 1 芯 片 循 环 测 序 2 芯 片 循 环 测 序 3 第 一 个 碱 基 是 什 么? 第 二 个 碱 基 是 什 么? 第 三 个 碱 基 是 什 么? 图 1 传 统 的 Sanger 测 序 法 及 新 一 代 DNA 测 序 技 术 工 作 流 程 图 (a) 高 通 量 鸟 枪 Sanger 测 序 法 首 先 基 因 组 DNA 被 随 机 切 割 成 小 片 段 分 子, 接 着 众 多 小 片 段 DNA 被 克 隆 入 质 粒 载 体, 随 后 转 化 到 大 肠 杆 菌 中 最 后 培 养 大 肠 杆 菌 提 取 质 粒, 进 行 测 序 每 一 个 测 序 反 应 都 在 只 有 几 微 升 的 反 应 体 系 中 完 成 测 序 后 获 得 一 系 列 长 短 不 一 的 末 端 标 记 有 荧 光 的 片 段, 最 后 通 过 对 每 一 个 延 伸 反 应 产 物 末 端 荧 光 颜 色 进 行 识 别 来 读 取 DNA 序 列 (b) 鸟 枪 循 环 芯 片 测 序 法 首 先 将 基 因 组 DNA 随 机 分 割 成 小 片 段 DNA 分 子, 然 后 在 这 些 小 片 段 DNA 分 子 的 末 端 连 接 上 普 通 的 接 头, 最 后 用 这 些 小 片 段 DNA 分 子 制 成 polony 芯 片 每 一 个 polony 中 都 含 有 一 个 小 片 段 DNA 分 子 的 许 多 个 拷 贝 许 多 这 样 的 polony 集 合 在 一 起 就 形 成 了 polony 芯 片 这 样 一 次 测 序 反 应 就 可 以 同 时 对 众 多 的 polony 进 行 测 序 然 后 与 sanger 法 中 一 样, 通 过 对 每 一 个 延 伸 反 应 产 物 末 端 荧 光 颜 色 进 行 识 别 来 读 取 出 DNA 序 列 重 复 上 述 步 骤 就 能 获 得 完 整 的 序 列 虽 然 这 些 新 一 代 测 序 仪 以 及 芯 片 的 实 际 制 作 过 程 似 乎 都 和 传 统 的 测 序 方 法 有 很 大 的 不 同, 而 且 各 有 特 点 ( 表 3), 但 实 际 上 它 们 背 后 的 原 理 和 技 术 都 是 非 常 相 似 甚 至 是 相 同 的 ( 图 1b) 新 一 代 测 序 法 首 先 也 是 将 基 因 组 DNA 随 机 切 割 成 小 片 段 DNA 分 子, 然 后 在 体 外 给 这 些 小 片 段 分 子 的 末 端 连 接 上 接 头 制 成 文 库, 也 可 以 使 用 配 对 标 签 (mate-paired tag) 制 成 跨 步 文 库 (jumping libraries) 随 后 可 以 通 过 原 位 polony(in situ polony, 小 词 典 1) 微 乳 液 PCR(emulsion PCR) 或 桥 式 PCR(bridge PCR)( 图 5) 等 方 法 获 得 测 序 模 板 上 述 方 法 有 一 个 共 同 点, 那 就 是 任 何 一 个 小 片 段 DNA 分 子 的 PCR 扩 增 产 物 都 是 在 空 间 上 聚 集 的 : 原 位 5

3 生 命 奥 秘 polony 法 和 桥 式 PCR 法 中 所 有 的 产 物 都 集 中 在 平 板 的 某 处, 在 微 乳 液 PCR 法 (emulsion PCR) 中 所 有 的 产 物 都 集 中 在 微 珠 的 表 面 真 正 的 测 序 反 应 本 身 和 传 统 测 序 法 一 样, 是 由 重 复 的 聚 合 酶 促 反 应 和 最 后 的 荧 光 读 取 分 析 反 应 组 成 ( 图 6) 本 文 讨 论 的 所 有 测 序 仪 都 是 使 用 合 成 测 序 法 (sequencing by synthesis), 即 通 过 聚 合 酶 或 连 接 酶 不 断 地 延 伸 引 物 获 得 模 板 序 列, 最 后 对 每 一 轮 反 应 的 结 果 进 行 荧 光 图 像 采 集 分 析, 获 得 序 列 结 果 表 3 新 一 代 测 序 技 术 的 特 点 体 外 构 建 DNA 文 库, 随 后 体 外 克 隆 扩 增 待 测 DNA 片 段, 这 就 解 决 了 传 统 Sanger 测 序 技 术 中 好 几 个 限 制 平 行 测 序 规 模 的 瓶 颈 问 题, 比 如 转 化 大 肠 杆 菌 以 及 阳 性 克 隆 挑 选 等 问 题 ; 基 于 芯 片 的 测 序 方 式 能 极 大 地 提 高 平 行 测 序 的 能 力 由 于 每 一 个 待 测 DNA 片 段 克 隆 的 直 径 都 不 到 1μm, 因 此 可 以 在 芯 片 上 同 时 对 上 亿 个 待 测 DNA 片 段 进 行 测 序 因 为 每 一 个 待 测 DNA 片 段 克 隆 都 固 定 在 芯 片 上 的 固 定 位 置, 因 此 可 以 一 次 对 芯 片 上 的 所 有 片 段 进 行 测 序, 而 只 需 要 使 用 几 微 升 的 酶 等 反 应 试 剂, 这 就 相 当 于 每 一 个 待 测 片 段 只 使 用 了 几 皮 升 (picoliter) 或 几 飞 升 (femtoliter) 的 反 应 试 剂, 从 而 极 大 降 低 了 测 序 反 应 的 费 用 ; 测 序 片 段 长 度 短 : 几 乎 所 有 的 新 一 代 测 序 技 术 的 测 序 长 度 都 要 明 显 短 于 传 统 测 序 技 术 的 测 序 长 度 ; 准 确 率 不 高 : 平 均 来 说, 新 一 代 测 序 技 术 的 测 序 准 确 率 要 比 传 统 测 序 技 术 低 10 倍 注 : 虽 然 目 前 测 序 片 段 长 度 短 和 准 确 率 不 高 这 两 个 缺 点 限 制 了 新 一 代 测 序 技 术 的 应 用, 不 过 应 该 坚 信, 我 们 最 终 一 定 会 克 服 这 些 问 题 就 好 像 经 过 了 30 年 的 努 力, 传 统 的 测 序 技 术 也 今 非 昔 比, 到 达 了 今 天 的 水 平 一 样 测 序 仪 454 测 序 仪 的 出 现 极 大 促 进 了 测 序 业 务 的 开 展, 科 研 人 员 已 经 将 测 序 技 术 作 为 解 决 科 研 工 作 中 许 多 常 见 问 题 的 利 器 这 是 因 为 454 测 序 仪 在 以 下 几 个 方 面 取 得 了 质 的 突 破 : 首 先 是 解 决 了 高 通 量 测 序 问 题 ; 其 次 它 简 化 了 样 品 准 备 步 骤, 将 以 往 转 化 大 肠 杆 菌 扩 增 质 粒 的 繁 琐 过 程 全 部 用 简 单 的 体 外 PCR 扩 增 法 替 代 了 ; 最 后, 它 缩 小 了 测 序 反 应 体 积, 节 省 了 试 剂 这 样,454 测 序 仪 做 到 了 以 极 其 低 廉 的 价 格 进 行 大 规 模 平 行 测 序 反 应 它 的 测 序 规 模 之 大 测 序 费 用 之 低 是 以 往 的 测 序 仪 无 法 匹 敌 的 454 测 序 仪 与 其 它 的 新 一 代 测 序 仪 一 起, 降 低 了 测 序 检 测 的 费 用, 推 动 了 测 序 技 术 平 民 化 进 程, 使 得 小 实 验 室 也 能 开 展 测 序 检 测 项 目, 打 破 了 以 往 只 有 少 数 几 个 大 型 测 序 中 心 才 能 进 行 测 序 研 究 的 垄 断 地 位 在 过 去 的 18 个 月 里, 由 于 有 了 454 测 序 仪 的 帮 助, 人 们 对 人 类 基 因 组 的 结 构 有 了 更 深 入 的 了 解, 同 时 第 一 次 使 用 非 Sanger 测 序 法 对 个 人 进 行 了 测 序, 还 建 立 了 一 种 发 现 小 RNA 的 新 方 法 不 过, 要 能 让 更 多 的 人 使 用 上 新 一 代 的 测 序 产 品, 它 们 还 需 要 变 得 更 便 宜, 并 且 更 加 容 易 操 作 在 一 段 时 间 之 内,454 测 序 仪 必 定 会 进 一 步 降 低 测 序 费 用, 帮 助 人 们 迎 接 个 人 基 因 组 时 代 的 到 来 自 从 诺 贝 尔 奖 得 主 Frederick Sanger 和 Walter Gilbert( 图 2) 分 别 发 明 了 链 终 止 法 DNA 测 序 技 术 (sequencing by chain termination technique) 和 链 断 裂 法 DNA 测 序 技 术 (sequencing by chain fragmentation technique) 之 后, 人 们 就 一 直 希 望 能 够 扩 大 DNA 测 序 技 术 的 处 理 规 模 到 了 今 天, 我 们 对 测 序 技 术 的 需 求 和 对 计 算 机 技 术 的 需 求 一 起 出 现 了 迅 猛 的 增 长, 因 为 测 序 技 术 的 发 展 速 度 已 经 远 远 跟 不 上 实 验 要 求 的 增 长 速 度 于 是 出 现 了 好 几 种 替 代 Sanger 测 序 法 的 新 型 测 序 方 法, 比 如 杂 交 测 序 法 借 助 原 子 力 显 微 镜 (atomic force microscopy) 直 接 DNA 成 像 测 序 法 (direct imaging of DNA sequence) 质 谱 分 析 法 6

4 合 成 测 序 法 以 及 微 液 流 测 序 法 等 等 在 我 们 进 行 人 类 基 因 组 计 划 时 还 出 现 了 三 项 技 术 改 进 方 法, 即 使 用 荧 光 标 记 物 取 代 了 放 射 性 标 记 物 来 标 记 终 止 碱 基 ( 双 脱 氧 碱 基 ); 使 用 毛 细 管 电 泳 (capillary electrophoresis) 取 代 了 传 统 的 平 板 凝 胶 电 泳 ; 建 立 了 末 端 配 对 测 序 法 (paired-end sequencing) 来 对 质 粒 fosmid 人 工 细 菌 染 色 体 (BAC) 等 短 片 段 序 列 进 行 测 序, 解 决 了 测 序 长 度 带 来 的 限 制 问 题 同 时, 开 展 研 究 的 自 动 化 液 体 分 装 技 术 (liquid-handling robotics) 帮 助 我 们 摆 脱 了 人 工 试 管 操 作, 可 以 用 自 动 化 的 方 式 在 微 量 滴 定 板 (microtiter plate) 上 装 载 待 测 序 样 品 ( 质 粒 等 ), 极 大 地 降 低 了 测 序 的 费 用 和 劳 动 强 度 图 2 Frederick Sanger( 左 ) 与 Walter Gilbert( 右 ) 图 片 来 源 :Nobelprize.org 随 着 美 国 454 Life Sciences 公 司 ( 该 公 司 现 已 被 美 国 罗 氏 公 司 收 购 ) 的 第 一 台 新 一 代 测 序 仪 454 测 序 仪 的 面 世, 我 们 获 得 了 一 种 完 全 不 同 的 测 序 方 式 454 测 序 仪 引 领 的 新 一 代 测 序 技 术 在 一 直 困 扰 传 统 测 序 技 术 的 三 个 瓶 颈 问 题 上 取 得 了 突 破 这 三 个 问 题 分 别 是 文 库 制 备 模 板 制 备 和 测 序 而 且, 在 随 后 出 现 的 其 它 新 一 代 测 序 仪 产 品 身 上, 我 们 或 多 或 少 都 会 发 现 在 454 测 序 仪 上 使 用 到 的 技 术, 这 也 足 以 说 明 454 测 序 仪 的 技 术 创 新 的 确 取 得 了 巨 大 的 成 功 454 测 序 仪 的 先 行 者 地 位 使 它 对 整 个 测 序 业 的 影 响 远 远 超 过 了 其 它 新 一 代 测 序 仪 竞 争 对 手 这 一 点 从 Leamon Rothberg 等 人 撰 写 的 一 篇 介 绍 2005 年 技 术 进 展 的 论 文 被 引 用 了 570 多 次 的 事 实, 以 及 有 100 多 篇 经 过 同 行 审 议 的 关 于 人 类 遗 传 学 代 谢 组 学 生 态 学 进 化 学 以 及 古 生 物 学 的 论 文 (peer-reviewed publications) 都 是 使 用 454 测 序 仪 开 展 的 研 究 多 个 事 实 中 都 能 够 得 到 证 明 454 测 序 仪 技 术 是 继 Sanger 测 序 技 术 之 后 出 现 的 第 一 个 用 于 对 细 菌 基 因 组 进 行 从 头 测 序 的 新 技 术, 也 是 第 一 个 被 用 来 对 人 类 基 因 组 进 行 测 序 的 非 Sanger 测 序 技 术 其 它 使 用 454 测 序 仪 开 展 的 重 要 研 究 项 目 包 括 探 究 蜜 蜂 消 失 原 因 的 项 目 研 究 人 类 基 因 组 重 排 复 杂 性 的 项 目 建 立 用 于 研 究 传 染 性 疾 病 新 方 法 的 项 目 以 及 对 尼 安 德 特 尔 人 (Neanderthal) 基 因 组 的 测 序 项 目 等 摩 尔 定 律 对 454 测 序 仪 的 影 响 454 测 序 仪 的 迅 猛 发 展 不 是 因 为 我 们 想 要 Sanger 测 序 仪 小 型 化, 而 是 因 为 新 型 奔 腾 芯 片 的 出 现 以 及 摩 尔 定 律 法 则 给 我 们 带 来 的 希 望 很 明 显, 常 规 的 人 类 基 因 测 序 项 目 会 对 我 们 处 理 测 序 技 术 的 能 力 提 出 更 高 要 求, 这 与 我 们 对 计 算 机 处 理 能 力 的 要 求 是 一 样 的 不 过, 只 有 将 计 算 机 的 电 子 管 换 成 晶 体 管, 才 为 后 来 集 成 电 路 技 术 的 发 展 提 供 了 可 能, 这 正 是 计 算 机 产 业 发 展 的 关 键 所 在 而 希 望 对 传 统 的 毛 细 管 电 泳 技 术 进 行 改 良, 提 高 它 的 速 度 和 处 理 规 模, 正 如 只 用 电 子 管 直 接 制 作 集 成 电 路 一 样 不 可 能 因 此, 如 果 将 各 种 测 序 技 术 比 作 一 个 个 晶 体 管, 将 一 系 列 测 序 步 骤 整 合 起 来 比 作 集 成 电 路, 那 么 也 就 可 以 用 摩 尔 定 律 来 预 测 DNA 测 序 技 术 的 发 展 速 度 了 合 成 测 序 法 概 念 虽 然 在 提 出 的 时 候 还 不 算 成 功, 但 它 的 出 现 为 测 序 仪 小 型 化 奠 定 了 基 础 基 于 合 成 测 7

5 生 命 奥 秘 序 法 出 现 了 两 种 策 略 : 一 种 是 循 环 可 切 除 终 止 测 序 法 (cyclic reversible termination technology), 即 依 次 逐 个 添 加 荧 光 标 记 的 碱 基, 继 而 检 测 荧 光 信 号, 切 除 荧 光 基 团, 如 此 往 复 ; 另 一 种 策 略 是 焦 磷 酸 测 序 法 (sequenced by detecting pyrophosphate release) 454 测 序 仪 采 用 的 正 是 焦 磷 酸 测 序 法, 因 为 它 似 乎 比 第 一 种 方 法 的 效 率 更 高 结 果 证 明,454 公 司 的 选 择 是 正 确 的 454 测 序 仪 采 用 的 是 小 型 化 焦 磷 酸 测 序 反 应, 测 序 模 板 准 备 和 焦 磷 酸 测 序 反 应 步 骤 都 是 在 固 态 芯 片 上 完 成 的 实 际 上, 早 在 上 世 纪 90 年 代 中 期, 焦 磷 酸 测 序 技 术 就 已 经 被 科 研 界 用 来 进 行 基 因 分 型 工 作 了, 但 那 时 的 焦 磷 酸 测 序 技 术 还 不 能 够 满 足 标 准 的 测 序 实 验 要 求, 因 为 它 的 测 序 长 度 太 短, 因 此 只 能 用 于 旨 在 发 现 SNP 的 基 因 分 型 研 究 当 中 当 时 进 行 基 因 分 型 操 作 时, 是 在 微 量 滴 定 板 (microtiter plate) 上 进 行 的, 可 以 连 续 进 行 最 多 96 次 基 因 分 型 实 验, 平 均 每 个 样 品 花 费 20 美 分 那 时 焦 磷 酸 测 序 还 不 能 用 于 从 头 测 序 工 作, 因 为 从 头 测 序 需 要 对 每 一 个 尤 其 是 第 一 个 碱 基 都 能 准 确 地 区 分 清 楚, 而 焦 磷 酸 测 序 只 能 简 单 地 对 已 知 位 点 的 碱 基 进 行 检 测, 而 且 从 头 测 序 要 求 的 测 序 长 度 也 是 焦 磷 酸 测 序 法 无 法 达 到 的 不 过, 由 于 焦 磷 酸 测 序 的 原 理 是 通 过 检 测 碱 基 掺 入 时 发 出 的 光 来 进 行 测 序 的 ( 图 3), 所 以 它 并 不 需 要 类 似 于 电 泳 之 类 的 物 理 分 离 过 程 来 对 碱 基 进 行 区 分 这 也 就 是 说 焦 磷 酸 测 序 仪 可 以 缩 小 ( 减 ) 到 只 需 要 检 测 光 线 就 够 了, 而 不 需 要 像 传 统 的 测 序 仪 还 需 要 电 泳 设 备, 而 这 正 是 限 制 传 统 电 泳 仪 小 型 化 的 关 键 所 在 发 光 检 测 方 法 还 能 够 进 行 多 路 平 行 操 作, 但 是 直 到 454 测 序 仪 出 现 之 前, 还 没 有 人 这 样 做 过, 以 前 都 是 依 次 进 行 检 测 的 和 晶 体 管 早 期 的 遭 遇 一 样 ( 当 时 人 们 也 怀 疑 晶 体 管 替 代 不 了 电 子 管 ), 人 们 同 时 对 高 密 度 的, 用 于 并 行 焦 磷 酸 测 序 的 反 应 也 充 满 了 疑 问 不 过, 当 我 们 不 再 在 溶 液 中 进 行 测 序 反 应, 而 是 将 测 序 模 板 所 有 的 试 剂 ( 酶 ) 都 固 定 在 平 板 上 制 成 芯 片 之 后, 就 获 得 了 小 型 化 的, 能 进 行 多 路 并 行 处 理 的 测 序 仪, 这 就 与 晶 体 管 被 小 型 化 并 整 合 成 集 成 电 路 的 过 程 一 样 此 外, 借 助 微 量 滴 定 板 上 一 个 个 的 小 孔 所 达 到 的 将 不 同 测 序 反 应 进 行 分 隔 这 一 目 的, 也 能 通 过 在 单 个 固 相 支 持 物 上 进 行 严 密 包 裹 ( 隔 离 ) 的 反 应 来 实 现 在 这 些 各 自 隔 绝 的 反 应 体 系 中, 链 聚 合 反 应 速 度 和 发 光 速 度 都 能 通 过 对 反 应 试 剂 和 产 物 弥 散 状 况 进 行 严 密 的 控 制 来 进 行 精 密 的 调 整 氧 化 荧 光 素 + 发 光 ATP + 荧 光 素 ATP PPi 图 3 焦 磷 酸 测 序 反 应 原 理 图 中 红 色 单 链 表 示 模 板 链, 引 物 以 黑 色 表 示,DNA 聚 合 酶 以 绿 色 的 椭 圆 形 表 示 每 当 掺 入 一 个 碱 基 ( 如 图 中 蓝 色 的 G) 时, 就 会 释 放 出 焦 磷 酸 (PPi), 然 后 被 磷 酸 化 酶 (sulfurylase, 图 中 蓝 色 箭 头 所 示 ) 转 化 成 ATP 然 后 荧 光 素 酶 ( 图 中 红 色 箭 头 所 示 ) 就 可 以 在 ATP 参 与 下 将 荧 光 素 转 变 成 氧 化 荧 光 素, 同 时 发 光 也 会 被 测 序 仪 检 测 到 新 的 并 行 试 验 方 法 在 开 发 新 型 高 通 量 高 并 行 运 行 方 法 时 碰 到 的 一 个 关 键 问 题 是, 如 何 将 反 应 试 剂 同 时 加 入 数 量 如 此 之 多 的 各 个 反 应 体 系 中? 在 焦 磷 酸 测 序 的 过 程 当 中 需 要 反 复 加 入 不 同 的 碱 基 以 供 测 序 反 应 使 用, 而 当 时 的 自 动 化 加 样 设 备 无 法 有 效 地 做 到 对 这 么 多 的 反 应 体 系 同 时 循 环 加 样 于 是, 开 发 一 种 全 新 的 高 密 度 并 行 处 理 方 法 这 8

6 一 重 要 课 题 又 再 一 次 摆 在 了 科 研 人 员 的 面 前 这 一 次, 我 们 找 到 了 一 个 非 常 简 单 但 是 又 很 巧 妙 地 方 法 在 高 密 度 的 反 应 芯 片 表 面 使 用 层 流 (laminar flow) 加 样 方 式, 反 应 试 剂 会 通 过 扩 散 作 用 很 好 地 进 入 每 一 个 反 应 体 系, 而 且 也 可 以 用 层 流 的 方 式 洗 去 多 余 的 反 应 试 剂 现 在, 所 有 的 新 一 代 测 序 仪 都 采 用 了 这 种 层 流 加 样 方 法 为 了 将 每 个 单 独 的 测 序 反 应 都 分 隔 开 来, 我 们 一 开 始 使 用 平 板 ( 芯 片 ), 不 过 在 平 板 上 平 均 每 一 平 方 厘 米 的 面 积 上 最 多 只 能 同 时 进 行 数 百 至 数 千 个 反 应 但 我 们 希 望 达 到 的 是 在 每 平 方 厘 米 的 面 积 上 同 时 进 行 100 万 个 测 序 反 应, 这 样 才 能 令 测 序 仪 小 型 化, 同 时 节 省 试 剂 并 进 行 快 速 成 像 和 测 序 为 了 实 现 更 高 密 度 的 测 序 反 应, 我 们 在 平 板 上 制 作 了 很 多 小 孔, 将 每 个 反 应 体 系 都 安 置 在 这 些 小 孔 中, 这 些 小 孔 都 足 够 深, 足 以 分 隔 每 个 反 应 体 系 虽 然 这 种 方 法 极 大 提 高 了 测 序 反 应 的 密 度, 缩 小 了 平 板 的 面 积, 但 是 要 达 到 我 们 的 要 求 还 是 需 要 60mm 60mm 大 小 的 芯 片 才 行 针 对 图 像 采 集 问 题 使 用 了 商 业 化 的 天 文 学 照 相 (astrological grade camera) 器 材, 在 电 荷 偶 合 装 置 (CCD) 的 表 面 连 接 上 光 纤 束 (fiber-optic bundle) 这 些 光 纤 是 锥 形 排 列 的, 这 样 可 以 将 大 范 围 的 光 信 号 都 传 输 到 CCD 表 面 上 很 小 的 一 个 范 围 采 取 下 面 两 个 步 骤, 我 们 就 可 以 制 成 含 有 高 密 度 小 孔 的 芯 片 : 先 将 光 纤 束 连 接 到 类 似 于 载 玻 片 一 样 的 一 次 性 芯 片 上, 然 后 用 酸 蚀 刻 (acid etching procedure) 技 术 在 玻 片 的 另 一 面 打 上 小 孔 这 种 酸 蚀 刻 技 术 是 根 据 制 作 生 物 传 感 器 的 技 术 改 进 而 来 的 454 公 司 制 作 的 每 张 芯 片 上 可 以 达 到 数 百 万 个 小 孔, 每 一 个 小 孔 都 是 一 个 独 立 的 反 应 站, 互 不 干 扰, 测 序 反 应 发 出 的 光 被 连 接 在 芯 片 上 的 光 纤 传 送 到 CCD 记 录 下 来 ( 图 4) 这 种 芯 片 就 好 像 集 成 电 路 一 样 一 次 可 以 同 时 处 理 数 百 万 个 测 序 反 应 这 种 芯 片 同 样 也 能 被 其 它 通 过 发 光 检 测 技 术 的 产 品 所 使 用 454 测 序 仪 也 没 有 像 以 前 的 96 孔 板 焦 磷 酸 测 序 仪 那 样 使 用 液 态 的 试 剂, 而 是 将 试 剂 和 模 板 统 统 都 吸 附 在 一 个 个 微 珠 上, 然 后 把 这 些 微 珠 一 个 个 地 放 到 芯 片 上 的 小 孔 中, 每 孔 一 个 微 珠 这 种 固 定 步 骤 不 仅 保 证 了 每 孔 测 序 反 应 的 独 立 性, 也 极 大 地 节 省 了 试 剂 消 耗 费 用 a e b c d f iii ii i 图 测 序 仪 技 术 应 用 简 介 (a) 分 离 基 因 组 DNA, 随 即 切 割 成 小 片 段, 每 个 片 段 两 端 连 接 上 接 头 序 列, 并 变 性 形 成 单 链 ;(b) 将 (a) 中 制 成 的 单 链 分 子 与 微 珠 连 接, 每 个 微 珠 连 接 上 一 条 单 链 分 子, 然 后 将 这 些 微 珠 在 乳 液 中 包 裹 成 一 个 个 油 包 水 的 小 液 滴, 每 个 液 滴 中 包 含 一 个 微 珠, 然 后 进 行 乳 液 PCR 扩 增, 最 后 每 个 微 珠 上 都 会 携 带 有 上 千 万 条 待 测 模 板 分 子 ;(c) 打 破 液 滴, 收 集 微 珠, 然 后 将 微 珠 放 置 到 芯 片 上 的 小 孔 中, 每 个 小 孔 中 一 个 微 珠 ;(d) 在 每 个 小 孔 中 置 入 吸 附 有 焦 磷 酸 测 序 反 应 所 需 酶 的 小 微 珠 ; (e) 微 珠 置 入 前 的 芯 片 图 像 ;(f)454 测 序 仪 主 要 包 括 以 下 几 个 部 分 :(i) 液 体 试 剂 供 应 装 置 ;(ii) 反 应 池 ;(iii) 光 线 探 测 成 像 系 统 和 计 算 机 控 制 系 统 9

7 生 命 奥 秘 要 想 实 现 高 通 量 基 因 组 测 序, 只 对 测 序 步 骤 进 行 优 化 还 是 远 远 不 够 的 人 类 基 因 组 计 划 花 费 的 30 亿 美 元 经 费 中 有 很 大 一 部 分 都 用 在 了 测 序 样 品 制 备 阶 段 当 时 即 使 是 采 用 最 简 单 的 制 备 样 品 方 法 也 需 要 将 目 标 片 段 克 隆 到 细 菌 中, 挑 克 隆, 再 转 到 96 孔 板, 然 后 进 行 克 隆 扩 增, 提 取 质 粒, 制 备 测 序 模 板 这 种 工 作 流 程 既 耗 时 也 耗 钱 如 果 采 用 新 型 的 文 库 制 备 方 法 就 可 以 极 大 地 节 省 这 部 分 开 支, 这 种 新 型 的 方 法 是 先 分 离 基 因 组 DNA, 随 机 切 割 成 小 片 段 分 子, 然 后 通 过 有 限 稀 释 (limiting dilution) 和 聚 合 酶 扩 增 反 应, 即 体 外 克 隆 方 式 (clones without bacterial) 制 备 模 板 片 段 这 样, 从 模 板 制 备 到 最 后 的 测 序 反 应 整 个 过 程 都 能 够 在 体 外 完 成 从 发 明 到 创 新 从 概 念 的 提 出 到 最 后 技 术 上 的 实 现,454 测 序 仪 主 要 关 注 两 个 方 面, 首 先 是 开 发 蚀 刻 光 纤 玻 片 ; 其 次, 改 进 焦 磷 酸 测 序 方 法 使 其 能 在 固 相 支 持 物 上 进 行, 即 将 其 改 造 成 固 态 焦 磷 酸 测 序 法, 同 时 也 对 模 板 及 文 库 构 建 方 法 进 行 了 改 进, 让 454 测 序 仪 能 进 行 长 片 段 测 序 工 作 和 从 头 测 序 工 作 在 蚀 刻 板 上 的 小 孔 中 进 行 固 态 长 片 段 焦 磷 酸 测 序 反 应 蚀 刻 技 术 经 过 改 良 之 后 能 在 75mm 75mm 的 玻 片 上 刻 出 深 55μm 宽 44μm 的 小 孔 而 开 发 固 态 测 序 方 法 和 改 良 测 序 长 度 则 是 两 个 紧 密 相 关 的 问 题, 因 为 在 固 定 的 小 孔 中 反 应 实 际 上 就 能 改 进 测 序 质 量 和 测 序 长 度 由 于 反 应 试 剂 能 迅 速 渗 透 到 小 孔 中, 因 此 反 应 速 度 也 会 加 快 而 且 这 里 也 没 有 使 用 三 磷 酸 腺 苷 双 磷 酸 酶 (apyrase) 提 取 未 参 与 反 应 的 碱 基, 而 是 将 芯 片 置 入 反 应 池 中 通 过 层 流 液 体 的 快 速 渗 透 作 用 将 多 余 的 未 参 与 反 应 的 碱 基 和 反 应 副 产 品 洗 掉, 由 此 得 到 100bp~500bp 的 测 序 长 度 在 能 有 效 去 除 多 余 碱 基 的 同 时, 每 轮 反 应 中 聚 合 酶 的 效 率 也 得 到 了 极 大 提 高 这 样 高 效 率 的 聚 合 反 应 使 得 454 测 序 仪 具 有 较 长 测 序 长 度 的 同 时 也 保 证 了 高 准 确 性, 测 序 长 度 在 200bp 时 的 准 确 率 高 达 99.5% 这 是 因 为 通 过 降 低 小 孔 中 残 存 的 未 参 与 反 应 的 碱 基 浓 度, 可 以 降 低 这 些 碱 基 对 聚 合 酶 活 性 的 抑 制 作 用, 或 者 降 低 这 些 碱 基 导 致 的 延 后 错 误 (carry-forward error, 即 由 于 未 参 与 反 应 的 碱 基 导 致 的 测 序 反 应 不 同 步 现 象 ) 的 发 生 率 454 测 序 仪 在 测 序 长 度 和 准 确 率 方 面 具 有 优 势 还 因 为 其 在 应 用 流 体 学 表 面 化 学 和 酶 学 ( 包 括 选 择 更 好 的 聚 合 酶 在 更 高 的 温 度 进 行 测 序 反 应 以 及 更 换 及 平 衡 各 个 酶 组 分 ) 等 方 面 都 有 创 新 ( 表 4) 还 有 一 些 能 提 高 测 序 精 度 和 测 序 长 度 的 技 术, 不 过 暂 时 还 没 有 商 业 化 产 品 这 些 技 术 包 括 使 用 可 切 除 的 终 止 碱 基 (reversible terminator) 提 高 对 同 聚 物 (homopolymers) 的 检 测 精 度 ; 双 末 端 测 序 法 (double-ended sequencing), 即 同 一 模 板 的 两 条 链 均 不 测 序 ; 以 及 选 择 性 酶 固 定 法 (alternative enzymeimmobilization method) 等 这 些 技 术 改 进 还 都 没 有 用 到 测 序 仪 产 品 中, 有 一 部 分 原 因 是 因 为 现 在 还 没 有 必 要 使 用 表 4 通 过 与 454 合 作 进 行 的 研 究 应 用 项 目 应 用 领 域 细 菌 测 序 及 比 较 基 因 组 学 古 生 物 学 及 古 代 DNA 小 RNA 环 境 基 因 组 学 基 因 组 结 构 研 究 人 类 全 基 因 组 测 序 合 作 项 目 结 核 分 枝 杆 菌 对 尼 安 德 特 人 的 DNA 进 行 测 序 拟 南 芥 DICER 功 能 分 析 有 关 导 致 蜂 群 崩 溃 症 的 微 生 物 研 究 人 类 基 因 组 中 的 变 异 对 James Watson 的 基 因 组 进 行 测 序 注 : 蜜 蜂 群 崩 溃 症 (honeybee colony collapse), 指 的 是 来 自 养 蜂 业 的 蜂 箱 或 自 然 界 存 在 的 欧 洲 蜜 蜂 群 的 工 蜂 突 然 消 失 的 现 象, 又 称 作 Colony collapse disorder(ccd) 10

8 完 全 的 体 外 大 规 模 模 板 制 备 工 作 是 达 成 高 通 量 低 价 格 测 序 技 术 的 前 提 已 广 泛 使 用 的 乳 液 PCR 扩 增 技 术 就 是 一 种 很 好 的 方 法 不 过, 由 于 很 难 在 热 循 环 测 序 反 应 中 保 证 乳 液 微 滴 的 稳 定 性, 因 此 最 开 始 实 验 的 模 板 扩 增 方 法 是 恒 温 扩 增 法 (isothermal) 乳 液 PCR 不 需 要 借 助 细 菌 的 帮 助 就 能 扩 增 模 板, 虽 然 这 一 点 非 常 诱 人, 但 最 开 始 时 并 没 有 合 适 的 表 面 活 性 剂 能 帮 助 乳 液 在 热 循 环 过 程 中 保 持 稳 定 于 是 出 现 了 恒 温 扩 增 法, 即 滚 环 扩 增 反 应 (RCA) 虽 然 滚 环 扩 增 反 应 的 产 量 非 常 高, 但 这 些 产 物 中 大 部 分 都 不 能 用 来 作 为 测 序 模 板 因 此, 还 需 要 找 到 一 种 不 需 要 细 菌 扩 增, 能 用 于 有 限 稀 释 的 模 板 扩 增 新 方 法 于 是, 人 们 又 把 目 光 转 回 了 PCR 法 在 RCA 法 中, 首 先 将 模 板 克 隆 有 限 稀 释 之 后 置 入 光 纤 玻 片 上 的 小 孔 中, 然 后 用 橡 胶 衬 垫 把 光 纤 玻 片 封 闭 起 来, 将 玻 片 放 入 传 统 的 平 顶 PCR 仪 进 行 扩 增 这 种 方 法 取 得 了 成 功, 但 是 效 率 不 高, 因 为 在 玻 片 中 的 热 质 量 (thermal mass) 和 它 的 钳 效 应 (clamping mechanism) 需 要 更 长 的 PCR 循 环 时 间, 而 且 模 板 的 有 限 稀 释 度 不 能 低 于 10% 孔 与 孔 之 间 的 相 互 污 染 现 象 也 是 一 个 不 容 忽 视 的 问 题 不 过 无 论 如 何, 该 方 法 还 是 第 一 个 首 先 从 全 基 因 组 文 库 中 扩 增 模 板 然 后 使 用 非 Sanger 非 Gilbert 测 序 法 对 基 因 组 进 行 从 头 测 序 的 方 法, 也 是 第 一 个 使 用 体 外 模 板 扩 增 技 术 进 行 全 基 因 组 ( 腺 病 毒 基 因 组 ) 测 序 的 方 法 乳 液 滴 的 热 稳 定 性 问 题 最 终 通 过 加 入 用 于 制 造 炸 药 的 表 面 活 性 剂 得 到 了 解 决, 于 是 乳 液 PCR 技 术 马 上 在 众 多 新 一 代 测 序 仪 中 得 到 了 广 泛 的 应 用 因 为 乳 液 PCR 技 术 具 有 高 效 性 可 扩 展 性, 既 能 从 30Kb 的 腺 病 毒 基 因 组 中 扩 增 模 板, 也 能 从 好 几 Mb 的 肺 炎 链 球 菌 (Streptococcus pneumoniae) 基 因 组 中 扩 增 模 板 随 着 测 序 精 度 测 序 长 度 乳 液 滴 稳 定 性 等 各 方 面 技 术 的 不 断 发 展,454 测 序 仪 已 经 不 仅 仅 用 于 对 细 菌 级 别 的 基 因 组 进 行 测 序 了, 还 能 对 更 高 级 更 复 杂 的 生 物 基 因 组 进 行 测 序, 例 如 现 代 人 类 基 因 组 尼 安 德 特 人 基 因 组 以 及 环 境 基 因 组 等 文 库 制 备 文 库 制 备 包 括 以 下 几 个 步 骤, 首 先 随 机 切 割 样 品 基 因 组, 获 得 大 量 DNA 片 段, 然 后 接 上 接 头 进 行 扩 增 反 应 454 测 序 仪 的 样 品 制 备 程 序 和 Craig Venter 等 人 的 鸟 枪 法 样 品 制 备 程 序 有 着 本 质 的 差 别 454 公 司 采 用 的 是 如 图 4 中 所 示 的 有 限 稀 释 乳 液 PCR 扩 增 法, 而 没 有 鸟 枪 法 中 的 细 菌 克 隆 繁 殖 步 骤 去 掉 了 细 菌 繁 殖 步 骤 极 大 地 提 高 了 整 个 测 序 工 作 的 速 度 和 效 率, 同 时 避 免 了 由 于 细 菌 繁 殖 导 致 的 序 列 丢 失 的 可 能 性 这 种 方 法 同 样 对 古 老 DNA 和 代 谢 基 因 组 学 的 研 究 也 非 常 适 用 末 端 配 对 文 库 制 备 方 法 的 建 立 同 样 帮 助 454 测 序 仪 获 得 了 对 复 杂 基 因 组 从 头 测 序 对 重 复 片 段 测 序 以 及 对 基 因 组 结 构 ( 复 制 重 排 ) 展 开 系 统 研 究 三 种 能 力 这 种 末 端 配 对 文 库 的 制 备 方 法 是 受 到 了 Bender 科 研 小 组 对 果 蝇 (Drosophila) 制 备 跨 步 文 库 (jumping library) 方 法 的 启 发 而 发 展 得 来 的 应 用 范 围 随 着 越 来 越 多 重 要 的 研 究 领 域 受 到 测 序 技 术 的 影 响,454 公 司 开 始 和 其 它 商 业 和 学 术 机 构 开 展 合 作, 进 行 样 品 测 序 和 分 析 工 作 这 些 合 作 项 目 又 进 一 步 验 证 了 454 测 序 仪 使 用 的 技 术 能 够 在 众 多 领 域 中 发 挥 作 用, 例 如 末 端 配 对 文 库 技 术 对 于 研 究 基 因 组 结 构 的 作 用 和 乳 液 PCR 技 术 捕 获 目 的 DNA 片 段 的 作 用 等 细 菌 基 因 组 测 序 和 比 较 基 因 组 研 究 为 了 测 试 454 测 序 仪 在 全 基 因 组 测 序 方 面 的 能 力,454 公 司 一 开 始 就 参 与 了 一 项 合 作 项 目, 该 研 究 项 目 会 对 4 株 结 核 分 支 杆 菌 基 因 组 进 行 测 序, 这 四 株 结 核 分 支 杆 菌 分 别 是 一 株 对 R 具 有 耐 药 性 的 结 核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium tuberculosis ) 菌 株, 基 因 组 大 小 约 4Mb; 两 株 对 R 具 有 耐 药 性 的 耻 垢 分 支 杆 11

9 生 命 奥 秘 菌 (Mycobacterium smegmatis ), 基 因 组 大 小 约 6Mb; 以 及 一 株 正 常 的 耻 垢 分 支 杆 菌 (Mycobacterium smegmatis ), 基 因 组 大 小 约 6Mb 他 们 希 望 能 发 现 结 核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium tuberculosis ) 对 R 产 生 抗 药 性 的 机 制 该 项 研 究 清 晰 的 展 现 了 454 测 序 仪 在 测 序 速 度 和 测 序 精 度 方 面 的 优 势 使 用 传 统 的 Sanger 测 序 法 对 一 个 4Mb 的 基 因 组 和 3 个 6Mb 的 基 因 组 进 行 测 序 需 要 好 几 个 月 的 时 间, 而 用 454 测 序 仪, 在 只 有 一 位 实 验 人 员 参 与 实 验 的 情 况 下, 包 括 样 品 制 备 等 步 骤 在 内 所 用 的 时 间 仅 需 要 一 周 而 且 使 用 454 测 序 仪 还 避 免 了 传 统 测 序 方 法 中 细 菌 克 隆 阶 段 可 能 出 现 的 错 误, 获 得 了 高 质 量 的 测 序 结 果, 发 现 了 导 致 结 核 分 枝 杆 菌 对 R 产 生 抗 药 性 的 两 个 点 突 变 位 点 这 项 研 究 成 果 让 我 们 在 最 近 的 40 年 内 第 一 次 找 到 了 特 异 性 治 疗 结 核 病 的 药 物, 同 时 也 对 454 测 序 仪 在 细 菌 基 因 组 测 序 方 面 的 应 用 价 值 有 了 深 刻 的 体 会 随 后,454 测 序 仪 又 参 与 了 比 较 基 因 组 学 研 究 项 目 对 高 致 病 性 细 菌 空 肠 弯 曲 菌 (Campylobacter jejun ) 基 因 组 的 从 头 测 序 项 目 对 幽 门 螺 杆 菌 (Helicobacter pylori ) 在 慢 性 胃 炎 致 病 过 程 中 的 进 化 研 究 项 目 从 南 极 海 冰 细 菌 (Antarctic sea ice bacterium) 中 新 发 现 冰 结 合 蛋 白 (ice-binding protein) 并 对 其 测 序 的 研 究 项 目, 以 及 在 引 起 肺 炎 脑 膜 炎 和 泌 尿 道 感 染 的 细 菌 中 发 现 致 病 因 素 的 研 究 项 目 等 由 于 454 测 序 仪 不 会 因 为 细 菌 克 隆 产 生 测 序 误 差, 所 以 在 对 结 核 分 枝 杆 菌 抗 药 性 的 研 究 中 表 现 出 了 非 常 强 的 发 现 突 变 位 点 的 能 力, 这 一 点 也 被 后 来 的 其 它 研 究 项 目 所 证 实 此 外, 最 近 在 用 454 测 序 仪 进 行 的 人 类 基 因 组 测 序 项 目 中 发 现 了 长 达 29Mb 的 片 段 与 人 类 基 因 组 参 考 序 列 build-36 不 相 符, 这 些 片 段 被 认 为 是 参 考 序 列 中 不 存 在 的 序 列, 属 于 基 因 组 中 的 常 染 色 质 部 分 不 过, 还 需 要 注 意 的 是, 有 些 报 道 称 由 于 重 复 片 段 的 存 在 会 出 现 序 列 组 装 错 误, 而 且 小 模 板 片 段 雾 化 (nebulization) 处 理 这 种 方 式 也 会 造 成 测 序 错 误 出 现 小 RNA 测 序 对 于 包 括 mirna 在 内 的 小 RNA 的 研 究 兴 趣 从 2005 年 开 始 就 持 续 不 断 升 温, 而 2005 年 恰 好 也 是 454 测 序 仪 上 市 的 那 一 年 454 测 序 仪 以 其 不 需 要 进 行 传 统 的 细 菌 克 隆 步 骤 和 足 以 覆 盖 只 有 21bp 长 的 mirna 的 测 序 长 度 等 优 势, 很 快 就 在 mirna 的 作 用 研 究 之 中 占 据 了 一 席 之 地 454 测 序 仪 最 早 参 与 进 行 的 mirna 研 究 是 对 拟 南 芥 (Arabidopsis thaliana)mirna 开 展 的 研 究 随 后 马 上 又 参 与 了 另 一 项 研 究 项 目, 在 这 个 项 目 中 我 们 在 小 鼠 体 内 发 现 了 一 种 新 型 的 小 RNA pirna 这 些 研 究 项 目 为 我 们 在 人 类 黑 猩 猩 斑 马 鱼 和 肿 瘤 细 胞 系 中 开 展 小 RNA 研 究 铺 平 了 道 路 454 测 序 仪 具 有 的 这 种 对 小 RNA 进 行 研 究 的 能 力 使 它 在 众 多 有 关 RNA 的 研 究 领 域 都 能 有 所 作 为, 例 如 转 录 体 研 究 领 域 EST 研 究 领 域 5'-RATE 研 究 领 域 和 基 于 转 录 体 的 SNP 研 究 领 域 等 在 古 生 物 学 和 古 DNA 研 究 领 域 的 作 用 要 用 传 统 的 测 序 方 法 对 尼 安 德 特 人 的 基 因 组 进 行 测 序 研 究 非 常 困 难, 因 为 这 些 古 老 DNA 量 非 常 少, 而 且 都 早 已 裂 解 成 了 片 段 一 开 始,454 公 司 使 用 比 较 容 易 得 到 的 不 太 重 要 的 古 代 DNA 样 品 检 验 了 454 测 序 仪 对 它 们 的 测 序 能 力, 结 果 非 常 好, 尽 管 当 时 454 测 序 仪 的 测 序 长 度 只 有 100bp 不 过, 尼 安 德 特 人 的 基 因 组 片 段 长 度 基 本 上 都 介 于 40bp~90bp 之 间, 而 且 最 近 开 发 的 乳 液 PCR 方 法 也 能 够 对 微 量 ( 单 分 子 ) 样 本 进 行 很 好 的 扩 增 于 是,454 测 序 仪 参 与 了 对 38,000 年 前 古 老 的 尼 安 德 特 人 的 基 因 组 进 行 测 序 的 工 作, 研 究 结 果 分 别 发 表 在 了 好 几 篇 论 文 当 中, 引 起 了 广 泛 的 关 注, 并 促 进 了 古 生 物 学 基 因 组 的 研 究 随 后 有 人 对 长 毛 象 (woolly mammoth) 和 更 新 世 狼 (Pleistocene wolves) 的 基 因 组 开 展 了 测 序 研 究 环 境 基 因 组 学 和 感 染 性 疾 病 研 究 领 域 美 国 在 2001 年 爆 发 了 炭 疽 恐 怖 袭 击 危 机 之 后,454 公 司 便 对 如 何 使 用 454 测 序 仪 对 复 杂 的 未 知 的 未 人 工 培 养 的 环 境 微 生 物 基 因 组 进 行 测 序 展 开 了 研 究 前 后 两 个 合 作 研 究 项 目 均 表 明 454 测 序 仪 能 够 用 于 从 DNA 混 合 样 品 中 发 现 未 知 微 生 物 并 对 其 进 行 分 类 在 第 一 个 研 究 项 目 中, 有 三 名 患 者 都 接 受 了 同 一 名 澳 大 利 亚 器 12

10 官 捐 赠 者 的 器 官, 之 后 均 因 不 明 原 因 而 死 亡 从 这 三 名 死 者 身 上 提 取 了 非 人 类 DNA 样 品 进 行 测 序, 结 果 获 得 了 144,000 条 序 列 分 析 后 发 现, 这 些 序 列 分 别 属 于 一 种 沙 粒 病 毒 科 (Arenaviridae) 家 族 病 毒 的 14 个 不 同 基 因 随 后 进 行 的 第 二 项 研 究 在 对 健 康 蜂 群 和 患 病 蜂 群 进 行 环 境 基 因 组 学 比 较 研 究 之 后 发 现, 以 色 列 急 性 麻 痹 病 毒 (Israeli acute paralysis virus) 是 导 致 蜜 蜂 蜂 群 崩 溃 症 的 元 凶 上 述 这 些 研 究 都 突 出 了 454 测 序 仪 的 一 个 特 点, 即 在 样 品 准 备 前 不 需 要 进 行 克 隆 或 预 扩 增 步 骤, 因 此 非 常 适 用 于 对 未 知 的 未 能 人 工 培 养 的 物 种 进 行 测 序 这 些 特 点 也 在 其 它 对 地 下 矿 藏 深 海 土 壤 和 高 盐 等 环 境 下 进 行 的 环 境 微 生 物 构 成 方 面 的 研 究 所 证 实 基 因 组 结 构 研 究 领 域 454 测 序 仪 技 术 的 进 步 使 它 能 够 适 用 于 更 多 的 科 研 领 域 最 新 开 发 的 末 端 配 对 测 序 法 (pairedend sequencing) 就 非 常 适 合 用 于 发 现 人 类 基 因 组 当 中 的 结 构 变 异 末 端 配 对 作 图 过 程 (paired-end mapping), 简 单 来 说 就 是 对 一 个 非 洲 人 和 一 个 欧 洲 人 的 基 因 组 进 行 测 序 后 发 现 结 构 变 异 并 对 其 作 图, 最 终 将 1,000 多 个 3Kb 或 更 长 的 结 构 变 异 片 段 定 位 到 人 类 基 因 组 参 考 序 列 中 研 究 发 现, 在 人 类 基 因 组 当 中 存 在 的 结 构 变 异 远 远 超 过 了 人 们 的 预 计, 其 中 有 很 多 变 异 都 会 造 成 非 常 重 要 的 表 型 改 变 这 项 对 诺 贝 尔 奖 得 主 James Watson 基 因 组 进 行 测 序 的 项 目 和 其 它 相 关 研 究, 一 起 使 得 人 类 基 因 多 样 性 (human genetic variation) 这 一 科 学 命 题 成 为 了 科 学 (Science) 杂 志 的 年 度 重 大 科 技 突 破 1.2 Illumina 测 序 仪 Illumina 测 序 仪 通 常 也 被 称 作 Solexa 测 序 仪 (Illumina 测 序 仪 的 特 点 见 表 5) 它 适 用 于 采 用 各 种 方 法 制 备 的 DNA 文 库, 文 库 中 DNA 片 段 可 以 长 达 数 百 bp, 并 可 通 过 桥 式 PCR 来 扩 增 模 板 片 段 ( 图 5b) 在 桥 式 PCR 反 应 中, 正 向 引 物 和 反 向 引 物 都 被 通 过 一 个 柔 性 接 头 (flexible linker) 固 定 在 固 相 载 体 (solid substrate) 上 经 过 PCR 反 应, 所 有 的 模 板 扩 增 产 物 就 都 被 固 定 到 了 芯 片 上 固 定 的 位 置 值 得 注 意 的 是,Illumina 测 序 仪 使 用 的 桥 式 PCR 与 传 统 的 桥 式 PCR 有 所 不 同, 它 会 交 替 使 用 Bst 聚 合 酶 进 行 延 伸 反 应 以 及 使 用 甲 酰 胺 (formamide) 进 行 变 性 反 应 这 样, 经 过 桥 式 PCR 扩 增 之 后, 也 会 在 固 相 载 体 上 形 成 一 个 个 的 模 板 克 隆 一 块 芯 片 的 8 条 独 立 泳 道 上 每 一 条 泳 道 都 可 以 容 纳 数 百 万 的 模 板 克 隆, 这 样 一 次 就 可 以 同 时 对 8 个 不 同 的 文 库 进 行 测 序 经 过 上 述 PCR 扩 增 步 骤 之 后, 所 有 的 模 板 都 被 线 性 化 处 理 (linearization) 而 形 成 单 链 模 板, 接 着 与 测 序 引 物 退 火 杂 交 随 后 使 用 修 饰 的 DNA 聚 合 酶 和 四 种 核 苷 酸 混 合 试 剂 进 行 单 碱 基 延 伸 测 序 反 应 ( 图 6b) 这 些 核 苷 酸 试 剂 都 经 过 两 种 方 式 处 理 过, 它 们 都 是 可 逆 的 终 止 子 (reversible terminator) 这 些 核 苷 酸 的 3 羟 基 端 都 有 一 个 可 被 化 学 法 切 除 的 基 团, 这 样 每 一 次 反 应 都 只 会 掺 入 一 个 核 苷 酸, 同 时 每 种 核 苷 酸 都 标 记 上 了 可 被 化 学 法 切 除 的 不 同 颜 色 的 荧 光 基 团, 以 标 识 每 种 碱 基 经 过 一 轮 单 碱 基 掺 入 反 应 采 集 到 信 号 之 后, 就 可 以 通 过 化 学 方 法 切 除 上 述 被 掺 入 核 苷 酸 上 标 记 的 两 个 基 团, 然 后 就 能 够 继 续 掺 入 下 一 个 核 苷 酸, 重 复 测 序 反 应 了 这 种 测 序 方 法 对 36bp 长 度 的 序 列 测 序 准 确 率 是 非 常 高 的, 不 过 如 果 处 理 更 长 的 序 列, 准 确 率 就 会 有 所 降 低 了 表 5 Illumina 测 序 仪 的 特 点 对 于 检 测 同 聚 物 来 说,Illumina 测 序 仪 要 比 454 测 序 仪 好 很 多 ; Illumina 测 序 仪 的 平 均 出 错 率 在 1%~1.5%, 不 过 可 以 通 过 质 量 优 化 将 错 误 率 降 低 到 不 到 0.1%; 与 其 它 测 序 仪 一 样, 经 过 改 进 之 后,Illumina 测 序 仪 也 能 进 行 配 对 测 序 (mate-paired read), 比 如 每 一 次 测 序 都 能 同 时 对 两 条 不 同 的 模 板 进 行 测 序, 各 获 得 其 中 长 约 36bp 的 序 列 信 息 ; Illumina 测 序 仪 在 测 序 长 度 方 面 有 所 缺 陷, 这 是 因 为 它 存 在 下 列 诸 如 被 掺 入 核 苷 酸 上 标 记 的 荧 光 基 团 或 者 终 止 基 团 切 除 不 完 全 等 原 因 导 致 测 序 信 号 发 生 了 衰 减 (decay) 和 相 移 (dephasing); Illumina 测 序 仪 在 检 测 碱 基 替 换 突 变 时 最 易 出 错, 其 次 是 检 测 插 入 或 缺 失 突 变 时 13

11 生 命 奥 秘 a b 图 5 克 隆 扩 增 模 板 片 段 (a) 在 454 测 序 仪 Polonator 测 序 仪 以 及 SOLiD 测 序 仪 中 广 泛 用 来 扩 增 模 板 片 段 的 微 乳 液 PCR 技 术 示 意 图 首 先, 体 外 构 建 好 的 两 端 连 接 有 接 头 ( 如 图 中 金 色 和 绿 色 所 示 ) 的 DNA 文 库 在 一 个 油 包 水 (water-in-oil) 的 乳 液 环 境 中 经 PCR 扩 增, 由 于 此 处 只 使 用 了 一 对 针 对 接 头 的 引 物 ( 有 一 条 PCR 引 物 的 5 端 被 固 定 在 微 珠 表 面 ), 因 此 进 行 的 是 多 模 板 PCR(multi-template PCR) 而 不 是 多 重 PCR(multiplex PCR) 另 外, 由 于 在 模 板 浓 度 还 很 低 的 情 况 下, 大 部 分 包 裹 着 微 珠 的 微 乳 液 滴 中 最 多 只 能 有 一 条 引 物, 因 此 经 过 PCR 扩 增 之 后, 每 一 个 微 珠 表 面 上 都 只 会 连 接 上 一 种 模 板 分 子 的 扩 增 产 物 打 破 微 乳 液 滴, 将 这 些 携 带 有 大 量 模 板 分 子 的 微 珠 收 集 起 来 制 成 芯 片 (b)illumina 测 序 仪 中 使 用 的 桥 式 PCR 技 术 示 意 图 首 先, 体 外 构 建 好 的 两 端 连 接 有 接 头 ( 如 图 中 金 色 和 绿 色 所 示 ) 的 DNA 文 库 经 由 密 集 固 定 在 载 体 上 的 引 物 ( 引 物 的 5' 端 借 助 一 个 柔 性 接 头 固 定 在 载 体 上 ) 进 行 PCR 扩 增 这 样 扩 增 产 物 也 会 被 固 定 在 载 体 上,PCR 反 应 结 束 之 后, 每 一 个 模 板 克 隆 都 包 含 有 1,000 条 模 板 产 物 仔 细 检 测 模 板 浓 度 既 可 以 保 证 在 芯 片 上 最 大 限 度 地 携 带 模 板, 同 时 也 能 避 免 模 板 过 于 拥 挤 的 现 象 发 生 1.3 AB SOLiD 测 序 仪 AB SOLiD 测 序 仪 可 以 对 由 任 何 方 法 制 成 的 DNA 文 库 进 行 测 序 AB SOLiD 测 序 仪 有 一 个 极 大 的 特 点 就 是 能 够 将 富 集 模 板 片 段 的 微 珠 在 芯 片 上 进 行 高 度 可 控 的 任 意 排 列 AB SOLiD 测 序 仪 也 是 使 用 如 图 5a 中 所 示 的 微 乳 液 PCR 方 法 扩 增 模 板 片 段 的, 不 过, 它 这 里 使 用 的 是 直 径 只 有 1μm 的 小 磁 珠 PCR 扩 增 反 应 结 束 之 后, 微 乳 液 滴 被 打 破, 小 磁 珠 被 富 集 起 来 固 定 到 固 态 平 板 上, 制 成 高 密 度 测 序 芯 片 后 面 的 合 成 测 序 法 由 DNA 连 接 酶 而 非 DNA 聚 合 酶 完 成 首 先, 通 用 引 物 与 模 板 片 段 两 端 的 接 头 序 列 互 补 结 合, 然 后 连 接 酶 将 一 个 被 荧 光 标 记 的 8bp 长 的 核 酸 探 针 片 段 (fluorescently labeled octamers) 连 接 到 引 物 末 端 ( 图 6c) 这 段 8bp 长 的 核 酸 探 针 片 段 是 经 过 设 计 的, 比 如 其 中 第 五 位 碱 基 上 就 标 记 了 荧 光 连 接 反 应 完 成 之 后, 就 可 以 采 集 荧 光 图 像, 然 后 在 第 五 位 碱 基 和 第 六 位 碱 基 之 间 切 断, 去 掉 荧 光 标 签 如 此 反 复, 就 可 以 获 得 每 间 隔 四 个 碱 基 的 第 五 号 碱 基 的 确 切 信 息, 比 如 第 5 号 碱 基 第 10 号 碱 基 第 15 号 碱 基 以 及 第 20 号 碱 基 等 等 经 过 几 轮 这 样 的 循 环 之 后, 已 经 获 得 延 伸 的 引 物 会 变 性 脱 落, 再 重 新 结 合 上 新 的 引 物 从 头 开 始 新 一 轮 测 序, 不 过 这 一 次 可 能 获 得 的 是 第 4 号 碱 基 第 9 号 碱 基 第 14 号 碱 基 以 及 第 19 号 碱 基 的 信 息 我 们 可 以 使 用 不 同 长 度 的 引 物 (+1 或 者 -1) 或 者 使 用 在 不 同 位 点 ( 比 如 第 2 号 碱 基 ) 标 记 荧 光 的 8bp 核 酸 探 针 片 段 达 到 这 个 目 的 如 此 反 复, 最 终 就 能 获 得 整 条 模 板 片 段 的 完 整 序 列 信 息 AB SOLiD 测 序 仪 还 有 一 个 特 点 就 是 使 用 了 双 碱 基 编 码 技 术 (two-base encoding), 该 技 术 具 有 误 差 校 正 功 能, 因 为 它 是 通 过 两 个 碱 基 来 对 应 一 个 荧 光 信 号 而 不 是 传 统 的 一 个 碱 基 对 应 一 个 荧 光 信 号, 这 样 每 一 个 位 点 都 会 被 检 测 两 次, 因 此 出 错 率 明 显 降 低 Polonator 测 序 仪 是 一 个 和 AB SOLiD 测 序 仪 比 较 相 似 的 产 品, 因 为 它 也 运 用 了 J.S 等 人 和 哈 佛 大 学 Church 研 究 小 组 开 发 的 部 分 系 统 Polonator 测 序 仪 同 样 也 使 用 微 乳 液 PCR 法 扩 增 模 板 片 段, 使 用 连 接 酶 法 测 序 不 过,Polonator 测 序 仪 的 价 格 要 比 其 它 第 二 代 测 序 仪 低 得 多 而 且 更 重 要 的 是,Polonator 测 序 仪 是 一 个 开 源 的 设 备, 用 户 可 以 通 过 自 己 编 程 设 计 出 最 适 合 自 己 的 测 序 仪 不 过,Polonator 测 序 仪 目 前 可 测 序 的 长 度 还 非 常 有 限 14

12 值 得 注 意 的 是,454 测 序 仪 SOLiD 测 序 仪 以 及 Polonator 测 序 仪 还 都 存 在 一 个 共 同 的 不 足, 那 就 是 微 乳 液 PCR 技 术 实 在 是 太 过 麻 烦 并 且 对 实 验 操 作 的 技 术 要 求 较 高 不 过 从 另 一 方 面 来 说, 使 用 仅 仅 只 有 1μm 大 小 的 磁 珠 构 成 的 高 密 度 测 序 芯 片 进 行 测 序 ( 不 论 是 使 用 聚 合 酶 法 连 接 酶 法, 还 是 其 它 的 生 化 方 法 ) 是 最 有 可 能 实 现 的 高 通 量 测 序 方 法 因 为 1μm 是 衍 射 技 术 (diffraction) 所 能 分 辨 的 极 限 大 小 了 另 一 方 面, 最 近 报 道 的 使 用 1μm 磁 珠 进 行 高 分 辨 率 芯 片 点 样 技 术 的 突 破, 使 我 们 有 望 实 现 每 个 测 序 模 板 一 个 像 素 (one pixel per sequencing feature) 的 愿 望 1.4 HeliScope 测 序 仪 a HeliScope 测 序 仪 是 由 Quake 团 队 设 计 开 发 的, 它 实 际 上 也 是 一 种 循 环 芯 片 测 序 设 备 不 过,HeliScope 测 序 仪 最 大 的 特 点 是 无 需 对 测 序 模 板 进 行 扩 增, 它 使 用 了 一 种 高 灵 敏 度 的 荧 光 探 测 仪 直 接 对 单 链 DNA 模 板 进 行 合 成 法 测 序 首 先, 将 基 因 组 DNA 切 割 成 随 机 的 小 片 段 DNA 分 子, 并 且 在 每 个 片 段 末 端 加 上 poly-a 尾 然 后 通 过 poly-a 尾 和 固 定 在 芯 片 上 的 poly-t 杂 交, 将 待 测 模 板 固 定 到 芯 片 上, 制 成 测 序 芯 片 最 后 借 助 聚 合 酶 将 荧 光 标 记 的 单 核 苷 酸 掺 入 到 引 物 上 ( 图 6d) 采 集 荧 光 信 号, 切 除 荧 光 标 记 基 团, 进 行 下 一 轮 测 序 反 应, 如 此 反 复, 最 终 获 得 完 整 的 序 列 信 息 根 据 最 近 的 报 道, 经 过 数 百 轮 这 种 单 碱 基 延 伸 可 以 获 得 25bp 或 更 长 的 测 序 长 度 HeliScope 测 序 仪 的 其 它 特 点 见 表 6 -[ 微 珠 ] 焦 磷 酸 + 腺 苷 酰 硫 酸 1 datpαs, 底 物, 腺 苷 三 磷 酸 双 磷 酸 酶 洗 涤 2 dgtp, 底 物, 腺 苷 三 磷 酸 双 磷 酸 酶 洗 涤 ATP + 荧 光 素 3 dctp, 底 物, 腺 苷 三 磷 酸 双 磷 酸 酶 洗 涤 4 dttp, 底 物, 腺 苷 三 磷 酸 双 磷 酸 酶 洗 涤 氧 化 荧 光 素 + 发 光 b -[ 载 体 表 面 ] 1 荧 光 基 团 1-dATP-( 阻 碍 物 基 团 )+ 荧 光 基 团 2-dGTP-( 阻 碍 物 基 团 )+ 荧 光 基 团 3-dCTP-( 阻 碍 物 基 团 )+ 荧 光 基 团 4-dTTP-( 阻 碍 物 基 团 ) 2 四 个 通 道 中 荧 光 成 像 3 化 学 法 切 除 荧 光 标 记 基 团 及 阻 碍 物 终 止 基 团 c -[ 微 珠 ] 1 连 接 上 特 定 的 8bp 探 针 2 采 集 信 号 切 除, 重 复 5 次 3 重 新 开 始 新 一 轮 测 序 d [ 载 体 表 面 ]- 1 Cy5-dATP, 采 集 信 号, 切 除 荧 光 标 记 2 Cy5-dGTP, 采 集 信 号, 切 除 荧 光 标 记 3 Cy5-dCTP, 采 集 信 号, 切 除 荧 光 标 记 4 Cy5-dTTP, 采 集 信 号, 切 除 荧 光 标 记 15

13 生 命 奥 秘 图 6 循 环 芯 片 测 序 技 术 示 意 图 (a)454 测 序 仪 使 用 的 方 法, 经 微 乳 液 PCR 法 扩 增 后, 携 带 有 大 量 模 板 分 子 的 微 珠 被 放 置 到 芯 片 上 的 微 孔 中 随 后 使 用 焦 磷 酸 法 测 序, 每 一 轮 测 序 反 应 都 会 掺 入 一 个 核 苷 酸, 随 后 加 入 反 应 试 剂 荧 光 素 和 5' 腺 苷 酰 硫 酸, 这 样 在 每 一 个 小 孔 中 每 当 有 聚 合 酶 将 核 苷 酸 掺 入 时 都 会 发 光 最 后 用 腺 苷 三 磷 酸 双 磷 酸 酶 洗 涤 去 掉 多 余 的 核 苷 酸 (b) Solexa 测 序 仪 使 用 桥 式 PCR 直 接 在 芯 片 上 进 行 模 板 片 段 扩 增, 然 后 同 时 加 入 四 种 经 过 修 饰 的 脱 氧 核 苷 酸, 每 一 个 核 苷 酸 都 携 带 一 种 荧 光 基 团 和 一 个 可 被 去 除 的 终 止 基 团 经 过 修 饰 的 DNA 聚 合 酶 催 化 引 物 延 伸 测 序 反 应 采 集 图 像, 然 后 切 除 荧 光 标 记 基 团 和 终 止 基 团, 重 复 上 述 反 应, 完 成 测 序 (c)solid 测 序 仪 和 Polonator 测 序 仪 使 用 微 乳 液 PCR 法 扩 增 模 板 片 段, 然 后 吸 附 有 大 量 扩 增 片 段 的 直 径 1μm 的 磁 珠 被 制 成 高 密 度 测 序 芯 片 接 着 使 用 连 接 酶 而 不 是 聚 合 酶 测 序 法 完 成 测 序 在 SOLiD 测 序 仪 中, 每 一 次 反 应 都 会 在 引 物 末 端 加 上 一 个 荧 光 标 记 的 8bp 的 探 针, 在 探 针 中 央 的 两 个 碱 基 上 ( 而 不 是 1 个 碱 基, 即 双 碱 基 编 码 技 术 ) 标 记 有 荧 光 基 团, 探 针 被 连 接 上 之 后 发 出 荧 光, 随 后 荧 光 基 团 部 分 (zzz) 被 切 除, 重 新 进 行 下 一 轮 反 应 经 过 几 轮 这 样 的 测 序 反 应 之 后 可 得 到 一 段 不 连 续 的 碱 基 序 列 然 后 变 性 去 掉 已 被 延 伸 的 引 物, 重 新 结 合 上 新 的 引 物 进 行 新 一 轮 测 序 反 应 (d)heliscope 测 序 仪, 单 核 酸 分 子 不 经 扩 增 直 接 测 序 Poly-A 尾 被 添 加 到 DNA 文 库 片 段 末 端, 通 过 与 固 定 在 芯 片 上 的 Poly-T 互 补 杂 交 将 模 板 链 固 定 到 芯 片 上, 制 成 测 序 芯 片 模 板 上 标 记 有 Cy3 以 标 识 出 它 们 在 芯 片 上 的 位 置 DNA 聚 合 酶 将 荧 光 标 记 的 单 核 苷 酸 掺 入 到 引 物 上, 采 集 荧 光 信 号 获 得 序 列 信 息, 切 除 荧 光 基 团, 重 复 上 述 步 骤, 完 成 测 序 表 6 HeliScope 测 序 仪 的 其 它 几 项 特 点 它 和 454 测 序 仪 一 样, 测 序 是 不 同 步 的, 即 每 条 模 板 测 序 的 程 度 不 同, 有 快 有 慢, 测 序 速 度 要 依 据 每 条 模 板 本 身 的 序 列 而 定, 比 如 在 有 些 循 环 中 有 的 模 板 序 列 就 没 有 相 应 的 合 适 碱 基 掺 入 不 过, 由 于 使 用 的 是 单 分 子 测 序, 因 此 也 不 存 在 相 移 问 题, 所 以 也 不 会 因 为 相 移 问 题 出 现 错 误 ; 在 荧 光 标 记 的 核 苷 酸 上 没 有 终 止 基 团 比 如 在 454 测 序 仪 中, 同 聚 物 问 题 是 一 个 非 常 重 要 的 问 题 而 在 HeliScope 测 序 仪 中 则 可 以 很 容 易 地 通 过 控 制 每 一 轮 测 序 反 应 中 碱 基 加 入 反 应 的 速 度 来 解 决 这 个 问 题 而 且,Harris 等 人 还 提 到 在 产 生 同 聚 物 时 连 续 掺 入 的 标 记 有 荧 光 的 碱 基 之 间 会 发 生 淬 灭 (quenching) 现 象, 这 样 就 无 法 正 确 分 辨 同 聚 物 的 长 度 具 体 是 多 长, 是 A AA 还 是 AAA; 可 以 通 过 两 步 法, 即 测 序 两 次 来 提 高 测 序 的 准 确 性 这 是 由 于 在 测 序 过 程 中 新 合 成 的 链 同 样 通 过 引 物 固 定 在 芯 片 上, 所 以 可 以 变 性 使 新 合 成 的 链 与 模 板 链 分 离, 重 新 以 反 方 向 再 次 测 序, 这 样 在 两 次 测 序 的 phred 样 质 量 值 ( 小 词 典 3) 接 近 30; 由 于 大 量 的 未 标 记 碱 基 不 发 荧 光 碱 基 或 污 染 碱 基 掺 入, 所 以 使 用 HeliScope 测 序 仪 检 测 缺 失 突 变 的 出 错 率 最 高, 一 次 检 测 误 差 率 为 2%~7%, 两 次 检 测 误 差 率 为 0.2%~1% 不 过, 检 测 碱 基 替 换 突 变 的 误 差 率 非 常 低, 一 次 检 测 误 差 率 为 0.01%~1%, 两 次 检 测 误 差 率 为 0.001%, 这 是 目 前 所 有 测 序 仪 当 中 最 高 的 准 确 率 原 文 检 索 :Jonathan M Rothberg & John H Leamon. (2008) The development and impact of 454 sequencing. Nature Biotechnology, 26(10): 筱 玥 / 编 译 2. 用 于 处 理 新 一 代 测 序 技 术 数 据 的 软 件 和 标 准 各 种 新 一 代 测 序 仪 的 飞 速 发 展 面 临 着 一 个 极 其 重 要 的 问 题, 那 就 是 生 物 信 息 学 问 题, 这 些 问 题 包 括 序 列 质 量 评 分 (sequence quality scoring) 问 题 序 列 比 对 问 题 序 列 组 装 问 题 数 据 发 布 问 题 等 下 面 将 逐 个 进 行 讨 论 16

14 2.1 序 列 质 量 问 题 目 前, 序 列 质 量 评 分 问 题 是 受 到 广 泛 关 注 的 一 个 问 题 造 成 这 种 现 象 的 原 因 主 要 是 因 为 所 有 新 一 代 测 序 仪 的 测 序 质 量 都 不 高, 而 且 不 同 的 序 列 情 况 都 有 各 自 的 误 差 率 随 着 新 一 代 测 序 仪 产 品 的 不 断 成 熟, 在 临 床 及 科 研 工 作 中 的 应 用 范 围 越 来 越 广, 它 们 的 测 序 质 量 也 就 变 得 重 要 起 来, 而 且 我 们 也 需 要 对 各 个 测 序 仪 的 测 序 质 量 有 一 个 清 晰 的 可 靠 的 评 价 标 准 由 于 这 个 问 题 还 只 是 刚 刚 出 现, 所 以 我 们 有 机 会 设 立 一 个 全 球 统 一 的 标 准 化 的 评 价 体 系 对 目 前 现 有 的 以 及 将 来 即 将 出 现 的 测 序 仪 进 行 评 价 我 们 希 望 避 免 再 次 发 生 类 似 过 去 几 个 芯 片 厂 家 之 间 进 行 数 据 比 较 的 尴 尬 局 面 对 于 测 序 仪 的 应 用 范 围 进 行 标 准 化 的 质 量 评 价 也 是 有 好 处 的 比 如 评 价 从 头 测 序 的 质 量 评 价 测 序 结 果 与 参 考 序 列 的 相 似 度 评 价 测 序 仪 发 现 突 变 以 及 多 态 性 的 能 力 以 及 对 测 序 仪 在 进 行 大 规 模 测 序 项 目 研 究 时 的 质 量 可 靠 性 进 行 评 价 等 表 7 列 出 了 几 项 应 该 被 重 点 评 价 的 项 目 表 7 应 该 被 重 点 评 价 的 项 目 测 序 仪 技 术 的 可 重 复 性 ; 测 序 仪 的 准 确 性, 例 如 phred 样 质 量 值 ; 测 序 仪 系 统 误 差 模 式 ; 在 标 签 计 数 应 用 项 目 中 测 序 仪 真 实 比 值 的 偏 差 这 些 质 量 数 据 都 应 该 以 一 种 简 单 标 准 化 的 方 式 包 含 在 测 序 结 果 中 现 在 所 有 的 测 序 仪 器 生 产 商 也 都 在 他 们 的 测 序 报 告 中 加 入 了 测 序 质 量 信 息, 消 费 者 可 以 借 此 对 数 据 进 行 交 叉 比 较, 甚 至 还 有 可 能 各 取 所 长, 将 不 同 测 序 仪 的 测 序 结 果 整 合 起 来, 获 得 最 佳 的 测 序 结 果 目 前, 旨 在 从 短 片 段 测 序 结 果 中 发 现 多 态 性 以 及 突 变 位 点 的 重 测 序 项 目 经 常 会 依 靠 主 要 投 票 机 制 (majority voting scheme) 该 方 法 易 于 操 作, 但 是 容 易 出 错, 假 阴 性 率 较 高 诸 如 Brockman 小 组 和 Quinlan 小 组 开 发 的, 更 多 更 好 的 用 于 发 现 单 核 苷 酸 多 态 性 的 方 法 是 将 误 差 率 与 单 个 碱 基 信 号 联 系 起 来, 即 误 差 率 与 测 序 质 量 和 序 列 内 容 相 关, 这 样 就 能 获 得 更 准 确 的 结 果 我 们 估 计, 像 phred 样 质 量 值 之 类 的 评 价 体 系 以 及 第 三 方 算 法 的 不 断 发 展, 最 终 一 定 会 诞 生 一 个 很 好 的 发 现 多 态 性 的 工 具 2.2 用 于 分 析 数 据 的 软 件 以 及 生 物 信 息 学 工 具 虽 然 这 些 软 件 和 工 具 都 还 没 有 完 全 商 业 化, 但 我 们 还 是 能 获 得 一 些 软 件 用 来 分 析 新 一 代 测 序 仪 的 测 序 结 果 ( 表 8) 这 些 软 件 和 工 具 的 功 能 主 要 集 中 在 4 个 方 面 ( 表 9) 序 列 比 对 和 组 装 是 一 个 颇 受 关 注 的 问 题 虽 然 BLAST 和 BLAT 等 序 列 比 对 工 具 对 于 长 片 段 的 序 列 比 对 来 说 非 常 有 用, 但 是 它 们 不 适 合 新 一 代 测 序 仪 获 得 的 短 片 段 序 列 因 此, 有 大 量 的 针 对 短 测 序 片 段 的 比 对 工 具 出 现, 这 些 工 具 中 允 许 错 配 或 者 空 隙 出 现 这 些 工 具 中 有 些 借 鉴 了 非 常 成 熟 的 序 列 比 对 算 法, 例 如 Smith-Waterman 算 法 等, 不 过 还 是 有 很 多 新 的 专 门 针 对 短 序 列 片 段 的 算 法 出 现 比 如 SOAP 就 是 这 样 一 种 新 型 算 法, 这 个 软 件 包 能 非 常 有 效 地 进 行 有 空 隙 或 者 无 空 隙 的 序 列 比 对 该 软 件 包 使 用 了 一 种 内 存 密 集 种 子 (memory-intensive seed) 算 法 和 查 表 格 (look-up table) 算 法 来 加 快 比 对 速 度, 同 时 能 够 对 最 容 易 出 错 的 3' 端 序 列 进 行 反 复 调 整 其 它 用 来 加 速 比 对 过 程 的 方 法 还 包 括 字 节 编 码 (bit encoding) 技 术 该 技 术 能 将 序 列 信 息 压 缩 成 计 算 机 信 息, 这 样 更 利 于 计 算 机 管 理 和 分 析 越 来 越 多 的 比 对 软 件 在 进 行 比 对 时 开 始 考 虑 数 据 质 量, 比 如 能 处 理 Solexa 测 序 仪 测 序 结 果 和 SOLiD 测 序 仪 测 序 结 果 的 MAQ 软 件, 以 及 能 用 最 新 的 字 符 空 隙 转 化 成 彩 色 空 17

15 生 命 奥 秘 隙 (color-space to letter-space) 的 Smith-Waterman 算 法 对 SOLiD 测 序 仪 的 双 碱 基 编 码 测 序 结 果 进 行 分 析 的 SHRiMP 工 具 ( 表 8 可 用 于 分 析 短 片 段 序 列 数 据 的 生 物 信 息 学 工 具 软 件 名 称 软 件 功 能 下 载 地 址 Cross_match 比 对 ELAND 比 对 Exonerate 比 对 MAQ 比 对 及 变 异 检 测 Mosaik 比 对 RMAP 比 对 SHRiMP 比 对 SOAP 比 对 SSAHA2 比 对 SXOligoSearch 比 对 ALLPATHS 序 列 组 装 Edena 序 列 组 装 Euler-SR 序 列 组 装 SHARCGS 序 列 组 装 SHRAP 序 列 组 装 SSAKE 序 列 组 装 VCAKE 序 列 组 装 Velvet 序 列 组 装 PyroBayes 碱 基 识 别 PbShort 突 变 检 测 ssahasnp 突 变 检 测 表 9 表 8 中 的 软 件 和 工 具 的 主 要 功 能 将 测 序 结 果 与 参 考 序 列 比 对 ; 进 行 碱 基 识 别 以 及 发 现 多 态 性 ; 将 配 对 测 序 结 果 或 非 配 对 测 序 结 果 从 头 组 装 ; 基 因 组 浏 览 和 注 释 和 序 列 比 对 算 法 的 进 展 情 况 不 同, 如 何 将 相 对 低 质 量 的 短 片 段 序 列 从 头 组 装 起 来 还 是 一 大 难 题 不 过, 已 经 有 好 几 种 组 装 工 具 开 始 投 入 使 用 了 对 于 这 种 短 片 段 序 列 的 从 头 组 装 工 作 来 说, 配 对 序 列 对 于 整 个 工 作 的 成 功 与 否 影 响 最 大, 因 此 已 经 有 人 开 始 利 用 配 对 序 列 设 计 新 的 组 装 工 具 了 2.3 序 列 数 据 出 版 发 行 组 织 存 档 原 则 目 前 对 于 如 何 组 织 存 档 以 及 发 布 这 些 新 一 代 测 序 仪 产 生 的 短 片 段 序 列 结 果 正 处 于 热 烈 的 讨 论 之 中, 人 们 希 望 制 定 一 个 类 似 芯 片 试 验 (microarray experiments, 时 制 定 的 MIAME(Minimum 18

16 Information About a Microarray Experiment) 规 则 这 些 早 期 的 工 作 经 验 在 如 何 处 理 包 括 生 物 学 注 释 信 息 临 床 原 始 数 据 关 键 试 验 细 节 ( 比 如 样 品 特 征 样 品 处 理 方 法 ) 在 内 的 元 数 据, 以 及 如 何 处 理 出 版 发 行 这 些 数 据 等 方 面 给 了 我 们 良 好 的 建 议 如 何 对 这 些 新 一 代 测 序 仪 的 测 序 结 果 数 据 进 行 公 共 管 理 也 是 一 个 需 要 探 讨 的 问 题 NCBI 最 近 专 门 为 短 片 段 序 列 建 立 了 数 据 库 Short Read Archive(SRA), 并 同 步 制 定 数 据 提 交 格 式 SRA 数 据 库 不 仅 会 收 集 包 括 实 验 注 释 信 息 试 验 参 数 等 信 息 的 数 据, 而 且 还 会 被 整 合 到 Entrez 查 询 系 统 当 中 目 前 的 工 作 主 要 包 括 开 发 线 上 搜 索 工 具 数 据 图 形 化 工 具, 这 些 工 作 有 望 在 近 期 完 成 3. 新 一 代 测 序 技 术 的 前 景 500 ABI solid 更 短 的 测 序 长 度, 更 低 的 测 序 费 用 更 长 的 测 序 长 度, 更 低 的 测 序 费 用 每 1,000 美 元 能 对 多 少 Mb 的 核 酸 片 段 完 成 测 序 计 数 测 序 项 目 从 头 测 序 项 目 IIIumina 更 短 的 测 序 长 度, 更 低 的 测 序 费 用 更 长 的 测 序 长 度, 更 高 的 测 序 费 用 平 均 测 序 长 度 (bp) 图 7 新 一 代 测 序 仪 的 比 较 情 况 对 两 种 不 同 测 序 仪 从 测 序 长 度 和 测 序 费 用 两 方 面 进 行 比 较 Illumina 公 司 的 Solexa 测 序 仪 和 ABI 公 司 的 SOLiD 测 序 仪 的 测 序 费 用 数 据 和 测 序 长 度 数 据 来 自 许 多 渠 道, 包 括 各 自 生 产 厂 家 的 网 页 和 最 新 的 技 术 资 料 454 公 司 从 2005 年 至 2008 年 上 半 年 的 数 据 反 应 了 它 们 在 测 序 长 度 和 测 序 费 用 方 面 的 进 步 在 2007 年 6 月,James Watson 的 基 因 组 序 列 登 录 到 了 GenBank 数 据 库 当 中, 这 是 第 一 次 使 用 非 Sanger 测 序 法 获 得 了 人 类 个 体 基 因 组 序 列, 并 且 第 一 次 将 个 人 基 因 组 序 列 公 之 于 众 整 个 测 序 过 程 在 两 个 月 之 内 就 完 成 了, 花 费 不 到 100 万 美 元, 这 只 占 耗 时 10 年 之 久 的 人 类 基 因 组 计 划 使 用 经 费 的 千 分 之 一, 同 时 还 是 2007 年 5 月 在 网 上 公 布 结 果 的 Venter 基 因 组 计 划 费 用 的 百 分 之 一 我 们 比 较 了 454 测 序 仪 最 初 的 技 术 参 数 ( 每 次 可 以 获 得 两 千 万 碱 基 序 列, 测 序 长 度 100bp, 准 确 率 96%) 和 用 于 对 James Watson 进 行 测 序 时 的 技 术 参 数 ( 每 次 可 以 获 得 一 亿 碱 基 序 列, 测 序 长 度 250bp, 准 确 率 超 过 99%), 结 果 发 现 摩 尔 定 律 真 的 适 用 于 基 因 组 测 序 领 域 454 测 序 仪 和 其 它 的 新 一 代 测 序 仪 ( 图 7) 一 起, 展 示 出 了 小 型 化 技 术 和 并 行 处 理 技 术 的 威 力, 它 们 提 高 了 处 理 通 量, 降 低 了 测 序 费 用 除 了 引 领 新 一 代 测 序 技 术 的 发 展 之 外,454 公 司 的 研 发 团 队 还 开 发 了 体 外 DNA 文 库 构 建 模 板 扩 增 等 技 术, 而 且 这 些 技 术 现 在 都 已 经 被 市 场 上 其 它 新 一 代 测 序 仪 所 广 泛 使 用 很 快, 19

17 生 命 奥 秘 随 着 计 算 机 技 术 的 飞 速 发 展, 个 体 基 因 组 测 序 的 费 用 将 会 由 100,000 美 元 降 低 到 10,000 美 元, 继 而 降 低 到 1,000 美 元 甚 至 更 低 个 人 基 因 组 时 代 马 上 就 要 到 来 了! 4. 新 一 代 测 序 技 术 与 传 统 测 序 技 术 的 优 缺 点 分 析 从 费 用 角 度 适 用 范 围 和 限 制 性 来 说, 传 统 测 序 仪 和 新 一 代 测 序 仪 之 间 具 有 明 显 的 差 距 因 此, 对 于 每 一 个 具 体 的 项 目 来 说, 都 需 要 仔 细 考 虑, 选 择 出 最 合 适 的 测 序 仪 传 统 的 Sanger 测 序 法 适 用 于 对 kb~mb 长 度 的 DNA 片 段 进 行 的 小 规 模 的 测 序 项 目 Sanger 测 序 法 相 比 新 一 代 测 序 法 而 言 具 有 极 大 的 间 隔 尺 寸 (granularity), 既 能 用 于 大 型 项 目 也 能 用 于 小 型 项 目 虽 然 与 传 统 测 序 仪 相 比, 新 一 代 测 序 仪 在 某 些 方 面 很 明 显 地 处 于 劣 势, 比 如 在 测 序 长 度 和 准 确 率 方 面, 但 即 便 如 此, 在 处 理 大 规 模 的 测 序 项 目 时 大 家 还 是 倾 向 于 选 择 新 一 代 测 序 仪 看 看 新 一 代 测 序 仪 对 以 往 使 用 传 统 测 序 仪 进 行 的 生 殖 细 胞 突 变 和 体 细 胞 突 变 研 究 的 帮 助 就 可 以 认 识 到 它 们 的 作 用 有 多 么 强 大 在 这 项 研 究 里, 使 用 Sanger 测 序 法 除 了 试 剂 这 一 项 费 用 之 外, 其 它 的 费 用 也 远 远 高 过 了 使 用 其 它 新 一 代 测 序 仪 这 些 其 它 费 用 包 括 在 96 孔 板 或 384 孔 板 中 处 理 样 品 的 费 用 电 泳 费 用 大 量 的 生 物 信 息 学 处 理 费 用 以 及 设 备 维 护 人 工 费 用 等 研 究 人 员 最 近 对 100 份 样 品 中 的 100 个 基 因 使 用 传 统 测 序 方 法 究 竟 需 要 花 费 多 少 费 用 进 行 了 一 次 非 正 式 的 调 查, 假 设 每 个 基 因 平 均 由 10 个 外 显 子 组 成, 结 果 发 现 整 体 费 用 在 30 万 美 元 至 100 万 美 元 不 等, 价 格 依 据 测 序 单 位 是 非 盈 利 的 基 因 组 测 序 中 心 还 是 商 业 化 的 测 序 服 务 机 构 而 不 同 很 显 然, 这 么 高 昂 的 费 用 对 于 任 何 一 个 实 验 室 来 说 都 是 难 以 承 受 的 新 一 代 测 序 仪 除 了 能 将 测 序 费 用 降 低 好 几 个 数 量 级 之 外, 它 们 还 具 有 所 需 仪 器 设 备 少 的 优 点, 不 过 新 一 代 测 序 仪 在 后 续 数 据 处 理 方 面 会 碰 到 问 题 各 款 新 一 代 测 序 仪 之 间 也 有 非 常 明 显 的 差 异 ( 表 10), 它 们 都 有 各 自 拿 手 的 绝 活 ( 表 11) 有 一 些 测 序 项 目, 比 如 重 测 序 (resequencing) 对 于 测 序 仪 的 测 序 长 度 要 求 就 没 有 从 头 测 序 的 要 求 高 对 于 需 要 依 靠 标 签 计 数 (tag counting) 的 测 序 项 目, 例 如 在 定 量 分 析 蛋 白 质 与 DNA 之 间 的 相 互 作 用 时, 我 们 就 会 更 加 需 要 能 将 待 测 片 段 分 割 成 尽 量 多 尽 量 小 片 段 的 测 序 方 法 测 序 的 准 确 度 和 各 自 相 对 拿 手 的 项 目, 比 如 是 善 于 发 现 插 入 缺 失 突 变 还 是 善 于 发 现 碱 基 替 换 突 变 也 是 需 要 着 重 考 虑 的 问 题 另 外, 在 进 行 从 头 测 序 或 发 现 结 构 性 变 异 的 研 究 时 使 用 的 配 对 测 序 法 已 经 广 泛 应 用 于 各 种 新 一 代 测 序 仪 当 中 这 时, 这 些 配 对 的 模 板 片 段 在 芯 片 上 的 分 布 情 况, 比 如 相 互 之 间 的 距 离 远 近 等 就 是 需 要 重 点 考 虑 的 问 题 了 表 10 新 一 代 DNA 测 序 平 台 新 一 代 测 序 仪 名 称 模 板 扩 增 方 法 合 成 测 序 方 法 中 使 用 到 的 酶 和 试 剂 测 序 费 用 ( 美 元 )/Mb 设 备 价 格 ( 美 元 / 台 ) 是 否 末 端 配 对 发 生 1 错 误 的 突 变 类 型 测 序 长 度 454 微 乳 液 PCR 聚 合 酶 ( 焦 磷 酸 测 序 ) ~60 500,000 是 插 入 或 缺 失 突 变 250bp Solexa 桥 式 PCR 聚 合 酶 ( 可 被 切 除 的 终 止 基 团 ) ~2 430,000 是 替 换 突 变 36bp SOLiD 微 乳 液 PCR 连 接 酶 ( 由 双 碱 基 编 码 技 术 设 计 的 8bp 长 度 探 ~2 591,000 是 替 换 突 变 35bp 针 ) Polonator 微 乳 液 PCR 连 接 酶 ( 九 聚 物 ) ~1 155,000 是 替 换 突 变 13bp HeliScope 单 个 分 子 检 测 聚 合 酶 ( 非 同 步 延 长 ) ~1 1,350,000 是 缺 失 突 变 30bp 注 :DNA 测 序 领 域 的 快 速 发 展 使 得 对 各 类 测 序 方 法 的 价 格 及 读 长 的 评 估 在 很 短 时 间 内 便 失 去 意 义 Roche Applied Science Illumina 及 Applied Biosystems 公 司 目 前 都 在 不 断 推 出 新 的 产 品 表 中 列 出 的 测 序 费 用 只 是 对 使 用 的 反 应 试 剂 费 用 的 一 个 估 算 测 序 长 度 指 的 是 单 链 长 度 20

18 最 后, 需 要 考 虑 的 当 然 是 价 格 因 素, 各 个 新 一 代 测 序 仪 的 费 用 都 不 相 同, 作 为 消 费 者, 当 然 希 望 各 个 测 序 仪 生 产 厂 家 之 间 的 竞 争 更 加 激 烈 一 点 单 纯 比 较 每 个 碱 基 的 测 序 费 用 是 一 个 不 错 的 选 择 方 法, 不 过 有 时 这 也 会 误 导 我 们, 比 如 准 确 率 更 高 的 方 法 当 然 费 用 会 高 一 些 表 11 新 一 代 测 序 技 术 的 应 用 应 用 范 围 全 基 因 组 测 序 (Complete genome resequencing) 约 化 表 示 测 序 法 (Reduced representation sequencing) 靶 向 再 测 序 (Targeted genomic resequencing) 末 端 配 对 测 序 (Paired end sequencing) 环 境 基 因 组 测 序 (Metagenomic sequencing) 转 录 组 测 序 (Metagenomic sequencing) 小 RNA 测 序 (Small RNA sequencing) 酸 性 亚 硫 酸 盐 标 记 DNA 测 序 (Sequencing of bisulfite-treated DNA) 染 色 质 免 疫 沉 淀 测 序 (ChIP-Seq) 核 酶 片 段 及 测 序 (Nuclease fragmentation and sequencing) 分 子 条 码 (Molecular barcoding) 应 用 举 例 人 类 个 体 基 因 组 多 态 性 及 突 变 的 全 面 检 测 大 规 模 多 态 性 检 测 靶 向 多 态 性 及 突 变 检 测 遗 传 及 获 得 性 结 构 变 异 检 测 传 染 性 及 共 生 菌 群 检 测 定 量 基 因 表 达 及 选 择 性 剪 切 ; 转 录 注 释 ; 转 录 SNPs 或 体 细 胞 突 变 检 测 microrna 表 达 谱 基 因 组 DNA 中 胞 嘧 啶 甲 基 化 模 式 的 测 定 全 基 因 组 蛋 白 质 与 DNA 相 互 作 用 图 谱 核 小 体 定 位 多 个 体 来 源 样 品 的 多 通 路 测 序 5. 总 结 过 去 几 年 间, 新 一 代 测 序 技 术 获 得 了 突 飞 猛 进 的 进 展, 同 时 有 好 几 款 使 用 大 规 模 平 行 循 环 芯 片 测 序 技 术 的 测 序 仪 得 到 了 广 泛 的 应 用 这 几 款 测 序 仪 虽 然 使 用 的 技 术 有 所 差 异, 但 是 在 测 序 数 据 的 质 量 和 数 量 方 面 都 有 着 同 样 的 特 征, 因 此 也 都 面 临 着 同 样 的 试 验 设 计 数 据 分 析 和 注 释 的 问 题 不 过, 这 些 新 一 代 测 序 仪 将 以 往 的 测 序 费 用 降 低 了 好 几 个 数 量 级 鉴 于 此, 以 前 只 有 大 型 测 序 中 心 才 能 够 开 展 的 项 目, 现 在 在 小 型 实 验 室 里 也 能 顺 利 进 行 了 由 于 新 一 代 测 序 仪 的 出 现, 测 序 研 究 领 域 也 开 始 升 温, 有 些 研 究 团 队 正 在 努 力 开 发 新 的 测 序 技 术 希 望 能 够 取 代 现 有 的 新 一 代 测 序 仪 按 照 目 前 的 发 展 速 度, 我 们 很 难 估 计 几 年 之 后 的 情 况 不 过, 能 够 预 计 的 是, 下 下 一 代 或 者 说 是 第 三 代 测 序 仪 一 定 会 像 十 年 前 的 芯 片 技 术 一 样, 迅 速 地 普 及 开 来, 从 而 成 为 常 规 的 技 术 希 望 人 们 不 仅 关 注 测 序 技 术 本 身 的 发 展, 更 加 关 注 如 何 利 用 测 序 技 术 来 揭 开 生 物 学 和 医 学 上 的 众 多 谜 团 原 文 检 索 : Jay Shendure & Hanlee Ji. (2008) Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology, 26(10): Jonathan M Rothberg & John H Leamon. (2008) The development and impact of 454 sequencing. Nature Biotechnology, 26(10): YORK& 筱 玥 / 编 译

19 生 命 奥 秘 22

20 小 词 典 小 词 典 1. Polony 芯 片 该 方 法 是 由 瑞 士 日 内 瓦 雪 兰 诺 制 药 研 究 中 心 的 Eric Kawashima 俄 罗 斯 科 学 院 的 Alexander Chetverin 和 当 时 在 美 国 哈 佛 大 学 的 密 特 拉 共 同 开 发 的 他 们 制 作 出 了 可 排 列 在 载 玻 片 或 凝 胶 分 子 层 上 的 一 个 个 独 立 的 聚 合 酶 群 落, 成 为 polony, 每 一 个 聚 合 酶 群 落 里 都 含 有 一 个 DNA 模 板 分 子, 通 过 PCR 反 应 就 可 以 获 得 大 量 的 模 板 这 些 扩 增 后 的 聚 合 酶 群 落 就 像 菌 落 一 样 一 个 个 散 布 在 载 玻 片 或 凝 胶 分 子 层 上, 成 为 polony 芯 片 每 一 个 polony 直 径 约 为 1μm, 一 个 芯 片 上 可 以 承 载 数 十 亿 个 聚 合 酶 群 落 2. 元 基 因 组 (metagenomics) 元 基 因 组 又 称 环 境 基 因 组 学, 是 指 同 时 被 研 究 的 整 个 微 生 物 群 落 的 DNA 3. Phred 样 质 量 值 (Phred-like quality scores) Phred 样 质 量 值 最 初 是 被 定 义 用 来 衡 量 自 动 DNA 测 序 质 量 的 Phred 样 质 量 值 被 广 泛 用 来 衡 量 DNA 测 序 仪 的 测 序 质 量 好 坏, 并 且 被 用 来 比 较 不 同 测 序 方 法 之 间 的 效 率 高 低 Phred 样 质 量 值 在 多 少 个 碱 基 中 掺 入 1 个 错 误 碱 基 数 测 序 准 确 率 % % 30 1, % 40 10, % , % 四 新 型 纳 米 孔 测 序 技 术 新 型 纳 米 孔 测 序 法 (nanopore sequencing) 是 采 用 电 泳 技 术, 借 助 电 泳 驱 动 单 个 分 子 逐 一 通 过 纳 米 孔 来 实 现 测 序 的 由 于 纳 米 孔 的 直 径 非 常 细 小, 仅 允 许 单 个 核 酸 聚 合 物 通 过, 因 而 可 以 在 此 基 础 上 使 用 多 种 方 法 来 进 行 高 通 量 检 测 此 外, 纳 米 级 别 的 孔 径 保 证 了 检 测 具 有 良 好 的 持 续 性, 所 以 测 序 的 准 确 度 非 常 高 对 于 长 达 1,000 个 碱 基 的 单 链 DNA 分 子 RNA 分 子 或 者 更 短 的 核 酸 分 子 而 言, 根 本 无 需 进 行 扩 增 或 标 记 就 可 以 使 用 纳 米 孔 测 序 法 进 行 检 测, 这 使 得 便 宜 快 速 地 进 行 DNA 测 序 成 为 可 能 如 果 对 现 有 纳 米 孔 测 序 法 进 行 进 一 步 发 展 和 改 进, 那 么 它 将 有 望 成 为 第 三 代 测 序 技 术 ( 也 可 称 为 下 下 一 代 测 序 技 术 ), 从 而 帮 助 人 们 实 现 24 小 时 内 只 花 费 1,000 美 元 完 成 二 倍 体 哺 乳 动 物 基 因 组 测 序 这 一 目 标 一 个 盛 满 电 解 质 溶 液 的 容 器 被 一 纳 米 孔 膜 隔 成 两 半, 如 果 施 以 比 较 小 的 电 压, 如 约 100mV 电 压, 就 能 使 用 标 准 的 电 生 理 检 测 手 段 测 量 通 过 纳 米 孔 的 电 流 大 小 很 多 生 物 电 通 道 的 开 关 都 是 靠 小 肽 段 分 子 是 否 堵 塞 通 道 来 实 现 的 基 于 这 个 事 实, 加 州 大 学 圣 克 鲁 兹 分 校 (University of California Santa Cruz, UCSC) 的 Deamer 和 哈 佛 大 学 (Harvard University) 的 George Church 都 不 约 而 同 地 提 出 一 个 构 想 : 如 果 DNA 分 子 或 者 RNA 分 子 也 能 堵 塞 某 个 通 道, 那 么 应 该 可 以 运 用 上 述 方 法 来 检 测 电 流 接 下 来,Deamer 和 Branton 等 人 证 明 了 单 链 DNA 和 RNA 分 子 能 通 过 蛋 白 质 组 成 的 孔 道, 并 且 能 检 测 到 它 们 通 过 这 种 纳 米 级 孔 道 时 所 造 成 的 电 流 改 变 ( 图 8a) 他 们 使 用 的 孔 道 蛋 白 是 金 黄 色 葡 萄 球 菌 α 溶 血 素 (Staphylococcus aureus toxin, α-hemolysin) 这 种 蛋 白 以 前 曾 被 Bayley 小 组 用 作 生 物 传 感 器 Bayley 小 组 发 现,α 溶 血 素 蛋 白 非 常 稳 23