急性心肌梗死患者血清循环 mir-214 水平及其与冠状动脉病变范围的关系汪雁归, 等 363 ABSTRACT Objective: To examine the circulating levels of mir-214 in acute myocardial infarction (AMI)

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1 362 中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 15, (4) DOI: /j.issn 急性心肌梗死患者血清循环 mir-214 水平及其与冠状动脉病变范围的关系 汪雁归 1, 黄佳 2 3, 杨天伦 (1. 湖南省人民医院老年病科, 长沙 ;2. 中南大学湘雅二医院 ICU, 长沙 ; 3. 中南大学湘雅医院心内科, 长沙 ) [ 摘要 ] 目的 : 了解急性心肌梗死 (acute myocardial infarction,ami) 患者血清中循环 mir-214 表达水平及其与冠状动脉病变范围的关系 方法 : 收集 11 年 9 月至 12 年 1 月在中南大学湘雅医院心内科住院的 AMI 患者 45 例 (AMI 组 ), 并选择同时期在中南大学湘雅医院体检中心体检的 例健康人员为对照组 AMI 组按冠状动脉病变的范围又分为单支 双支和三支病变组 (n=,13,12) 提取各组人员入院时血清中总 RNA, 并行荧光定量 PCR 检测循环 mir-214 表达水平, 酶联免疫吸附法 (enzyme-linked immunosorbent assay,elisa) 检测患者空腹血浆中胎盘生长因子 (placental growth factor,plgf) 分泌水平 比较不同冠状动脉病变支数组间循环 mir-214 和 PLGF 水平, 并分析上述指标与 AMI 病变范围的相关性 结果 :AMI 各亚组血清中循环 mir-214 水平低于对照组, 且病变范围越广下降水平越明显, 各组间对比差异均有统计学意义 ( 均 P<0.05);AMI 各亚组血浆中 PLGF 表达水平高于对照组, 且随病变范围增大表达水平升高越明显, 各组间对比差异均有统计学意义 ( 均 P<0.05) AMI 组血清中循环 mir-214 水平与血浆中 PLGF 水平呈负相关 (r= 0.588,P<0.01) 结论:AMI 组循环 mir-214 水平显著降低, 且它与 AMI 的病变范围存在相关性 循环 mir-214 有可能作为 AMI 早期诊断和预后的生物学标志物 [ 关键词 ] 循环 mir-214; 胎盘生长因子 ; 急性心肌梗死 ; 相关性 Circulating mir-214 level and its correlation with the extent of coronary lesion in patients with acute myocardial infarction WANG Yangui 1, HUANG Jia 2, YANG Tianlun 3 (1. Department of Geriatrics, Hunan Provincial People's Hospital, Changsha ; 2. Department of ICU, Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha ; 3. Department of Cardiovasology, Central South University, Chsngsha , China) 收稿日期 (Date of reception): 第一作者 (First author): 汪雁归, yangui1982@126.com 通信作者 (Corresponding author): 杨天伦, tianluny@163.com 基金项目 (Foundation item): 湖南省科技计划项目 (12SK3243) This work was supported by the Science and Technology Plan Project of Hunan Province, P. R. China (12SK3243).

2 急性心肌梗死患者血清循环 mir-214 水平及其与冠状动脉病变范围的关系汪雁归, 等 363 ABSTRACT Objective: To examine the circulating levels of mir-214 in acute myocardial infarction (AMI) patients and to explore the relationship between the circulating levels of mir-214 and the degree of coronary lesion. Methods: A total of 45 patients with AMI (AMI group) were enrolled from Xiangya Hospital of Central South University between September, 11 and January, 12. Twenty healthy volunteers served as a normal control group (n=). According to the coronary artery lesion area, AMI group was also divided into a single-branch group, a double-branch group and a triple-branch group (n=, 13, 12 respectively). Circulating levels of mir-214 and plasma levels of placental growth factor (PLGF) were measured by real time-pcr assay and enzyme-linked immunosorbent assay respectively on the day when the patients admitted to the hospital. The plasma levels of mir-214 and PLGF were compared among the various branch groups. The correlation between mir-214 and PLGF was analyzed in AMI subgroups. Results: The mir-214 levels in the AMI subgroups were lower than that in the control group. The more decrease in mir-214 level, the larger size of coronary lesion. There was significant difference in the different groups (all P<0.05). Compared with the control group, the levels of plasma PLGF were significantly higher in the AMI subgroups. The more increase in PLGF level, the larger size of coronary lesion. There was significant difference in the different groups (all P<0.05). The plasma levels of mir- 214 were negatively correlated with that of PLGF in the AMI group (r= 0.588, P<0.01). Conclusion: The circulating level of mir-214 was significantly decreased in the AMI group, which might be correlated with the extent of the coronary lesion. Circulating mir-214 may be a promising biomarker for the diagnosis and prognosis of severe AMI. KEY WORDS circulating mir-214; placental growth factor; acute myocardial infarction; correlation 急性心肌梗死 (acute myocardial infarction, AMI) 具有发病急骤及致死率高等特点, 仍是导致人类死亡的头号疾病, 影响患者生活质量与生命 [1] 安全 近年来更多学者发现 micrornas(mirna) 在心肌功能研究中起到重要作用 MiRNA 是一种长度约为 22 核苷酸 (nt) 的非编码 RNA, 其主要通过碱基互补与靶 mrna 的 3' 端非翻译区 (3'UTR) 结合, 导致靶 mrna 降解或抑制蛋白质的合成, 在转录后水平调节基因的表达 其中, 部分细胞微粒能分泌 mirna 至细胞基质中发挥效应 [2], 因其结构稳定, 在各种病理应激条件下表达明显改变, 充分显示了它们在各种疾病中发挥了作用 体内外 [3-4] 实验已证实心肌组织 mirna-214(mir-214) 在心力衰竭以及心肌缺血中发挥重要作用 因 mirna 在血液中有异常高的稳定性,miRNA 可能是一个理想的基于血液的心肌缺血检测生物标志物 胎盘生长因子 (placental growth factor,plgf) 是血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 家族成员之一, 与 VEGF 结果相似, 参与病理状态下的新血管和侧支血管的形成, 而对生理状态下的血管发育影响很小 它也是动脉粥样 硬化斑块不稳定的一种主要炎症促发因子, 能介导巨噬细胞浸润进入早期动脉粥样硬化斑块, 刺激血管平滑肌细胞增殖, 引起粥样硬化斑块不稳定 破裂 [5-6] PLGF 对于冠心病血管再生及危险预后与 mir-214 水平的表达存在关联, 而对于 AMI 的研究并不多见, 加上临床上主要倾向于心肌酶及其他心肌损伤标志物等研究, 本文就循环 mir-214 和 PLGF 与 AMI 的相关性进行研究, 以了解其在本疾病中的诊断价值 1 资料与方法 1.1 临床资料收集从 11 年 9 月至 12 年 1 月于中南大学湘雅医院进行诊治的 45 例 AMI 患者 (AMI 组 ) 的一般临床资料和血清标本, 其中男性 30 例, 女性 15 例, 年龄 (68.±7.91) 岁, 经临床症状 心肌酶学检查及心电图确诊 AMI 并采用冠状动脉造影显示冠状动脉病变的范围, 将 AMI 组又分为单支 双支和三支病变组 其中单支组 例, 双支组 13 例, 三支组 12 例, 对照组选择同时期在中南大学湘雅医院体检中

3 364 中南大学学报 ( 医学版 ), 15, (4) 心的 例健康人员 其中, 男性 11 例, 女性 9 例, 年龄 (66.5±8.2) 岁 各组研究对象在年龄 性别 BMI 指数等方面差异均无统计学意义 ( 均 P>0.05), 具有可比性 排除标准 : 患者具有自身免疫性疾病 严重肝肾功能不全 急性或慢性感染 恶性肿瘤 心肌炎 心肺或其他器官移植患者等 [7] 1.2 方法 AMI 患者的治疗 AMI 患者入院后根据个体情况给予相应的规范化治疗 药物保守治疗或经皮冠状动脉介入治疗 (percutaneous coronary intervention,pci) 术后予以抗凝抗栓 调脂 稳定斑块 抗心肌重构 抗交感 防猝死 扩张冠状动脉等规范药物治疗 标本采集对照组人群于清晨空腹 12 h 采取 4 ml 肘静脉血,AMI 组患者于入院当天采取 5 ml 肘静脉血 1 次, 所有血液均置于普通真空采血管中,4 下静置 30 min 后,3 000 r/min 速度离心 15 min, 取上清液置于 EP 管中,Eppendorf 离心机 r/min 离心 15 min, 再进行总 RNA 提取, 参照 mirna 提取试剂盒说明进行 RT-PCR 使用 TagMan MicroRNA 反转录试剂盒, 荧光定量 PCR 使用 Taq Man 普通试剂盒 血清 PLGF 使用酶联免疫吸附实验双抗体夹心法检测, 试剂盒购于美国 R&D 生物公司, 操作步骤参照试剂盒说明书, 行双复孔检测且为同批测定, 所有样本重复测定取平均值进行统计学分析, 均值为最终浓度, 选用 Mode13550 型酶标仪, 测定吸光度值, 波长为 450 nm 1.3 统计学处理数据处理采用 GraphPad Prism (Version 5.0 GraphPad software Inc,California,USA), 其中计量资料以 t 检验处理, 而计数资料则以 χ 2 检验处理, 使用 Spearman 相关性分析 以 α=0.05 为检验水准, P<0.05( 双侧 ) 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 AMI 组和对照组血清中循环 mir-214 水平比较如图 1 所示 :AMI 各亚组血清中循环 mir-214 水平较对照组均有明显降低, 各组间对比差异均有统计学意义 ( 均 P <0.05)( 对照组与 AMI 组相比较,P =0.015; 双支病变组与单支病变组相比较,P=0.023; 三支病变组与双支病变组相比较, P=0.033), 随着冠状动脉病变范围增多, 循环 mir- 214 表达水平 ( 以 2 Ct 表示 ) 下降越明显 mir-214 表达水平 对照组 P=0.015 P=0.023 P=0.033 单支病变组双支病变组三支病变组 图 1 对照组及 AMI 各亚组循环 mir-214 表达水平比较 Figure 1 Comparison of circulating mir-214 levels in the control group and the AMI subgroups 2.2 AMI 组和对照组血清中 PLGF 表达水平比较如图 2 所示 :AMI 各亚组血浆中 PLGF 分泌水平较对照组均有明显增高, 各组间对比差异均有统计学意义 ( 均 P <0.05)( 对照组与 AMI 组相比较,P =0.035; 双支病变组与单支病变组相比较,P=0.039; 三支病变组与双支病变组相比较, P=0.027), 随着冠状动脉病变范围增大,PLGF 分泌水平增加越明显 PLGF 水平 /(pg/ml) 60 0 P=0.035 P=0.039 P=0.027 对照组单支病变组双支病变组三支病变组 图 2 对照组与 AMI 各亚组 PLGF 表达水平比较 Figure 2 Comparison of plasmic PLGF levels in the control group and the AMI subgroups 2.3 血清中循环 mir-214 与 PLGF 之间的关系 使用 Spearman 相关性分析 AMI 组血清中循环 mir-214 表达水平与血浆中 PLGF 分泌水平之间的相关性 如图 3 所示 : 横坐标 Ct 代表 mir-214 与 U6( 内参 )Ct 值的差异, 该差异越大意味着 mir- 214 的表达越低 纵坐标代表血清中 PLGF 的含

4 急性心肌梗死患者血清循环 mir-214 水平及其与冠状动脉病变范围的关系汪雁归, 等 365 量 对照组 Ct(miR-214-U6) 与血浆中 PLGF 分泌水平无明显关系 (r=0.29,p>0.05) 而 AMI 组患者 Ct(miR-214-U6) 与血浆中 PLGF 分泌水平呈正相 关 (r=0.669,p<0.01) 这意味着 AMI 组患者血清中 mir-214 表达水平与血浆中 PLGF 分泌水平呈负相关 (r= 0.588,P<0.01) PLGF/(pg/mL) 30 PLGF/(pg/mL) Ct (mir-214-u6) Ct (mir-214-u6) 图 3 对照组与 AMI 组血清中循环 mir-214 与 PLGF 之间关系 Figure 3 Correlation between circulating mir-214 and PLGF in the control group and the AMI group A: Control group; B: AMI group 3 讨论 MiRNAs 能够靶向调控至少 1/3 的人类基因 [8] 近年来研究发现 : 多种 mirna 在心肌缺血缺氧时 表达异常, 表明不同的 mirna 调控心肌损伤 心室重建 心率失常等发生与发展 [1] mir-214 对于 [9] 心具有保护作用,Aurora 等在体内实验中证实心受损时,miR-214 对于心肌细胞钙离子平衡起到关键作用 因 mirna 在血液中能够稳定表达, 本文旨在检测血清中循环 mirna-214 表达与 AMI 病变范围之间的关系 结果发现 AMI 患者血清中循环 mir- 214 表达水平随着冠状动脉病变范围增加而明显降低 AMI 后机体内膜细胞激活, 心肌细胞凋亡, 可促进心肌细胞 mirnas 表达水平增高, 在心肌缺血小鼠模型中已证实心肌细胞内 mir-214 水平在心肌缺血后明显增高 [9], 然而此研究并未检测循环 mir- 214 表达水平 MiRNAs 可通过凋亡小体向粥样病变血管迁移 [9], 也可通过胞外体或脂蛋白在细胞间传送 而在本文中 AMI 患者循环 mir-214 表达水平随着病变范围增加呈现明显下降趋势 这可能与缺血病灶细胞吞噬,miRNA-214 局部聚集导致循环中 mir-214 水平下降有关 相关细胞生物学机制仍不明确, 有待进一步研究 与对照组相比,AMI 患者血清 PLGF 水平明显升高, 且随冠脉病变范围呈正相关, 以三支病变组最高, 三组之间存在统计学差异 这些结果 提示 PLGF 在 AMI 发展过程中起一定的促进作用, PLGF 水平的高低可以反映冠状动脉病变程度 一方面 PLGF 是 AMI 发生的一种主要炎症促发因子, 能介导巨噬细胞浸润动脉粥样硬化斑块, 刺激血管平滑肌增殖 ; 另一方面,AMI 的发生刺激机体冠状动脉侧支循环的开放, 两者均可引起 PLGF 表达增高 在多因素相关性研究中发现,AMI 患者血清中循环 mir-214 与血浆中 PLGF 分泌水平呈负相关 研 [10] 究已经证实 mir-214 和 enos 与血管形成存在密切联系 血管内皮细胞中 mir-214 过表达可显著抑制细胞外基质中管样结构的生成 同样, 上调 mir- 214 可减少促血管内皮新生因子分泌, 包括 VEGF, PLGF 等 [11] 本文结果从反方向证明 mir-214 可拮抗 PLGF 表达 然而, 在 AMI 发生 发展过程中, 两者之间的具体调控机制不明确,miR-214 参与的是抑制 PLGF 的炎症活动还是病理状态下新生血管的生成过程, 这其中的生物学机制需进一步研究 参考文献 [1] Small EM, Olson EN. Pervasive roles of micrornas in cardiovascular biology[ J]. Nature, 11, 469(7330): [2] Valadi H, Ekström K, Bossios A, et al. Exosome-mediated transfer of mrnas and micrornas is a novel mechanism of genetic exchange

5 366 中南大学学报 ( 医学版 ), 15, (4) between cells[ J]. Nat Cell Biol, 07, 9(6): [3] Wang GK, Zhu JQ, Zhang JT, et al. Circulating microrna: a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans[ J]. Eur Heart J, 10, 31(6): [4] D'Alessandra Y, Devanna P, Limana F, et al. Circulating micrornas are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction[ J]. Eur Heart J, 10, 31(22): [5] Shevchenko AO, Shevchenko OP, Orlova OV, et al. Neoangiogenesis and coronary atherosclerosis: diagnostic value of a novel biochemical marker placenta growth factor in patients with ischemic heart disease[ J]. Kardiologiia, 06, 46(11): [6] Koenig W, Khuseyinova N. Biomarkers of atherosclerotic plaque instability and rupture[ J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 07, 27(1): [7 ] 方晗, 谢楠, 秦莉峰, 等. 急性冠状动脉综合征患者血清钙卫蛋白水平及其与冠状动脉病变范围的关系 [ J]. 中南大学学报 : 医学版, 14, 39(9): FANG Han, XIE Nan, QIN Lifeng, et al. Correlation of serum calprotectin level with the range of coronary lesion in patients with acute coronary syndrome[ J]. Journal of Central South University. Medical Science, 14, 39(9): [8] Bostjancic E, Zidar N, Glavac D. MicroRNA microarray expression profiling in human myocardial infarction[ J]. Dis Markers, 09, 27(6): [9] Aurora AB, Mahmoud AI, Luo X, et al. MicroRNA-214 protects the mouse heart from ischemic injury by controlling Ca² + overload and cell death[ J]. J Clin Invest, 12, 122(4): [10] Chan LS, Yue PY, Mak NK, et al. Role of microrna-214 in ginsenoside-rg1-induced angiogenesis[ J]. Eur J Pharm Sci, 09, 38(4): [11] van Mil A, Grundmann S, Goumans MJ, et al. MicroRNA-214 inhibits angiogenesis by targeting quaking and reducing angiogenic growth factor release[ J]. Cardiovasc Res, 12, 93(4): ( 本文编辑傅希文 ) 本文引用 : 汪雁归, 黄佳, 杨天伦. 急性心肌梗死患者血清循环 mir-214 水平及其与冠状动脉病变范围的关系 [ J]. 中南大学学报 : 医学版, 15, (4): DOI: /j.issn Cite this article as: WANG Yangui, HUANG Jia, YANG Tianlun. Circulating mir-214 level and its correlation with the extent of coronary lesion in patients with acute myocardial infarction[ J]. Journal of Central South University. Medical Science, 15, (4): DOI: / j.issn

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