098 纤维素酶对干玉米秸秆 / 白菜废弃物混贮品质的影响及 5 期 process, the mixed fermentations of DMS and CW were complementary in terms of the abundance of lactic acid bacteria

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1 DOI: /j.cnki x 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 208,24 ( 5 ) : 纤维素酶对干玉米秸秆 / 白菜废弃物混贮品质的影响及细菌群落解析 * 任海伟, 2 刘菲菲 王莉 范文广 李志忠 ** 王昱 2 蓝雯琳 李金平 2 兰州理工大学生命科学与工程学院兰州 甘肃省生物质能与太阳能互补供能系统重点实验室兰州 摘要为实现干秸秆的跨季节保质贮存, 并改善其湿法贮存品质, 研究纤维素酶添加量对干玉米秸秆 (DMS) 与白菜废弃物 (CW) 混贮发酵品质的影响, 解析贮存过程中细菌菌群的动态演替规律. 设置对照组 (ME, 无酶添加 ) 低剂量组 (CA, 添加量 0.%) 和高剂量组 (CB, 添加量 0.3%),8 ± 恒温密闭贮存 70 d, 间隔一定时间分析有机组分含量和发酵品质, 并利用 Miseq 高通量测序技术研究细菌多样性的动态变化. 结果表明, 与 ME 组相比,CA 组和 CB 组在贮存 70 d 期间的可溶性碳水化合物含量显著升高, 酸性洗涤纤维 中性洗涤纤维 纤维素 综纤维素含量及 ph 值均显著下降 ;30-60 d 期间 CA 组和 CB 组的氨氮 / 总氮值显著下降,90 d 后有升高趋势. 贮存 70 d 期间 CA 组和 CB 组中乳酸含量显著增加, 乳酸 / 乙酸比值和乳酸 / 总有机酸比值得到优化, 提高了乳酸发酵程度, 改善了发酵品质. 细菌群落分析显示, DMS 与 CW 两种废弃物原料有乳酸菌互补性, 有利于混贮发酵反应快速启动 ; 加入纤维素酶后的 CA 组和 CB 组中门水平优势菌 Firmicutes 和 Proteobacteria 及属水平优势菌 Paralactobacillus 和 Lactobacillus 相对丰度提高,Enterobacter 等腐败细菌于 30 d 时消失, 有益乳酸菌的总丰度始终保持 50% 以上 ( 除 90 d 的 CA 组 ). 总之, 干玉米秸秆和白菜废弃物密闭混贮能确保干秸秆贮存近半年不变质, 添加纤维素酶效果更佳, 结合酶成本等因素, 生产实践中推荐添加量为 0.% ( 原料鲜重的 0.%). ( 图 5 表 5 参 37) 关键词干玉米秸秆 ; 白菜废弃物 ; 纤维素酶 ; 混贮品质 ; 细菌群落 CLC X72 : Q938. Effects of cellulase on the mixed silage quality of dried maize straw and cabbage waste and an analysis of its bacterial community* REN Haiwei, 2, LIU Feifei, WANG Li, FAN Wenguang, LI Zhizhong **, WANG Yu 2, LAN Wenlin & LI Jinping 2 School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou , China 2 Key Laboratory of Complementary Energy System of Biomass and Solar Energy, Lanzhou , China Abstract Dry maize straw (DMS) and cabbage waste (CW) were mixed and ensiled for trans-seasonal storage and examined to improve the wet storage quality of DMS, test the effects of different doses of cellulase on silage quality, and investigate the dynamics of the bacterial community within this mixed silage. This experiment used the following treatments: the control group ME (without enzyme addition), group CA (with the addition of cellulase at a low dose of 0.%), and group CB (with the addition of cellulase at a high dose of 0.3%). All treatment groups were preserved in an airtight container for 70 day at 8 ±, and the chemical composition, fermentation quality, and bacterial community were observed in each group. The content of water soluble carbohydrates in groups CA and CB increased significantly compared to that in group ME. In contrast, the content of acid detergent fiber, neutral detergent fiber, crude cellulose, holocellulose, and ph in groups CA and CB decreased significantly compared to group ME during storage for 70 days. The ratio of ammonia nitrogen to total nitrogen (AN/TN) in both groups CA and CB decreased significantly between 30 and 60 days, but then underwent an increasing trend after 90 days. The ratio of lactic acid to acetic acid (LA/AA) and the ratio of lactic acid to total organic acid (LA/TOA) were both increased by the addition of cellulase, which indicated that the intensity of lactic acid fermentation was improved. During the storage 收稿日期 Received: 接受日期 Accepted: * 国家自然科学基金项目 (566600, ) 甘肃省自然科学基金项目 (606RJZA206,606RJYA287,606RJZA96,7JR5RA7) 中国科学院环境与应用微生物重点实验室暨环境微生物四川省重点实验室开放基金项目 (KLCAS-206-0) 和甘肃省高等学校科研项目 (206-A- 0) 资助 Supported by the National Natural Science Foundation of China (566600, ), the Natural Science Foundation of Gansu Province (606RJZA206, 606RJYA287, 606RJZA96, 7JR5RA7), the Open Project of Key Laboratory of Environmental and Applied Microbiology & Environmental Microbiology Key Laboratory of Sichuan Province, Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences (KLCAS-206-0) and the Research Project of Higher Education in Gansu Province (206-A-0) ** 通讯作者 Corresponding author ( zzli2004@lut.cn)

2 098 纤维素酶对干玉米秸秆 / 白菜废弃物混贮品质的影响及 5 期 process, the mixed fermentations of DMS and CW were complementary in terms of the abundance of lactic acid bacteria they stimulated, which is beneficial because it permitted the fermentation reaction to start quickly. The dominant bacteria at the phylum level were mainly Firmicutes and Proteobacteria, while the dominant bacteria at the genus level were mainly Paralactobacillus and Lactobacillus, the abundances of which were both increased by the addition of cellulose regardless of the dose used. Spoilage bacteria, such as Enterobacter, disappeared after 30 days, and the relative abundance of lactic acid bacteria in groups CA and CB always remained above 50% (except in group CA after 90 days). In conclusion, the anaerobic sealed storage of DMS and CW can help to maintain a better quality of dry straw for half a year, and the addition of cellulase improved the quality of the silage. Moreover, the low dose of cellulase (0.% of total raw material) is recommended for use in practice considering the cost of this enzyme and its observed storage effects. Keywords dry maize straw; cabbage waste; cellulase; mixed silage quality; bacterial community diversity 作物秸秆是常见的饲草和能源作物, 但由于我国北方地 区农耕条件和耕作习惯等因素, 秸秆多数在萎蔫干黄后才 被收获, 导致水分和糖分大量流失, 木质化程度严重, 使其 资源化利用途径受到限制. 研究表明, 以青贮为代表的湿法 贮存技术为干黄秸秆的跨季节贮存提供了思路, 诸多学者将 干秸秆与蔬菜废弃物 ( 花椰菜 [] 白菜 [2] 莴笋叶 [3] ) 马铃薯 渣 [4] [5] 玉米粉浆等农产品加工废弃物进行混合, 能连续保 质贮存 d 不变质, 并使干秸秆原本致密的木质纤维结构 变得疏松软化. 可见干秸秆由于自身营养物质所限, 必需与 高水分 高糖分原料混合才能使贮存发酵反应快速启动并持 续较长时间, 否则极易保存失败. 另一方面, 我国是蔬菜生产 大国, 蔬菜种植 初加工 销售等环节会产生大量蔬菜废弃 物, 若直接废弃会产生严重的环境面源污染和资源浪费. 更 重要的是, 叶菜类蔬菜废弃物 ( 如白菜 ) 中的水分和糖分含 量较高, 与干秸秆在物理结构 营养组分 水分含量等方面 恰有较强互补性. 若将其与干秸秆进行混合贮存, 不仅能有 效解决干秸秆跨季节贮存问题, 还能减少蔬菜废弃引发的 环境污染, 转移保存蔬菜中的水分 糖分等营养物质, 一举 多得. 本课题组前期发现, 干秸秆与蔬菜废弃物在密闭环境中 以一定比例自然混合仅能连续贮存 -2 月 [2-3], 但若要实现真 正意义的秸秆跨季节贮存, 则需要进行过程调控和优化. 原 料中本底糖含量的多寡对混贮反应的快速启动与可持续时 长至关重要, 除添加糖蜜 葡萄糖等外源糖分外, 添加生物 酶制剂也是一种常用贮存品质调控手段. 纤维素酶 木聚糖 酶 果胶酶和淀粉酶等具有生物活性的酶制剂有助于有机 大分子分解, 增加可发酵糖供应量, 为乳酸菌繁殖发酵提供 底物, 使 ph 快速降低, 从而提高贮存品质. 叶杭等认为添加 木聚糖酶能改善稻草青贮品质, 且增加酶添加量有利于降 低青贮 ph 和提高干物质回收率 [6]. 李春霞发现甘蔗梢青贮中 添加果胶酶 纤维素酶和木聚糖酶均能降低中性洗涤纤维 (NDF) 和酸性洗涤纤维 (ADF) 含量, 提高糖生成量, 有效 改善青贮品质, 且 3 种酶复合添加效果更好 [7]. 许能祥等发现 添加 α- 淀粉酶能增加青贮稻草中的可溶性碳水化合物含量, 从而提高乳酸含量, 改善发酵品质 [8]. 张诗等发现添加纤维 素酶能降低半纤维素含量, 提高干物质回收率, 显著改善巨 菌草的青贮品质 [9]. 国外学者也有类似文献报道,Khota 等发 现相比较于乳酸菌剂, 纤维素酶更有助于提高粗蛋白含量, 降低纤维素含量 [0]. Dehghani 等认为添加果胶酶和葡聚糖酶 能有效增加青贮苜蓿中的乳酸及总糖含量, 并降低丁酸 氨 含量及 ph 值, 提高发酵品质 []. Weinberg 等发现单独添加纤 维素酶对青贮品质无显著影响, 与乳酸菌同时添加才能发 挥积极作用 [2]. 湿法贮存是多种微生物共同作用的复杂生化过程, 通 过促进乳酸菌等有益微生物的繁殖代谢来抑制有害菌, 从 而实现原料保质贮存. 目前, 有关贮存过程中微生物多样 性的研究方法主要包括 6S rrna 分子鉴定 限制性片段长 度多态性 (RFLP) 变性梯度凝胶电泳 (PCR-DGGE) 第 3 [2] 代单分子测序技术 (SMRT) 和宏基因组高通量测序技术 等, 其中基于 Illumina HiSeq 2500 和 MiSeq 等平台的高通量 测序技术在土壤 海洋 肠道及极端生境的微生物生态方 面应用广泛, 而解析湿法贮存过程微生物多样性的研究报 道还相对较少. Ni 等用 Illumina MiSeq PE300 平台发现乳酸 菌和糖蜜混合添加有助于提高大豆青贮过程中乳杆菌属 (Lactobacillus) 的丰度, 并抑制梭菌属 (Clostridium) 和肠杆 菌属 (Enterobacter) 等有害菌生长 [3]. Li 等通过 MiSeq PE300 平台发现加入微藻会影响五节芒青贮过程中的微生物菌 群, 优势乳酸菌由肠球菌 (Enterococus) 变为乳杆菌属, 肠 球菌和乳球菌 (Lactococcus) 丰度明显下降 [4]. 胡宗福等用 Miseq 平台研究了全株玉米青贮期间主要有乳球菌 片球菌属 (Pediococcus) 肠球菌和魏斯氏菌属 (Weissella) 等细菌 [5]. 陶莲等用 Miseq 平台分析了玉米秸秆青贮前后的菌群变化, 发现青贮后厚壁菌门 (Firmicutes) 片球菌属和乳杆菌属菌 群丰度显著增加 [6]. 有关高通量技术用于干秸秆与白菜废弃 物混贮发酵过程的微生物菌群研究尚未见报道. 鉴此, 为了促进秸秆资源化利用, 实现干秸秆的长时 间 跨季节保质贮存, 本课题组在前期研究基础上, 以干 玉米秸秆 (Dry maize straw,dms) 与白菜废弃物 (Cabbage waste,cw) 为对象, 将二者以一定比例混合后连续恒温密闭 贮存 70 d, 探究不同添加量纤维素酶对混贮品质的影响, 并 利用 Illumina MiSeq 高通量测序平台解析混贮发酵过程中微 生物菌群变化, 进而为干秸秆跨季节贮存品质的调控和尾菜 资源化利用奠定理论基础. 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol

3 24 卷 任海伟等 099 材料与方法. 材料干玉米秸秆取自甘肃省定西市陇西县, 摘穗后田间留 置一段时间收集, 含水量为 0.23%, 粉碎至 -2 cm 长备用 ; 白菜废弃物收集自兰州市七里河区职工菜市场, 含水量为 9.4%, 切成 2 cm 2 cm 备用 ; 纤维素酶 ( 酶活力为 0 万 U/g) 购自宁夏和氏璧生物技术有限公司 ;DNA 试剂盒采用 Water DNA Isolation Kit, 购自成都福际生物技术有限公司..2 混贮试验设计与样品预处理.2. 混贮试验设计依据课题组前期研究结果 [7], 准确 称取 3.23 kg 干玉米秸秆和 9.87 kg 白菜废弃物, 混匀后均匀喷 洒事先配制好的纤维素酶液, 对照组喷洒相同体积蒸馏水, 使贮存体系含水量为 73%. 试验设置纤维素酶低剂量组 (CA 组, 酶添加量为原料鲜重的 0.%) 高剂量组 (CB 组, 酶添加 量为原料鲜重的 0.3%) 和无酶添加对照组 (ME 组 ),8± 恒温密封贮存 70 d, 分别于 30 d 60 d 90 d 20 d 70 d 分析 有机组分 发酵品质和细菌多样性..2.2 样品预处理准确称取 2 份有代表性的混贮料 200 g, 其中 份取 20 g 按 :9 比例加入蒸馏水打浆, 依次通过 4 层纱布 和定性滤纸过滤,3 900 r/min 离心 0 min, 所得浸提液测定 ph 值后 -20 冷冻保存, 用于乳酸 乙酸 丙酸等有机酸和 氨态氮等指标测定. 另 份样品用于有机组分含量分析..3 有机化学组分分析干物质含量采用 05 烘干法. NDF ADF 和酸性洗涤 木质素 (ADL) 测定采用 ANKOMA200i 全自动纤维分析仪. 纤维素 (CL) 半纤维 (HC) 和综纤维素 (HoC) 含量通过公式计算获得 :CL = ADF - ADL;HC = NDF - ADF;HoC = CL + HC. 可溶性碳水化合物测定采用蒽酮硫酸比色法 [8-9]..4 发酵品质分析 ph 值测定采用 PHS-3D 型 ph 计. 氨态氮测定采用苯酚 - 次氯酸钠比色法. 乳酸含量测定采用山东省科学院 SBA- 40X 生物传感器. 乙酸 丙酸及丁酸等挥发性脂肪酸含量 测定采用气相色谱法, 进样口温度 200, 载气为高纯氮气 (99.999%), 不分流进样, 升温程序 :40 保持 2 min, 以 2 /min 升至 00 后保持 5 min, 再以 0 /min 升至 200, 保 持 5 min [8-9]..5 细菌多样性分析无菌环境下取 60 g 贮存样品均分成 3 份, 分别加 200 ml 无 菌生理盐水混合,37 振荡 2 h 得到菌悬液, 用直径 47 mm 孔径 0.22 μm 无菌滤膜过滤获得微生物菌体. 然后用无菌手术 剪剪碎整张滤膜, 置于 2 ml 无菌离心管, 依 Water DNA 试剂 盒步骤提取微生物总 DNA, 经 2% 琼脂糖凝胶电泳检测合格 后送上海派森诺生物科技有限公司进行 Illumina Miseq 测序. 选择扩增区域 6S rdnav3-v4, 设计正反向加上 transposase sequences 的引物, 扩增得到带 transposase sequences 的 PCR 产物片段 min,95 30 s,60 30 s,72 30 s,25 个循环,72 0 min. 目的 PCR 产物用 0.8 倍体积 AMPure XP Beads 纯化后, 用 P5 + index i5 和 P7 + index i7 引物进行第二轮扩增, 得到的 PCR 产物即带有 P5/P7 接头序列和双端 index. 第二轮 PCR 产物用 倍体积 AMPure XP Beads 纯化后, 用 Qubit ds DNA HS assay kit(invitrogen, 美国 ) 进行 荧光定量 (Qubit 2.0 Fluorometer), 多个样本等量混合成测 序 pool min,95 30 s,55 30 s,72 30 s,8 个循环,72 0 min. 取 0 ng 的测序 pool, 用 MiSeq Reagent Kit v3 在 Illumina MiSeq 中进行双向测序, 得到 bp 的数据. 下 机数据预处理后进行 Alpha 多样性分析, 选定相对丰度高于 0.% 的细菌群落制微生物菌群分布图, 并从门 属水平进行 细菌多样性分析 [20]..6 数据分析用 Excel 2007 软件处理基础数据, 用 SPSS 20.0 对试验 结果进行数据统计分析, 各处理数据间用 Duncan 法进行多 重比较. 2 结果与分析 2. 贮存期间主要有机化学组分的变化 2.. 纤维素酶添加量对木质纤维组分的影响由表 和表 2 可知, 与 0 d( 未贮存原料 ) 相比, 随着贮存时间延长,3 个试 验组的 ADL 含量总体呈下降趋势,HoC 含量则呈总体增加趋 势 ;ME 组 ADF 和纤维素含量整体呈增加趋势,CA 组则整体 呈现先减小后增加趋势, 而 CB 组中 ADF 和纤维素含量则均 呈下降趋势 ;ME 组和 CB 组中 NDF 和半纤维素含量呈上升趋 势, 而 CA 组中 NDF 含量则呈下降趋势. 另外, 与 ME 组相比, d 期间 CA 组和 CB 组中 NDF ADF 及纤维素含量均显著下降, 且 CB 组中 ADF 含量始终显著低于 CA 组 ( 除 30 d),30-60 d 时 CB 组中 NDF 和纤维素含量显著低于 CA 组,90 d 时下降趋势消失且 30 d 后显著高于 CA 组. 另一方面,CB 组中 ADL 含量在 d 时显著高于 ME 组和 CA 组, 而 CA 组在 d 时的 ADL 含量显著高于 CB 组和 ME 组. 此外, 贮存 d 期 间,CB 组中半纤维素含量显著高于 ME 组和 CA 组,ME 组中 HoC 含量始终显著高于 CA 组和 CB 组 ; 贮存 d 期间 CA 组 的 HoC 含量显著高于 CB 组, 但 d 期间 CB 组中 HoC 含量 显著高于 CA 组. 表 原料干玉米秸秆 (DMS) 和废弃白菜 (CW) 物理混合前后的化学成分 Table Chemical compositions of dry maize straw (DMS) and cabbage waste (CW) before and after mixing 原料 Ensilage material 干物质 Dry matter (DM/%, FW) 中性洗涤纤维 Neutral detergent fiber (NDF/%, DM) 酸性洗涤纤维 Acid detergent fiber (ADF/%, DM) 酸性洗涤木质素 Acid detergent lignin (ADL/%, DM) 纤维素 Cellulose (CL/%, DM) 半纤维素 Hemicellulose (HC/%, DM) 可溶性碳水化合物 Water soluble carbohydrates (WSC/%, DM) CW 8.59 ± ± ± ± ± ± ± 0.03 DMS ± ± ± ± ± ± ± 0.02 CW + DMS ± ± 0.39Da 44.0 ±.09Ca 9.95 ± 0.2Ba ± ± ± 0.20 FW: 鲜重. FW: Fresh weight. Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报

4 00 纤维素酶对干玉米秸秆 / 白菜废弃物混贮品质的影响及 5 期 表 2 纤维素酶添加量对木质纤维组分含量的动态影响 Table 2 Dynamic effects of cellulose dosage on the content of fiber composition ME CA CB 贮存时间 Time (t/d) 中性洗涤纤维 Neutral detergent fiber (NDF/%) 酸性洗涤纤维 Acid detergent fiber (ADF/%) 酸性洗涤木质素 Acid detergent lignin (ADL/%) 半纤维素 Hemicellulose (HC/%) 纤维素 Cellulose (CL/%) 综纤维素 Holocellulose (HoC/%) ± 0.39Da 44.0 ±.09Ca 9.95 ± 0.2Ba ± 0.74Ca ±.08Da ± 0.34Da ± 0.4Ca ± 0.43BCa 5.88 ± 0.26Eb ± ± 0.69Ca ± 0.4Ba ± 0.25Ca ± 0.09Ba 0.98 ± 0.85Ab ± 0.22Bc 34.5 ± 0.90Da 60.5 ± 0.77Ca ± ± ± 0.07Fc 27.2 ± ± ± ± 0.0Ca ± 0.04BCa 7.07 ± 0.35Db ± 0.04Ab 37.7 ± 0.39Ca ± 0.36Ba ± 0.53Ba ± ± 0.07Cb ±.06Bb ± 0.46Ba ± 0.59Ba ± ±.09Ba 9.95 ± 0.2Ca ± 0.74Da ±.08Ba ± 0.34Ca ± 0.3Bb 4.63 ± 0.09Cb 4.47 ± 0.0Fc ± 0.09Cb 37.6 ± 0.08Ab ± 0.2Ab ± 0.24Cb ± 0.08Eb 6.86 ± 0.06Ec ± ± 0.02Db ± 0.22Cb ± 0.37Ab 42.5 ± 0.4Cb 2.40 ± ± 0.22Cb ± 0.26Cc ± 0.05Dc ± 0.5Cc ± 0.0Dc.6 ± 0.25Ba ± 0.22Bc ± 0.4Ec ± 0.34Ec ± 0.40Ab ± 0.08Ab 8.55 ± 0.34Da 2.37 ± 0.48Ec 37.5 ± 0.32Ab ± 0.6Bc ± 0.39ABa 44.0 ± ± 0.2Ba ± 0.74Da ± ± 0.34Ca ± 0.04Dc ± 0.09CDc 6.46 ± 0.2Da 23.8 ± 0.04Dc ± 0.30ABc ± 0.25Cc ± 0.23Ec ± 0.0Ec 2.82 ± ± 0.23Ab 2.75 ± 0.09Cc 50.2 ± 0.32Dc ± 0.03BCb 4.3 ± 0.04Bc 7.30 ± 0.07Cb ± 0.02Cb 34.0 ± 0.05Ab ± 0.07Bb ± 0.9Cb ± 0.04Db 6.65 ± 0.03Dc ± 0.22Ba ± 0.0Bb ± 0.2ABb ± 0.4Ab ± 0.04Cc 7.26 ± 0.2Cc ± 0.36Ba ± 0.25Bc ± 0.6Ab ME: 无酶对照组 ;CA: 低添加量组 (0.%);CB: 高添加量组 (0.3%). 同列不同小写字母表示相同时间不同处理组之间差异显著 (P < 0.05); 同列不同大写字母表示同一处理组内不同时间段差异显著 (P < 0.05). ME: No cellulase addition; CA: Low dosage of cellulase (0.%); CB: High dosage of cellulase (0.3%). The data with different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level between different groups at the same time; the data with different uppercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level for the same groups within different time 纤维素酶对水溶性碳水化合物 (WSC) 含量的影响 由图 可知, 贮存 30 d 时 3 个试验组中 WSC 含量均显著低 于 0 d, 下降率分别高达 79.64%(ME 组 ) 72.9%(CA 组 ) 和 60.3%(CB 组 ); 随时间延长 CA 组和 CB 组中 WSC 含量分别 于 60 d 和 30 d 后转为增加趋势, 但仍低于 0 d. 另一方面, 整个 d 贮存周期内,CA 组和 CB 组中 WCS 含量显著高于 ME 组, 且 d 期间 CA 组显著高于 CB 组. 可见, 添加纤维素 酶能增加混贮料中的 WSC 含量. WSC BCc Bc BC Cc Dc Eb Ba BCa Ca Da ME CA CB 图 纤维素酶添加量对可溶性碳水化合物 (WSC) 含量变化的动态影响. ME: 无酶对照组 ;CA: 低添加量组 (0.%);CB: 高添加量组 (0.3%). 不同小写字母表示相同时间不同处理组之间差异显著 (P < 0.05); 不同大写字母表示同一处理组内不同时间段差异显著 (P < 0.05). Fig. Dynamic effects of cellulase dosage on the content of water soluble carbohydrate (WSC). ME: No cellulase addition; CA: Low dosage of cellulase (0.%). CB: High dosage of cellulase (0.3%). The different lowercase letters at the same column indicate significant difference at 0.05 level between different groups at the same time; the different uppercase letters at the same column indicate significant difference at 0.05 level for the same groups within different time. Ba Cb Cb Db Eb 2.2 纤维素酶添加量对混贮发酵品质的影响 2.2. 贮存过程中 ph 值的变化混贮过程中 ph 值的下降速 率是混贮发酵成功与否的关键指标之一. 由图 2 可知, 随着贮 存时间的延长,ME 组和 CB 组中 ph 值总体呈现先升高后下降 趋势,CA 组中 ph 值则呈显著下降趋势 ; 另一方面,30 d 时 CB 组中 ph 值显著低于 ME 组, 但 CA 组与 ME 组差异不显著,60 d 后 CA 组的 ph 值均显著低于 ME 组,CB 组除 30 d 外也显著低 于 ME 组 ; 贮存后期 (30-70 d)ca 组中 ph 值显著低于 CB 组. 说明添加高 低剂量纤维素酶均有利于促进混贮体系 ph 值 的快速下降, 且在贮存后期低剂量纤维素酶更有利于保持 低 ph 状态, 从而改善混贮发酵品质 贮存过程中氨态氮 / 总氮 (AN/TN) 的变化氨态氮 主要是微生物或酶分解蛋白质 氨基酸和含氮物质所生成, 氨态氮 / 总氮 (AN/TN) 值越大说明蛋白质分解程度越高. 由 表 3 可知,ME 组的 AN/TN 值在 d 期间差异不显著, 维持 恒定,30 d 时显著下降, 之后又维持恒定,CA 组则在 d 期间差异不显著,90 d 时显著增加, 之后也维持恒定, 而 CB 组则呈先升高后下降趋势,90 d 时 AN/TN 值最高, 达 3.23% DM. 另一方面,30-60 d 期间 CA 组和 CB 组中 AN/TN 显著低于 ME 组,90 d 后 CA 组和 CB 组中 AN/TN 的下降趋势消失,70 d 时均显著高于 ME 组. 说明添加纤维素酶有利于减少贮存初 期的蛋白质分解, 降低 AN/TN 比值, 改善混贮发酵品质, 但 随时间延长这种 添加剂有益作用 会被削弱, 使 AN/TN 比 值显著升高, 但仍处于优质青贮推荐范围 贮存过程中小分子发酵产物构成模式的变化乳 酸 乙酸等小分子有机酸醇是混贮发酵过程中微生物菌群的 中间代谢产物, 这些小分子物质含量的多寡及其构成模式对 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol

5 24 卷 任海伟等 0 ph Ca 4. 4 Bb Ba Bb Bb 3.7 Dc t/d 图 2 纤维素酶添加量对 ph 值变化的动态影响. ME: 无酶对照组 ;CA: 低添加量组 (0.%);CB: 高添加量组 (0.3%). 不同小写字母表示相同时间不同处理组之间差异显著 (P < 0.05); 不同大写字母表示同一处理组内不同时间段差异显著 (P < 0.05). Fig.2 Dynamic effects of cellulose dosage on the ph value. ME: No cellulase addition; CA: Low dosage of cellulase (0.%). CB: High dosage of cellulase (0.3%). The different lowercase letters at the same column indicate significant difference at 0.05 level between different groups at the same time; the different uppercase letters at the same column indicate significant difference at 0.05 level for the same groups within different time. 发酵品质而言至关重要. 由表 4 可知,3 个试验组中 LA 含量随时间延长呈 升高 - 下降 - 升高 的 N 型变化趋势, 且均在 60 d Cb Cb Db Cc ME CA CB Ea Db 时达到各试验组的最高值 ; 除个别样品外 CA 组和 CB 组中 LA 含量均显著高于 ME 组, 且 CB 组中 LA 含量始终显著高于 CA 组 ( 除 30 d). ME 组和 CB 组中 AA 含量随时间延长总体上呈 增加趋势, 而 CA 组中 AA 含量则呈先增后减趋势 ;30 d 时 CA 组和 CB 组中 AA 含量均显著高于 ME 组,60-30 d 期间 CB 组中 AA 含量始终显著低于 ME 组. 另一方面, 贮存初期 (30-60 d) CB 组中 PPA 和 BA 含量均显著高于 ME 组,90 d 后 CA 组和 CB 组 中 BA 含量仍高于 ME 组, 但整个贮存周期内 PPA 和 BA 含量均 低于 0.5% DM, 符合优良青贮条件. 另外,ME 组中 EA 含量随 时间延长呈下降趋势, 而 CA 组和 CB 组中 EA 含量则呈升高趋 势 ;30 d 时 CA 组和 CB 组中 EA 含量显著低于 ME 组,90 d 后 ME 组中 EA 含量反而显著下降. 上述有机小分子发酵产物构成 模式的联动变化, 使乳酸 / 乙酸比值 (LA/AA) 乳酸 / 总有机 酸比值 (LA/TOA) 等发酵特性参数随时间延长呈下降趋势, 但 CB 组和 CA 组中的这两项指标均高于 ME 组, 说明干玉米秸 秆与白菜废弃物混贮后期乳酸发酵强度逐渐变弱, 添加纤维 素酶有助于强化乳酸发酵, 并存在一定剂量效应. 2.3 纤维素酶对贮存过程中微生物菌群的动态影响 2.3. Alpha 多样性 Chao 和 ACE 指数表示细菌群落丰富 度, 其值越大表明群落物种丰富度越高. 由表 5 可知,30 d 时 CA 组和 CB 组的细菌丰富度明显提高, 说明纤维素酶的添加 表 3 纤维素酶添加量对氨态氮 / 总氮 (AN/TN) 的动态影响 Table 3 Dynamic effects of cellulose dosage on the AN/TN value during storage 表 4 纤维素酶添加量对小分子发酵产物构成模式的动态影响 Table 4 Dynamic effects of cellulose dosage on the formation pattern of low-molecular fermentation products ME CA CB 处理 Treatment 30 d 60 d 90 d 30 d 70 d ME 2.0 ± ± 0.25ABa.67 ± 0.25Ab.62 ± 0.3BCa.34 ± 0.09Cb CA.20 ± 0.22Bb.25 ± 0.9Bb 2.03 ± 0.25Ab 2.4 ± ± 0.0 CB.49 ± 0.27Cb.23 ± 0.08Cb 2.83 ± ± 0.02Db.94 ± 0.25Ba ME: 无酶对照组 ;CA: 低添加量组 (0.%);CB: 高添加量组 (0.3%). 同列不同小写字母表示相同时间不同处理组之间差异显著 (P < 0.05); 同列不同大写字母表示同一处理组内不同时间段差异显著 (P < 0.05). ME: No cellulase addition; CA: Low dosage of cellulase (0.%); CB: High dosage of cellulase (0.3%). The data with different lowercase in the same column indicate significant difference at 0.05 level between different groups at the same time; the data with different uppercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level for the same groups within different time. 贮存时间 Time (t/d) 乳酸 Lactic acid (LA/%) 乙酸 Acetic acid (AA/%) 丙酸 Propionic acid (PPA/%) 丁酸 Butyric acid (BA/%) 乙醇 Ethanol (EA/%) 乳酸 / 乙酸 Lactic acid / acetic acid (LA/AA) 乳酸 / 总有机酸 Lactic acid / total organic acid (LA/TOA) ± 0.04Bb 0.77 ± 0.02Cb 0.09 ± 0.0ABb 0.25 ± 0.03Bb 0.7 ± ± 0.03Ac.27 ± 0.05BCa 0.08 ± 0.0Bb 0.2 ± 0.0Cb 0.67 ± 0.05ABa ± 0.02Cc.45 ± 0.08Bb 0. ± ± ± 0.02Cc ± 0.02Db. ± 0.06BCa 0.0 ± 0.00ABa 0.5 ± 0.02Db 0.58 ± 0.05BCc ± 0.0Bc 2.06 ± 0.58 ND 0.0 ± 0.00Eb 0.56 ± 0.09Cb ± 0.07Dc 0.87 ± 0.02Da 0.09 ± 0.0Ab 0.23 ± 0.03Cb 0.33 ± 0.0Cc ± 0.0Ab.36 ± 0.0Ba 0.0 ± 0.0b 0.43 ± ± 0.06Ba ± 0.0Cb.76 ± ± ± 0.0Db 0.98 ± ± 0.02Ca.6 ± 0.07Ca 0.2 ± ± 0.06Ba.07 ± ± 0.0Bb ND ND ND ND ± 0.02Ba 0.84 ± 0.03Ca 0.7 ± ± 0.06ABa 0.63 ± 0.03Cb ± ± 0.02Bb 0. ± 0.02Ba 0.40 ± ± 0.3Ca ± 0.0Da.5 ± 0.05Bc 0.09 ± 0.0Ba 0. ± 0.0Cb 0.82 ± 0.0Bb ± 0.0Ec 0.8 ± 0.08Cb 0.0 ± 0.02Ba 0.3 ± 0.04Ba 0.85 ± 0.07Bb ± 0.02Ca 2.49 ± 0.06 ND 0.08 ± 0.03Ca 2.93 ± ME: 无酶对照组 ;CA: 低添加量组 (0.%);CB: 高添加量组 (0.3%). 同列不同小写字母表示相同时间不同处理组之间差异显著 (P < 0.05); 同列不同大写字母表示同一处理组内不同时间段差异显著 (P < 0.05). ME: No cellulase addition; CA: Low dosage of cellulase (0.%); CB: High dosage of cellulase (0.3%). The data with different lowercase in the same column indicate significant difference at 0.05 level between different groups at the same time; the date with different uppercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level for the same groups within different time. Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报

6 02 纤维素酶对干玉米秸秆 / 白菜废弃物混贮品质的影响及 5 期 促进了细菌群落的丰富 ;60 d 后 CB 组的 Chao 和 ACE 指数均低于 ME 组, 细菌丰富度下降 ; 而 CA 组的 Chao 和 ACE 指数在 60 d 时低于 ME 组,90 d 时高于 ME 组,30-70 d 期间与 ME 组差异不明显, 说明随贮存时间的延长, 纤维素酶对细菌丰富度的影响程度弱化. 另一方面,ME 组中 Simpson 指数和 Shannon 指数均呈先增加后降低趋势,CA 组中 Simpson 指数和 Shannon 指数均总体呈增加趋势 ;CB 组中 Simpson 指数和 Shannon 指数呈现下降趋势. 此外, 从 Simpson 和 Shannon 指数还能看出,3 个试验组在 30 d 和 60 d 时的细菌群落多样性差异不明显,90 d 后高剂量 CB 组的细菌群落多样性明显高于 CA 组和 ME 组 门分类水平细菌群落组成如图 3 所示, 干玉米秸秆中主要包括厚壁菌门和变形菌门 (Proteobacteria) 细菌, 相对丰度分别为 33.8% 和 65.3%; 还附着有少量放线菌门 (Actinobacteria) 和拟杆菌门 (Bacteroidetes), 但二者相对丰度均不足 %. 另一方面, 变形菌和拟杆菌是白菜废弃物中的主要门水平细菌, 丰度分别为 80.2% 和 8.6%, 此外还有少量厚壁菌门细菌, 但其丰度亦不足 %. 两种原料混贮发酵 70 d 期间, 厚壁菌和变形菌始终是 3 个试验组中的主要门水平细菌, 其中 CA 组中变形菌门细菌的丰度值呈 降低 升高 降低 趋势, 且丰度接近或高于 30%, 厚壁菌门细菌的相对丰度则呈 V 型变化趋势, 除 90 d(3%) 外其丰度值均高于 50%;CB 组中厚壁菌门细菌的相对丰度在 30 d 时仅为 53.2%, 之后随时间延长逐渐升高,70 d 时高达 89.7%, 变形菌门丰度则逐渐下降, 从 30 d 时 4.6% 降至 70 d 时的 8%. 总体来看,CB 组中厚壁菌门细菌的相对丰度高于 CA 组, 而变形菌门相对丰度则低于 CA 组. 厚壁菌门细菌主要有产芽孢 非产芽孢和支原体菌群, 变形菌门细菌包括大肠杆菌 沙门氏菌 弧菌和螺杆菌等, 这些细菌会与乳酸菌竞争性利用糖类物质, 降解蛋白质产生生物胺, 并阻碍混贮 ph 的降低, 因此变形菌门丰度的降低有助于改善发酵品质. 另外,CA 组在 90 d 时还包含少量酸杆菌门 (Acidobacteria) 绿弯菌门 (Chloroflexi) 蓝细菌门 (Cyanobacteria) 和梭杆菌门 (Fusobacteria) 细菌, 其丰度之和约为 2%. 表 5 Alpha 多样性指数 Table 5 Diversity of Alpha index 贮存时间 Time (t/d) 分组 Group Chao 指数 Chao index ACE 指数 ACE index Simpson 指数 Simpson index Shannon 指数 Shannon index ME CA CB ME CA CB ME CA CB ME CA CB ME CA CB ME: 无酶对照组 ;CA: 低添加量组 (0.%);CB: 高添加量组 (0.3%). Chao: 用 chao 算法估计样品中所含 OTU 数目的指数 ;Ace: 用来估计群落中 OTU 数目的指数 ;Simpson: 用来估算样品中微生物多样性指数之一 ; Shannon: 用来估算样品中微生物多样性指数之一. ME: No cellulase addition; CA: Low dosage of cellulase (0.%). CB: High dosage of cellulase (0.3%). Chao is used to estimate the number of OTUs contained in the sample using the Chao algorithm; Ace is used to estimate the number of OTUs in a community; Simpson is used to estimate one of the microbial diversity indices in the sample; Shannon is used to estimate one of the microbial diversity indices in the sample 属分类水平细菌群落组成由图 4 可知, 干玉米 秸秆附着有大量肠杆菌属 (47.%) 泛生菌属 (Pantoea, 0.%) 耶尔森氏菌属 (Yersinia,4.8%) 微小杆菌属 (Exiguobacterium,3.5%) 假单胞菌属 (Pseudomonas, 2.3%) 等非乳酸菌 ; 而肉食杆菌属 (Carnobacterium) 和肠 球菌属等乳酸菌的丰度仅为 28%. 与之相比, 白菜废弃物附 着的乳酸菌含量极低, 丰度仅为 0.9%, 但存在大量假单胞菌 (48.4%) 泛生菌 (7.%) 黄杆菌 (Flavobacterium,6.3%) 及少量肠杆菌 (3.6%) 等腐败菌. 两种原料混贮 70 d 期间, 类乳杆菌 (Paralactobacillus) 和乳杆菌逐渐演变成为 ME 组 中的主要乳酸菌, 且混贮前期 (30-60 d)me 组还含有大量肠 Relative abundance (P/%) DMS CW ME CA CB ME2 CA2 CB2 ME3 CA3 CB3 ME4 CA4 CB4 ME5 CA5 CB5 Taxonomy Actinobacteria Bacteroidetes Firmicutes Proteobacteria Acidobacteria Chloroflexi Cyanobacteria Fusobacteria Gemmatimonadetes Verrucomicrobia Others 图 3 混贮过程中门水平细菌群落动态的组成变化. DMS: 干玉米秸秆 ;CW: 白菜废弃物 ;ME: 无酶对照组 ;CA: 低添加量组 (0.%);CB: 高添加量组 (0.3%). 后缀 分别表示贮存周期 30 d 60 d 90 d 30 d 70 d. Fig. 3 The changes in composition of bacterial community at the phylum level during storage. DMS: Dry maize straw; CW: Cabbage waste; ME: No cellulase addition; CA: Low dosage cellulase addition (0.%). CB: High dosage cellulase addition (0.3%). Suffix, 2, 3, 4, 5 mean storage time 30 d, 60 d, 90 d, 30 d, 70 d, respectively. 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol

7 24 卷 任海伟等 03 杆菌 (40%),90 d 时肠杆菌 假单胞菌 欧文氏菌 (Erwinia) 和葡萄球菌 (Staphylococcus) 等非乳酸菌突变为优势类群, 乳酸菌含量不及 %,90 d 后肠杆菌消失, 乳杆菌丰度又增至 62.%. 加入纤维素酶后,CA 组和 CB 组在 d 期间的优势 菌群落与 ME 组基本一致, 但相对丰度存在差异, 总乳酸菌 丰度高于 ME 组, 腐败菌肠杆菌的丰度均低于 ME 组, 有助于 提高 CA 组和 CB 组的混贮发酵品质. 值得注意的是,90 d 时 CA 组和 CB 组中均新增明串珠菌 (Leuconostoc) 和肠球菌, CA 组还新出现发光杆菌 (Photobacterium),30 d 时 CA 组 和 CB 组中新增拉恩菌 (Rahnella), 相对丰度分别为 5% 和.8%. 另外,30-70 d 期间 CA 组和 CB 组中的肠杆菌和乳球 菌消失,CA 组中明串珠菌相对丰度增至 3.6%. 总体来看, 添加纤维素酶能提高干玉米秸秆和白菜废弃 物混贮发酵期间的乳酸菌丰度, 进而强化乳酸菌发酵强度, 使耐酸能力较强的有益菌乳杆菌丰度大幅提高, 腐败菌肠杆 菌在 30 d 时消失, 尤其高剂量 CB 组在 30 d 和 70d 时的乳杆 菌丰度分别高达 69.% 和 82.5%, 且 CB 组中的乳杆菌丰度始终 高于 CA 组, 这也从另一个侧面反映了纤维素酶的添加有助 于优化混贮发酵进程 乳酸菌的多样性乳酸菌是混贮发酵过程中的有益 微生物, 能利用原料中的糖发酵产生乳酸, 迅速降低 ph 值, 快速完成发酵反应. 由图 5 可知, 干玉米秸秆和白菜废弃物 贮存前附着的乳酸菌主要为肉食杆菌, 所占比例高达 95% 以 上, 此外还含有少量肠球菌和乳球菌, 但由于白菜废弃物自 身附着的总乳酸菌丰度不足 %, 故混贮发酵反应启动的关 键乳酸菌主要来自干玉米秸秆. 两种原料混贮后乳酸菌多样 性变得更丰富, 优势菌逐渐演变为肉食杆菌 肠球菌 类乳 杆菌 乳杆菌 片球菌 明串珠菌和乳球菌等, 其中乳杆菌和 类乳杆菌是 3 个试验组中的主要乳酸菌, 但二者所占比重的 变化趋势恰好相反, 前者随时间延长呈降低趋势, 后者则呈升高趋势. 另一方面, 与 ME 组相比,CA 组和 CB 组中的肉食杆菌和类乳杆菌比重有所下降, 而 CA 组中明串珠菌比重大幅提升. 可见, 干玉米秸秆和白菜废弃物混贮发酵过程中始终以杆菌为主, 与添加纤维素酶与否无关. 3 讨论 3. 纤维素酶对化学组分的影响采用湿法贮存原理将干玉米秸秆和白菜废弃物混贮发酵能实现干秸秆的长时间贮存, 同时还能起到软化其木质纤维结构和优化有机组分构成的目的 [6]. 试验中 CA 组和 CB 组中的 ADF NDF 纤维素和 HoC 含量均显著低于 ME 组, 且 ADF 含量的下降与纤维素酶添加量存在剂量效应. 同时, 加入纤维素酶后 CA 组和 CB 组中可溶性碳水化合物的含量显著增加, 且 CA 组中可溶性碳水化合物含量显著高于 CB 组, 说明低剂量纤维素酶有利于可溶性碳水化合物组分保存. 这与席兴军 [2] Selmer [22] 和 Sun [23] 等研究结果一致, 因为添加纤维素酶能分解原料细胞壁的木质纤维成分, 将 NDF 和 ADF 等组分降解为葡萄糖等可发酵糖. 另一方面, 长时间低 ph 的酸性混贮环境也会使木质纤维结构变得松散, 容易使纤维素和半纤维素组分受到 H + 和纤维降解菌的联合作用, 进而发生分解并释放可溶性碳水化合物. 可见, 添加纤维素酶能通过降解 NDF 和 ADF 等组分来优化结构性碳水化合物组分, 从而提高原料的生物可降解性 [2]. 3.2 纤维素酶对发酵品质的影响干玉米秸秆和白菜废弃物直接混贮发酵 70 d 期间的 ph 介于 范围, 而加入纤维素酶后 CA 组和 CB 组中 ph 始终低于 4.2, 且贮存初期 ph 值下降速度明显加快, 这与 [24] Colombatto 等研究结果一致, 因为添加纤维素酶能为贮存 Relative abundance (P/%) DMS CW ME CA CB ME2 CA2 CB2 ME3 CA3 CB3 ME4 CA4 CB4 ME5 CA5 CB5 Taxonomy Carnobacterium Paralactobacillus Lactobacillus Pediococcus Lactococcus Leuconostoc Enterococcus Bacillus Agrobacterium Sphingomonadaceae Sphingomonas Comamonadaceae Enterobacter Erwinia Pantoea Serratia Pseudomonas Xanthomonadaceae Stenotrophomonas Staphylococcus Caulobacteraceae Rhizobiales Devosia Kaistia Pelagibacteraceae Novosphingobium Sphingobium Variovorax Methylophaga Pseudoxanthomonas Microbacteriaceae Flavobacterium Chryseobacterium Sphingobacteriaceae Pedobacter Sphingobacterium Acidobacteria Streptophyta Exiguobacterium Cetobacterium Gemmatimonadetes Kaistobacter Shewanella Moraxellaceae Photobacterium Sinobacteraceae Luteibacter Stenotrophomonas Ochrobactrum Klebsiella Rahnella Halomonas Pseudomonas Comamonadaceae Yersinia Saccharibacillus Cyanobacteria_norank Janthinobacterium Chryseobacterium Duganella Others 图 4 混贮过程中属水平细菌群落组成的动态变化. DMS: 干玉米秸秆 ;CW: 白菜废弃物 ;ME: 无酶对照组 ;CA: 低添加量组 (0.%);CB: 高添加量组 (0.3%). 后缀 分别表示贮存周期 30 d 60 d 90 d 30 d 70 d. Fig. 4 The change in composition of bacterial community at the genus level during storage. DMS: Dry maize straw; CW: Cabbage waste; ME: No cellulase addition; CA: Low dosage of cellulase (0.%). CB: High dosage of cellulase (0.3%). Suffix, 2, 3, 4, 5 mean storage time 30 d, 60 d, 90 d, 30 d, 70 d, respectively. Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报

8 04 纤维素酶对干玉米秸秆 / 白菜废弃物混贮品质的影响及 5 期 00 Proportion of LAB (P/%) DMS CW ME CA CB ME2 CA2 CB2 ME3 CA3 CB3 ME4 CA4 CB4 ME5 CA5 CB5 Carnobacterium Enterococcus Paralactobacillus Lactobacillus Pediococcus Leuconostoc Lactococcus Bacillus Other 图 5 混贮过程中乳酸菌的多样性变化. DMS: 干玉米秸秆 ;CW: 白菜废弃物 ;ME: 无酶对照组 ;CA: 低添加量组 (0.%);CB: 高添加量组 (0.3%). 后缀 分别表示贮存周期 30 d 60 d 90 d 30 d 70 d. Fig. 5 Diversity of lactic acid bacteria (LAB) during storage. DMS: Dry maize straw; CW: Cabbage waste; ME: No cellulase addition; CA: Low dosage of cellulase (0.%). CB: High dosage of cellulase (0.3%). Suffix, 2, 3, 4, 5 mean storage time 30 d, 60 d, 90 d, 30 d, 70 d, respectively. 体系中乳酸菌等厌氧微生物的发酵产酸提供更多的可发酵 糖底物, 这一点从图 中可溶性碳水化合物含量变化可以得到 验证. 氨态氮主要是微生物或酶分解蛋白质 氨基酸和含氮 物质所生成, 氨态氮 / 总氮值越大说明蛋白质分解程度越高, 贮存质量越差. 试验中加入纤维素酶后有效降低了贮存前期 (30-60 d)ca 组和 CB 组中的氨态氮 / 总氮值, 因为添加纤维 素酶使混贮体系 ph 迅速降低, 从而抑制原料中植物蛋白酶 活性和腐败菌的繁殖, 弱化了蛋白质降解. Dean 等发现青贮 料中添加纤维素酶能获得较低的 ph 值和氨态氮 / 总氮 [25]. 赵 苗苗和玉柱也认为添加纤维素酶能使青贮象草的 ph 值和氨 态氮 / 总氮显著下降, 从而有效提高发酵品质 [26]. 一般认为良好的贮存发酵状态下, 乳酸含量应占总有 机酸 60% 以上, 并占干物质含量的 3%-8%, 乙酸含量应占总 有机酸 %-4%, 丙酸含量占.5% 左右, 乳酸 / 乙酸比值应高于 2:, 丁酸含量则应接近于 0% [27]. 试验中,CB 组和 CA 组乳酸 含量均高于 3.5%(CB 组 30 d 除外 ), 乳酸 / 总有机酸比值均高 于 70%(CB 组 30 d 除外 ), 且明显高于 ME 组, 说明添加纤维 素酶有利于强化乳酸发酵, 提高乳酸生成比重, 改善贮存发 酵特性, 并存在剂量效应, 这与图 4 中高添加量纤维素酶有 助于提升乳酸细菌相对丰度结果一致. 混贮发酵过程中微生 物菌群除产生乳酸外, 还会生成乙酸 丙酸和丁酸等小分子 有机酸. 试验中, 除个别样品外,3 个试验组中的乙酸 丙酸 等含量均处于发酵良好贮存范围, 且 CB 组和 CA 组乳酸 / 乙酸 比值明显高于 ME 组. 另据 Kung 等报道, 当乳酸 / 乙酸比值高 于 3 时, 一般是同型发酵乳酸菌占主导地位 [28]. 因此推测 3 个 试验组在 d 期间属于同型乳酸发酵,90 d 后异型乳酸发 酵逐步占主导地位. Filya 等认为优质青贮料应具有较高含量 的乳酸和较低的丁酸 氨态氮含量及 ph 值, 据此试验中干玉 米秸秆与白菜废弃物混贮发酵近半年时间仍符合优质贮存 条件, 实现了干秸秆的跨季节 长时间贮存 [29]. 3.3 纤维素酶对微生物菌群的影响干玉米秸秆和白菜废弃物混贮发酵过程中的微生物菌 群变化是影响贮存品质的重要因素. 高通量结果发现, 混贮 前 2 种原料均附着有大量变形菌门细菌, 同时还分别含有厚 壁菌门和拟杆菌门细菌. 二者混贮发酵 70 d 期间,3 个试验 组都演变为始终以变形菌门和厚壁菌门细菌为主, 但 2 个添 加剂组中变形菌门细菌的丰度明显低于对照组, 而高剂量 CB 组中厚壁菌门细菌的丰度明显提高. 厚壁菌门细菌是革兰 氏阳性菌, 能降解多种大分子化合物, 如纤维素 淀粉 蛋白质等 [30], 混贮过程中厚壁菌门细菌的分解作用可能是 ADF 和 NDF 含量显著降低的重要原因. 变形菌门细菌包括大肠杆 菌 沙门氏菌等病原菌, 会与乳酸菌竞争营养物质并产生生 物胺, 从而对混贮发酵品质产生负面影响,2 个添加剂组中变 形菌门细菌丰度下降有利于贮存品质的提升, 这与表 4 中发 酵品质的变化趋势基本一致. Kadivar 和 Stapleton 报道认为田间未收割的鲜玉 米主要附着有类芽孢杆菌 (Paenibacillus) 黄杆菌科 (Flavobacteriaceae) 鞘氨醇单胞菌 (Sphingomonas) 微小 杆菌属和根瘤菌科 (Rhizobiaceae) 等细菌属 [3]. Heron 等认 为鲜草原料中主要含有欧文氏菌 拉恩菌和假单胞菌等细 菌属 [32]. 试验中原料干玉米秸秆附着有鞘氨醇单胞菌 肠 杆菌 泛生菌 假单胞菌 微小杆菌 耶尔森氏菌 黄杆菌 寡养单胞菌 (Stenotrophomonas) 杜檊氏菌 (Duganella) 和金黄杆菌属 (Chryseobacterium) 等细菌, 也有一定数量 的肉食杆菌属 乳球菌和肠球菌等乳酸菌 ; 白菜废弃物含 鞘氨醇单胞菌 耶尔森氏菌 假单胞菌 泛生菌 詹森菌 (Janthinobacterium) 金黄杆菌 杜檊氏菌 黄杆菌和肠杆 菌等细菌属, 几乎不含乳酸菌. 可见干玉米秸秆和白菜废弃 物混贮发酵不仅具有水分 糖分等营养互补特性, 还存在 乳酸菌的互补性, 有利于混贮发酵反应快速启动. 经过一定 时间混贮发酵,3 个试验组中的属水平细菌群落演变为肠球 菌 乳杆菌 类乳杆菌 片球菌 乳球菌 肉食杆菌和沙雷 氏菌等近 30 个属, 其中肠杆菌 乳杆菌和类乳杆菌的相对 丰度较高, 这与其他学者报道基本一致. Li 等也发现意大 利黑麦草原料中包含有假单胞菌 乳杆菌和拉恩菌, 混贮 发酵后演变为肠杆菌 肠球菌 乳杆菌 欧文氏菌 类芽孢 杆菌 泛生菌 片球菌和芽孢杆菌等细菌属 [33]. Bao 等发现 苜蓿原料中主要包含芽孢杆菌 肠杆菌 魏斯氏菌和沙门 氏菌 (Salmonella) 等, 混贮发酵 35 d 后演变为片球菌 乳杆 菌 芽孢杆菌 沙门氏菌 肠杆菌 泛生菌 魏斯氏菌 肠球 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol

9 24 卷 任海伟等 05 菌和苍白杆菌 (Ochrobactrum) 等 [34]. 刘晶晶等发现青贮柳枝稷中主要包括乳杆菌 肠杆菌 肠球菌 梭状芽胞杆菌 芽孢乳杆菌 毛螺菌 魏斯氏菌 泛生菌 沙雷氏菌 气球菌 (Aerococcus) 和瘤胃球菌 (Ruminococcaceae) 等细菌属 [35]. 另一方面, 试验中加入纤维素酶后的 CA 组和 CB 组中乳酸细菌丰度明显提高, 并存在剂量效应, 同时芽孢杆菌 耶尔森氏菌 沙门氏菌 弯曲杆菌和肠杆菌等致病腐败菌丰度明显下降. 另外, 混贮发酵过程中存在的芽孢杆菌 泛生菌 假单胞菌 鞘氨醇杆菌属 产黄菌属 寡养单胞菌和细杆菌 (Microbacterium) 等细菌对纤维素和木质素组分有降解作用, 尤其组成的复合微生物菌系能发挥较好的木质纤维素分解功能 [36], 这些复合菌系的存在可能是导致纤维素和 ADL 等组分发生降解的重要原因. 乳酸菌是混贮发酵过程的关键优势有益菌, 解析不同贮存过程中的乳酸菌多样性至关重要. 试验中, 干玉米秸秆附着的乳酸菌主要包括肉食杆菌 肠球菌和乳球菌, 与白菜废弃物混贮发酵后逐渐演变为肉食杆菌 类乳杆菌 乳杆菌 片球菌 乳球菌 明串珠菌和肠球菌等, 乳酸菌多样性变得更加丰富. Cai 等也发现青贮水稻中主要包含乳球菌 乳杆菌 明串珠菌 肠球菌 片球菌和魏斯氏菌等乳酸菌 [37]. 特殊的是,CA 组在贮存 30 d 时出现少量芽孢杆菌. 刘晶晶等筛选的乳酸菌复合系中就包含有能形成孢子 兼性耗氧或者需氧的同型发酵产乳酸的凝固芽胞杆菌, 该细菌还能产生木聚糖酶, 这可能也是 CA 组中半纤维素组分含量显著下降的原因之一 [35]. 4 结论 干玉米秸秆和白菜废弃物密闭混贮能确保干秸秆保质贮存近半年时间不变质, 添加纤维素酶还能优化干玉米秸秆的木质纤维组分含量, 使中性洗涤纤维 NDF 与酸性洗涤纤维 ADF 含量显著下降, 改善贮存品质, 迅速降低发酵 ph 值, 抑制有害菌生长, 提高乳酸发酵程度. 综合考虑酶制剂成本与贮存效果等因素, 生产实践中推荐使用低添加量 纤维素酶 ( 原料鲜重的 0.%). 参考文献 [References] 杨道兰, 汪建旭, 冯炜弘, 张艳, 尹燕, 王永林. 花椰菜茎叶与玉米秸 秆的混贮品质 [J]. 草业科学, 204, 3 (3): [Yang DL, Wang JX, Feng WH, Zhang Y, Yin Y, Wang YL. Effects of brocooli stems and leaves and maize straw mix-ensiling on silage quality [J]. Pratacult Sci, 204, 3 (3): ] 2 赵拓. 添加剂对玉米秸秆与白菜混贮品质影响及细菌多样性研 究 [D]. 兰州 : 兰州理工大学, 206 [Zhao T. Effects of microbial additives on the mixed-silage quality for corn stover and cabbage waste and bacterial diversity [D]. Lanzhou: Lanzhou University of Technology, 206] 3 任海伟, 窦俊伟, 赵拓, 李雪雁, 李志忠, 李金平, 孙文斌, 黄娟娟. 添加 剂对玉米秸秆和莴笋叶混贮品质的影响 [J]. 草业学报, 206, 25 (0): [Ren HW, Dou JW, Zhao T, Li XY, Li ZZ, Li JP, Sun WB, Huang JJ. Effect of additives on mixed silage quality of corn stover and asparagus lettuce leaves [J]. Acta Pratacult Sin, 206, 25 (0): 42-52] 4 王典, 李发弟, 张养东, 卜登攀, 孙鹏, 周凌云. 马铃薯淀粉渣和玉米 秸秆混合青贮料对肉牛瘤胃内环境及血清生化指标的影响 [J]. 动物营养学报, 202, 24 (7): [Wang D, Li FD, Zhang YD, Bo DP, Sun P, Zhou LY. Mixed Silage of potato pulp and corn straw affects rumen environment and serum biochemical parameters of beef cattle [J]. Chin J Anim Nutr, 202, 24 (7): ] 5 李欣新, 张永根, 张微微, 张宁, 刘凯玉, 李春雷, 姚庆, 王艳菲. 玉米浆与干稻秸以不同比例混合对黄贮饲料发酵品质和营养成分的影响 [J]. 动物营养学报, 203, 25 (): [Li XX, Zhang YG, Zhang WW, Zhang N, Liu KY, Li CL, Yao Q, Wang YF. Effects of mixing corn steep liquor with dry rice straw in different proportions on fermentation quality and nutrient composition of yellow rice straw silage feed [J]. Chin Anim Nutr, 203, 25 (): ] 6 叶杭, 张文昌, 邹长连, 张国轶, 陈国富, 庄益芳. 木聚糖酶对稻草青贮饲料品质的影响 [J]. 中国农学通报, 205, 3 (): [Ye H, Zhang WC, Zou CL, Zhang GY, Chen GF, Zhuang YF. Effects of xylanase on quality of rice straw silage [J]. Chin Agric Sci Bull, 205, 3 (): 45-49] 7 李春霞. 纤维酶制剂对甘蔗梢营养成分的影响 [D]. 福州 : 福建农林大学, 200 [Li CX. Effects of fiber enzymes on nutritions of sugarcane tip [D]. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 200] 8 许能祥, 董臣飞, 顾洪如, 程云辉, 张文洁, 丁成龙. α- 淀粉酶对不同 NSC 含量稻草青贮品质的影响 [J]. 草业学报, 205, 24 (): [Xu NX, Dong CF, Gu HR, Cheng YH, Zhang WJ, Ding CL. Effects of α-amylase on fermentation of rice (Oryza sativa) straw [J]. Acta Pratacult Sci, 205, 24 (): 46-54] 9 张诗, 林芝, 余豪闯, 罗宗志, 庄益芳. 酶制剂和绿汁发酵液对巨菌草青贮品质的影响 [J]. 草业科学, 207, 34 (8): [Zhang S, Lin Z, Yu HC, Luo ZZ, Zhuang YF. Effects of enzyme and fermented green juice on silage quality of Pennisetum sp. [J]. Pratacult Sci, 207, 34 (8): ] 0 Khota W, Pholsen S, Higgs D, Yimin Cai. Natural lactic acid bacteria population of tropical grasses and their fermentation factor analysis of silage prepared with cellulase and inoculant [J]. J Dairy Sci, 206, 99 (2): Dehghani MR, Weisbjerg MR, Hvelplund T, Hvelplund T, Kristensen NB. Effect of enzyme addition to forage at ensiling on silage chemical composition and NDF degradation characteristics [J]. Livestock Sci, 202, 50 (-3): Weinberg ZG, Ashbell G, Azrieli A, Brukental L. Ensiling peas, ryegrass and wheat with additives of lactic acid bacteria (LAB) and cell wall degrading enzymes [J]. Grass Forage Sci, 993, 48 (): Ni KK, Wang FF, Zhu BG, Yang JX, Zhou GA, Pan Y, Tao Y. Effects of lactic acid bacteria and molasses additives on the microbial community and fermentation quality of soybean silage [J]. Bioresour Technol, 207, 238: Li LH, Sun YM, Yuan ZH, Kong XY, Wao Y, Yang LG, Zhang Y, Li D. Effect of microalgae supplementation on the silage quality and anaerobic digestion performance of Manyflower silvergrass [J]. Bioresour Technol, 205, 89 (0): 胡宗福, 常杰, 萨仁呼, 王思珍, 牛化欣. 基于宏基因组学技术检测全株玉米青贮期间和暴露空气后的微生物多样性 [J]. 动物营养学报, 207, 29 (0): [Hu ZF, Chang J, Sarnhu, Wang SZ, Niu HX. Microbial diversity of whole-plant maize during ensilage and after air exposure analyzed by metagenomics technology [J]. Chin J Anim Nutr, 207, 29 (0): -] 6 陶莲, 刁其玉. 青贮发酵对玉米秸秆品质及菌群构成的影响 [J]. 动 Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报

10 06 纤维素酶对干玉米秸秆 / 白菜废弃物混贮品质的影响及 5 期 物营养学报, 206, 28 (): [Tao L, Diao QY. Effects of ensiling on fermentation quality and bacteria composition of corn stalk [J]. Chin J Anim Nutr, 206, 28 (): ] 7 任海伟, 窦俊伟, 赵拓, 李雪雁, 李志忠, 李金平, 孙文斌, 黄娟娟. 添加剂对玉米秸秆和莴笋叶混贮品质的影响 [J]. 草业学报, 206, 25 (0): [Ren HW, Dou JW, Zhao T, Li XY, Li ZZ, Li JP, Sun WB, Huang JJ. Effects of additives on the mixed silage quality of corn stover and asparagus lettuce leaves [J]. Acta Pratacult Sin, 206, 25 (0): 42-52] 8 任海伟, 赵拓, 李金平, 李雪雁, 李志忠, 徐娜, 王永刚, 喻春来, 高晓航, 王晓力. 玉米秸秆与废弃白菜混贮料的发酵特性及其乳酸菌分离鉴定 [J]. 草业科学, 205, 32 (9): [Ren HW, Zhao T, Li JP, Li XY, Li ZZ, Xu N, Wang YG, Yu CL, Gao XH. Identification of lactic acid bacteria and fermentation characteriatics of mixed ensilages of corn stover and cabbage waste [J]. Pratacult Sci, 205, 32 (9): ] 9 赵拓. 添加剂对玉米秸秆与白菜混贮品质影响及细菌多样性研究 [D]. 兰州 : 兰州理工大学, 206 [Zhao T. Effect of microbial additives on the mixed-silage quality for corn stover and cabbage waste and bacterial diversity [D]. Lanzhou: Lanzhou University of Technology, 206] 20 许颖, 马德胜, 宋文枫, 魏小芳. 6S rdna 高通量测序技术分析油藏微生物多样性 [J]. 应用与环境生物学报, 206, 22 (3): [Xu Y, Ma DS, Song WF, Wei XF. 6S rdna-assisted high-throughput sequencing analysis of microbial diversity in oil reservoirs [J]. Chin J Appl Environ Biol, 206, 22 (3): ] 2 席兴军, 韩鲁佳, 原慎一郎, 野中和久. 添加乳酸菌和纤维素酶对玉米秸秆青贮饲料品质的影响 [J]. 中国农业大学学报, 2003, 8 (2): 2-24 [Xi XJ, Han LJ, Hara Shin-ichiro, Nanaka Kazuhisa. Effects of lactobacillus and cellulase on the quality of corn stover silage [J]. J Chin Agric Univ, 2003, 8 (2): 2-24] 22 Selmer-Olsen I. Enzymes as silage additives for grass clover mixtures [J]. Grass Forage Sci, 200, 49 (3): Sun ZH, Liu SM, Tayo GO, Tang SX, Tan ZL, Lin B, He ZX, Hang XF, Zhou ZS, Wang M. Effects of cellulase or lactic acid bacteria on silage fermentation and in vitro gas production of several morphological fractions of maize stover [J]. Anim Feedence Technol, 2009, 52 (3): Colombatto D, Mould FL, Bhat MK, Phipps RH, Owen E. In vitro evaluation of fibrolytic enzymes as additives for maize (Zea mays L.) silage: II. Effects on rate of acidification, fibre degradation during ensiling and rumen fermentation [J]. Anim Feed Sci Technol, 2004, (): Dean DB, Adesogan AT, Krueger N, Littell RC. Effect of fibrolytic enzymes on the fermentation characteristics, aerobic stability, and digestibility of bermudagrass silage [J]. J Dairy Sci, 2005, 88 (3): 赵苗苗, 玉柱. 添加乳酸菌及纤维素酶对象草青贮品质的改善效果 [J]. 草地学报, 205, 23 (): [Zhao MM, Yu Z. Effects of lactic acid bacteria and cellulase on napier grass silages [J]. Acta Agrest Sin, 205, 23 (): ] 27 孟庆翔, 杨军香. 全株玉米青贮制作与质量评价 [M]. 北京 : 中国农业科学技术出版社, 206 [Meng QX, Yang JX. Production and quality evaluation of whole plant corn silage [M]. Beijing: China Agricultural Science and Technology Press, 206] 28 Kung LJ, Ranjit NK. The effect of Lactobacillus buchneri and other additives on the fermentation and aerobic stability of barley silage [J]. J Dairy Sci, 200, 84 (5): Filya I. The Effect of Lactobacillus buchneri, and Lactobacillus plantarum, on the fermentation, aerobic stability, and ruminal degradability of low dry matter corn and sorghum silages [J]. J Dairy Sci, 2003, 86 (): 陶莲, 刁其玉. 青贮发酵对玉米秸秆品质及菌群构成的影响 [J]. 动物营养学报, 206, 28 (): [Tao L, Diao QY. Effects of ensiling on quality and bacteria composition of corn stalk [J]. Chin J Anim Nutr, 206, 28 (): ] 3 Kadivar H, Stapleton AE. Ultraviolet radiation alters maize phyllosphere bacterial diversity [J]. Microb Ecol, 2003, 45 (4): Heron SJE, Wilkinson JF, Duffus CM. Enterobacteria associated with grass and silages [J]. J Appl Microbiol, 200, 75 (): Li Y, Nishino N. Bacterial and fungal communities of wilted Italian ryegrass silage inoculated with and without Lactobacillus rhamnosus or Lactobacillus buchneri [J]. Lett Appl Microbiol, 20, 52 (4): Bao WC, Mi ZH, Xu HY, Zheng Y, Kwok LY, Zhang HP, Zhang WY. Assessing quality of Medicago sativa silage by monitoring bacterial composition with single molecule, real-time sequencing technology and various physiological parameters [J]. Sci Rep, 206, 6: 刘晶晶, 杨富裕, 王小芬, 刘晋欢, 袁旭峰, 崔宗均. 柳枝稷青贮用乳酸菌复合系的组成多样性及其代谢特性 [J]. 微生物学报, 205, 55 (): [Liu JJ, Yang FY, Wang XF, Liu JH, Yuan XF, Cui ZJ. Composition diversitiy and metabolic characters of lactic acid bacteria community SGL [J]. Acta Microbiol Sin, 205, 55 (): ] 36 买尔哈巴 艾合买提, 樊振, 李越中, 古丽斯玛依 艾拜都拉, 乌斯满 依米提. 瘤胃中纤维素分解菌的分离 鉴定及其产酶条件的优化 [J]. 微生物学报, 203, 53 (5): [Aihemaiti M, Fan Z, Li YZ, Aibaidoula G, Yimit W. Isolation and identification of rumen bacteria for cellulolytic enzyme production [J]. Acta Microbiol Sin, 203, 53 (5): ] 37 Cai Y, Suyanandana P, Saman P, Benno Y. Classification and characterization of lactic acid bacteria isolated from the intestines of common carp and freshwater prawns [J]. J Gen Appl Microbiol, 999, 45 (4): 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol