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靖宗
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1 中国水产科学 2016 年 11 月, 23(6): Journal of Fishery Sciences of China 研究论文 DOI: /SP.J 斑节对虾谷氨酸脱氢酶基因克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响周发林 1 1,, 陈劲松 2, 黄建华 1, 杨其彬 1, 邱丽华 1, 马振华 1 1, 江世贵 1. 中国水产科学研究院南海水产研究所, 农业部南海渔业资源开发利用重点实验室, 广东广州 ; 2. 上海海洋大学水产与生命学院上海摘要 : 采用 cdna 末端快速扩增技术 (rapid amplification of cdna ends, RACE) 获得了斑节对虾 (Penaeus monodon) 谷氨酸脱氢酶基因 (PmGDH) 的 cdna 序列该序列全长 2386 bp, 开放阅读框 (ORF) 为 1677 bp, 3ʹ 非编码区 (UTR) 为 688 bp, 包括含有 27 个碱基的 poly(a) 尾, 5ʹ 非编码区 (UTR) 为 21 bp ORF 可编码 558 个氨基酸, 预测分子量为 kd, 理论等电点为 6.57 序列含有 ELFV dehydrog N 与 NAD bind 1 Glu DH 两个保守结构域, 37 个磷酸化位点, 3 个糖基化位点通过同源性相似性以及系统进化树分析, 斑节对虾的 GDH 基因与凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei)gdh 基因的同源性和相似性最高, 并与其聚为一支采用荧光定量的方法研究了 PmGDH 基因在斑节对虾不同组织氨氮胁迫过程中差异表达情况结果表明, PmGDH 的 mrna 在各组织中都有表达, 其中, 在肌肉组织中表达量最高, 其次为眼柄神经, 在血淋巴与肠组织中表达量最低 96 h 氨氮胁迫后, 荧光定量 PCR 分析结果表明 PmGDH 在肝胰腺和鳃组织中的表达与对照组相比都具有显著差异 (P<0.05), 都具有不同程度的表达上调表明 PmGDH 在氨氮代谢方面具有重要的作用, 参与了斑节对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应关键词 : 斑节对虾 ; 谷氨酸脱氢酶 ; 氨氮胁迫 ; 基因克隆 ; 组织表达中图分类号 : S917 文献标志码 : A 文章编号 : (2016) 谷氨酸脱氢酶 (Glutamate dehydrogenase, EC , 简称 GDH) 作为一种线粒体酶广泛存在于植物动物和微生物中, 是氨基酸分解代谢的关键性酶, 其在动物肝肾和脑等组织中广泛分布, 活性很强, 可催化谷氨酸发生氧化脱氨基反应, 在甲壳动物氨氮代谢过程中发挥非常重要的作用 [1 2] 根据现有文献报道, 谷氨酸脱氢酶共有 4 种亚型, 其中 GDH-1 和 GDH-2 是小型六聚体酶, 广泛分布于动植物组织中, 在氨同化过程中起着重要作用 [3 5] ; GDH-3 是一类分子较大的谷氨酸脱氢酶, 作用于谷氨酸盐的分解代谢过程, 只在真菌和原生生物中有所发现 [6] ; 目前 GDH-4 仅发现于真菌中 [4] 在人类体内 GDH-1 与 GDH-2 都存在, GDH-2 在酸性条件下活性更高, 除了可以降低体内氨氮浓度, GDH 还有助于器官维持体内酸碱平衡 [7] [8] Jin 等于 2015 年的研究表明 GDH-1 可以通过调控癌细胞内的 α- 酮戊二酸含量来维持癌细胞内的氧化还原平衡在甲壳动物中, 关于谷氨酸脱氢酶基因的研究目前还比较少 Wang [9] 等于 2012 年对中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) 的 GDH 基因进行了克隆, 结果表明其开放阅读框长度为 1695 bp, 编码 564 个氨基酸, 并发现其对甲 [10] 壳动物的渗透调节起着重要作用熊泽泉于 2010 年对 5 种十足目甲壳动物的 GDH 序列片段进行了克隆, 发现 GDH 氨基酸序列十分保守, 但是在脊椎动物与无脊椎动物中稍有差异, 其中脊椎动物 GDH 中的一个甘氨酸在无脊椎动物中变收稿日期 : ; 修订日期 : 基金项目 : 虾产业技术体系项目 (CARS-47); 广东省省级科技计划项目 (2013B , 2014B ); 广东省海洋与渔业科技推广专项 (A201501A06); 海南省自然科学基金项目 (313117); 深圳市生物产业发展专项资金现代农业生物产业推广扶持计划项目 (NYSW ). 作者简介 : 周发林 (1975 ), 男, 副研究员, 从事水产动物遗传育种与分子生物学研究. zhoufalin@aliyun.com 通信作者 : 江世贵, 研究员. jiangsg@21cn.com

2 第 6 期周发林等 : 斑节对虾谷氨酸脱氢酶基因克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响 1237 [11] 成了丙氨酸 Li 等于 2009 年对凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 的 GDH 基因进行了克隆, 发现凡纳滨对虾体内也存在两种 GDH 基因, GDH A 和 GDH B, 其中 GDH A 开放阅读框 1422 bp, 编码 474 个氨基酸, 而 GDH B 开放阅读框大小 1656 bp, 编码 552 个氨基酸, 并且两者前 462 个氨基酸序 [12] 列完全相同刘胜男等于 2015 年的研究表明, 在氨氮胁迫条件下, 三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus) 的鳃组织以及肝胰腺中的 GDH 基因都 [2] 有不同程度的表达上调李少飞于 2014 年对中国明对虾 (Fenneropenaeus chinensiss) 的谷氨酸脱氢酶进行克隆和功能分析, 结果表明该基因 cdna 序列全长 1779 bp, 在氨氮解毒代谢过程中发挥了重要作用在斑节对虾 (Penaeus monodon) 中, 还未见 GDH 基因的相关报道氨氮是水产养殖环境中的一种重要环境污染因子, 对甲壳动物机体的免疫系统生长发育组织损伤渗透调节代谢等都有重要影响 [13 15] 目前, 我们对斑节对虾氨氮胁迫的应答和氨氮代谢分子调控机制的研究尚不够深入, 特别是其氨氮解毒代谢途径中起到调控作用的关键基因研究仍较为缺乏 [16] 已有的研究表明, 谷氨酸脱氢酶基因在中国明对虾的氨氮解毒代谢过程中发挥着至关重要的作用 [2] 因此, 本实验通过 RACE 技术克隆得到斑节对虾谷氨酸脱氢酶基因 (PmGDH) cdna 序列全长, 分析了其在斑节对虾不同组织及在氨氮胁迫过程中在斑节对虾肝胰腺与鳃组织内各时间点的表达变化规律, 希望能为斑节对虾氨氮胁迫应答以及体内氨氮代谢分子调控机理的解析提供一定的基础数据, 并为斑节对虾养殖健康发展提供科学依据 1 材料与方法 1.1 实验材料实验所用的斑节对虾养殖于中国水产科学研究院南海水产研究所深圳基地选取体长 14~16 cm, 体重为 35~40 g 的亚成虾用于 cdna 克隆, 以及肝胰腺脑神经眼柄神经肌肉胃肠鳃淋巴胸神经和卵巢等组织的表达分析选取体长 6~7 cm, 体重 3~4 g 的幼虾用于氨氮胁迫实验实验用虾在水温 (25±1) 盐度为 30 的循环水池中暂养 3 d 后使用 1.2 总 RNA 的提取及 cdna 第一链的合成总 RNA 的提取按照 Trizol Reagent (Invitrogen) 的操作说明书进行操作, 提取斑节对虾上述各组织以及氨氮胁迫各时间点样品的总 RNA, 通过琼脂糖凝胶电泳确定其完整度用于 RACE 分析的样品按照 PrimeScript II 1stStrand cdna Synthesis Kit 的操作说明书进行反转录其他用于荧光定量表达分析的样品依照 PrimeScript RT reagent Kit With gdna Eraser (Perfect Real-time) (TaKaRa) 的使用说明进行反转录模板为 500 ng 的总 RNA, 所得 cdna 用 β-actin 引物检测后稀释 10 倍, 80 保存备用 1.3 斑节对虾谷氨酸脱氢酶基因的 cdna 克隆根据本实验室转录组测序所得的谷氨酸脱氢酶序列片段, 用 Primer 5.0 软件设计特异性引物, 结合 RACE 技术获得谷氨酸脱氢酶基因的 cdna 全长所用引物见表 1 Tab. 1 引物名称 primer GT-F1 GT-R1 GT-F2 GT-R2 GT-F3 GT-R3 GTS1 GTS2 GTA1 GTA2 β-actin-f β-actin-r GTD-F GTD-R 表 1 实验中所用引物序列 Oligonucleotide primers used in the experiments 引物序列 (5 3 ) sequence (5 3 ) AAATGTTGCGGTTAGGAA GGTTTTGGCGAAAGTATCT CGCCGACGAGGTAAAGG GCCAACATGCCAAAAAGG CATTGTCCACTCTGGTTTG TCCCTGTGTTGCCATTAT GGTGACGACCTCTGGATGGCG AGGCTCGTCCGCACCATCTG TCCACAACCTGACACCC GCCCTCACTACGGATGTTC AGTAGCCGCCCTGGTTGTAGA TTCTCCATGTCGTCCCAGT GATGGCTCAATCTACAAC TCTCCTTCATAAGTCTCAG 用途 function 已知片段验证 cdna cloning 已知片段验证 cdna cloning 已知片段验证 cdna cloning 3 RACE 5 RACE 内参基因 reference gene 荧光定量 PCR RTFQ-PCR 1.4 序列分析利用 Emboss( 软件预测氨基酸序列 ; 对推导出的蛋白序列进行

3 1238 中国水产科学第 23 卷蛋白理化特性预测用 ProtParam 软件 ( expasy.org/protparam/); 通过 SMART 4.0 ( embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?genomic= 1) 进行蛋白结构域分析 ; 信号肽预测用 SingalP 3.0( 程序 ; 糖基化位点预测利用 ( NetNGlyc/); 磷酸化位点预测用 NetPhos( cbs.dtu.dk/services/netphos/); 用 NCBI 中的 Blast 程序 ( 搜索用于谷氨酰胺合成酶同源性和相似性分析与系统树构建的氨基酸序列 ; 多重序列比对采用 Clustal X 程序 ; 利用 Clustal X 程序和 MEGA 6.0 软件, 构建 NJ 系统进化树 ; 利用 GOR 方法 ( fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html) 进行二级结构预测, 三维结构预测采用 SWISS- MODEL 软件 1.5 斑节对虾 PmGDH 基因的表达分析斑节对虾 PmGDH 基因组织表达分析取 3 尾体长 14~16 cm 雌虾的肝胰腺脑神经眼柄神经肌肉胃肠鳃淋巴胸神经和卵巢组织 ( 每个样品约 10 mg), 3 尾虾的同种组织样品混合均匀, 并用 RNA Later (Ambion) 保存, 用于斑节对虾 PmGDH 基因组织表达分析根据斑节对虾谷氨酸脱氢酶基因的全长序列设计荧光定量 PCR 引物 GTD-F 和 GTD-R( 表 1), 选 β-actin 为内参基因 ( 表 1) 以斑节对虾的不同组织 ( 眼柄神经脑组织淋巴肝胰腺胃肠鳃肌肉血淋巴胸神经 ) 的 cdna 为模板进行荧光定量 RT-PCR 扩增反应体系为 10 μl, 包括 5 μl SYBR Premix Ex Taq(Tli RnaseH Plus) (Ta- KaRa), 0.2 μl 引物 (10 μmol/l), 1.5 μl 模板, 双蒸水补足 10 μl, 并以蒸馏水代替模板设置阴性对照, 每个样品设 3 个重复, 反应程序为 95 预变性 30 s; 95 变性 20 s, 60 退火 5 s, 45 个循环 ; 65 延伸 15 s; 熔解温度从 55 升至 97 ; 37 冷却 5 min 实验数据采用相对 C T 法 (2 ΔΔC T 法 ) 进行谷氨酸脱氢酶 mrna 的表达量计算斑节对虾 PmGDH 基因氨氮胁迫后的表达分析预实验共设计 6 个氨氮浓度梯度, 分别是 0 40 mg/l 80 mg/l 100 mg/l 120 mg/l 140 mg/l 每个浓度梯度一个泡沫箱, 每个泡沫箱放 20 L 海水, 30 尾虾挑选大小均匀的 180 尾幼虾随机分布于 6 个泡沫箱中 96 h 实验期间每隔 2 h 统计 1 次每个梯度的死亡数量, 捞取死虾预实验期间不投喂任何饵料 96 h 实验结束后, 通过直 [17] 线内插法算出半致死浓度 (LC 50 ) 为 90 mg/l, 并通过公式求出其安全浓度 (SC) [18] 为 9 mg/l 正式实验共设计 3 组, 分别是高浓度胁迫组, 胁迫浓度为半致死浓度 90 mg/l; 低浓度胁迫组, 胁迫浓度为安全浓度 9 mg/l; 对照组, 使用养殖用的海水每一组都设 3 个平行, 每个平行一个泡沫箱通过向实验用水中添加氯化铵 ( 分析纯 ) 的方式来控制氨氮浓度, 每 12 h 换一次实验用水, 每次全部换掉, 与预实验相同, 每个泡沫箱加入 20 L 海水, 放 30 尾虾, 温度为 (29.0±1.5), ph 为 7.0±0.5, 盐度为 30±0.5 每隔 2 h 统计 1 次每个泡沫箱的死亡数据, 捞取死虾 ; 分别于胁迫时间 6 h 12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 和 96 h 共 7 个时间点进行取样, 每次取样在每个泡沫箱中各选取两条活力较好的个体取其肝胰腺与鳃组织分别混合均匀保存于 RNA Later(Ambion) 中按照前述方法分别提取氨氮胁迫后各个时间点斑节对虾肝胰腺和鳃的总 RNA, 按照上述方法逆转录合成 cdna 取各个稀释后的 cdna 样品为模板, β-actin 为内参进行定量表达检测反应体系, 反应程序, 数据处理方法同上组织表达 1.6 统计学分析运用统计学软件 SPSS 18.0 进行相对独立的单因素方差分析 (ANOVA), 并进行 Duncan s 多重比较分析各组织间的差异显著性 (P<0.05 为差异显著 ) 结果表示为平均值 ± 标准差 ( x ±SD) 2 结果与分析 2.1 斑节对虾谷氨酸脱氢酶 cdna 的克隆及序列分析通过克隆得到斑节对虾谷氨酸脱氢酶 cdna 全长, 命名为 PmGDH (GenBank 登录号 : KP ) PmGDH cdna 全长 2386 bp, 开放阅读框

第 6 期周发林等 : 斑节对虾谷氨酸脱氢酶基因克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响 1239 (ORF) 长度 1677 bp, 3 非编码区 (UTR) 为 688 bp, 含有 27 个碱基的 poly(a) 尾, 5 非编码区 (UTR) 为 21 bp ORF 可编码 558 个氨基酸, 其中甘氨酸含量最高为 9.7%, 预测分子量为 61.837 kd, 理论等电点为 6.

4 第 6 期周发林等 : 斑节对虾谷氨酸脱氢酶基因克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响 1239 (ORF) 长度 1677 bp, 3 非编码区 (UTR) 为 688 bp, 含有 27 个碱基的 poly(a) 尾, 5 非编码区 (UTR) 为 21 bp ORF 可编码 558 个氨基酸, 其中甘氨酸含量最高为 9.7%, 预测分子量为 kd, 理论等电点为 6.57 本序列包含 37 个磷酸化位点 ( 其中丝氨酸位点 17 个, 苏氨酸位点 8 个, 酪氨酸位点 12 个 ), 3 个 N- 糖基化位点, 并且与其他甲壳动物 GDH 相似, 都含有 ELFV dehydrog N 与 NAD bind 1 Glu DH 两个超家族结构同时, 利用 Signal P3.0 预测显示, 此氨基酸序列 N 端前 18 个氨基酸组成信号肽, 信号肽的断裂点位于第 18 个和第 19 个氨基酸之间 ( 图 1) 2.2 同源性分析利用 GOR 法对 PmGDH 蛋白质二级结构预测后发现, 整条氨基酸序列的二级结构由 α 螺旋延伸链以及无规则卷曲构成, 其中 α 螺旋占 37.10%, 延伸链占 17.74%, 无规则卷曲比例最大占 45.16% SWISS-MODEL 结果显示, PmGDH 的三维结构由 α 螺旋以及连接的无规则卷曲构成, 蛋白结构呈不规则的三角盘状并且, PmGDH 的三维结构与人类的 GDH-1 的三维结构较相近, 同源性达到 74.65%( 图 2) 斑节对虾 GDH 基因编码的氨基酸序列经 BLAST 比对分析发现与其他生物的 GDH 具有较高的同源性从 NCBI 上检索其他物种的 GDH 氨基酸序列并利用 Clustal-X 软件对其氨基酸序列进行多重序列比对分析结果表明, 不同物种间的 GDH 序列较为保守, 其中, PmGDH 与凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei: ACC ) 相似度最高达到 98%, 其次是中国明对虾 (Fenneropenaeus chinensis: AIB ), 同源性也达到了 97% 与其他节肢动物的同源性为: 中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis:aeo ) 89%, 佛罗里达弓背蚁 (Eriocheir sinensis: EFN ) 81%, 豌豆长管蚜 (Acyrthosiphon pisum: XP_ ) 81%, 家蚕 (Bombyx mori: ABD )77%, 蝇蛹金小蜂 (Nasonia vitripennis: XP_ ) 77%, 黑腹果蝇 (Drosophila melanogaster: CAA ) 75% 其与脊椎动物 GDH 的同源性也很高, 与非图 1 斑节对虾 GDH 基因的 cdna 全长序列及推导的氨基酸序列两边每行标注的序号是指核苷酸和氨基酸的位置 ; 起始密码子 (ATG) 和终止密码子 (TAA) 用下划线标出 ; poly(a) 尾巴用斜体字标出 ; -- 为信号肽切割位点 ; 两个方框中分别为 : ELFV dehydrog N 超家族和 NAD bind 1 Glu DH 超家族. Fig. 1 Nucleotid and amino acid sequences of PmGDH The serial numbers on both sides of each row refer to the location of the nucleotide and amino acid; start codon (ATG) and termination codon (TAA) are underlined; the poly (A) signal is marked in italics; The cleavage site for the mitochondrial signal peptide is indicated by -- ; the completed ELFV dehydrog N super family and NAD bind 1 Glu DH super family domain are boxed.

1240 第 23 卷中国水产科学洲爪蟾(Xenopus laevis: NP_001087023.1)与小家西洋鲑(Salmo salar: NP_001117108.1)的同源性都鼠 (Mus musculus: NP_032159.1) 的同源性都为为 72%, 与智人(Homo sapiens: CAA30521.

1) 和秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditis elegans: NP_502267.1)的同源性分别为 64%和 63% (图 3) 利用 MEGA 6.

5 1240 第 23 卷中国水产科学洲爪蟾(Xenopus laevis: NP_ )与小家西洋鲑(Salmo salar: NP_ )的同源性都鼠 (Mus musculus: NP_ ) 的同源性都为为 72%, 与智人(Homo sapiens: CAA )的同 74%, 与大猩猩(Pan troglodytes: AAU )和大源性为 71%, 与斑马鱼(Danio rerio: NP_ ) 的同源性为 70%, 与环纹背带线虫(Teladorsagia circumcincta: AEO ) 和秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditis elegans: NP_ )的同源性分别为 64%和 63% (图 3) 利用 MEGA 6.0 软件, 采用 NJ 法构建了 PmGDH 及其他物种的 GDH 的系统进化树(图 4) 从系统树可以看出, 节肢动物的 GDH 聚类亲缘图2 斑节对虾 GDH 蛋白与人类 GDH-1 蛋白三维结构空间示意图 Fig. 2 The three-dimensional ribbon structure of PmGDH protein and Homo sapiens GDH-1 关系较近, 无脊椎动物与脊椎动物的 GDH 明显的被区分开来其中, 斑节对虾的 PmGDH 氨基酸序列先与凡纳滨对虾的 GDH 聚为一支后又与图 3 待续 Fig.3 to be continued

6 第 6 期周发林等 : 斑节对虾谷氨酸脱氢酶基因克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响 1241 ( 续图 continued) Fig. 3 图 3 PmGDH 的氨基酸序列与其他物种 GDH 的氨基酸多重序列比对 Multiple alignment of the predicted amino acid sequence of PmGDH with other eukaryote GDH amino acid sequences 中国明对虾的 GDH 聚在一起, 最后与其他节肢动物聚合 2.3 PmGDH 基因的组织表达分析选择 β-actin 作为参照, 利用实时荧光定量 PCR 技术对 PmGDH 基因在斑节对虾各组织中的表达进行检测 PmGDH 在各组织的表达情况如图 5 所示由图可以看出, PmGDH 在斑节对虾的脑组织眼柄神经鳃组织淋巴肝胰腺胃胸神经肠组织肌肉心脏以及血淋巴中均有表达, 且各组织中表达量存在显著差异 (P<0.05), 其中肌肉组织中表达量最高, 其次在眼柄神经, 鳃组织, 以及肝胰脏中表达量都较高, 而在肠组织与血淋巴中的表达量最低 ( 图 5) 2.4 PmGDH 基因不同浓度氨氮胁迫下表达分析通过 Real-time PCR 检测, 在不同浓度氨氮胁迫过程中斑节对虾 GDH 基因在肝胰腺中的表达的变化趋势如图 6 结果表明, 低浓度组与高浓度组在氨氮胁迫实验开始后的表达量都有所上调并显著高于对照组 (P<0.05) 低浓度组在 12 h 达到峰值并在 24 h 后开始下降并趋于平稳而高浓度组在实验开始 6 h 迅速达到第 1 个峰值之后出现表达下调, 但与对照组差异并不显著 (P<0.05), 之后

7 1242 中国水产科学第 23 卷图 4 利用 MEGA 6.0 软件构建的基于 PmGDH 氨基酸序列的 NJ 系统进化树 Fig. 4 NJ phylogenetic tree based on PmGDH amino acid sequences by MEGA 6.0 图 5 斑节对虾 GDH 基因在各组织表达的情况 M: 肌肉 ; E: 眼柄 ; G: 鳃 ; HE: 肝胰脏 ; L: 淋巴 ; H: 心脏 ; S: 胃 ; B: 脑 ; TG: 胸神经 ; I: 肠 ; HA: 血淋巴. 小写字母不同表示差异性显著 (P<0.05). Fig. 5 The expression of Penaeus monodon GDH in different tissues M: muscle; E: eyestalk nerve; G: gill; HE: hepatopancreas; L: lymph; H: heart; S: stomach; B: brain; TG: thoracic ganglia; I: intestines; HA: haemolymph. Values with different letters are significantly different from each other (P<0.05). 在 48 h 又开始上调并在 72 h 到达第 2 个峰值, 显著高于对照组 (P<0.05) 在不同浓度氨氮胁迫过程中斑节对虾 GDH 图 6 斑节对虾肝胰腺中 PmGDH 基因在氨氮胁迫过程中表达变化情况同一时间内小写字母不同表示实验组与对照组差异性显著 (P<0.05). Fig. 6 Expression profiles of PmGDH gene in Penaeus monodon hepatopancreas during ambient ammonia stresses Values with different letters at the same time are significantly different from the control group (P<0.05). 基因在鳃组织中表达的变化趋势与在肝胰腺中有些类似 ( 图 7) 高浓度组与低浓度组的变化趋势有所不同在低浓度组中, GDH 基因的表达量在实验开始 6 h 后明显下调并显著低于对照组 (P< 0.05),

8 第 6 期周发林等 : 斑节对虾谷氨酸脱氢酶基因克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响 1243 之后开始表达上调并在 48 h 到达峰值, 在 72 h 后开始下降并趋于正常水平而在高浓度组中, GDH 基因的表达水平在实验开始 6 h 明显上调并显著高于对照组 (P<0.05), 到达极值 12~48 h 期间有所恢复, 48 h 后再次表达上调并在 72 h 到达第二个峰值, 显著高于对照组 (P<0.05), 之后在 96 h 表达明显被抑制, 显著低于对照组 (P<0.05) 图 7 斑节对虾鳃组织中 PmGDH 基因在氨氮胁迫过程中表达变化情况同一时间内小写字母不同表示实验组与对照组差异性显著 (P<0.05). Fig. 7 Expression profiles of PmGDH gene in Penaeus monodon gill during ambient ammonia stresses Values with different letters at the same time are significantly different from the control group (P<0.05). 3 讨论本实验成功克隆了斑节对虾谷氨酸脱氢酶 (PmGDH) 基因, 经多重序列比对发现, 该氨基酸 [11] [2] 序列十分保守, 与凡纳滨对虾和中国明对虾相似性最高, 序列都存在 3 个糖基化位点, 在 N 端有信号肽序列, 并且都含有 ELFV dehydrog N 与 NAD bind 1 Glu DH 两个保守结构域 PmGDH 蛋白质二级结构预测结果显示其由 α 螺旋延伸链以及无规则卷曲构成, 各部分所占比例与大菱鲆 (Scophthalmus maximus)gdh 十分相似 [1] 此外, PmGDH 的三维结构与人类的 GDH-1 的三维结构较相近, 同源性达到 74.65% 上述结果表明, 本实验克隆得到的是斑节对虾 GDH 基因 PmGDH 基因在斑节对虾各组织中广泛表达, 但各组织间的表达量差异很大, 存在组织特异性表达, 推测 PmGDH 的这种组织特异性与 GDH 参与氨基酸分解以及丙氨酸和脯氨酸循环有关 [19 20] PmGDH 基因在斑节对虾肌肉中表达量最高, 其次在鳃组织, 肝胰腺以及眼柄中表达量也很高, [11] 而在血淋巴中表达量最低, 这一趋势与 Li 等于 [2] 2009 年和李少飞于 2014 年对凡纳滨对虾和中国明对虾 GDH 基因组织表达分析的结果基本一致谷氨酸脱氢酶在斑节对虾肌肉中大量表达, 这可能与甲壳动物的大量氨基酸代谢发生在肌肉中, 而谷氨酸脱氢酶又直接参与氨基酸分解代谢有关 [2] 除此之外, GDH 在维持甲壳动物体内氨氮浓度以及氨氮解毒代谢过程中发挥着重要作用, 而肝胰腺与鳃是甲壳动物的主要氨氮解毒代谢场所与氨氮排泄器官 [12], 所以 PmGDH 在肝胰腺与鳃组织中表达量也很高甲壳动物为排氨动物, 正常情况下体内大部分的氨氮可通过尿素及尿酸的形式经鳃排出体外 [21 22] 当甲壳动物受到氨氮胁迫, 可通过肝胰腺以及鳃等组织解毒代谢来降低体内氨氮浓度, 减轻外界高氨环境对组织器官造成的损伤 [23 25], 已有的研究表明, 谷氨酸脱氢酶 ( 去氨氮方向 ) 催化形成谷氨酸, 随后谷氨酰胺合成酶催化谷氨酸反应形成无毒的谷氨酰胺加以储存, 起到降低体内氨氮的作用 [26] 为了研究谷氨酸脱氢酶(GDH) 在斑节对虾氨氮解毒代谢中的作用, 本研究分别使用高浓度组与低浓度组对斑节对虾进行氨氮胁迫实验, 分析了在不同浓度氨氮胁迫过程中斑节对虾 GDH 基因在肝胰腺与鳃组织中表达变化趋势肝胰腺是甲壳动物的主要氨氮解毒代谢器官, 其中含有大量的酶与蛋白质, 而且水生动物摄入的饲料蛋白后被吸收的氨基酸有 80% 进入肝代谢 [27] 本实验结果表明, 肝胰腺中 PmGDH 基因对于氨氮的刺激反应十分迅速, 高浓度组与低浓度组在实验开始 6 h 后表达量都明显上调, 显著高于对照组 (P<0.05) 所不同的是, 高浓度组的上调幅度更大, 而且随着实验的进行, 高浓度组的反应也比低浓度组更加强烈一些 : 低浓度组在 12 h 到达峰值, 显著高于对照组 (P<0.05), 随后就逐渐下

9 1244 中国水产科学第 23 卷降并趋于稳定, 最终与对照组无显著差异 (P<0.05); 而高浓度组在 6 h 迅速到达第 1 个峰值之后表达量有所下降, 在 48 h 再次表达上调并于 96 h 到达第 2 个峰值, 显著高于对照组这表明氨氮低浓度组也就是安全浓度对于斑节对虾的影响不大, 可以通过机体自身调节消除, 而高浓度组也就是半致死浓度对于斑节对虾的生理影响较为严重, 需要机体进行量两次调节, 而 PmGDH 基因在实验过程中的显著上调也说明 PmGDH 基因在氨氮解毒代谢过程中发挥了重要作用相关研究表明, 胡子鲇在两种不同浓度的 NH 4 Cl 胁迫下肝中的谷氨酸脱氢酶 ( 去氨化方向 ) 活性显著上调, 同时谷氨酸含量也随即上调 [28] [2] 李少飞于 2014 年的研究结果表明, 中国明对虾肝胰腺中的 FcGDH 基因在 4 mg/l 与 16 mg/l 两组氨氮浓度胁迫下均表现出不同程度的表达上调, 并且 16 mg/l 浓度组上调幅度大于 4 mg/l 浓度组鳃是大多数水生甲壳动物氨氮排泄器官 [29] 在氨氮胁迫过程中, PmGDH 在鳃组织中的表达规律与在肝胰腺中相似, 高浓度组在 6 h 迅速达到第 1 个峰值并显著高于对照组与低浓度组 (P< 0.05), 之后在 72 h 达到第 2 个峰值, 而在 96 h 又急速下降并显著低于对照组 (P<0.05); 低浓度组则在实验开始后逐步表达上调, 在 48 h 达到峰值并显著高于对照组 (P<0.05), 之后就开始下降最终趋于正常值 (P<0.05) 这表明 PmGDH 在鳃组织中的表达模式与在肝胰腺中的类似, 在氨氮代谢过程中发挥重要作用, 当甲壳动物体内氨氮浓度过高时, 机体会通过降低鳃组织对 NH 3 的通透性, + 增加对 NH 4 的排出来进行调节 [25] 而高浓度组在 96 h 突然大幅度表达下调, 推测是由于长时间的高浓度氨氮胁迫损伤了斑节对虾鳃组织, 已有研究表明, 甲壳动物的鳃组织在氨氮胁迫下会受到氧化损伤, 鳃上皮细胞结构受到破坏, 并且随着氨氮浓度的升高这种损伤也相应加重 [30] 参考文献 : [1] Mu X S. Gene cloning, specific expression in different tissues and recombinant protein preparation of 4 biomarkers in Scophthalmus maximus[d]. Qingdao: Ocean University of China, [ 穆小生. 大菱鲆 4 种生物标志物基因的克隆, 组织特异性表达研究及重组蛋白制备 [D]. 青岛 : 中国海洋大学, 2013.] [2] Li S F. cdna cloning and expression analysis of the enzyme genes related to ammonia metabolism in Fenneropenaeus chinensis and study on effect of these enzymes in the detoxification of ammonia following ambient ammonia stresses [D]. Dalian: Dalian Ocean University, [ 李少飞. 中国对虾氨氮代谢酶基因的 cdna 克隆及其在氨氮解毒代谢过程中的作用 [D]. 大连 : 大连海洋大学, 2014.] [3] Benachenhou-Lahfa N, Forterre P, Labedan B. Evolution of glutamate dehydrogenase genes: evidence for two paralogous protein families and unusual branching patterns of the archaebacteria in the universal tree of life[j]. J Mol Evol, 1993, 36(4): [4] Miñambres B, Olivera E R, Jensen R A, et al. A new class of glutamate dehydrogenases (GDH) biochemical and genetic characterization of the first member, the AMP-requiring nad-specific GDH of Streptomyces clavuligerus[j]. J Biol Chem, 2000, 275(50): [5] Brown J R, Doolittle W F. Archaea and the prokaryoteto-eukaryote transition[j]. Microbiol Mol Biol Rev, 1997, 61(4): [6] Andersson J O, Roger A J. Evolution of glutamate dehydrogenase genes: evidence for lateral gene transfer within and between prokaryotes and eukaryotes[j]. BMC Evol Biol, 2003, 3(1): [7] Spanaki C, Plaitakis A. The role of glutamate dehydrogenase in mammalian ammonia metabolism[j]. Neurotoxic Res, 2012, 21(1): [8] Jin L, Li D, Alesi G N, et al. Glutamate dehydrogenase 1 signals through antioxidant glutathione peroxidase 1 to regulate redox homeostasis and tumor growth[j]. Can Cell, 2015, 27(2): [9] Wang Y, Li E, Yu N, et al. Characterization and expression of glutamate dehydrogenase in response to acute salinity stress in the Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis[j]. PloS ONE, 2012, 7(5): e [10] Xiong Z Q. Study on glutamate dehydrogenase gene of the economic macro-decapods (Crustacea) species[d]. Shanghai: East China Normal University, [ 熊泽泉. 十足目 (Crustacea: Decapoda) 经济甲壳动物谷氨酸脱氢酶基因的研究 [D]. 上海 : 华东师范大学, 2010.] [11] Li E, Arena L, Chen L, et al. Characterization and tissue-specific expression of the two glutamate dehydrogenase cdnas in Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei[j]. J Crust Biol, 2009, 29(3):

10 第 6 期周发林等 : 斑节对虾谷氨酸脱氢酶基因克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响 1245 [12] Liu S N, Pan L Q, Liu M Q. Effects of ammonia exposure on key detoxification metabolism associated genes expression in swimming crab Portunus trituberculatus[j]. Transactions Oceanology and Limnology, 2015(2): [ 刘胜男, 潘鲁青, 刘茂琪. 氨氮胁迫对三疣梭子蟹解毒代谢关键基因表达的影响 [J]. 海洋湖沼通报, 2015(2): ] [13] Chen J C, Chen C T. Changes of osmotic and electrolyte concentrations in the haemolymph of Penaeus japonicus exposed to ambient ammonia[j]. Comp Biochem Physiol C: Pharmacol Toxicol Endocrinol, 1996, 114(1): [14] Cheng W, Chen J C. The virulence of enterococcus to freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii and its immune resistance under ammonia stress[j]. Fish Shellfish Immunol, 2002, 12(2): [15] Wang J, Qu K M, Liu H Y, et al. Acute toxic effects of nutrite and non-ion ammonia on Fenneropenaeus chinensis at different dissolved oxygen levels[j]. Marine Fisheries Research, 2008, 28(6): 1 6. [ 王娟, 曲克明, 刘海英, 等. 不同溶氧条件下亚硝酸盐和氨氮对中国对虾的急性毒性效应 [J]. 海洋水产研究, 2008, 28(6): 1 6.] [16] Huang J H, Li Y, Yang Q B, et al. Comparison of tolerance to ammonia-n in Penaeus monodon families[j]. South China Fisheries Scince, 2012, 8(6): [ 黄建华, 李永, 杨其彬, 等. 斑节对虾家系氨氮耐受性的比较 [J]. 南方水产科学, 2012, 8(6): ] [17] Zheng W Y, Weng E Q. Introduction to Environmental Toxicology[M]. Xiamen: Xiamen University Press,1993: [ 郑微云, 翁恩琪. 环境毒理学概论 [M]. 厦门 : 厦门大学出版社, 1993: ] [18] Zang W L, Xu X C, Dai X L, et al. Toxic effects of Zn 2+, Cu 2+, Cd 2+ and NH 3 on Chinese prawn[j]. Chin J Oceanol Limnol, 1993, 3: [19] Willett C S, Burton R S. Characterization of the glutamate dehydrogenase gene and its regulation in a euryhaline copepod[j]. Comp Biochem Physiol B: Biochem Mol Biol, 2003, 135(4): [20] Plaitakis A, Zaganas I. Regulation of human glutamate dehydrogenases: implications for glutamate, ammonia and energy metabolism in brain[j]. J Neurosci Res, 2001, 66(5): [21] Regnault M. Nitrogen excretion in marine and fresh-water crustacea[j]. Biol Rev, 1987, 62(1): [22] Weihrauch D, Morris S, Towle D W. Ammonia excretion in aquatic and terrestrial crabs[j]. J Exp Biol, 2004, 207(26): [23] Hong M, Chen L, Sun X, et al. Metabolic and immune responses in Chinese mitten-handed crab (Eriocheir sinensis) juveniles exposed to elevated ambient ammonia[j]. Comp Biochem Physiol C: Toxicol Pharmacol, 2007, 145(3): [24] Chen J M, Chen J C. Study on the free amino acid levels in the hemolymph, gill, hepatopancreas and muscle of Penaeus monodon exposed to elevated ambient ammonia[j]. Aquat Toxicol, 2000, 50(1): [25] Yue F. Immune response and detoxification mechanism of swimming crab Portunus trituberculatus exposed to ambient ammonia[d]. Qingdao: Ocean University of China, [ 岳峰. 三疣梭子蟹在氨氮胁迫下免疫应答与解毒代谢机制的研究 [D]. 青岛 : 中国海洋大学, 2010.] [26] Wang J Y, Zhu S G, Xu C F. Biological Chemistry[M]. Beijing: Higher Education Press, 2002: [ 王镜岩, 朱胜庚, 徐长法. 生物化学 : 第 3 版 [M]. 北京 : 高等教育出版社, 2002: ] [27] Walton D J. Stereochemistry of reduction of D-glyceraldehyde catalyzed by a nicotinamide adenine dinucleotide phosphate dependent dehydrogenase from skeletal muscle[j]. Biochemistry, 1973, 12(18): [28] Saha N, Dutta S, Haussinger D. Changes in free amino acid synthesis in the perfused liver of an air-breathing walking catfish, Clarias batrachus infused with ammonium chloride: a strategy to adapt under hyperammonia stress[j]. J Exp Zool, 2000, 286(1): [29] Li Y. Artificial selection of Penaeus monodon and impacts of ammonia-n on immune parameters, detoxification[d]. Shanghai: Shanghai Ocean University, [ 李永. 斑节对虾人工选育及氨氮对其免疫, 解毒代谢影响 [D]. 上海 : 上海海洋大学, 2012.] [30] Zeng Y Y, Chen X F, Ai C X, et al. Effects of Ammonia-N stress on haemolymph physiological and biochemical indexes and microstructure of gill and hepatopancreas of Scylla paramamosain[c]. The 11th Annual Meeting and Academic Seminar of the Chinese Society of Crustaceans, 2011: 107. [ 曾媛媛, 陈曦飞, 艾春香, 等. 氨氮胁迫对拟穴青蟹血淋巴生理生化指标及鳃和肝胰腺显微结构的影响 [C]. 中国甲壳动物学会第十一届年会暨学术研讨会论文摘要集, 2011: 107.]

11 1246 中国水产科学第 23 卷 Molecular cloning and expression analysis of glutamate dehydrogenase (GDH) in Penaeus monodon under ammonia nitrogen stress ZHOU Falin 1, CHEN Jinsong 1, 2, HUANG Jianhua 1, YANG Qibin 1, QIU Lihua 1, MA Zhenhua 1, JIANG Shigui 1 1. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou , China; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai , China Abstract: Glutamate dehydrogenase (GDH) is found widely in many plants, animals and microorganisms as a mitochondrial enzyme, and it is the key enzyme in amino acid catabolism. It is distributed extensively in animal tissues such as the hepatopancreas, kidney and brain. GDH activity is very strong and it may catalyze the glutamic acid oxidative deamination reaction. To explore the function of the GDH gene during ammonia nitrogen metabolism of black tiger shrimps (Penaeus monodon), the complete cdna sequence of GDH from P. monodon (denoted PmGDH) was obtained by rapid amplification of cdna ends. The full length of the sequence of PmGDH was 2386 bp containing a 5 UTR of 21 bp and a 3 UTR of 688 bp, and the length of the open reading frame (ORF) was 1677 bp encoding 558 amino acids. The predicted molecular mass of the amino acid (aa) sequence was kd with an estimated pi of 6.57, and there was a poly A with 27 bp. In common with the GDH of other animals, the structure of the PmGDH protein contained two conservative domains, ELFV dehydrog N and NAD bind 1 Glu DH. There were 37 phosphorylation sites and three glycosylation sites in this protein. Through multiple sequence alignment and phylogenetic tree analysis, it was concluded that the homology and similarity between PmGDH and the GDH of Litopenaeus vannamei was the highest. Analysis of the tissue expression pattern of PmGDH showed that the PmGDH mrna was expressed in all tissues tested, including lymphoid tissue, ovary, eyestalk nerve, brain, stomach, muscle, intestines, thoracic nerve, hemolymph, hepatopancreas and gill. The highest levels were found in muscle, the next highest in the eyestalk and the lowest levels in the hemolymph. To study the functions of PmGDH in P. monodon under conditions of ammonia nitrogen stress, the hepatopancreas and gill were sampled at 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h and 96 h after exposure to different concentrations of ammonia nitrogen. The expression of PmGDH in the hepatopancreas and gill was significantly different compared with the control group (P<0.05), and the expression levels differed between hepatopancreas and gill. The results showed that PmGDH may play an important role in shrimp ammonia metabolism and may be involved in responses to acute ammonia stress. Key words: Penaeus monodon; GDH; ammonia nitrogen stress; gene clone; tissue expression Corresponding author: JIANG Shigui. jiangsg@21cn.com

498 上海海洋大学学报 25 卷也发现了 GS 的存在, 而且甲壳动物的神经组织中 GS 的表达也己有报道 [7-9] 但是到目前为止, 对虾中 GS 基因的克隆也仅见于中国明对虾 (Fenneropenaeuschinensis) [3] 与凡纳滨对虾 (Litopenaeusvannamei

498 上海海洋大学学报 25 卷也发现了 GS 的存在, 而且甲壳动物的神经组织中 GS 的表达也己有报道 [7-9] 但是到目前为止, 对虾中 GS 基因的克隆也仅见于中国明对虾 (Fenneropenaeuschinensis) [3] 与凡纳滨对虾 (Litopenaeusvannamei 文章编号 :674-5566(206)04-0497- DOI:0.2024/jsou.205090560 斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响,2 陈劲松, 周发林, 江世贵, 杨其彬, 马振华, 邱丽华, 傅明骏,,2 李运东, 黄建华 (. 中国水产科学研究院南海水产研究所农业部南海渔业资源开发利用重点实验室, 广东广州 50300;2. 上海海洋大学水产与生命学院,