498 上海海洋大学学报 25 卷也发现了 GS 的存在, 而且甲壳动物的神经组织中 GS 的表达也己有报道 [7-9] 但是到目前为止, 对虾中 GS 基因的克隆也仅见于中国明对虾 (Fenneropenaeuschinensis) [3] 与凡纳滨对虾 (Litopenaeusvannamei

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琛妆铭宾
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1 文章编号 : (206) DOI:0.2024/jsou 斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响,2 陈劲松, 周发林, 江世贵, 杨其彬, 马振华, 邱丽华, 傅明骏,,2 李运东, 黄建华 (. 中国水产科学研究院南海水产研究所农业部南海渔业资源开发利用重点实验室, 广东广州 50300;2. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 20306) 摘要 : 根据本实验室构建的斑节对虾 (Penaeusmonodon)cDNA 文库得到的 EST 序列, 利用 RACE 技术获得了斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因 (PmGS) 的 cdna 全长序列, 进行了相关生物信息学分析, 在此基础上采用荧光定量的方法研究了 PmGS 基因在斑节对虾不同组织氨氮胁迫过程中差异表达情况该序列全长 420 bp, 开放阅读框 (ORF) 为 086bp,3 非编码区 (UTR) 为 294bp, 包括含有 27 个碱基的 poly(a) 尾,5 非编码区 (UTR) 为 40bp ORF 可编码 36 个氨基酸, 预测分子量为 ku, 理论等电点为 6.9 序列含有一个谷氨酰胺结合结构域 (Gln synt_c),8 个磷酸化位点,2 个糖基化位点斑节对虾和中国明对虾的 GS 基因的相似性最高, 达 99% PmGS mrna 在斑节对虾各组织中都有表达, 在淋巴组织中表达量最高, 其次为鳃组织, 在胸神经中的表达量最低 96h 高浓度氨氮胁迫后,PmGS mrna 在肝胰腺中的表达水平显著高于对照组, 但在鳃中的表达水平显著低于对照组 (P<0.05) 以上结果暗示,PmGS 在氨氮代谢方面具有重要的作用, 可能参与了斑节对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应关键词 : 斑节对虾 ; 谷氨酰胺合成酶 ; 基因克隆 ; 氨氮胁迫 ; 组织表达中图分类号 :S97,S 文献标志码 :A 谷氨酰胺合成酶 (glutaminesynthetase,gs) 广泛存在于动植物细胞中, 在甲壳动物氨氮代谢过程中发挥着重要作用 [] 谷氨酰胺合成酶通过将体内过多的氨和谷氨酸转换成谷氨酰胺, 降低体内氨氮的浓度, 达到解毒代谢的目的谷氨酰胺是一种中性无毒物质, 容易穿透细胞膜, 是氨的主要运输方式排氨动物体内的氨主要是经谷氨酰胺运送到排泄部位, 如鳃等, 再经鳃内谷氨酰胺酶的分解, 借助扩散作用排出体外 [2] 谷氨酰胺合成酶 (GS) 主要有 3 种亚型, 只有 GSⅡ 型以真核生物为主要族群 [3] 到目前为止, 关于 GS 基因的克隆与功能研究主要集中在脊椎动物, 比如在仓鼠 (Chinesehamster) [4] [5] 鸡以及 [6] 人类中都曾有过报道, 但在无脊椎动物特别是甲壳动物中研究还比较少 JAMIESON 等研究发现,GS 在环节动物 E.japonensis 的原肾管和胆管细胞中均有表达, 这与 E.japonensis 氮代谢产物的排泄有关 [] 目前已从昆虫, 如埃及斑蚊 (Aedesaegypti) [7] 沙蝇 (Lutzomyialongipalpis) [8] [9] 果蝇幼虫和成虫 [0], 昆虫神经系统和肌肉 [] 脂肪体中肠马氏管 [2] [3] 丝线中发现 GS 存 [4] 在 ; 在蚊子的中肠上皮细胞卵巢脂肪体中也有发现在甲壳类动物, 如小龙虾 (Procambarus clarkiai) [5] 太平洋牡砺 (Crasostreagigas) [6] 中收稿日期 : 修回日期 : 基金项目 : 虾产业技术体系 (CARS-47); 广东省省级科技计划项目 (203B ); 广东省海洋与渔业科技推广专项 (B20400B0,A2050A06); 海南省自然科学基金项目 (337); 深圳市生物产业发展专项资金现代农业生物产业推广扶持计划项目 (NYSW ) 作者简介 : 陈劲松 (99 ), 男, 硕士研究生, 研究方向为水产动物遗传育种与分子生物学 E mail:chenjingsong99@63.com 通信作者 : 黄建华,E mail:hjh20440@sina.com.cn

2 498 上海海洋大学学报 25 卷也发现了 GS 的存在, 而且甲壳动物的神经组织中 GS 的表达也己有报道 [7-9] 但是到目前为止, 对虾中 GS 基因的克隆也仅见于中国明对虾 (Fenneropenaeuschinensis) [3] 与凡纳滨对虾 (Litopenaeusvannamei) [20], 斑节对虾 (Penaeus monodon) 中 GS 基因还未见报道氨氮是水产养殖环境中普遍存在的一种有毒物质, 是一种重要的水质指标, 其含量高低也是引发病害的一个重要因素有研究表明, 氨氮对甲壳动物机体的免疫系统生长发育组织损伤渗透调节代谢等都有重要影响 [2-24] 但目前我们对斑节对虾氨氮胁迫的应答和氨氮代谢功能的研究尚不够深入, 对于其氨氮解毒代谢途径中起到调控作用的关键酶及其基因的研究仍较为缺乏 [2] 本研究通过 RACE 技术克隆得到了谷氨酰胺合成酶基因的 cdna 序列全长, 分析了其组织表达分布, 并对其在氨氮胁迫过程中在斑节对虾肝胰腺与鳃组织内各时间点的表达变化规律进行了分析, 希望能为斑节对虾氨氮胁迫应答以及体内氨氮代谢分子调控机理的解析提供一定的基础数据, 并为斑节对虾健康养殖的发展提供科学依据材料与方法. 实验材料实验所用的斑节对虾养殖于南海水产研究所深圳基地选取体长 3~4cm, 体质量为 35~40g 的亚成虾用于肝胰腺脑神经眼柄神经肌肉胃肠鳃淋巴胸神经和卵巢组织的取样, 选取体长 6~7cm, 体质量 3~4g 的幼虾用于氨氮胁迫实验取样前分别于 27~30 充气的自然海水中暂养 3d, 所取组织均用 RNALater (Ambion) 保存.2 总 RNA 的提取及 cdna 第一链的合成总 RNA 的提取按照 Trizol Reagent (invitrogen) 的操作说明书进行操作, 提取斑节对虾上述各组织以及氨氮胁迫各时间点样品的总 RNA 用于 RACE 的样品为肌肉肝胰腺的混合样品提取的 RNA 用 NanoDrop2000/2000c 分光光度计测定纯度及浓度, 通过琼脂糖凝胶电泳确定其完整度用于做 RACE 的样品为肝胰腺组织与肌肉组织的混合样, 按照 PrimeScriptⅡ ststrandcdna SynthesisKit 的操作说明书进行反转录其他进行荧光定量的样品依照 PrimeScriptRTreagentKit WithgDNAEraser(PerfectReal time)(takara) 的使用说明进行反转录模板为 500ng 的总 RNA, 所得 cdna 用 β actin 引物检测后稀释 0 倍, -80 保存备用.3 斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因的 cdna 克隆及序列分析对本实验室构建的斑节对虾 cdna 文库中的 EST 序列进行 BLAST 分析之后, 发现其中有一条 633bp 的 EST 序列与中国明对虾谷氨酰胺合成酶序列高度同源 (92%) 然后用 Primer5.0 软件设计特异性引物, 利用 RACE 技术获得谷氨酰胺合成酶基因的 cdna 全长所用引物见表引物名称 primer GH F GH R GH F2 GH R2 GHS GHS2 GHA GHA2 β actin F β actin R GHD F GHD R 表实验中所用引物序列 Tab. Oligonuleotideprimersusedinexperiments 引物序列 (5-3 ) sequence TGTTCTATGAAACTTTAACAGACGAC GACGCCGCAGTAGTAGGGT TTCGGCATGGAACAGGAGTA CACGCAAACCTAAAATGTCTAAAAT GGTGACGACCTCTGGATGGCG AGGCTCGTCCGCACCATCTG GGTCTTGTCGTGCTTGTAG CATAGCCTGGCATTTCTG AGTAGCCGCCCTGGTTGTAGA TTCTCCATGTCGTCCCAGT ATAAGACGGTATTAGACA TTTGGAATGAAGTTAAGG 用途 function 已知片段验证已知片段验证 3 RACE 5 RACE 内参基因荧光定量 PCR 利用 Embos(htp://embos.bioinformatics. nl/) 软件预测氨基酸序列 ; 用 ProtParam 软件对推导出的蛋白序列进行蛋白理化特性预测 (htp:// web.expasy.org/protparam/); 通过 SMART4.0

3 4 期陈劲松, 等 : 斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响 499 (htp://smart. embl heidelberg. de/smart/set_ mode.cgi?genomic=) 进行蛋白结构域分析 ; 信号肽预测用 SingalP4.0(htp:// dk/services/signalp/) 程序 ; 糖基化位点预测利用 NetNGlyc(htp:// NetNGlyc/); 磷酸化位点预测用 NetPhos(htp:// 用 NCBI 中的 Blast 程序 (htp:// 搜索用于谷氨酰胺合成酶同源性和相似性分析与系统树构建的氨基酸序列 ; 多重序列比对采用 ClustalX 程序 ; 利用 ClustalX 程序和 MEGA6.0 软件, 构建 NJ 系统进化树 ; 利用 GOR 方法 (htps://npsa prabi. ibcp. fr/cgi bin/npsa _ automat.pl?page=npsa_gor4.html) 进行二级结构预测, 三维结构预测采用 SWISS MODEL 软件.4 斑节对虾 PmGS 基因的表达分析.4. 斑节对虾 PmGS 基因组织表达分析取 3 尾体长 3~4cm 雌虾进行肝胰腺脑神经眼柄神经肌肉胃肠鳃淋巴胸神经和卵巢组织的取样 ( 每个样品约 0mg), 同种组织样品混合均匀, 所取组织均用 RNA Later (Ambion) 保存, 用于斑节对虾 PmGS 基因组织表达分析根据斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因的全长序列设计荧光定量 PCR 引物 GHD F 和 GHD R ( 表 ), 选 β actin 为内参基因 ( 表 ) 以斑节对虾的不同组织 ( 眼柄神经脑组织淋巴肝胰腺胃肠鳃肌肉卵巢和胸神经 ) 以及氨氮胁迫各时间的 cdna 为模板进行荧光定量 RT PCR 扩增反应体系为 0μL, 包括 5μLSYBRPremix ExTaq(TliRnaseHPlus)(TaKaRa),0.2μL 引物 (0μmol/L),.5μL 模板, 双蒸水补足 0μL, 并以蒸馏水代替模板设置阴性对照, 每个样品设 3 个重复, 反应程序为 95 预变性 30s;95 变性 20s,60 退火 5s,45 个循环 ;65 延伸 5s; 溶解温度从 55 升至 97 ;37 冷却 5min 实验数据采用相对 CT 法 (2 ΔΔCT 法 ) 进行谷氨酰胺合成酶 mrna 的表达量计算.4.2 斑节对虾 PmGS 基因氨氮胁迫后的表达分析氨氮胁迫实验于南海水产研究所深圳养殖基地进行, 选取标粗池中的 6~7cm 的幼虾为实验材料正式实验开始之前先进行预实验, 以确定本次实验所使用的氨氮胁迫浓度本次预实验共设计 6 个氨氮浓度梯度, 分别是 mg/L 每个浓度梯度一个泡沫箱, 每个泡沫箱放 20L 海水,30 尾虾预实验所用的虾都是在混合家系的水泥池中捞取, 挑选大小均匀的 80 尾幼虾随机分布于 6 个泡沫箱中 96 h 实验期间每隔 2 小时统计一次每个梯度的死亡数量, 捞取死虾预实验期间不投喂任何饵料 [25] 96h 实验结束后, 通过直线内插法算出半致死浓度 (LC 50 ) 为 90mg/L, 并通过公式求出其安全浓度 (SC) [26], 为 9mg/L 正式实验共设计 3 组, 分别是高浓度胁迫组, 胁迫浓度为半致死浓度 90mg/L; 低浓度胁迫组, 胁迫浓度为安全浓度 9mg/L; 对照组, 使用养殖用的海水每一组都设 3 个平行, 每个平行一个泡沫箱通过向实验用水中添加氯化铵 ( 分析纯 ) 的方式来控制氨氮浓度, 每 2 小时换一次实验用水, 每次全部换掉, 与预实验相同, 每个泡沫箱加入 20L 海水, 放 30 尾虾, 温度为 (29.0±.5),pH 为 7.0±0.5, 盐度为 30±0.5 每隔两小时统计一次每个泡沫箱的死亡数据, 捞取死虾 ; 分别于胁迫时间和 96h 共 7 个时间点进行取样, 每次取样在每个泡沫箱中各选取两条活力较好的个体取其肝胰腺与鳃组织分别混合均匀保存于 RNA Later(Ambion) 中按照前述方法分别提取氨氮胁迫后各个时间点斑节对虾肝胰腺和鳃的总 RNA, 按照上述方法逆转录合成 cdna 取各个稀释后的 cdna 样品为模板,β actin 为内参进行定量表达检测反应体系, 反应程序, 数据处理方法同上组织表达.5 统计学分析运用统计学软件 SPSS8.0 进行相对独立的单因素方差分析 (ANOVA), 并进行 Duncan s 多重比较分析各组织间的差异显著性 (P<0.05 为差异显著 ) 结果表示为平均值 ± 标准差 (X± SD) 2 结果 2. 斑节对虾谷氨酰胺合成酶 cdna 的克隆及序列分析通过克隆得到斑节对虾谷氨酰胺合成酶 cdna 全长, 命名为 PmGS(GenBank 登录号 :

4 500 上海海洋大学学报 25 卷 KP984792) PmGScDNA 全长 420bp, 开放阅读框 (ORF) 长度 086bp,3 非编码区 (UTR) 为 294bp, 含有 27 个碱基的 poly(a) 尾,5 非编码区 (UTR) 为 40bp ORF 可编码 36 个氨基酸, 预测分子量为 ku, 理论等电点为 6.9 序列含有一个谷氨酰胺结合结构域 (Gln synt_c), 位于 07~356aa,8 个磷酸化位点,2 个糖基化位点 ( 图 ) 2.2 同源性分析利用 GOR 法对 PmGS 蛋白质二级结构预测后发现, 整条氨基酸序列的二级结构由 α 螺旋与无规则卷曲构成, 其中包含 6 个 α 螺旋, 占 6.90%, 无 β 折叠 SWISS MODEL 结果显示, PmGS 的三维结构由 α 螺旋以及连接的无规则卷曲构成, 蛋白结构呈圆盘状并且,PmGS 的三维结构与人类的 GS 的三维结构较相近, 同源性达到 69.0%( 图 2) 斑节对虾 GS 基因的全长序列经 BLAST 比对分析发现与其他生物的 GS 基因具有较高的同源性从 NCBI 上检索其他物种的 GS 氨基酸序列并利用 Clustal X 软件对其氨基酸序列进行多重序列比对分析结果表明 : 不同物种间的 GS 序列较为保守, 其中,PmGS 与中国明对虾 (Fenneropenaeuschinensis) 同源性最高达到 99%, 其次是凡纳滨对虾 (Litopenaeusvannamei), 一致性也达到了 93%, 与沙漠蝗 (Schistocerca gregaria) 和黑腹果蝇 (Drosophilamelanogaster) 的相似度分别为 72% 与 7%, 与小鼠 (Mus musculus) 原鸡 (Galusgalus) 和鲤 (Cyprinus carpio) 的相似度都为 70%, 与牛 (BosTaurus) 和野猪 (Susscrofa) 的相似度为 69%, 与人 (Homo sapiens) 的同源性为 68%( 图 3) 利用 MEGA 6.0 软件, 采用 NJ 法构建了 PmGS 及其他物种的 GS 基因的系统进化树 ( 图 4) 从系统树可以看出, 无脊椎动物与脊椎动物的谷氨酰胺合成酶明显被区分开来其中, 斑节对虾的 GS 基因先与中国明对虾的 GS 基因聚为一支后又与凡纳滨对虾的 GS 基因聚在一起, 最后与其他节肢动物聚合 2.3 PmGS 基因的组织表达分析选择 β actin 作为参照, 利用实时荧光定量 PCR 技术对 GS 基因在斑节对虾各组织中以及在氨氮胁迫过程中肝胰脏与鳃组织中的表达进行检测 PmGS 在各组织的表达情况如图 5 所示, 可以看出,PmGS 在斑节对虾的脑组织眼柄神经鳃组织淋巴肝胰腺胃胸神经肠组织肌肉和卵巢中均有表达, 其中淋巴中表达量最高, 其次在鳃组织, 肠组织, 以及肝胰脏中表达量都较高, 而在卵巢与胸神经中的表达量最低 ( 图 5) 2.4 PmGS 基因不同浓度氨氮胁迫下表达分析通过 RT PCR 检测, 在不同浓度氨氮胁迫过程中斑节对虾 GS 基因在肝胰腺中表达的变化趋势如图 6 所示结果表明, 高浓度胁迫组与低浓度胁迫组的表达趋势有所不同高浓度胁迫组中 GS 基因反应比较迅速, 表达量在 6h 就迅速上调, 显著高于对照组 (P<0.05); 之后在 2~24h 期间又有所下降 ; 在 48~96h 时间段内又迅速上升并于 72h 时到达峰值, 显著高于对照组 (P< 0.05);72h 后再次下降, 但是仍显著高于对照组 (P<0.05) 低浓度组于 6~2h 时开始表达上调, 并于 2h 到达最大值, 显著高于对照组 (P< 0.05), 之后开始下降并趋于稳定, 接近正常值 ( 图 6) 在不同浓度氨氮胁迫过程中斑节对虾 GS 基因在鳃组织中表达的变化趋势如图 7 所示高浓度组与低浓度组几乎呈现同样的趋势, 在胁迫过程中 GS 基因的表达明显被抑制, 两组都呈下降趋势特别是高浓度组, 在 6~24h 急剧下降, 6h 后都显著低于对照组 (P<0.05); 低浓度组是在 0~2h 时快速下降, 在 2h 到达最低点, 显著低于对照组 (P<0.05); 在 2h 后逐渐趋于稳定, 但是仍显著低于对照组 (P<0.05, 图 7)

４期陈劲松等斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响５０１图１斑节对虾ＧＳ基因的ＤＮＡ全长序列及推导的氨基酸序列Ｆｇ１ＮｕｍｓｑｕｓｆｐｕｓｍＧＳ两边每行标注的序号是指核苷酸和氨基酸的位置起始密码子ＡＴＧ和终止密码子ＴＡＡ用下划线标出

5 ４期陈劲松等斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响５０１图１斑节对虾ＧＳ基因的ＤＮＡ全长序列及推导的氨基酸序列Ｆｇ１ＮｕｍｓｑｕｓｆｐｕｓｍＧＳ两边每行标注的序号是指核苷酸和氨基酸的位置起始密码子ＡＴＧ和终止密码子ＴＡＡ用下划线标出字体加粗标注为磷酸化ｙＡ尾巴用斜体字标出方框所示为谷氨酰胺结合结构域位点灰色阴影标注为糖基化位点ｐＴｓｕｍｂｂｓｓｆｗｆｓｆｕｍｓＡＴＧｍＴＡＡｓｕｇｐｓｐｙｓｓｇｇｂｓｗｇｙｓｙｓｐｙｓｇｓｍｋｓＧｓｕｕｍｓｓｗｂｘ

6 ５０２上海海洋大学学报图２斑节对虾ＧＳ蛋白与人类ＧＳ蛋白三维结构空间示意图Ｆｇ２ＴｍｓｂｂｓｕｕｆｐｍｇｓｐＨｍｓｐｓｇｓ图３ＰｍＧＳ的氨基酸序列与其他物种ＧＳ的氨基酸多重序列比对Ｆｇ３ＭｕｐｇｍｆｐｍｓｑｕｆｐｍｇｓｗｕｋｙＧＳｍｓｑｕｓ２５卷

7 4 期陈劲松, 等 : 斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响 503 图 4 利用 MEGA6.0 软件构建的基于 PmGS 基因所编码氨基酸序列的 NJ 系统进化树 Fig.4 NJphylogenetictreebasedonPmGSamino acidsequencesbymega6.0 BosTaurus( 牛 :NP_ );Susscrofa( 野猪 :NP_ );Homosapiens( 人 :AAB30693.);Musmusculus ( 小鼠 :NP_ );Galusgalus( 原鸡 :AAC6936.); Cyprinuscarpio( 鲤 :AGN52748.);Drosophilamelanogaster( 黑腹果蝇 :NP_ );Schistocercagregaria( 沙漠蝗 : AEV89758.);Litopenaeusvannamei( 凡纳滨对虾 :AEO );Fenneropenaeuschinensis( 中国明对虾 :ACB59229.) 图 6 斑节对虾肝胰腺中 PmGS 基因在氨氮胁迫过程中表达变化情况 Fig.6 ExpresionprofilesofPmGSgeneinPenaeus monodonhepatopancreasduring ambientammoniastreses 图中数值为平均值 ± 标准差 (X±SD), 同一时间内小写字母不同表示实验组与对照组差异性显著 (P<0.05) Values(expresedasmean±SD) withdiferentletersatthe sametimearesignificantlydiferentwiththecontrolgroup(p< 0.05). 3 讨论图 5 斑节对虾 GS 基因在各组织中表达的情况 Fig.5 TheexpresionofPenaeusmonodon GSindiferenttisues L. 淋巴 ;G. 鳃 ;I. 肠 ;HE. 肝胰脏 ;E. 眼柄神经 ;B. 脑 ;M. 肌肉 ;S. 胃 ;O. 卵巢 ;TG. 胸神经 ; 图中数值为平均值 ± 标准差 (X±SD), 小写字母不同表示差异性显著 (P<0.05) L.lymph;G.gil;I.intestines;HE.hepatopancreas;E.eyestalk nerve;b.brain;m.muscle;s.stomach;o.ovary;tg.thoracic ganglia;values(expresedasmean±sd)withdiferentleters aresignificantlydiferentfromeachother(p<0.05). 谷氨酰胺在氨基酸代谢过程中扮演重要的角色, 其主要参与谷氨酸分解与合成过程, 是氨基酸代谢循环重要的中间转换物质谷氨酰胺主要由谷氨酸和 NH + 4 经谷氨酰胺合成酶催化合成 [27], 由此可见谷氨酰胺合成酶是谷氨酰胺合成途径必不可少的关键酶, 在机体氨基酸代谢过程中具有重要作用然而到目前为止对斑节对虾 GS 基因的研究仍属空白本研究首次克隆了斑节对虾谷氨酰胺合成酶 PmGS 基因, 经 BLAST 发现, 该蛋白极为保守, 与其他物种的谷氨酰胺合成酶 GS 一样, 具有一个 C 端结构域, 谷氨酰胺结合结构域 (Gln synt_c), 位于 07~356aa [3,20] PmGS 与其他物种的 GS 氨基酸序列比对发现, 斑节对虾 GS 与其他物种的 GS 序列均具有较高的同源性, 说明 GS 在种间是保守的系统进化分析表明斑节对虾首先与中国明对虾聚为一支, 同源性高达 99%, 然后又与凡纳滨对虾聚合, 其同源性也达到了 93% 上述结果表明, 该序列是斑节对虾 GS 基因

8 504 上海海洋大学学报 25 卷图 7 斑节对虾鳃组织中 PmGS 基因在氨氮胁迫过程中表达变化情况 Fig.7 ExpresionprofilesofPmGSgeneinPenaeus monodongilduringambientammoniastreses 图中数值为平均值 ± 标准差 (X±SD), 同一时间内小写字母不同表示实验组与对照组差异性显著 (P<0.05) Values(expresedasmean±SD) withdiferentletersatthe sametimearesignificantlydiferentwiththecontrolgroup(p< 0.05). 斑节对虾 GS 基因在各组织中广泛表达, 其表达分布趋势与凡纳滨对虾 GS 基因相类似 [20] 其中在淋巴组织中表达量最高, 这可能与淋巴是甲壳动物主要免疫与渗透调节器官有关已有研究表明, 谷氨酰胺合成酶可能通过间接的方式参与免疫防御抵抗病原微生物感染, 可增强水生动物免疫防御机能和抗病力 [3,28] 除了淋巴组织,PmGS 在鳃组织中表达量也很高, 可能与其是大多数水生甲壳动物氨氮排泄器官有关 [29] 已有的研究表明水生甲壳动物氨基酸的 α 氨基形成的氨, 主要经过谷氨酰胺的形式运送到排泄部位鳃之后, 经鳃内谷氨酰胺酶的分解, 游离的氨便可借助扩散作用排出体外 [30] 除此之外, PmGS 在肠组织中的表达量也很高已有研究表明, 谷氨酰胺可促进水生动物肠上皮细胞的增殖 [3] 分化与肠上皮细胞雷帕霉素靶蛋白基因的表 [32] 达, 提高细胞蛋白质合成能力和肠黏膜蛋白质合成量 [33], 并能提高肠上皮细胞的抗氧化能力 [34], 因此, 推断 PmGS 在斑节对虾肠组织也有类似功能甲壳动物为排氨动物, 体内氨氮可以通过尿素和尿酸排出体外 [35-36] 某些甲壳动物在氨氮胁迫条件下, 可通过肝胰腺和鳃组织合成谷氨酰胺以降低体内氨氮浓度, 减轻外界高氨环境对组织器官造成的损伤 [27,37-38] 为了研究谷氨酰胺合成酶 (GS) 在斑节对虾氨氮解毒代谢中的作用, 本研究分析了在不同浓度氨氮胁迫过程中斑节对虾 GS 基因在肝胰腺与鳃组织中表达变化趋势, 结果表明在不同浓度氨氮胁迫下,PmGS 在肝胰腺中的表达量均有不同程度的上调, 且与对照组差异显著肝胰腺是甲壳动物的主要代谢器官, 其中含有大量的酶与蛋白质, 而 GS 参与细胞内多种酶活动, 包括氨基酸代谢谷氨酰胺合成细胞信号以及神经递质谷氨酸的循环等 [2] 本研究的实验结果表明肝胰腺中 PmGS 基因对于氨氮的刺激反应十分迅速, 高浓度组在 6h 时就到达第一个峰值, 可以推断肝胰腺可能是谷氨酰胺合成酶储存和释放的主要器官以及氨氮解毒代谢场所此外,PmGS 表达量在不同时间点达到峰值, 并且高浓度组上调速度与幅度明显大于低浓度组这一结果表明, 在一定范围内, 随着氨氮胁迫浓度的提高,PmGS 在肝胰腺中的表达也相应地上调鳃是大多数水生甲壳动物氨氮排泄器官 [30] 与在肝胰腺中不同, 不同浓度氨氮胁迫条件下, PmGS 在鳃组织中的表达量都呈下降趋势, 且高浓度组尤为明显低浓度组在开始胁迫后就开始下降, 在 2h 到达最低点并显著低于对照组, 之后有所回升并趋于稳定 ; 而高浓度组在 2h 后开始几乎一直处于下降趋势, 并且出现较大波动, 于 96h 降到最低点氨氮胁迫条件下,PmGS 在鳃组织中的表达受到抑制, 并且氨氮浓度越高抑制作用越明显推测可能是由于在氨氮胁迫条件下, 斑节对虾的鳃组织遭到了破坏, 导致 PmGS 基因在鳃组织中表达下调已有研究表明, 拟穴青蟹 (Scylaparamamosain) 的鳃组织在氨氮胁迫下会受到氧化损伤, 鳃上皮细胞结构受损, 并且随着氨氮浓度的升高这种损伤也相应加重 [39] 参考文献 : [] JAMIESONBGM.Theultrastructureoftheoligochaeta[M]. London:AcademicPresInc.Ltd,98. [2] 李少飞. 中国对虾氨氮代谢酶基因的 cdna 克隆及其在氨氮解毒代谢过程中的作用 [D]. 大连 : 大连海洋大学, 204. LISF.cDNAcloningandexpresionanalysisoftheenzyme genesrelated to ammonia metabolism in Fenneropenaeus

9 4 期陈劲松, 等 : 斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响 505 chinensisand study on efectofthese enzymes in the detoxificationofammoniafolowingambientammoniastreses [D].Dalian:DalianOceanUniversity,204. [3] 贾玉萍. 中国明对虾 SWD 抗菌肽, 谷氨酰胺合成酶和 Ras 基因的表达与功能研究 [D]. 济南 : 山东大学, JIA Y P. Expresing and functionalanalysis ofswd antimicrobialpeptide, glutamine synthetase and ras in Chineseshrimp Fenneropenaeuschinensis[D]. Ji'nan: ShandongUniversity,2008. [4] HAYWARDBE,HUSSAINA,WILSONRH,etal.The cloningandnucleotidesequenceofcdna foranamplified glutaminesynthetasegenefrom thechinesehamster[j]. NucleicAcidsResearch,986,4(2): [5] HAIFENG P,YOUNG A P.Thestructureofthechicken glutaminesynthetase encodinggene[j].gene,989,8 (): [6] GIBBSCS,CAMPBELLKE,WILSONRH.Sequenceofa human glutamine synthetase cdna[j]. Nucleic Acids Research,987,5(5):6293. [7] SMARTT C T, CHILESJ, LOWENBERGER C, etal. Biochemicalanalysisofabloodmeal inducedaedesaegypti glutaminesynthetasegene[j]. InsectBiochemistryand MolecularBiology,998,28(2): [8] RAMALHO ORTIG?OJM,TEMPORALP,DEOLIVEIRA SM P,etal.Characterizationofconstitutiveandputative diferentialy expresed mrnas by means ofexpresed sequencetags,diferentialdisplayreversetranscriptase PCR andrandomlyamplifiedpolymorphicdna PCRfromthesand flyvectorlutzomyialongipalpis[j].memóriasdoinstituto OswaldoCruz,200,96():05-. [9] CAIZZIR,RITOSSAF.TheenzymeglutaminesynthetaseI ofdrosophilamelanogasterisasociatedwithamodifiedrna [J].BiochemicalGenetics,983,2(3/4): [0] DEPINTOV,CAGGESEC,PREZIOSOG,etal.Purification ofthe glutamine synthetase I isozyme of Drosophila melanogasterand structuraland functionalcomparison of glutaminesynthetasesiand I[J].BiochemicalGenetics, 987,25(/2): [] BOTHAM RP,BEADLEDJ,HARTRJ,etal.Synaptic vesicledepletionandglutamateuptakeinanerve muscle preparation ofthe locust, Locusta migratoria L[J]. Experientia,978,34(2): [2] LEVENBOOK L,KUHN J.Propertiesanddistributionof glutaminesynthetaseinthesouthernarmyworm,prodenia eridania[j].biochimicaetbiophysicaacta,962,65(2): [3] HIRAYAMAC,KONNOK,SHINBOH.Utilizationofammonia asanitrogensourceinthesilkworm,bombyxmori[j]. JournalofInsectPhysiology,996,42(0): [4] SMARTTCT,KILEYLM,HILLYERJF,etal.Aedes aegyptiglutaminesynthetase:expresionandgenestructure [J].Gene,200,274(/2): [5] MCKINNONE,HARGITTAIPT,GROSSFELDRM,etal. Glutaminecycleenzymesinthecrayfishgiantnervefiber: implicationsforaxon to gliasignaling[j].glia,995,4 (3): [6] TANGUYA,BOUTETI,MORAGAD.Molecularcharacterization ofthe glutamine synthetase gene in the Pacific oyster Crasostreagigas:expresionstudyinresponsetoxenobiotic exposureand developmentalstage[j]. Biochimica et BiophysicaActa(BBA) GeneStructureandExpresion, 2005,68(2/3):6-25. [7] LINSER PJ,TRAPIDO ROSENTHALH G,ORONA E. Glutamine synthetase is a glial specific marker in the olfactoryregionsofthelobster(panulirusargus) nervous system[j].glia,997,20(4): [8] ALLODIS,BRESSANCM,CARVALHOSL,etal.Regionaly specific distribution of the binding of anti glutamine synthetase and anti S00 antibodies and of Datura stramonium lectininglialdomainsoftheopticlobeofthe giantprawn[j].glia,2006,53(6): [9] SULLIVANJM,BENTONJL,SANDEMANDC,etal. Adultneurogenesis:acommonstrategyacrosdiversespecies [J].JournalofComparativeNeurology,2007,500(3): [20] 孙武卫. 低盐胁迫下凡纳滨对虾消减 cdna 文库构建及谷氨酰胺合成酶 cdna 克隆和表达 [D]. 湛江 : 广东海洋大学,202. SUNW W.ConstructionofaSSH cdna library,cdna cloningandexpreslonofglutaminesynthetaseinlitopenaeus vannamei, Boone induced by hypo osmotic stres[d]. Zhanjiang:GuangdongOceanUniversity,202. [2] CHENJC,CHENCT.Changesofosmoticandelectrolyte concentrationsin the haemolymph ofpenaeusjaponicus exposedtoambientammonia[j].comparativebiochemistry and Physiology PartC: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology,996,4(): [22] 黄建华, 李永, 杨其彬, 等. 斑节对虾家系氨氮耐受性的比较 [J]. 南方水产科学,202,8(6): HUANGJH,LIY,YANG Q B,etal.Comparisonof tolerancetoammonia N inpenaeusmonodonfamilies[j]. SouthChinaFisheriesScience,202,8(6): [23] CHENGW,CHENJC.ThevirulenceofEnterococcusto freshwaterprawnmacrobrachium rosenbergianditsimmune resistanceunderammonia stres[j]. Fish & Shelfish Immunology,2002,2(2): [24] 王娟, 曲克明, 刘海英, 等. 不同溶氧条件下亚硝酸盐和氨氮对中国对虾的急性毒性效应 [J]. 海洋水产研究, 2008,28(6):-6. WANGJ,QUKM,LIUHY,etal.Acutetoxicefectsof nitriteandnon ionammoniaonfenneropenaeuschinensisat diferentdisolved oxygen levels[j]. Marine Fisheries Research,2008,28(6):-6.

10 506 上海海洋大学学报 25 卷 [25] 郑微云, 翁恩琪. 环境毒理学概论 [M]. 厦门 : 厦门大学出版社,993. ZHENGW Y,WENG E Q.Introductiontoenvironmental toxicology[m].xiamen:xiamenuniversitypres,993. [26] ZANG W L,XU X C,DAIX L,etal.Toxicefectsof Zn 2+,Cu 2+, Cd 2+ and NH 3 on cflnese prawn[j]. ChineseJournalofOceanologyandLimnology,993,(3): [27] HONGM L,CHENLQ,SUNXJ,etal.Metabolicand immuneresponsesinchinesemiten handedcrab(eriocheir sinensis) juvenilesexposed toelevated ambientammonia [J]. ComparativeBiochemistryand PhysiologyPartC: Toxicology&Pharmacology,2007,45(3): [28] 杜宗君, 刘扬, 姜俊. 谷氨酰胺与水产动物免疫防御机能的关系 [J]. 水产科学,20,30(2): DUZJ,LIUY,JIANGJ.Relationshipbetweenglutamine andimmunedefensefunctionsofaquaticanimals:areview [J]FisheriesScience,20,30(2): [29] 刘胜男, 潘鲁青, 刘茂琪. 氨氮胁迫对三疣梭子蟹解毒代谢关键基因表达的影响 [J]. 海洋湖沼通报,205(2): LIUSN,PANLQ,LIUM Q.Efectsofammoniaexposure onkeydetoxificationmetabolism asociatedgenesexpresion inswimmingcrabportunustrituberculatus[j].transactions ofoceanologyandlimnology,205(2): [30] 李永. 斑节对虾人工选育及氨氮对其免疫解毒代谢影响 [D]. 上海 : 上海海洋大学,202. LIY.ArtificialselectionofPenaeusmonodonandimpactsof ammonia N on immune parameters, detoxification[d]. Shanghai:ShanghaiOceanUniversity,202. [3] JIANG J,ZHENG T, ZHOU X Q, etal. Influenceof glutamineandvitamineongrowthandantioxidantcapacity offishenterocytes[j].aquaculturenutrition,2009,5 (4): [32] 姜俊. 鲤鱼 IECsGLS 和 TOR 基因 cdna 克隆及 Gln 对 IECs 蛋白合成的影响和机理研究 [D]. 雅安 : 四川农业大学,2009. JIANGJ.CarpCyprinuscarpioIECsGLSandTOR gene cdnacloneandglntoiecsproteinsynthesisinfluenceand mechanism research [D]. Ya an: Sichuan Agricultural University,2009. [33] 叶元土, 王永玲, 蔡春芳, 等. 谷氨酰胺对草鱼肠道 L 亮氨酸,L 脯氨酸吸收及肠道蛋白质合成的影响 [J]. 动物营养学报,2007,9(): YEYT,WANG Y L,CAICF,etal.EfectsoftheL glutamineontheabsorptionofl leucine,l prolineandthe proteinsynthesisinintestineofgrascarp(ctenopharyngodon Idelus)invitro[J].ChineseJournalofAnimalNutrition, 2007,9(): [34] CHENJ,ZHOUXQ,FENGL,etal.Efectsofglutamine onhydrogenperoxide inducedoxidativedamageinintestinal epithelialcelsofjiancarp(cyprinuscarpiovar.jian)[j]. Aquaculture,2009,288(3/4): [35] REGNAULTM.Nitrogenexcretioninmarineandfresh water crustacea[j].biologicalreviews,987,62():-24. [36] WEIHRAUCH D,MORRISS,TOWLE D W.Ammonia excretioninaquaticandterestrialcrabs[j].journalof ExperimentalBiology,2004,207(26): [37] CHENJM,CHENJC.Studyonthefreeaminoacidlevels inthe hemolymph, gil, hepatopancreasand muscle of Penaeusmonodonexposedtoelevatedambientammonia[J]. AquaticToxicology,2000,50(/2): [38] 岳峰. 三疣梭子蟹在氨氮胁迫下免疫应答与解毒代谢机制的研究 [D]. 青岛 : 中国海洋大学,200. YUEF.Immuneresponseanddetoxificationmechanism of swimmingcrabportunustrituberculatusexposedtoambient ammonia[d].qingdao:oceanuniversityofchina,200. [39] 曾媛媛, 陈曦飞, 艾春香, 等. 氨氮胁迫对拟穴青蟹血淋巴生理生化指标及鳃和肝胰腺显微结构的影响 [C]// 中国甲壳动物学会第十一届年会暨学术研讨会论文摘要集. 济南 : 中国海洋湖沼学会,20. ZENGYY,CHENXF,AICX,etal.EfectsofAmmonia N stres on haemolymph physiologicaland biochemical indexesand microstructureofgiland hepatopancreasof Scylaparamamosain[C]//ThethAnnualMeetingand AcademicSeminaroftheChineseSocietyofCrustaceans.Ji nan:chineseinstituteofoceanologyandlimnology,20.

11 4 期陈劲松, 等 : 斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响 507 Molecularcloningandtheexpresionanalysisofglutaminesynthetase(GS) inpenaeusmonodonundertheconditionofammonianitrogenstres CHENJinsong,2,ZHOUFalin,JIANGShigui,YANGQibin,MAZhenhua,QIULihua,FUMingjun, LIYundong,2,HUANGJianhua (.KeyLabofSouthChinaSeaFisheryResourcesExploitationandUtilization,MinistryofAgriculture;SouthChinaSeaFisheries ResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Guangzhou 50300,Guangdong,China;2.ColegeofFisheriesandLife Science,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai 20306,China) Abstract:Theful lengthcdna sequenceofglutaminesynthetasefrom blacktigershrimps(penaeus monodon)(denotedaspmgs)wasobtainedbyhighthroughputtranscriptomesequencingandrace.onthis basis,theexpresionsofthepmgsgeneindiferenttisuesandinhepatopancreasandgilduringammonia nitrogenstresweredetectedbyfluorescence quantitativerealtimepcr.thecdnaofpmgswas420bp, thelengthoftheopenreadingframe(orf)was086bpencodingapolypeptideof36aminoacids,a5 UTRof40bpanda3 UTRof294bp.Themolecularmasofthededucedaminoacid(aa)sequencewas kDawithanestimatedpIof6.9.AndtherewasapolyAwith27bp.LikeotheranimalGSs,the structureofthepmgsproteinconsistedofaglnsynt_cdomain.therewereeightphosphorylationsitesandtwo glycosylationsitesinthisprotein.sequencealignmentanalysisandphylogeneticanalysisshowedthatthe PmGSwiththeGSofFenneropenaeuschinensisssharedasimilarityof99.45%.Analysisofthetisue expresionpaternofthepmgsshowedthatthepmgsmrnawasexpresedinaltestedtisues,including lymphoidtisue,ovary,eyestalknerve,brain,stomach,muscle,intestines,thoracicnerve,hepatopancreasand gil.withthehighestlevelsinlymphoidtisue,thesecondlevelingilandthelowestlevelinthoracic ganglia.theexpresionsofthepmgsgeneinhepatopancreasandgilsignificantlydiferfrom thecontrol group(p<0.05),andtheexpresionprofilesdiferedbetweenhepatopancreasandgil.theresultshows thatpmgsmightplayanimportantroleinshrimpammoniametabolismandbeinvolvedinresponsestoacute ammoniastres. Keywords:Penaeusmonodon;GS;geneclone;ammonianitrogenstres;tisueexpresion

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Microsoft Word 周发林_new_.doc 中国水产科学 2016 年 11 月, 23(6): 1236 1246 Journal of Fishery Sciences of China 研究论文 DOI: 10.3724/SP.J.1118.2016.16048 斑节对虾谷氨酸脱氢酶基因克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响周发林 1 1,, 陈劲松 2, 黄建华 1, 杨其彬 1, 邱丽华 1, 马振华 1 1, 江世贵 1. 中国水产科学研究院南海水产研究所,

498 上海海洋大学学报 25 卷 也发现了 GS 的存在, 而且甲壳动物的神经组织中 GS 的表达也己有报道 [7-9] 但是到目前为止, 对虾中 GS 基因的克隆也仅见于中国明对虾 (Fenneropenaeuschinensis) [3] 与凡纳滨对虾 (Litopenaeusvannamei

498 上海海洋大学学报 25 卷也发现了 GS 的存在, 而且甲壳动物的神经组织中 GS 的表达也己有报道 [7-9] 但是到目前为止, 对虾中 GS 基因的克隆也仅见于中国明对虾 (Fenneropenaeuschinensis) [3] 与凡纳滨对虾 (Litopenaeusvannamei