11. 封口膜 12. 活性炭 13. 锡箔纸 14. 柑橘种子 15. 柑橘胚性愈伤 % 酒精 17. 3% NaClO 18. NaOH 19. FDA 20. 纤维素酶 R-10 (Yakult Honsha) 21. 离析酶 R-10 (Yakult Honsha) 22. DM

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偃思梅
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柑橘原生质体融合 - 电融合 Citrus Protoplast Electrofusion 刘丹 #, 肖诗鑫 #, 邓秀新 *, 郭文武 * 园艺植物生物学教育部重点实验室, 园艺林学学院, 华中农业大学, 武汉 * 通讯作者邮箱 :xxdeng@mail.hzau.edu.cn; guoww@mail.hzau.edu.cn # 共同第一作者引用格式 : 刘丹, 肖诗鑫, 邓秀新, 郭文武.

1 柑橘原生质体融合 - 电融合 Citrus Protoplast Electrofusion 刘丹 #, 肖诗鑫 #, 邓秀新 *, 郭文武 * 园艺植物生物学教育部重点实验室, 园艺林学学院, 华中农业大学, 武汉 * 通讯作者邮箱 :xxdeng@mail.hzau.edu.cn; guoww@mail.hzau.edu.cn # 共同第一作者引用格式 : 刘丹, 肖诗鑫, 邓秀新, 郭文武. (2018). 柑橘原生质体融合 - 电融合. Bio-101 e Doi: /BioProtoc How to cite: Liu, D., Xiao, S. X., Deng, X. X. and Guo, W. W. (2018). Citrus protoplast electrofusion. Bio- 101 e Doi: /BioProtoc (in Chinese) 实验原理 : 细胞融合即细胞核来源于一个亲本, 线粒体基因组或叶绿体基因组来源于另一个亲本的融合方式在柑橘中, 我们采用电融合在交流电作用下, 双亲原生质体迅速平行排成多个串珠, 随后在直流电作用下, 部分小串珠开始解体又融合在一起, 形成新的圆球体细胞融合能有效克服有性杂交不亲和以及远缘杂交障碍等困难, 突破生殖隔离关键词 : 基因组, 电融合, 原生质体材料与试剂 1. 滤纸 2. 玻璃器皿 (90 mm) 3. 双圈定性滤纸 ( 中速 ) 4. 生根管 5. 刀片 6. 专用细胞培养皿 7. 玻璃离心管 8. 长吸管 μm 醋酸纤维微孔滤膜 10. 橡皮筋 Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 1

2 11. 封口膜 12. 活性炭 13. 锡箔纸 14. 柑橘种子 15. 柑橘胚性愈伤 % 酒精 17. 3% NaClO 18. NaOH 19. FDA 20. 纤维素酶 R-10 (Yakult Honsha) 21. 离析酶 R-10 (Yakult Honsha) 22. DMSO 23. Sucrose 24. 椰子汁 20 ml Benzylaminopurine (6-BA) 26. Kinetin (KT) 27. Naphthalene acetic acid (NAA) 28. Indole-3-acetic acid (IAA) 29. KOH 30. KH2PO4 31. KNO3 32. MgSO4 33. CuSO4 34. CaCl2 2H2O 35. NaH2PO4 2H2O 36. 甘露醇 37. BH3 营养液配制所需试剂 : 1) 麦芽提取物 2) 蔗糖 3) 谷氨酰胺 4) 七水合硫酸镁 Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 2

3 5) 磷酸二氢钾 6) 二水合氯化钙 7) 氯化钾 8) 水解酪蛋白 9) 碘化钾 10) 硼酸 11) 二水合钼酸钠 12) 五水合硫酸铜 13) 六水合氯化钴 14) 一水合硫酸锰 15) 乙二胺四乙酸 16) 七水合硫酸亚铁 17) 肌醇 18) 果糖 19) 核糖 20) 木糖 21) 甘露糖 22) 鼠李糖 23) 纤维二糖 24) 半乳糖 25) 丙酮酸钠盐 26) 柠檬酸 27) 苹果酸 Malic acid 28) 延胡索酸 Fumaric acid 29) 生物素 30) 核黄素 31) 叶酸 32) 对氨基苯甲酸 33) 氯化胆碱 Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 3

4 34) 抗坏血酸 35) 泛酸钙 36) 维生素 B1 37) 维生素 B6 38) 烟酸 39) 维生素 A 40) 维生素 D3 41) 维生素 B 培养基相关母液 ( 见溶液配方 ) 1) 肌醇储备液 (100x) 2) 甘氨酸储备液 (100x) 3) 微量储备液 (100x) 4) Fe 2+ -EDTA 储备液 (100x) 5) Vitamin 储备液 (100x) 6) 大量储备液 (100x) 7) 6-BA 储备液 (1 mg/ml) 8) KT 储备液 (1 mg/ml) 9) IAA 储备液 (1 mg/ml) 10) NAA 储备液 (1 mg/ml) 39. 培养基的配制 ( 见溶液配方 ) 1) 胚状体诱导培养基 2) 胚状体增殖培养基 3) 固体培养基 4) 悬浮培养基 5) 播种培养基 6) 生芽培养基 7) 生根培养基 8) 0.6 M EME 培养基 9) 0.15 M EME 培养基 Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 4

5 10) CPW13 ( 见溶液配方 ) 11) CPW25 ( 见溶液配方 ) 12) 电融合液 ( 见溶液配方 ) 13) BH3 液体培养基 ( 见溶液配方 ) 仪器设备 1. 酒精灯 2. 镊子 3. 三角瓶 4. 刀柄目不锈钢过滤网筛 6. 超净台 7. 摇床 8. 培养箱实验步骤 1. 材料的准备 1.1 愈伤亲本的准备胚性愈伤悬浮系建立 : 固体培养基上挑选继代 20 天左右生长旺盛, 疏松, 颗粒细小的胚性愈伤组织于液体悬浮培养基 (100 ml 三角瓶 ),120 rpm 振荡培养, 每两周继代一次, 继代 3 代后, 若悬浮愈伤状态良好, 可用于原生质体分离 1.2 叶肉亲本的准备无菌苗的培养 : 柑橘果实完全成熟时进行采摘, 之后进行单果包装, 贮存在 4 C 冷库中备用使用时从柑橘果实中取出种子并将种子表面的果肉洗掉, 将种子浸泡在 1 mol/l NaOH 中 10 min 去除表面果胶, 之后用蒸馏水清洗 3 次, 洗除 NaOH 然后剥除外种皮, 用浓度为 3% (w/v) 的 NaClO 浸泡消毒 15 min 左右, 用无菌水清洗至少 3 次, 直至无菌水变无色, 避免残留的 NaClO 对种子造成毒害作用用镊子将消毒好的种子置于垫有滤纸的玻璃皿上去除内种皮, 并接种于 MT 播 Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 5

6 种培养基上, 封口置于光下培养光照培养一段时间后, 待叶片完全转绿长势旺盛, 充分展开后, 可以用于原生质体的提取另外, 除使用无菌苗提取原生质体以外, 也可以采摘温室中的叶片叶片采摘要选择嫩绿成熟无病虫害的叶片, 采摘后先将叶片洗干净, 然后在 2% (w/v) NaClO 中浸泡消毒 15 min 左右, 然后在无菌环境中用无菌水清洗 6 次, 以免残留的 NaClO 对叶片产生毒害作用 2. 原生质体的分离 2.1 愈伤原生质体的分离 : 用长吸管吸取 1 g ( 继代 6-10 天 ) 的愈伤组织于 50 ml 的三角瓶中, 吸干悬浮培养基, 先加入 1.5 ml 0.6 EME, 后加入等体积的酶液, 封口后置于 28 C 40 r/min 恒温摇床遮光酶解 15 h 2.2 叶肉原生质体的分离 : 先加入 1.5 ml 0.6 EME 于 50 ml 的三角瓶中, 之后用解剖刀将叶片切成 0.1 cm 的细条, 及时放入预先加好的后 1.5 ml 0.6 EME 中, 避免叶片失水, 后加入等体积的酶液, 封口后置于 28 C 40 r/min 恒温摇床遮光酶解 16 h 3. 原生质体的纯化过夜酶解的原生质体经孔径为 45 μm 的不锈钢网筛去除未完全酶解的残渣, 将滤液转移至无菌的玻璃离心管中,100 x g 离心 6 min, 使原生质体沉于管底, 去除上清液之后向管内加入 3 ml 的 CPW 13 并用长吸管轻轻地吸打混匀, 然后将液体吸出并缓慢加到事先加有 6 ml CPW 26 的离心管中, 这一步骤动作一定要缓慢轻柔, 避免产生太大冲击力, 使 CPW 13 混合液悬浮于 CPW 26 液体上方, 然后 80 x g 离心 3 min 进行界面梯度离心完整的原生质体在 CPW 13 和 CPW 26 的分界面处出现一个清晰的环形带, 其它杂质及少量原生质体沉于管底注 : 如果此种情况下无法形成界面, 则原生质体沉淀物用 CPW13 悬浮, 用长吸管将其吸出置于另一个无菌的离心管中 ( 将长吸管垂直插入离心管中吸取原生质体, 勿倾斜 ), 加入适量电融合液至 6 ml 并吸打混匀,100 x g 离心 6 min 去除上清液, 加入适量的电融合液吸打混匀, 在倒置显微镜下用血细胞计数板统计原生质体数目, 然后用电融合液调整愈伤和叶肉原生质体的密度一般来说, 愈伤原生质体密度为 1 x 10 6 个 /ml, 叶肉原生质体密度 2 x 10 6 个 /ml 4. 原生质体活性检查 : 利用 FDA ( 二乙酸荧光素 ) 进行柑橘原生质体活力检测 Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 6

7 4.1 首先用电融合液重悬原生质体, 吸取 200 μl 的原生质体悬浮液, 置于事先包裹锡箔纸的 1.5 ml 离心管中, 加入 4.8 μl 的 5 mg/ml FDA, 避光染色 10 min 染色结束后吸出 50 μl 于载玻片上, 在倒置荧光显微镜 (Olympus IX 71) 下观察 4.2 从显微镜中可以看出 : 有活力的原生质体会发出绿色的荧光, 统计绿色原生质体的数量同一个视野中散发绿色荧光的原生质体数量与明场下完整原生质体的总量的比值即为原生质体活性当比值大于 80% 时, 则可用于融合等后续实验 5. 原生质体融合 - 电融合法 5.1 将双亲原生质体用电融合液重悬, 混合均匀 ( 胚性愈伤组织原生质体 1 x 10 6 个 /ml; 叶肉原生质体 2 x 10 6 个 /ml) 5.2 融合小池先用电融合液洗涤, 以防原生质体聚集于电极两侧的角落里, 然后取 0.8 ml (FTC-03) 或 1.6 ml (FTC-04) 原生质体混合液于环形融合小槽, 融合小池中央加 2 滴电融合液用来保持湿度, 封口膜封口 5.3 将融合小池置于倒置显微镜载物台, 插线静置在倒置显微镜下观察, 当大多数原生质体处于同一水平面时开始进行电融合 ( 此过程一般需要 5-10 min) 5.4 电击结束后, 静置 min, 等待融合的原生质体圆球化 5.5 轻轻吸出融合产物于无菌的离心管,80 x g 离心 8 min, 去上清液, 培养密度为 1 x 10 5 个 /ml, 常采用 BH3 液体浅层培养 6. 融合细胞培养将融合细胞采用 BH3 液体浅层培养, 随着原生质体的生长发育, 期间不断降低渗透压待细胞团变成淡黄色时, 转移至胚状体诱导培养基中, 进一步增殖, 之后诱导其生芽生根结果与分析融合细胞圆球化后, 采用 BH3 液体浅层培养融合细胞培养 15 d 后, 培养皿中出现了肉眼可见的白色的小颗粒, 此时降低渗透压至 0.45 M 培养 25 d 后, 培养皿中出现较大细胞团, 此时降低渗透压至 0.3 M 培养至 35 d 后时, 培养皿中出现致密的淡黄色小颗粒, 将其转移至胚状体诱导培养基中, 固液共培, 弱光下继续培养, 待胚状体长出转移至 Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 7

8 胚状体增殖培养基, 胚状体迅速壮大转绿随后将长势良好的胚状体转移至生芽培养基继续培养, 当再生芽长至有 3-4 片叶时, 将其从胚状体上切下并转至生根培养基诱导生根再生完整根系后, 挑选根系健壮生长势好的再生苗炼苗 2 周, 最后移栽到温室注意事项 1. 融合亲本状态最佳 : 悬浮细胞继代一周后状态最好, 叶肉则在叶片充分成熟展开, 叶色浓绿时状态最好 2. 提取原生质体过程中, 动作一定要轻缓, 慢速 3. 原生质体融合过程中, 叶片密度 : 愈伤密度 = 2:1 溶液配方一培养基相关母液 1. 6-BA 储备液 (1 mg/ml) 6-BA 100 mg 加入 1.0 ml 1 M KOH 搅拌至 6-BA 完全溶解, 然后加蒸馏水定容到 100 ml,4 C 保存 2. KT 储备液 (1 mg/ml) KT 100 mg 加入 1.0 ml 1 M KOH 搅拌至 KT 完全溶解, 然后加蒸馏水定容到 100 ml,4 C 保存 3. IAA 储备液 (1 mg/ml) IAA 100 mg 加入 1.0 ml 1 M KOH 搅拌至 IAA 完全溶解, 然后用蒸馏水定容至 100 ml,4 C 避光保存 4. NAA 储备液 (1 mg/ml) NAA 100 mg 加入 1.0 ml 1 M KOH 搅拌至 NAA 完全溶解, 然后用蒸馏水定容到 100 ml,4 C 避光保存 5. 5 mg/ml FDA 储备液 FDA5 mg 溶解于 1 ml DMSO 中, 用 1.5 ml 离心管装,-20 C 避光保存 6. 1 M KOH 储备液 KOH 5.6 g 用 100 ml 蒸馏水溶解, 室温保存注 : 溶液配方 7-12 详见柑橘组织培养常用培养基配制方法 ( 杨雯惠等,2018) Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 8

9 7. 大量储备液 8. 微量储备液 9. 铁盐储备液 10. 肌醇储备液 11. 甘氨酸储备液 12. 维生素储备液 13. CPW 盐储备液 CPW stock I 母液 KH2PO g KNO3 1.0 g MgSO4 2.5 g KI g CuSO g 加蒸馏水定容至水, 定容至 100 ml,-20 C 避光保存注 : 1) 配 CPW stock I 时, 由于 100 ml 只需加 KI g, 故先称取 0.2 g 溶于 1 ml 蒸馏水中, 配成 100x 母液, 使用时取 10 μl 2) 配 CPW stock I 时, 由于 100 ml 只需加 CuSO g, 故先称取 g CuSO 4 溶于, 配成 100x 母液, 使用时取 10 μl CPW stock II 母液 :CaCl2 1.5 g 溶解于蒸馏水, 定容至 100 ml,-20 C 避光保存 14. 酶母液储备液 CaCl2 2H2O 3.6 g NaH2PO4 2H2O 0.14 g 溶解于蒸馏水, 定容至 100 ml,-20 C 避光保存 15. CaCl2 储备液 (100x) CaCl g 溶解于蒸馏水, 定容至 100 ml,4 C 避光保存 Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 9

10 二培养基的配制 1. MT 固体培养基悬浮培养基播种培养基详见柑橘组织培养常用培养基配制方法 mol/l EME 培养基 (200 ml) 肌醇储备液 (100x) 甘氨酸储备液 (100x) 微量储备液 (100x) Fe 2+ -EDTA 储备液 (100x) Vitamin B 储备液 (100x) Vitamin C 储备液 (100x) 大量储备液 (100x) 20 ml Sucrose g Malt Extract 0.1 g 加蒸馏水定容至 200 ml, 调 ph 至 5.8, 高压灭菌 M EME 培养基 (200 ml) 肌醇储备液 (100x) 甘氨酸储备液 (100x) 微量储备液 (100x) Fe 2+ -EDTA 储备液 (100x) Vitamin B 储备液 (100x) Vitamin C 储备液 (100x) 大量储备液 (100x) 20 ml Sucrose g Malt Extract 0.1 g 加蒸馏水定容至 200 ml, 调 ph 至 5.8, 高压灭菌 4. 胚状体诱导培养基肌醇储备液 (100x) 甘氨酸储备液 (100x) 微量储备液 (100x) Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 10

11 Fe 2+ -EDTA 储备液 (100x) Vitamin B 储备液 (100x) Vitamin C 储备液 (100x) 大量储备液 (100x) 100 ml Sucrose 50 g Malt Extract 0.5 g 加蒸馏水定容至 1,000 ml, 调 ph 至 5.8, 高压灭菌 5. 胚状体增殖培养基肌醇储备液 (100x) 甘氨酸储备液 (100x) 微量储备液 (100x) Fe 2+ -EDTA 储备液 (100x) Vitamin B 储备液 (100x) Vitamin C 储备液 (100x) 大量储备液 (100x) 100 ml Sucrose 50 g Malt Extract 1.5 g 加蒸馏水定容至 1,000 ml, 调 ph 至 5.8, 高压灭菌 6. CPW13 (100 ml) CPW stock I 1 ml CPW stock II 1 ml 甘露醇 13 g 加蒸馏水定容至 100 ml, 调 ph 至 5.8, 高压灭菌 7. CPW25 (100 ml) CPW stock I CPW stock II 蔗糖 1 ml 1 ml 25 g 加蒸馏水定容至 100 ml, 调 ph 至 5.8, 高压灭菌 8. 酶 1 ( 愈伤组织 ) (40 ml) 纤维素酶 R g Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 11

12 离析酶 R-10 甘露醇酶母液 0.48 g 5.1 g 4 ml 加蒸馏水定容止 40 ml, 调 ph 至 5.8, 通过 0.22 μm 醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌 9. 酶 2 ( 试管苗叶片 ) (40 ml) 纤维素酶 R-10 离析酶 R-10 甘露醇酶母液 0.6 g 0.6 g 5.1 g 4 ml 加蒸馏水定容止 40 ml, 调 ph 至 5.8, 通过 0.22 μm 醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌 10. 电融合液 (100 ml) 甘露醇 CaCl2 (100x) 母液 g 1 ml 加蒸馏水定容止 100 ml, 调 ph 至 5.8, 高压灭菌 11. 生芽培养基肌醇储备液 (100x) 甘氨酸储备液 (100x) 微量储备液 (100x) Fe 2+ -EDTA 储备液 (100x) Vitamin B 储备液 (100x) Vitamin C 储备液 (100x) 大量储备液 (100x) 100 ml 1 mg/ml 6-BA 500 μl 1 mg/ml KT 500 μl 1 mg/ml NAA 100 μl Source 40 g Agar 8 g 加蒸馏水定容至 1,000 ml, 调 ph 至 5.8, 高压灭菌 Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 12

13 12. 生根培养基肌醇储备液 (100x) 甘氨酸储备液 (100x) 微量储备液 (100x) Fe 2+ -EDTA 储备液 (100x) Vitamin B 储备液 (100x) Vitamin C 储备液 (100x) 大量储备液 (100x) 50 ml 1 mg/ml IBA 100 μl 1 mg/ml NAA 500 μl Source 25 g Agar 8 g 活性炭 0.5 g 加蒸馏水定容至 1,000 ml, 调 ph 至 5.8, 高压灭菌 13. BH3 营养液配方中文名英文名分子式浓度 (mg/l) Chinese Name English Name molecular formula Concentration (mg/l) 麦芽提取物 Malt extract 500 蔗糖 Sucrose C12H22O 甘露醇 Mannitol C6H14O 谷氨酰胺 Glutamine C5H10N2O 七水合硫酸镁磷酸二氢钾 magnesium sulfate heptahydrate MgSO4 7H2O 370 Potassium Phosphate Monobasic KH2PO4 170 二水合氯化钙 Calcium chloride dihydrate CaCl2 2H2O 440 氯化钾 Potassium chloride KCl 1500 水解酪蛋白 Casein hydrolysate 250 碘化钾 Potassium iodide KI 0.83 硼酸 Orthoboric acid H3BO3 6.2 七水合硫酸锌 Zinc sulfate heptahydrate ZnSO4 7H2O 8.6 二水合钼酸钠 Sodium MolybdatDihydrat NaMoO4 2H2O 0.25 Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 13

14 五水合硫酸铜 Copper (II) sulfate pentahydrate CuSO4 5H2O 六水合氯化钴 cobalt chloride CoCl2 6H2O 一水合硫酸锰 Manganese sulphate MnSO4 H2O 22.3 乙二胺四乙酸 Ethylenediaminetetraacetic acid C10H16N2O 七水合硫酸亚铁 ferrous sulfate FeSO4 7H2O 27.8 肌醇 Myo-inositol C6H12O6 100 果糖 Fructose C6H12O6 250 核糖 Ribose C4H9O4CHO 250 木糖 Xylose C5H10O5 250 甘露糖 Mannose C6H12O6 250 鼠李糖 Rhamnose C6H12O5 250 纤维二糖 Cellobiose C12H22O 半乳糖 Galactose C6H12O6 250 丙酮酸钠盐 Sodium pyruvate C3H3NaO3 20 柠檬酸 Citric acid C6H8O7 40 苹果酸 Malic acid C4H6O5 40 延胡索酸 Fumaric acid C4H14O4 40 生物素 Biotin C10H16N2O3S 0.01 核黄素 Riboflavin C17H20N4O6 0.2 叶酸 Folic acid C19H19N7O6 0.4 对氨基苯甲酸 p-aminobenzoic acid C7H7NO 氯化胆碱 Choline chloride C5H14CNO 1 抗坏血酸 VC(Ascorbic acid) C6H8O6 2 泛酸钙 Calcium pantothenate C18H32CaN2O10 1 维生素 B1 vitamin B1 C12H16N4OS 10 维生素 B6 vitamin B6 C8H10NO5P 10 烟酸 vitamin B3 C6H5NO2 1 维生素 A vitamin A C20H30O 0.01 维生素 D3 vitamin D3 C27H44O 0.01 维生素 B12 vitamin B12 C63H88NCoN14O14P 0.02 椰子汁 20 ml 加蒸馏水定容至 1,000 ml, 用 KOH 调 ph 至 5.8, 通过 0.22 μm 醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌 Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 14

15 参考文献 1. 郭文武. (1998). 柑橘细胞电融合及其再生植株遗传变异研究 [D]. 武汉 : 华中农业大学图书馆. 2. 肖诗鑫. (2014). 柑橘胞质杂种创制及原生质体再生过程的细胞学研究 [D]. 武汉 : 华中农业大学图书馆. 3. 杨雯惠, 解凯东, 郭文武. (2018). 柑橘组织培养常用培养基配制方法. Bio-101 e Doi: /BioProtoc Grosser, J. W., Gmitter, F. G., Louzada, E. S. and Chandler, J. L. (1992). Production of somatic hybrid and autotetraploid breeding parents for seedless citrus development. HortScience 27(10): Guo, W. W. and Deng, X. X. (1998). Somatic hybrid plantlets regeneration between Citrus and its wild relative, Murrayapaniculata via protoplast electrofusion. Plant Cell Rep 18(3-4): Copyright 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 15

实验室常用培养基的配制方法

实验室常用培养基的配制方法 Ampicillin( 氨卡青霉素 )(100 mg/ml) 100 mg/ml Ampicillin 50 ml 配制方法 1. 称量 Ampicillin 置于 50 ml 离心管中 ; 2. 加入 40 ml 灭菌水, 充分混合溶解后, 定容至 50 ml; 3. 用 0.22 µm 过滤膜过滤除菌 ; 4. 小份分装 (1 ml/ 份 ) 后,-20 保存 IPTG(