1292 水产学报 39 卷 义和实用价值 几丁质酶由几丁质酶基因表达生成 现有研究表明, 几丁质酶基因是一种基因数量较多的家族基因, 在果蝇 (Drosophilamelanogaster) 冈比亚按蚊 (Anophelesgambiae) 赤拟谷盗 (Tribolium castaneum) 等

Transcription

1 第 39 卷第 9 期 2015 年 9 月 水产学报 JOURNALOFFISHERIESOFCHINA Vol.39,No.9 Sept.,2015 文章编号 : (2015) DOI: /jfc 三疣梭子蟹几丁质酶基因的克隆及其在蜕皮过程中的表达分析 王伟 1,2, 吴旭干 1, 潘桂平 2, 侯文杰 2 1,4, 成永旭 (1 上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室, 上海 ; 2 中国水产科学研究院东海水产研究所, 上海 ; 3 上海市水产研究所及上海市水产技术推广站, 上海 ; 4 上海海洋大学上海高校知识服务平台水产动物遗传育种中心, 上海 ) 摘要 : 为探究几丁质酶基因在三疣梭子蟹蜕皮过程中的生理作用, 本研究通过转录组测序和 RACE 技术克隆了三疣梭子蟹几丁质酶基因 (PtChi)cDNA 全长 ( 登录号 :KF914663), 并通过荧光定量 PCR(qRT PCR) 技术研究了该基因在三疣梭子蟹不同组织及不同蜕皮阶段的表达情况 结果表明 :(1)PtChi 基因 cdna 全长 2200bp, 包括 5 非编码区 (5 UTR)16bp 3 非编码区 (3 UTR)714bp 和开放阅读框 1470bp, 编码 489 个氨基酸, 预测蛋白质分子量和等电点为 53 97ku 和 4 76 (2)BlastP 结果显示,PtChi 推导氨基酸序列与已知甲壳动物 Chi 3 的一致性为 61%~96%, 系统进化树分析表明 PtChi 与其他甲壳动物 Chi 3 聚为一支 (3)qRT PCR 结果显示 PtChi 基因在 C 期三疣梭子蟹肝胰腺中表达水平最高, 胃 大颚器 心脏和眼柄中 PtChi mrna 表达水平依次降低, 在其他组织中 PtChi mrna 表达量最低, 且表达水平无显著差异 (4) 不同蜕皮阶段,PtChi 在肝胰腺 肠 胃和大颚器 4 种组织中的表达变化模式有所不同, 肝胰腺中 PtChi mrna 表达水平在 AB 期最高,C 期最低, 暗示 PtChi 可能参与三疣梭子蟹蜕皮后期对病原体的免疫防御 ; 肠中的 PtChi mrna 表达水平在 E 期最高,C 期最低, 推测 PtChi 参与蜕皮过程中肠道围食膜的分解和免疫功能 ; 胃中 PtChi 表达水平在 C 期最高, 暗示其参与了食物消化 以上结果表明, 本研究克隆的 PtChi 可能为甲壳动物 Chi 3 型, 其准确生理学功能及其在蜕皮过程中的调控机制有待进一步深入研究 关键词 : 三疣梭子蟹 ; 几丁质酶 ; 基因克隆 ; 表达分析 ; 蜕皮周期中图分类号 :Q785;S968 文献标志码 :A 几丁质又称甲壳素 壳多糖, 是由 N- 乙酰 - β-d 氨基葡萄糖通过 β-1,4 糖苷键连接而成的直链多聚糖 [1], 是甲壳动物外骨骼的重要组成成分 [2] 甲壳动物生长发育过程中, 经常需要蜕去旧壳以继续生长 [3-4], 蜕壳前需要几丁质消化酶将旧壳中的几丁质降解, 从而导致旧壳疏松, 便于动物中从旧壳中顺利蜕出 [5] 甲壳动物甲壳中的几丁质完全分解需要几丁质酶和 N- 乙酰 - β-d 氨基葡萄糖甘酶 ( 也称壳二糖酶 ) 这 2 种几 丁质消化酶的共同参与 : 首先几丁质酶将几丁质降解为几丁质寡聚糖, 随后壳二糖酶将几丁质寡聚糖水解为 N - 乙酰 -β -D 氨基葡萄糖单体 [6] 水解产生的 N- 乙酰 -β-d 氨基葡萄糖单体可被部分重新吸收, 用于新壳的合成 [5] 对甲壳动物而言, 几丁质酶除了直接参与蜕皮调控外, 还具有消化食物中几丁质和抵御病原体侵染等功能 [7-9] 因此, 深入研究几丁质酶在甲壳动物生长发育过程中的生理功能具有一定的理论意 收稿日期 : 修回日期 : 资助项目 : 国家自然科学基金 ( ); 上海市自然科学基金 (12ZR ); 上海市农委青年人才成长计划 [ 沪农青字 (2014) 第 3-5 号 ]; 上海市科技兴农重点攻关专项 [ 农科攻字 (2013) 第 6-3 号 ]; 上海高校水产学一流学科建设专项 ( 沪教科 ) 通信作者 : 成永旭,E mail:yxcheng@shou.edu.cn

2 1292 水产学报 39 卷 义和实用价值 几丁质酶由几丁质酶基因表达生成 现有研究表明, 几丁质酶基因是一种基因数量较多的家族基因, 在果蝇 (Drosophilamelanogaster) 冈比亚按蚊 (Anophelesgambiae) 赤拟谷盗 (Tribolium castaneum) 等昆虫中存在 23~26 个几丁质酶基因 [10-11], 在日本对虾 (Penaeusjaponicus) [12] 中国明对虾 (Fenneropenaeuschinensis) [13] 斑节对虾 (Penaeus monodon) [1] 锯缘青蟹 (Scyla serata) [14] 和凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) [5] 等甲壳动物中也发现了 3~6 种几丁质酶基因 虽然甲壳动物的几丁质酶基因均具有信号肽 GH18 催化结构域 S/T 富集的连接区和几丁质结合域这 4 个典型的结构域, 但这些基因在甲壳动物不同组织中的时空表达模式和生理功能存在差异 [14] 如凡纳滨对虾几丁质酶基因 LvChi 1 LvChi 3 和 LvChi 4 主要在肝胰腺中表达 ;LvChi 2 在眼柄中相对表达水平较高 ;LvChi 5 在肌肉中表达量最高, 其次为表皮 ; 而 LvChi 6 主要在表皮 鳃和眼柄中表达 [5] 因此, 系统研究几丁质酶基因在甲壳动物蜕壳周期中不同组织内的表达情况, 可以在了解该基因与蜕皮的关系的同时, 初步了解该基因的功能 [15-17] 三疣梭子蟹 (Portunustrituberculatus) 是我国重要的养殖蟹类, 人工养殖过程中的蜕皮死亡综合征 (moltingdeathsyndrome,mds) 和病害问题一直是困扰该产业可持续发展的 2 个重要问题 [18-19] MDS 是指蟹类不能顺利完成蜕壳, 在蜕壳过程中或蜕壳不久便大量死亡的一种综合症状, 给经济蟹类养殖生产造成了巨大的经济损失 [18,20] 由于 MDS 形成原因非常复杂, 要深入了解其形成机制, 首先必需深入研究三疣梭子蟹蜕皮的生理和免疫机制, 为 MDS 的控制提供理论参考和实践依据 [21-22] 以往研究表明几丁质酶可能参与了甲壳动物的蜕壳调控和免疫保护, 并已有多种甲壳动物的不同几丁质酶基因被克隆和研究, 这为深入研究甲壳动物几丁质酶基因的生理功能奠定了基础 [14] 但迄今为止, 尚未见有三疣梭子蟹几丁质酶基因方面的研究报道 因此, 本研究基于三疣梭子蟹转录组文库获得的几丁质酶基因部分 cdna 序列 (contig8693), 通过反转录 PCR(RT PCR) 和 cdna 末端快速扩增 (RACE) 技术, 得到了三疣梭子蟹一种几丁质酶 基因 (PtChi) 的 cdna 全长 在对该基因序列进行相关生物信息学分析后, 通过荧光定量 PCR 技术研究了该基因在三疣梭子蟹不同组织及不同蜕皮阶段的表达情况, 结果可以为进一步研究 PtChi 的生理功能提供基础资料 1 材料与方法 1 1 实验材料与采样三疣梭子蟹幼蟹购自浙江舟山宏福水产养殖场, 幼蟹初始体质量 50~80g, 甲宽 7~9cm, 挑选 60 只肢体健全, 活力好的雌蟹运输到上海海洋大学营养繁殖研究室, 在室内循环水系统中暂养 1 周, 暂养水族箱规格 ( 长 宽 高 =75cm 53 cm 47cm), 水族箱底铺 3~5cm 细沙供其隐蔽, 每箱放 8~10 只幼蟹 暂养期间每日 投喂冷冻真蛸 (Octopusvulgaris) 和冷冻的凡纳滨对虾等饵料, 投喂量为蟹总体质量的 5%~10%, 次日上午清除残饵和粪便 暂养期间水温 24~26 盐度 24 溶解氧 >5mg/L 氨氮 <0 5mg/L 亚硝酸盐氮 <0 15mg/L ph 为 7 0~9 0 暂养结束后, 挑选 32 只处于蜕皮间期 (C 期 ) 或前期 (D 期 ) 的幼蟹用于正式实验, 正式实验期间的日常管理和水质参数同暂养阶段 为避免实验蟹间的相互残杀, 每只幼蟹单独饲养于水体体积为 40L 的小型循环水族箱 ( 长 宽 高 =53 cm 18cm 45cm) 根据三疣梭子蟹游泳足的形态学变化将其蜕皮周期分为蜕皮期 (E 期 ) 蜕皮后期 (AB 期 ) 蜕皮间期 (C 期 ) 和蜕皮前期 (D 期 ) [23], 实验过程中每天检查和记录每只幼蟹所处的蜕皮阶段, 对达到一定蜕皮阶段的个体进行解剖, 采集肝胰腺 肌肉 心脏 鳃 胃 肠 眼柄 胸神经节 Y 器官 大颚器等组织样品, 液氮速冻后 -80 保存待用 由于 D 期可分为多个亚期 [23], 且每个亚期持续时间相对较短,D 期样品仅采集形态特征较为典型的 D 2 亚期 每个蜕皮阶段采集 5~8 只个体 1 2 PtChicDNA 全长的克隆取冻存的肝胰腺组织, 采用 Trizol 法提取总 RNA, 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整度, 紫外分光光度计检测 RNA 纯度 使用 SMART TM RACE cdna AmplificationKit(Clontech,Cat ) 进行第一链 cdna 合成,Advantage2 PCR Kit (Clontech,Cat ) 进行 RACE 扩增 RACE

3 9 期王伟, 等 : 三疣梭子蟹几丁质酶基因的克隆及其在蜕皮过程中的表达分析 1293 用特异性引物根据三疣梭子蟹转录组文库 (NCBI 登录号 :SRA051608) 筛选到的几丁质酶基因序列片段 ( 序列拼接号 :contig8693) 设计 ( 表 1) 所得 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳后采用 DNA 回收试剂盒 (TaKaRa,Cat 9763) 进行回收纯化, 纯化产物与 pmd19 T 载体 (TaKaRa,Cat D104A) 进行连接后转化至大肠杆菌 Top10 感受态细胞 ( 天根,Cat.CB104-01) 中,37 180r/min 条件下振荡培养 2h, 离心收集菌体后接种并进行蓝白斑筛选, 随机挑选 10 个阳性克隆送上海生工生物工程公司进行测序 1 3 序列分析 PtChi 片段序列的拼装利用 DNAStar 软件中的 SeqMan 程序进行 获得 PtChi 全长 cdna 后采用 Blast 程序分析 PtChi 与其他动物 Chi 基因序列的同源性和一致性 ;ORF Finder(htp:// www ncbi nlm nih gov/gorf/gorf html) 预测 PtChi 基因开放阅读框 (ORF,open reading frame), 推导氨基酸序列的物理参数 信号肽和跨膜结构的预测分别采用 ProtParamtool(htp:// web expasy org/protparam/) SigalP 4 1 Server (htp://www cbs dtu dk/services/signalp/) 和 TMHMM 2 0(htp://www cbs dtu dk/services/ TMHMM -2 0/) 进行 最后通过 MEGA 5 0 软件进行多重序列比对和系统进化树构建 1 4 实时荧光定量 PCR(qRT PCR) 采用 Trizol 法提取各期组织样品的总 RNA 分别取 100ng 总 RNA 作为反转录模板进行 cdna 合成, 总 RNA 提取试剂盒 (Cat D9108A) 和反转录试剂盒 (Cat D2639A) 均为 TaKaRa 公司生产 根据 PtChi 序列, 采用 PrimerPremier5 0 软件设计定量 PCR 用特异性引物, 以三疣梭子蟹 18SrRNA 作为内参基因 [24] ( 表 1) 按照定量 PCR 试剂盒 (TaKaRa,Cat DRR420A) 说明, 将模板 cdna 梯度稀释后进行标准曲线扩增 当 PCR 反应满足无非特异性扩增, 目标基因和内参基因的扩增效率在 95%~105%, 标准曲线 R 2 值大于 0 99 时, 确定 qrt PCR 反应体系与条件 最终采用 Chi F2/R2 作为定量 PCR 扩增引物,qRT PCR 的反应体系见表 2, 反应条件 :95 预变性 30s;95 变性 3s,60 退火 30s,40 个循环 首先采用 C 期的肌肉 肝胰腺 心脏 胃 肠 鳃 Y 器官 大颚器 眼柄和胸神经节研究 PtChi 基因在三疣梭子蟹各个组织中的相对表达情况 在此基础上研究三疣梭子蟹蜕皮过程中,PtChi 在肝胰腺 胃 肠和大颚器中的表达变化 每个样品重复测定 4 次, 每个蜕壳阶段重复 5 个体 表 1 实验用 PCR 引物及序列 Tab.1 Primersandtheirsequencesused inthisexperiment 引物名称 primername 核苷酸序列 (5-3 ) sequence 用途 purpose 通用引物预混液 universal CTAATACGACTCACTATAGGGC RACE primer mix(upm) Chi5 R1 TCGATGGTACCCTTGCCGGCAGACA 5 RACE Chi5 R2 AGGGTCGTGCACAACAGTCCAGCCA 5 RACE Chi3 F1 CCCCAACGACTGCCCCTAGAGAGCC 3 RACE Chi3 F2 CCAGGACGGTGGCGGAGTGTTGGAT 3 RACE Chi F1 ATCCTGGCTGTGGGTGGATG qrt PCR Chi R1 TTAGCGTGCAGTGCCTCCTT qrt PCR Chi F2 CCCGACAACTGCCACCACTA qrt PCR Chi R2 CAAGGGCACAGACGACATGC qrt PCR 18S F TCCAGTTCGCAGCTTCTTCTT qrt PCR 18S R AACATCTAAGGGCATCACAGACC qrt PCR 表 2 PtChi 与 18SrRNA 基因荧光定量 PCR 反应体系中各试剂添加量 (μl) Tab.2 ThevolumeofeachreagentaddedtothePCR mixtureusedforqrt PCR ofptchiand18srrna 试剂 reagent PtChi 18SrRNA SYBR 预混 ExTaq 酶 SYBRPremixExTaq TM (2 ) PCR 上游引物 /PCR ForwardPrimer(10μM) PCR 下游引物 /PCR ReversePrimer(10μM) cdna 模板 /cdna template ROX 校正染料 DyeⅡ /ROX ReferenceDyeⅡ(50 ) 双蒸水 ddh 2 O 总体积 totalvolume 数据分析以 18SrRNA 作为内参基因, 通过 2 -ΔΔCt 法计算 PtChi mrna 的相对表达水平 使用 SPSS 17 0 软件对 qrt PCR 数据进行统计分析, 采用 Levene s 法进行方差齐性检验,ANOVA 对实验结果进行方差分析 当数据满足方差齐性时采用 Duncan 氏法进行多重比较 ; 当不满足方差齐性时对数据进行反正弦或平方根处理, 对仍不具备

4 水 １２９４ 产 学 报 ３９卷 齐性方差的数据 采用 Ｇ ｍ Ｈｏｗ 法 进行 多重 ＯＲＦ １４ ７ ０ｂ ｐ ＯＲＦ编码 ４ ８ ９个氨基酸 预测蛋白 比较 取 Ｐ ０ ０５为差异显著性标准 的分 子 式 和 分 子 量 分 别 为 Ｃ２４０５Ｈ３６２１Ｎ６２３Ｏ７３０Ｓ３２和 ５３ ９７ｋｕ 等 电 点 为 ４ ７６ 进 一 步 分 析 表 明 ２ 结果 Ｐ Ｃｈ推导氨基酸序列从 Ｎ端到 Ｃ端包 含甲壳动 ２ １ Ｐ Ｃｈ基因全长克隆及比对结果 三疣梭子蟹几丁质酶基因 Ｐ Ｃｈ ＤＮＡ全长 ２ 物几丁 质 酶 的 ４个 典 型 结 构 域 信 号 肽 １ ２０ ＧＨ１８催化结构域 ２２ ３６７ Ｓ Ｔ富集的 ２ ０ ０ｂ ｐ ＮＣＢＩ登录号为 ＫＦ９ １ ４ ６ ６ ３ 序列分析结果表 连接区 和 几 丁 质 结 合 结 构 域 ４２３ ４８０ 图 明 该基因 ＤＮＡ序列包括 ５ 非编码区 ５ ＵＴＲ １ 其中信号肽的裂解位 点位 于 第 ２０个 与 第 ２１ １ ６ｂｐ ３ 非编码区 ３ ＵＴＲ ７ １ ４ｂｐ和开放阅读框 个氨基酸之间 推测该蛋白属于分泌蛋白 图 １ Ｐ Ｃｈ基因 ＤＮＡ全长及预测氨基酸序列 斜体加粗显示信号肽序列 下划线区域分别为 ＧＨ１８结构域与几丁质结合结构域 启动密码子 终止密码子及加尾信号以方框框出 Ｆ ｇ １ Ｆｕ ＤＮＡ ｑｕ ｎ ｎｄ ｄ ｄｕ ｄｍ ｎｏ ｄ ｑｕ ｎ ｏｐ Ｃｈ Ｔｈ ｇｎ ｐ ｐ ｄ ｑｕ ｎ ｈｏｗｎ ｎｂｏ ｄ ＧＨ１８ｄｏｍ ｎ ｎｄ ｈ ｎｂ ｎｄ ｎｇｄｏｍ ｎ ｕｎｄ ｎ ｄ ｐ ｏｍｏ ｍ ｎ ｏ ｎｄ ｐｏ ｙ ｄ ｎｙ ｏｎ ｇｎ ｐ ｎ ｄｗ ｈ ｍ ｐ ｖ ｙ 本研究克隆的 Ｐ Ｃｈ与 锯 缘 青 蟹 日 本 对 虾 凡纳滨对虾 中 国 明 对 虾 和 斑 节 对 虾 的 几 丁 质 酶 ３ Ｃｈ ３ 氨基酸序列相似 度最 高 图 ２ 这些物 ３氨基酸序列在 几 丁 质 结 合 结 构 域 均 含 种的 Ｃｈ ｈ ｐ ｗｗｗ ｘ ｕ ｂ ｏ ｎ

5 ９期 王 伟 等 三疣梭子蟹几丁质酶基因的克隆及其在蜕皮过程中的表达分析 １２９５ 有 ６个保守的半胱氨酸 图 ２中 号标示 和 ４个 序列相似度也较高 相似度在 ７８ ９７ 图 ２ 芳香族氨 基 酸 残 基 图 ２中 下 三 角 标 示 整 体 尽管 Ｃｈ １ Ｃｈ ２和 Ｃｈ ３的 氨 基 酸 序 列 在 多 个 上 蟹类 Ｃｈ ３与虾类 Ｃｈ ３的氨基酸序列存在 一 区域存在明 显差 异 图 ２下划 虚线 但 这 ３种几 定的差异 图 ２中虚线方框 不同 甲壳 动物的 ３ 丁 质 酶 ＧＨ１８ 结 构 域 中 的 催 化 活 性 位 点 种几丁质酶 Ｃｈ １ Ｃｈ ２和 Ｃｈ ３ 氨基酸 序列比 ＦＤＧＬＤＬＤＷＥＹＰ 高度保守 图 ２ 对结果显示 不 同 物 种 间 的 同 种 几 丁 质 酶 氨 基 酸 图 ２ 三疣梭子蟹与其他甲壳动物的 Ｃｈ氨基酸序列比对 １ 单向箭头指示各功能域分界 序列内实线方框表示催化活性位点 序列内虚线方框为虾蟹类 Ｃｈ ３氨基酸序列存在差异 的 部 分 ２ 下划虚线标示 ３种几丁质酶氨基酸序列主要存在差异的区域 与 " 分 别 标 示 几 丁 质 结 合 结 构 域 内 的 半 胱 氨 酸 和 芳 香 族 氨 基 酸 位点 ３ Ｐ Ｃｈ为三疣梭子蟹几丁质酶 Ｓ Ｃｈ为锯缘青蟹几丁 质 酶 Ｐｊ Ｃｈ为 日 本 对 虾 几 丁 质 酶 ＬｖＣｈ凡 纳 滨 对 虾 几 丁 质 酶 Ｆ Ｃｈ为 中国明对虾几丁质酶 ＰｍＣｈ为斑节对虾几丁质酶 Ｆ ｇ ２ Ｃｏｍｐ ｏｎｏｍ ｎｏ ｄ ｑｕ ｎ ｏｃｈｂ ｗ ｎｐ ｕｂ ｕ ｕｎｄｏ ｈ ｕ ｎ ｐ １ Ｔｈｂｏｕｎｄ ｍｏｎｇｄ ｎｄｏｍ ｎ ｐ ｎ ｄｂｙｏｎ ｗ ｙ ｏｗ ｙ ｖ ｎ ｈ ｑｕ ｎ ｂｏｘ ｄｗ ｈ ｏ ｄ ｎ ｗｈ ｈｄｏ ｄｂｏｘ ｎｄ ｈｄ ｎ ｍｏｎｇ ｕ ｎｃｈ ３ ｑｕ ｎ ２ Ｔｈｍ ｊ ｏｄ ｎ ｏ ｍ ｎｏ ｄ ｑｕ ｎ ｏｍ ｈ Ｃｈｇ ｏｕｐ ｕｎｄ ｎ ｄｗ ｈｄｏ ｄ ｎ ｙ ｎ ｎｄ ｏｍ ｍ ｎｏ ｄ ｄｕ ｎ ｈ ｎｂ ｎｄ ｎｇｄｏｍ ｎ ｍ ｋ ｄｂｙｗ ｈ ｎｄ " ｐ ｖ ｙ ３ Ｐ Ｃｈｍ ｎｐ ｕｂ ｕ ｕ ｈ ｎ Ｓ Ｃｈｍ ｎｓ ｈ ｎ Ｐｊ Ｃｈｍ ｎｐ ｊ ｐｏｎ ｕ ｈ ｎ ＬｖＣｈ ｍ ｎｌ ｖ ｎｎｍ ｈ ｎ Ｆ Ｃｈｍ ｎｆ ｈ ｎ ｎ ｈ ｎ ＰｍＣｈｍ ｎｐ ｍｏｎｏｄｏｎ ｈ ｎ 预测蛋白质氨基 酸 多 重 序 列 比 对 Ｂ Ｐ 结 果显示 Ｐ Ｃｈ与锯 缘青 蟹 Ｃｈ ３的序 列一 致性最 ｈ ｐ ｗｗｗ ｘ ｕ ｂ ｏ ｎ

6 1296 水产学报 39 卷 高, 为 96%, 但与锯缘青蟹 Chi 1 和 Chi 2 的序列一致性仅为 37% 和 40% PtChi 与虾类 Chi 3 的序列一致性均低于锯缘青蟹 Chi 3, 但明显高于其他 2 种几丁质酶 如 PtChi 与日本对虾 Chi 3 Chi 1 和 Chi 2 的序列一致性分别为 61% 35% 和 40%; 与凡纳滨对虾 Chi 3 Chi 1 和 Chi 2 的序列一致性分别为 61% 36% 和 41% 基于 26 条甲壳动物几丁质酶氨基酸序列, 通 过 MEGA5 0 邻接法 (Neighbor Joining) 构建进化树, 结果表明 Chi 1 Chi 2 和 Chi 3 各自聚为一支 参与进化树构建的甲壳动物 Chi 4 Chi 5 和 Chi 6 在进化上与 Chi 3 更为接近, 共同聚为一大支 PtChi 与锯缘青蟹 Chi 3 亲缘关系最近, 聚为一支, 虾类的 Chi 3 聚为另一支 ( 图 3) 因此, 本研究中克隆的三疣梭子蟹 Chi 基因建议命名为 PtChi 3 图 3 Chi 氨基酸序列的 NJ 进化树 Fig.3 TheNeighbor JoiningphylogenetictreeforChis 2 2 三疣梭子蟹蜕皮间期 PtChi 基因在不同组织中的表达情况定量 PCR 结果显示,PtChi 在三疣梭子蟹蜕皮间期的多种组织中均有表达, 且表达水平存在显著差异 (P<0 05, 图 4) 其中,PtChi 在肝胰腺中的表达水平显著高于其他 9 种组织, 在胃 大颚器 心脏和眼柄中也有较高水平的表达, 表达水平高低顺序依次为胃 > 大颚器 > 心脏 > 眼柄 ; 整体上,PtChi 基因在肠 肌肉 鳃 胸神经节 Y 器官中的表达水平较低, 且这些组织中的 PtChi mrna 相对表达量差异不显著 ( 图 4) 2 3 PtChi 在不同蜕皮阶段的基因表达情况根据 PtChi mrna 在 C 期不同组织中的表达情况, 对整个蜕皮周期中肝胰腺 肠 胃 大颚器 4 种组织内的 PtChi mrna 表达变化进行了研究 结果显示, 不同蜕皮阶段上述 4 种组织中 PtChi mrna 的表达水平均变化显著 (P<0 05), 但变化模式有所不同 ( 图 5) 肝胰腺中 PtChi mrna

7 9 期王伟, 等 : 三疣梭子蟹几丁质酶基因的克隆及其在蜕皮过程中的表达分析 1297 基本一致, 均是 C 期最高,AB 期较低, 但两个组织中各期 PtChi 基因相对表达量大小顺序存在一定的差异, 分别为 C 期 >E 期 >AB 期 >D 期和 C 期 >D 期 >E 期 >AB 期 ( 图 5) 3 讨论 图 4 蜕皮间期三疣梭子蟹各组织中 PtChi mrna 的表达差异分析 Hp 肝胰腺 ;S. 胃 ;I. 肠道 ;MO. 大颚器 ;H. 心脏 ;M. 肌肉 ; G. 鳃 ;TG. 胸神经节 ;YO.Y 器官 ;E. 眼柄柱形图上含有不同字母代表不同组织中的 PtChi mrna 相对表达量差异显著 (P <0 05), 下同 Fig.4 Analysisofexpressiondiferences ofptchi mrna invarioustissues ofp.trituberculatusatintermoltperiod Hp hepatopancreas;s.stomach;i.intestine;mo.mandibular organ;h.heart;m.muscle;g.gil;tg.thoracicganglia;yo. Y organ;e.eyestalk BarswithdiferentletersmeansignificantdiferencesofPtChi mrna relativeexpresionlevelinvarioustissues(p<0 05), thesameasbelow 图 5 不同蜕皮阶段三疣梭子蟹 4 种组织中 PtChi mrna 的表达差异分析 E. 蜕皮期 ;AB. 蜕皮后期 ;C. 蜕皮间期 ;D. 蜕皮前期 Fig.5 Analysisofexpressiondiferences ofptchi mrna infourtissuesof P.trituberculatusatdiferentmoltingstages E.ecdysis;AB.postmolt;C.intermolt;D.premolt 的相对表达水平在 AB 期最高, 到 C 期显著下降, D 期又显著升高, 但仍显著低于 AB 期,D 期基因表达水平仅为 AB 期的 42% 左右 ; 肠中 PtChi mrna 表达水平在 E 期最高, 随后呈显著下降趋势, 至 C 期达最低值,D 期略有上升, 但与 C 期差异不显著 ; 胃和大颚器中 PtChi mrna 变化模式 3 1 PtChi 序列结构分析本研究通过转录组测序和 RACE 技术, 获得了 PtChi 基因的 cdna 全长序列 序列分析结果表明,PtChi 预测氨基酸序列包含甲壳动物几丁质酶的 4 个典型结构域 : 信号肽 GH18 催化结构域 S/T 富集的连接区和几丁质结合结构域 几丁质酶是一种分泌蛋白, 信号肽通常在分泌蛋白的跨膜转移过程中发挥重要作用 [25] GH18 催化结构域中的催化活性位点 (FDGLDLDWEYP) 在不同甲壳动物几丁质酶间高度保守 ( 图 2), 其中谷氨酸 (E) 为催化活动提供质子 [26] ; 第 3 个天冬氨酸 (D) 可作为正电过渡状态的稳定器 [27], 或作为亲核基维持几丁质酶整体的活性 [28] ; 而第 2 个天冬氨酸能够影响第 3 个天冬氨酸和谷氨酸的解离常数 (pk 值 ) [28] ; 色氨酸 (W) 的疏水性对于保持催化状态下氨基酸的异常 pk 值, 将其催化活性延伸到碱性范围十分关键 [29] S/T 富集连接区不仅负责连接几丁质酶的各结构域, 同时也可提供 O- 糖基化位点, 保护几丁质酶在消化系统和体液等富含蛋白酶的环境中不被裂解 [30] 几丁质结合结构域 (CBD 结构域 ) 则通过其内部高度保守的 4 个芳香族氨基酸残基 ( 图 2 中下三角 ) 与非可溶性几丁质结合, 帮助几丁质酶对其进行降解 ; 而 PtChiCBD 结构域中的 6 个半胱氨酸能够形成 3 个内部二硫键, 维持几丁质酶的结构稳定 [31] 由于不同几丁质酶间存在差异, 以上 4 个典型结构域的顺序和组成可作为几丁质酶的分类依据 [14] 以凡纳滨对虾的 6 种几丁质酶为例, 从氨基酸的 N 端到 C 端,Chi 1 和 Chi 3 的结构域依次为信号肽 GH18 催化结构域 连接区和 CBD 结构域 ;Chi 2 的 CBD 结构域位于 GH18 催化结构域之前 ;Chi 4 在 C 端含有 2 个 CBD 结构域 ; Chi 5N 端没有信号肽 ; 而 Chi 6 中目前只检测到了 GH18 催化结构域 [5] 虽然 Chi 1 和 Chi 3 的结构域模式相同, 但 Chi 1 的 CBD 结构域中的芳香族氨基酸和半胱氨酸数目整体上比 Chi 3 要

8 1298 水产学报 39 卷 多 [5] 根据本研究中 PtChi 推导氨基酸序列中各结构域的出现顺序及组成, 推测 PtChi 属于 Chi 3, 建议命名为 PtChi PtChi 的生理功能及其与蜕皮阶段的关系几丁质酶是一个多基因家族, 在甲壳动物蜕皮活动的调节 食物中几丁质的消化及病原体防御等方面起重要作用 目前甲壳动物中已发现了 6 种几丁质酶基因, 研究较多的为 Chi 1 Chi 2 和 Chi 3 [5,12-13,15-16,25,32] 其中 Chi 1 和 Chi 3 主要在肝胰腺中表达, 参与食物中几丁质和肠道围食膜的消化,Chi 3 还对病原体具有一定的免疫防御作用 [12,32] ;Chi 2 主要在表皮中表达, 眼柄等其他组织中也有分布, 在肝胰腺中微量表达或者不表达, 主要参与蜕皮过程中表皮内几丁质的分解重吸收 [15,33] 本研究中 PtChi 主要在蜕皮间期的肝胰腺中表达, 胃中也有较高的表达水平, 这与 Chi 1 和 Chi 3 的组织特异性相一致, 结合 PtChi 的 Blast 与多重序列比较结果, 初步推断 PtChi 应该属于 Chi 3 不同蜕皮阶段,PtChi 基因在肝胰腺 胃 肠 大颚器中的表达水平变化显著, 但各组织中的表达变化趋势不同 肝胰腺中 PtChi 基因的最高表达水平出现在 AB 期, 这与南极磷虾 (Euphausia superba) 和斑节对虾中的研究结果类似, 这些甲壳动物肝胰腺中几丁质酶活性及其基因表达水平均在蜕皮后期上升, 但出现这种变化规律的原因不详 [16,34] 笔者分析认为这可能与几丁质酶在免疫防御方面的功能有关 以往研究表明, WSSV 感染能够刺激日本对虾和凡纳滨对虾肝胰腺中 Chi 3 基因的表达上调 [35-36] 而三疣梭子蟹在蜕皮后的 AB 期身体各部分柔软, 缺乏外骨骼的保护, 易受各种病原体的侵染, 这可能是造成 PtChi 基因在 AB 期表达水平升高的原因, 暗示 PtChi 在肝胰腺中可能具有一定的免疫防御作用 ; 而在其他蜕皮阶段维持一定的基因表达水平可能与食物中几丁质的消化有关 肠道中 PtChi 基因的表达水平变化可能与蜕皮过程中肠道围食膜的消化分解有关 肠道围食膜是节肢动物中肠分泌的非细胞结构, 富含几丁质, 能够保护中肠不受粗糙食物颗粒和病原体的侵害 [37] 由于甲壳动物蜕皮过程中需要对围食膜进行分解, 因此肠道中 PtChi 在 E 期 mrna 表达水平最高, 在围食膜完成重新构建的 C 期和 D 期表达水平最低 ; 在蜕皮后的 AB 期, 肠道缺少围食膜的保护, 此阶段 PtChi 维持在较高水平, 参与肠道中的免疫活动 胃中 PtChi mrna 的最高表达量出现在 C 期, 揭示 PtChi 在胃中主要参与食物中几丁质的消化 大颚器中 PtChi 的整体表达水平较低, 但在 C 期和 D 期的表达水平显著升高, 其变化原因尚不清楚 本研究克隆了 PtChi 基因的 cdna 全长, 根据其生物学和信息学分析及其在蜕皮过程中表达变化情况, 推测该基因属于甲壳动物 Chi 3, 主要参与免疫调节 食物中几丁质的消化和肠道围食膜的分解等 但由于缺乏相关的功能验证,PtChi 的准确生理功能还需要通过构建重组蛋白 [1] 进 [35] 行攻毒实验以及 RNAi [38] 等技术手段进行验证, 进而深入研究 PtChi 基因在三疣梭子蟹蜕皮过程中的确切生理功能及调控机制 参考文献 : [1] ProespraiwongP,TassanakajonA,Rimphanitchayakit V.Chitinasesfrom theblacktigershrimppenaeus monodon:phylogenetics,expression and activities [J].ComparativeBiochemistryandPhysiologyPart B,Biochemistry & MolecularBiology,2010,156 (2): [2] KuritaK.Chitinandchitosan:functionalbiopolymers from marinecrustaceans[j].marinebiotechnology, 2006,8(3): [3] SpindlerBM,van WormhoudtA,SpindlerK D. Chitinolyticenzymesintheintegumentandmidgut- glandoftheshrimp Palaemon serratusduring the moultingcycle[j].marinebiology,1990,106(1): [4] KonoM,WilderM N,MatsuiT,etal.Chitinolytic enzymeactivitiesinthehepatopancreas,tailfanand hemolymph of kuruma prawn Penaeus japonicus duringthemoltcycle[j].fisheriesscience,1995,61 (4): [5] HuangQ S,YanJH,TangJY,etal.Cloningand tissueexpressionsofsevenchitinasefamilygenesin Litopenaeus vannamei[j]. Fish & Immunology,2010,29(1): Shelfish [6] KramerK J,Muthukrishnan S.Insect chitinases: molecularbiologyandpotentialuseasbiopesticides [J].InsectBiochemistry and MolecularBiology. 1998,27(11): [7] DuoCL. Review of fungal chitinases [J].

9 9 期王伟, 等 : 三疣梭子蟹几丁质酶基因的克隆及其在蜕皮过程中的表达分析 1299 Mycopathologia,2006,161(6): [8] MaliB,M hrlen F,Frohme M,etal.A putative doublerole ofa chitinase in a cnidarian:patern formation and immunity[j].developmentaland ComparativeImmunology,2004,28(10): [9] DahiyaN,TewariR,HoondalG S.Biotechnological aspectsofchitinolyticenzymes:areview[j].applied MicrobiologyandBiotechnology,2006,71(6): [10] ZhuQ S,DengY P,VankaP,etal.Computational identificationofnovelchitinase likeproteinsinthe Drosophila melanogaster genome [ J ]. Bioinformatics,2004,20(2): [11] ZhuQ S,Arakane Y,Banerjee D,etal.Domain organization and phylogenetic analysis of the chitinase likefamilyofproteinsinthreespeciesof insects[j].insect Biochemistry and Molecular Biology,2008,38(4): [12] WatanabeT,KonoM,AidaK,etal.Purificationand molecularcloning ofa chitinase expressed in the hepatopancreas of the penaeid prawn Penaeus japonicus[j]. Biochimica et Biophysica Acta ( BBA ) Protein Structure and Molecular Enzymology,1998,1382(2): [13] ZhangJQ,Sun Y Y,LiF H,etal.Molecular characterizationandexpressionanalysisofchitinase (Fcchi 3) from Chinese shrimp,fenneropenaeus chinensis[j].molecularbiologyreports,2010,37 (4): [14] LüL,NingQ J.Advancesincrustaceanschitinase genestructureandfunctionresearch[j].progressin PhysiologicalSciences,2011,42(6): [ 吕黎, 宁黔冀. 甲壳动物几丁质酶基因结构与功能的研究进展. 生理科学进展,2011,42(6): ] [15] WatanabeT,KonoM.IsolationofacDNA encoding achitinasefamilyproteinfrom cuticulartissuesofthe Kurumaprawn Penaeusjaponicus[J].Zoological Science,1997,14(1): [16] TanSH,DegnanB M,LehnertS A.ThePenaeus monodonchitinase1geneisdiferentialyexpressed inthehepatopancreasduring themoltcycle[j]. MarineBiotechnology,2000,2(2): [17] RochaJ,GarciaC FL,MuhliaA A,etal.Cuticular chitin synthase and chitinase mrna ofwhiteleg shrimp Litopenaeus vannameiduring the molting cycle[j].aquaculture,2012, : [18] BowserPR,Rosemark R.Mortalities ofcultured lobsters,homarus,associated with a molt death syndrome[j].aquaculture,1981,23(1-4): [19] LuY L,WangF,ZhangZY,etal.Efectsofsalinity ongrowth,moltand energy utilization ofjuvenile swimmingcrabportunustrituberculatus[j].journal offisherysciencesofchina,2012,19(2): [ 路允良, 王芳, 赵卓英, 等. 盐度对三疣梭子蟹生长 蜕壳及能量利用的影响. 中国水产科学, 2012,19(2): ] [20] SuprayudiM A,TakeuchiT,HamasakiK.Efectsof Artemia enriched with eicosapentaenoic and docosahexaenoicacidonsurvivalandoccurenceof moltingfailureinmegaloplarvaeofthemudcrab Scylaserrata[J].FisheriesScience,2004,70(4): [21] DanS,HamasakiK.Efectsofsalinityanddietaryn 3 highly unsaturated faty acids on the survival, development,and morphogenesisofthe larvae of laboratory - reared mud crab Scyla serrata (Decapoda, Portunidae) [ J]. Aquaculture International,2011,19(2): [22] WangW,WuX G,LouB,etal.Cloningofretinoid X receptor(rxr)anditsexpressionanalysisduring moltinginportunustrituberculatus[j].oceanologia etlimnologiasinica,2014,45(5): [ 王伟, 吴旭干, 楼宝, 等. 三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus)rxr 基因克隆及其在蜕皮过程中的表达分析. 海洋与湖沼,2014,45(5): ] [23] ShenJ,ZhuD F,HuZH,etal.Moltstaginginthe swimmingcrabportunustrituberculatus[j].journal offisheriesofchina,2011,35(10): [ 沈洁, 朱冬发, 胡泽辉, 等. 三疣梭子蟹蜕皮周期的分期. 水产学报,2011,35(10): ] [24] YangF,Xu H T,Dai Z M,et al.molecular characterization and expression analysis of vitelogenin in the marine crab Portunus trituberculatus[j].comparative Biochemistry and Physiology Part B, Biochemistry & Molecular Biology,2005,142(4): [25] ZhangSY,Jiang S F,Xiong Y W,etal.Six chitinasesfrom orientalriverprawnmacrobrachium nipponense:cdna characterization,classificationand mrna expression during post - embryonic developmentand moulting cycle[j].comparative BiochemistryandPhysiologyPartB,Biochemistry& MolecularBiology,2014,167(1):30-40.

10 1300 水产学报 39 卷 [26] TewsI,van ScheltingaA C T,PerakisA,etal. Substrate assisted catalysisunifiestwo familiesof chitinolyticenzymes[j].journaloftheamerican ChemicalSociety,1997,119(34): [27] SynstadB,GaseidnesS,vanAaltenD M F,etal. Mutationalandcomputationalanalysisoftheroleof conservedresiduesintheactivesiteofafamily18 chitinase[j].european JournalofBiochemistry, 2004,271(2): [28] LuY,ZenK C,MuthukrishnanS,etal.Site directed mutagenesisand functionalanalysisofactive site acidicaminoacidresiduesd142,d144ande146in Manducasexta(tobaccohornworm) chitinase[j]. InsectBiochemistryandMolecularBiology,2002,32 (11): [29] ZhangH,HuangX,FukamizoT,etal.Site directed mutagenesisandfunctionalanalysisofanactivesite tryptophan of insect chitinase [ J]. Insect BiochemistryandMolecularBiology,2002,32(11): [30] ArakaneY,ZhuQ,MatsumiyaM,etal.Propertiesof catalytic,linkerandchitin bindingdomainsofinsect chitinase[j].insectbiochemistry and Molecular Biology,2003,33(6): [31] TjoelkerLW,GostingL,FreyS,etal.Structuraland functionaldefinitionofthehumanchitinasechitin bindingdomain[j].journalofbiologicalchemistry, 2000,275(1): [32] WatanabeT,Kono M,Aida K,etal.Isolation of cdna encodingaputativechitinaseprecursorinthe kurumaprawn Penaeus japonicus[j].molecular MarineBiologyandBiotechnology,1996,5(4): [33] ProespraiwongP,TasanakajonaA,Rimphanitchayakit V.Chitinasesfrom theblack tigershrimp Penaeus monodon:phylogenetics,expresionandactivities[j]. ComparativeBiochemistry and Physiology PartB: BiochemistryandMolecularBiol,2010,156(2): [34] BuchholzF.Moultcycleand seasonalactivitiesof chitinolyticenzymesintheintegumentanddigestive tractoftheantarctickril,euphausiasuperba[j]. PolarBiology,1989,9(5): [35] PanD,He N,Yang Z,etal.Diferential gene expression profile in hepatopancreas of WSSV resistantshrimp(penaeusjaponicus)bysuppression subtractive hybridization[j].developmentaland ComparativeImmunology,2005,29(2): [36] ZhangZY,YinZ X,WangSP,etal.Profilingof diferentialyexpressed genesin hepatopancreasof white spot syndrome virus - resistant shrimp (Litopenaeusvannamei) bysuppressionsubtractive hybridization[j].fish & Shelfish Immunology, 2007,22(5): [37] WangLY,LiF H,Wang B etal.structureand partialproteinprofilesoftheperitrophicmembrane (PM ) from the gutofthe shrimp Litopenaeus vannamei[j].fish&shelfishimmunology,2012,33 (6): [38] ZhuQ S,ArakaneY,BeemanRW,etal.Functional specialization among insectchitinase family genes revealedbyrna interference[j].proceedingsofthe NationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesof America,2008,105(18):

11 9 期王伟, 等 : 三疣梭子蟹几丁质酶基因的克隆及其在蜕皮过程中的表达分析 1301 Cloningofchitinaseanditsexpresionanalysisduring moltinginportunustrituberculatus WANG Wei 1,3,WU Xugan 1,PAN Guiping 2,HOU Wenjie 2,CHENG Yongxu 1,4 (1.KeyLaboratoryofExplorationandUtilizationofAquaticGeneticResources, ShanghaiOceanUniversity,MinistryofEducation,Shanghai ,China; 2.EastChinaSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisheryScience,Shanghai ,China; 3.ShanghaiFisheriesResearchInstitute,ShanghaiFisheriesTechnicalExtensionStation,Shanghai ,China; 4.AquaticAnimalBreedingCenterofShanghaiUniversityKnowledgeServicePlatform, ShanghaiOceanUniversity,Shanghai ,China) Abstract:Theswimmingcrab,Portunustrituberculatusisacommercialyimportantmariculturespecies distributedineastcoastregionsofchina,japanandkorea.itshighnutritionalvalueandincreasingmarket demandshavepromotedthequickdevelopmentofpond cultureineastcoastalwatersofchinasincethe1990 s.however,themoltingdeathsyndrome(mds)andotherdiseaseproblemsaretwolimitingfactorsforthe sustainabledevelopmentofthiscrabaquaculture.chitinasehasbeenreportedtoparticipateinthemolting regulationandimmunedefenceforcrustaceanspecies,andthefurtherstudyofcrustaceanchitinasewilnot only enhance ourunderstanding forthe mechanism ofmolting activities,butalso provide valuable information forthecontrolofmds in theaquacultureofp.trituberculatus.unfortunately,to date,no availableinformationcouldbefoundonthechitinaseofp.trituberculatus.thepresentstudywastherefore conductedto clonefullength cdna ofachitinase(genbank accession number:kf914663) forp. trituberculatusbytranscriptomesequencingandrace(rapidamplificationofcdna ends).relativegene expresionlevelsofptchi(p.trituberculatuschi)geneinvarioustisueswerethendetectedbyqrt PCR (quantitativereal timepcr)duringthemoltingcycle.theresultsshowedthat:(1)thefullengthofptchi cdna was2200bp,includinga1470bporf(openreadingframe) whichencoded489aminoacid residues,a16bp5 UTRanda714bp3 UTR,whileitscalculatedmolecularweightandisoelectricpoint were53 97kuand4 76,respectively.(2) HomologousanalysisusingBlastpshowedthatthepredicted aminoacidsequenceofptchishared61% -96% identitywiththetypeofchi 3ofothercrustaceans,and PtChiwasclusteredwithcrustaceansChi 3sinphylogenetictree.(3)PtChihadthehighestgeneexpresion levelsinhepatopancreas,thendecreasedintheorderofstomach> mandibularorgan > heart> eyestalk, whilethelowestexpressionlevelswerefoundinothertisues.(4)thegeneexpresionpaternsofptchi werediferentamongtissuesduringthemoltingcycle.ptchi mrna hadthehighestexpressionlevelatab stageandthelowestexpressionlevelatcstageinhepatopancreas,whichsuggestedptchimayparticipatein theimmunityandpathogendefenseafterecdysis.inintestine,thehighestptchi mrna expresionlevelwas foundate stagewhilethelowestlevelwasdetectedatc stage.therefore,itwasdeducedthatintestinal PtChiwasinvolvedinthedegradationofendogenouschitiningutperitrophicmembraneandtheparticipation inimmunefunctions.inaddition,thepeakvalueofptchi mrnaexpressionlevelinstomachwasfoundatc stage,dueprobablytothedigestionoffoodchitinduringthisstage.theseresultsindicatedthatptchimay belongtothetypeofchi 3incrustaceanfamily,andmaybeinvolvedinthemoltingprocess,fooddigestion andimmunityofp.trituberculatus.however,itsexactlybiologicalfunctionrequiresfurtherstudies Keywords:Portunustrituberculatus;chitinase;genecloning;expresionanalysis;molting Correspondingauthor:ChengYongxu,E mail:yxcheng@shou.edu.cn