<4D F736F F D20BDE1BACBB7D6D6A6B8CBBEFAD0A7D3A654CFB8B0FBBCECB2E2CAD4BCC1BAD0A3A8C3B8C1AAC3E2D2DFB0DFB5E3B7A8A3A9D7F7D2B5D6B8B5BCCAE931332E372E31312E646F6378>

Size: px

Start display at page:

Download "<4D F736F F D20BDE1BACBB7D6D6A6B8CBBEFAD0A7D3A654CFB8B0FBBCECB2E2CAD4BCC1BAD0A3A8C3B8C1AAC3E2D2DFB0DFB5E3B7A8A3A9D7F7D2B5D6B8B5BCCAE931332E372E31312E646F6378>"

苹燕
5 years ago
Views:

1 项目名称结核感染 T 细胞检测试剂盒 ( 酶联免疫斑点法 ) 作业指导书版次第版编制时间页码共 13 页一. 目的 : 第一章 : 结核感染 T 细胞检测试剂盒 ( 酶联免疫斑点法 ) 介绍适用于结核病的辅助诊断 ; 结核感染检测 ; 传播风险预防控制二. 原理下面为结核感染 T 细胞酶联免疫斑点法检测的原理图 : 从全血中分离出来的 T 细胞, 经过洗涤排除本底干扰并通过计数保证标准数量的待测细胞, 在体外培养过程中受包含 ESAT-6 和 CFP 10 两个特异性片段的重组融合抗原刺激后分泌 IFN-γ ELISPOT 检测是高灵敏度的, 在细胞分泌的细胞因子 IFN-γ 扩散稀释前, 直接 1

2 被反应板上预包被的高亲和力高特异性的 IFN-γ 单抗捕获, 通过加入生物素标记的抗体结合 IFN-γ 的不同抗原决定簇, 并且通过碱性磷酸酶标记的链亲和素结合生物素进行一步放大作用, 显色底物溶液在原位被酶分解形成深蓝色斑点每一个斑点代表一个 γ 干扰素分泌细胞 ( 结核特异的效应 T 细胞 ) 通过对斑点计数可以判断体内是否存在对结核杆菌敏感的效应 T 细胞三. 试剂 : 1. 试剂组分试剂名 : 结核感染 T 细胞检测试剂盒 ( 酶联免疫斑点法 ), 由反应板特异性刺激抗原阳性对照刺激物浓缩标记抗体浓缩酶结合物浓缩洗涤液显色液组成厂商名 : 上海铭源数康生物芯片有限公司 2. 试剂保存有效期 :2-8, 未开封的有效期为 12 个月四. 特点 1. 结核感染 T 细胞检测试剂盒的优势 ELISPOT 试验是目前诊断结核病最新的产品形式之一 (1) 高灵敏度 : 单细胞水平, 活细胞功能检测, 可以从百万级数量的细胞中检测出每一个反应的 T 细胞, 且对肺结核及肺外结核均能有效检测 (2) 高特异性 : 不受卡介苗接种和大部分环境分支杆菌感染的影响 (3) 简便 : 无需复杂仪器辅助, 可高通量化操作 (4) 结果直观 : 通过显色反应, 可在细胞分泌的原位上显现清晰可辨的斑点, 随后通过肉眼或放大镜对斑点进行计数,1 个斑点代表 1 个 γ 干扰素分泌细胞 2. 结核感染 T 细胞检测试剂盒的适用范围 (1) 结核病的辅助诊断 : 菌阴结核病的辅助诊断 ; 肺外结核病的鉴别诊断 ; 儿童结核的辅助诊断疗效评估 (2) 结核感染检测 : 血透器官移植患者 ; 血液病肿瘤放 / 化疗患者 ; 糖尿病患者 ;HIV 患者 ; 生物制剂 / 免疫抑制剂治疗患者 (3) 传播风险预防控制 : 结核密切接触者移民医务工作者的预防 3. 结核感染 T 细胞检测试剂盒的评估结核病是当今世界由单一致病菌引起的死亡率最高的疾病, 长期位居我国传染性疾病死 2

3 亡之首, 这与结核病的检测水平低下而导致发现率低, 延误治疗, 使得结核病传播无法得到有效地控制是有密切联系的 WHO 专家认为, 对于控制结核病传播, 通过改进诊断方法, 早期发现患者, 控制传染源较治疗药物或疫苗的研究更为重要和紧迫, 故 2006 年在 WHO 出版的结核病诊断方法 : 全球需求和市场潜力报告中呼吁全球诊断试剂公司应致力于研发低成本高性能的新型结核诊断试剂结核菌素皮肤试验 (TST) 是长期以来用于快速诊断结核感染的唯一手段但是,TST 没有足够的灵敏度和特异性, 在活动性结核患者中, 相当部分会出现假阴性结果, 而且结核菌素纯蛋白衍生物 (PPD) 是 200 多种蛋白的混合物, 易受卡介苗接种和非结核分枝杆菌感染的干扰, 出现假阳性结果本产品是上海铭源数康生物芯片有限公司与解放军 309 医院全军结核病研究所合作转化的高新产品, 也是全军结核病研究所多年研究经验的积累其选用的结核分枝杆菌特异性刺激抗原为基因工程重组 ESAT-6 -CFP10 融合抗原, 该抗原在在卡介苗菌株及大部分环境分枝杆菌中缺失, 因此不受卡介苗接种和大部分环境分支杆菌感染的影响, 具有灵敏度高单细胞水平, 活细胞功能检测操作简便经济, 可以进行高通量筛选的优点本产品与进口的 Oxford Immunotec Ltd. 公司的试剂盒的检测结果做了对比, 具有很高的一致性由于本产品只是适用于体外辅助诊断, 因此希望和临床专家多配合, 汇总更多的病例, 为该种检测方法的应用提供更多有意义的临床数据 4. 结核感染 T 细胞检测试剂盒的安全性结核感染 T 细胞检测试剂盒是体外诊断系统, 由于不直接接触人体, 因此对人体无伤害检测中使用了从生物体内提取的生物材料和玻璃试剂瓶, 使用完毕请单独弃置, 以免污染水源因检测样本为新鲜血液, 请务必戴乳胶手套操作五. 结果判断 : 空白对照孔斑点数阳性对照孔斑点数检测孔斑点数 - 空白对照孔斑点数结果判定 16 阳性结果灰区 ( 建议重新检测 ) <13 <11 阴性结果 <20 16 阳性结果灰区 ( 建议重新检测 ) 3

4 <11 结果无效, 建议重新检测空白对照孔斑点数阳性对照孔斑点数检测孔斑点数结果判定 13 空白对照孔斑点数 <20 ( 检测孔斑点数 ) 2 ( 空白对照孔斑点数 ) 阳性结果 ( 检测孔斑点数 )<2 ( 空白对照孔斑点数 ) 阴性结果 ( 检测孔斑点数 ) 2 ( 空白对照孔斑点数 ) 阳性结果结果无效 ( 检测孔斑点数 )<2 ( 空白对照孔斑点数 ) 建议重新检测空白对照孔斑点数 >20 结果判定结果无效, 建议重新检测注 : 若阳性对照孔斑点数小于空白对照孔斑点数, 则质控系统无效, 结果无效, 建议重新检测 4

5 第二章 : 结核感染 T 细胞检测试剂盒 ( 酶联免疫斑点法 ) 操作步骤样本要求 1. 标本采集 : 使用新鲜肝素锂或柠檬酸钠抗凝的真空采血管无菌抽取待检人员外周静脉血 4-5 ml, 颠倒使抗凝液和血液混匀待用 ; 放置室温 (18-25 ) 小于 4 小时, 勿冷冻或冷藏注 : 每个实验室应确定 PBMC 的收集与分离程序, 以获得足够数量和活力的 PBMC 我们建议按以下方法收集与分离 PBMC 2. 外周血单个核细胞 (PBMCs) 的分离 : 分离淋巴细胞必须严格无菌操作 (1) 将含抗凝血的采血管颠倒混匀避免血液分层 (2) 按 2-3:1 的比例将抗凝血缓缓加入到含淋巴细胞分层液的灭菌离心管中, 形成明显界面, 在室温下 1000g 离心 20 min; 或按淋巴细胞分离液使用说明书进行操作, 可见外周血单个核细胞 (PBMC) 存在于云雾状层中 3. 外周血单个核细胞的洗涤与记数 : 每个检测孔必须加入 25 万个淋巴细胞, 错误记数会导致结果的不正确 (1) 吸取淋巴细胞层至灭菌离心管中 (2) 加入预热至 37 的 RPMI-1640 培养液 8 ml, 轻轻吹打混悬后, 于室温下 600g 离心 10 min (3) 弃去上清, 加入预热至 37 的 RPMI-1640 培养液 6 ml, 轻轻吹打混悬后, 于室温下 600g 离心 8 min, 弃去上清 (4) 加入 250µl 预热至 37 的无血清培养基重悬细胞沉淀取 10 µl 细胞悬液加入 40 µl 0.4% 台盼蓝, 混匀后取 10 µl 台盼蓝混合细胞液加入血球计数板, 在显微镜下计数, 然后用预热至 37 的无血清培养基配制浓度为个 /ml 的细胞悬液至少 300µl 待用检验方法 1. 加样及培养 : 加入刺激物培养必须严格无菌操作每份待测样本需 3 个反应孔 :1 个空白对照孔和 1 个阳性对照孔必须同每个样本的检测 5

6 一起进行 (1) 取出实验所需数目的反应板条特异性刺激抗原阳性对照刺激物平衡至室温待用, 未用的板条连同干燥剂放回封口袋及铝箔袋中 (2) 在反应孔内加入下列试剂 : 50 µl 无血清培养基至每个空白对照孔 ; 50 µl 阳性对照刺激物至每个阳性对照孔 ; 50 µl 结核杆菌特异性刺激抗原至每个检测孔 ; (3) 每孔加入 100µl 配制好的浓度为个 /ml 的细胞悬液, 使得每孔加入的细胞数量为个 (4) 将反应板放入湿润的培养箱在 37 5% CO 2 培养小时, 培养期间避免移动碰撞培养箱 2. 斑点形成及计数 : 不需要保证无菌操作 (1) 计算实验所需用量, 用 PBS 稀释浓缩标记抗体及浓缩酶结合物 (1:200 稀释 ) 成工作液, 现配现用 ; 用双蒸水或者去离子水稀释浓缩洗涤液 (1:10 稀释 ) 成 1 洗涤液 (2) 将反应板取出, 弃培养上清液, 加入 200 μl 4 预冷的双蒸水或者去离子水裂解细胞 10 min(-20 放置 5 min, 然后 4 放置 5 min), 用 1 洗涤液洗板 7 次,200 μl / 孔,1min/ 次, 最后一次洗板后拍干 (3) 在每个孔中加入 100 µl 标记抗体工作液, 置 37 孵育 1 小时 (4) 弃液体, 用 1 洗涤液洗板 5 次,200 μl / 孔,1min/ 次, 最后一次洗板后拍干, 加入 100 µl 酶结合物工作液, 置 37 孵育 30min (5) 取出显色液, 平衡至室温 (6) 弃液体, 用 1 洗涤液洗板 5 次,200 μl / 孔,1min/ 次, 最后一次洗板后拍干, 每孔加入平衡至室温的显色液 50 µl, 置 37 闭光显色 15 分钟至斑点大小肉眼清晰可见, 如下图所示 : 6

7 (7) 可见板底显示蓝紫色斑点, 用双蒸水或者去离子水洗涤反应孔以终止反应, 将板放入 37 烘箱干燥 4 小时或者室温干燥过夜 (8) 计数着色的斑点, 每一个点代表一个分泌 γ 干扰素的 T 细胞 7

8 第三章 : 结核感染 T 细胞检测试剂盒 ( 酶联免疫斑点法 ) 质量控制一. 质量控制 1. 通常正常结果, 空白对照孔没有或有很少的斑点而阳性对照孔斑点数超过 20 个 2. 空白对照孔斑点数超过 20 个有可能是污染造成, 建议重新采集标本检测 3. 当阳性对照孔斑点数少于 20 个时, 结果判断应慎重二. 异常结果处理 1. 空白对照孔斑点数超过 20 个有可能是污染造成, 建议重新采集标本检测 2. 阳性对照孔斑点数应当超过 20 个或遍布整个反应孔 ( 斑点数量太多 ) 当阳性对照孔斑点数少于 20 个时, 除非检测孔根据结果解释和判断标准确定为阳性, 那么此检测结果有效, 否则建议重新采集标本进行检测 3. 若阳性对照孔斑点数小于空白对照孔斑点数, 则质控系统无效, 结果无效, 建议重新检测 4. 基于生物学和反应体系的原因, 当 ( 检测孔斑点数 ) 减去 ( 空白对照孔斑点数 ) 为 13±2 时, 此结果被定义为灰区, 应当利用所有可利用相关的临床信息进行判断建议重新采集标本复查 8

9 第四章 : 结核感染 T 细胞检测试剂盒 ( 酶联免疫斑点法 ) 注意事项一实验条件注意事项 1. 实验室要求使用结核感染 T 细胞检测试剂盒时, 要求实验室宽敞明亮, 空气流通良好本试剂盒未提供但实验所需的设备及材料如下 : II 级生物安全柜 ( 推荐 ) 或洁净工作台淋巴细胞分离 : 人淋巴细胞 (PBMC) 分离液 ( 推荐使用 GE 的 Ficoll-PaqueTM Plus ) 或者淋巴细胞分离采血管 ( 推荐使用 BD 的 CPT 管 ) 水平离心机 : 离心力能达到 1600g, 温控 (18-25 ) PBMCs 计数设备和试剂 : 使用血球计数板及台盼兰在显微镜下计数或者全自动血细胞计数仪细胞培养箱 :37 ±1,5%CO 2 洗板设备 : 合适的自动洗板机或者手动洗板放大镜 (10 倍 ) 移液器及消毒的加样吸头 EP 管无菌的细胞培养基 : 细胞培养基 (RPMI-1640) 无血清培养基(AIM-V) PBS 缓冲液 (ph7.4) 双蒸水或去离子水 2. 实验要求及标本相关注意事项使用前请仔细阅读使用说明书, 不同批号的试剂组分不得混用或互换未开封的试剂盒存放在 2-8 开封后的各组分需在 2 个月内使用完毕, 且不超过试剂盒标签上注明的有效期试剂盒各组分从 2-8 取出使用前需平衡至室温采取血样时病人无须禁食血液采集后应在 4 小时内使用, 全血样本勿冷藏或者冷冻通常情况下, 样本的采集和检测地点基本是相同的, 不需长时间转移样本 ; 如果需要异地转移, 需在的条件下运输, 时间应小于 4 小时严格无菌操作避免试剂检测孔细胞悬液及培养基污染 9

10 残余的标本及所有接触人源性材料的物品均按生物危险品进行消毒处理所有化学试剂均有潜在危险, 应佩戴手套使用, 并注意安全二检验方法的局限性 1. 仅供专业人士使用 2. 本产品仅用于体外辅助诊断, 其结果解释仅为整体临床情况的一个参考, 临床医生需结合受试者的症状体征或其他实验室和影像学结果等进行综合判断 3. 改变细胞吹打洗涤计数方法孵育时间或温度, 可能影响最终的结果, 因此尽量避免 4. 检验结果阳性不能完全确定受试者体内存在针对结核分枝杆菌的特异性细胞免疫反应 ; 检验结果阴性并不能完全排除受试者体内不存在针对结核分枝杆菌的特异性细胞免疫反应 5. 本产品临床试验已验证的人群为成年人 ( 包括老年人 ) 免疫功能丧失 (T 细胞丧失分泌功能 ) 人群不能用本品检测 6. 本产品不适用于区分潜伏性感染和活动性结核 ; 不适用于判断结核病的严重程度或疾病进展情况 7. 检验结果出现假阳性, 可能是该检测者为结核潜伏感染者, 也可能是样本被污染或操作不当 ; 检验结果出现假阴性, 可能是该检测者的淋巴细胞功能异常, 或者操作不当 8. 据文献报道, 当感染堪萨斯分枝杆菌 (M.kansasii), 苏尔加分枝杆菌 (M.szulgai), 海氏分枝杆菌 (M.marinum) 戈登分枝杆菌 (M.gordonae) 时, 用本产品同类试剂盒检测有可能存在交叉影响但是在国内鉴别诊断为这些分枝杆菌感染的病例极少, 很难获得相关病例本产品检测样本要求为新鲜外周静脉抗凝血, 不能长时间保存, 因而本产品未作此类分杆菌交叉影响的研究当怀疑上述细菌感染时有必要进行鉴别诊断三. 实验操作注意事项 1. 样本采集 (1) 使用新鲜肝素锂或柠檬酸钠抗凝的真空采血管, 不推荐 EDTA 抗凝管, 采血后及时充分颠倒混匀, 防止形成较大凝血块, 影响细胞得率 10

11 (2) 避免溶血高脂黄疸和某些血液病的样本 (3) 放置室温 (18-25 ) 小于 4 小时, 勿冷冻或冷藏 2. 淋巴细胞的分离洗涤计数和培养 (1) 淋巴细胞分离液用前恢复室温, 细胞培养基 37 预热 (2) 需缓慢加样至淋巴细胞分离液层, 避免弄混界面 (3) 细胞洗涤时用手尽量弹散管底沉淀的细胞以充分洗涤, 避免细胞成团及损失, 但切勿用枪头反复吹洗, 更不可使用振荡器 (4) 整个过程需在超净工作台或生物安全柜中操作, 使用消毒的加样吸头和离心管, 严格无菌环境, 避免细胞及试剂污染 (5) 培养期间避免移动碰撞培养箱 3. 斑点形成 (1) 样本孔较多时则尽量使用多道移液器, 保证孔间洗涤条件相对一致, 枪头切勿触碰到反应板膜, 造成破损和痕迹, 影响最终的斑点计数 (2)-20 5min 放置切勿冷冻结冰, 避免伤害反应膜 (3) 最后一次洗涤完毕后尽量拍干孔内水分 (4) 标记二抗和酶结合物工作液按需配制, 且现配现用 (5) 反应膜的烘干 (37 ) 需注意时间, 防止膜过干开裂影响结果判读 11

12 第五章 : 结核感染 T 细胞检测试剂盒 ( 酶联免疫斑点法 ) 临床意义一. 阴性结果的意义基本排除结核感染的可能性, 进入下一阶段的治疗或调整诊断方法二. 阳性结果的意义 1. 明确为结核感染, 对免疫抑制人群的下一步治疗方案做出提示 2. 明确为结核感染, 通过其它诊断, 如胸片 CT 以及临床症状进一步判断是否是活动性结核 3. 对确诊的结核患者做用药后的疗效评估 4. 阳性结果包括了活动性结核与潜伏结核感染的可能, 需要结核临床来确诊是否是结核病患者三. 假阳性和假阴性的可能原因 1. 检验结果出现假阳性, 可能是该检测者为结核潜伏感染者, 也可能是样本被污染或操作不当 2. 检验结果出现假阴性, 可能是该检测者的淋巴细胞功能异常, 或操作不当 12

13 参考文献 : 1. Wu,X.,Li, Q., Liang,Y., et al..clinical Evaluation of a Homemade Enzyme-Linked Immunospot Assay for the Diagnosis of Active Tuberculosis in China. Mol Biotechnol Jan;47(1): Oxford Immunotec Web page. T SPOT-TB test manufacturer s instructions. Accessed March 29, Losi, M., Bossink, A., Codecasa, L., et al. (2007). Use of a T-cell interferon-γrelease assay for the diagnosis of tuberculous pleurisy. European Respiratory Journal, 30, Porsa, E., Cheng, L., & Graviss, E. A. (2007). Comparison of an ESAT-6/CFP-10 peptide-based enzyme-linked immunospot assay to a tuberculin skin test for screening of a population at moderate risk of contracting tuberculosis. Clinical and Vaccine Immunology, 14, Goletti, D., Vincenti, D., Carrara, S., et al. (2005). Selected RD1 peptides for active tuberculosis diagnosis: Comparison of a gamma interferon whole-blood enzyme-linked immunosorbent assay and an enzyme-linked immunospot assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 12, HillP C,Ja ckson-sillahd,foxa,et.al. (2005) ESAT6/CFP-10 fusion protein and peptides for optimal d- iagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection by exvivo enzyme-linked immunospot assay in the Gambia. J Clin.Microbiol,43: McCutcheon M, Wehner N, Wensky A, et al. (1997), A sensitive ELISPOT assay to detect low-frequency human T lymphocytes. Journal of Immunological Methods,210: Harboe, M., Oettinger, T., Wiker, H. G., et al. (1996). Evidence for occurrence of the ESAT6 protein in Mycobacterium tuberculosis and virulent Mycobacterium bovis and for its absence in Mycobacterium bovis BCG. Infection and Immunity, 64, Jakko van Ingen, Rina de Zwaan, Richard Dekhuijzen, et al. (2009). Region of Difference 1 in Nontuberculous Mycobacterium Species Adds a Phylogenetic and Taxonomical Character. Journal of Bacteriology, Sept. 2009, p , Vol. 191, No

结核分枝杆菌效应T细胞检测试剂盒（酶联免疫斑点法）说明书

结核分枝杆菌效应T细胞检测试剂盒（酶联免疫斑点法）说明书结核分枝杆菌效应 T 细胞检测试剂盒 ( 酶联免疫斑点法 ) 说明书产品名称通用名称 : 结核分枝杆菌效应 T 细胞检测试剂盒 ( 酶联免疫斑点法 ) 英文名称 :Diagnostic Kit for effector T cell to Mycobacterium tuberculosis(enzyme-linked immunosorbent spot, ELISPOT) 商品名称 :FS-Spot