石利民, 等.Epidot 酶联免疫斑点检测方法应用于结核诊断的初步评价 445 个氨基酸,MHC Ⅱ 类抗原多肽长度多为 13~20 个氨基酸多肽合成由赛百盛公司完成, 其纯度超过 95% 包被抗人 IFN γ 抗体和生物素化抗人 IFN γ 检测抗体均由本室自行筛选链霉亲和素碱性磷酸酶碱性

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阅祯连
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1 第 22 卷第 5 期 2012 年 9 月江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.22 No.5 Sept.2012 Epidot 酶联免疫斑点检测方法应用于结核诊断的初步评价石利民 1, 王燕 1, 崔红莲 2, 许文炯 1, 史秋磊 3, 乔梦凯 1, 雍玮 1, 孙美艺 3 1, 丁洁 (1. 南京市疾病预防控制中心微生物检验科, 江苏南京 ;2. 中国科学院微生物研究所分子病毒和分子免疫室, 北京 ;3. 北京表源生物技术公司研发部, 北京 ) [ 摘要 ] 目的 : 初步评价自行研发的结核分枝杆菌抗原特异性 γ 干扰素酶联免疫斑点 (Epidot ELISPOT) 检测方法应用于结核病诊断的价值方法 : 应用自行研发的 Epidot ELISPOT 检测方法及进口 T SPOT.TB 试剂盒, 检测 60 份结核病例和 75 份健康人群的外周血结核特异性 γ 干扰素释放水平 [ 斑点形成细胞 (spotformingcels,sfcs)] 结果 :ELISPOT 方法与 T SPOT.TB 检测方法对结核感染人群中的敏感性分别为 81.67% 90.00%, 特异度分别为 94.67% 94.67%,Epidot ELISPOT 的敏感度与 T SPOT.TB 比较 (χ 2 =1.313,P=0.252), 特异性比较 (χ 2 =0.000, P=1.000), 差异均无统计学意义分别用上述两种方法检测肺结核痰阳组和痰阴组形成的 SFCs, 组间差异均无统计学意义结论 : 自行研发的结核分枝杆菌抗原特异性 γ 干扰素酶联免疫斑点技术的灵敏度和特异性与 T SPOT. TB 检测方法类似, 可用于结核感染的辅助诊断 [ 关键词 ] 结核 ; 酶联免疫斑点实验 ;T SPOT;Epidot ELISPOT [ 中图分类号 ] R [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2012) 人体感染结核分枝杆菌后产生一系列体液免疫和细胞免疫变化人体初次感染结核菌后使 T 淋巴细胞致敏, 转化为记忆 T 淋巴细胞当人体再次接触结核分枝杆菌后, 会迅速产生效应 T 淋巴细胞, 产生多种细胞因子发挥免疫学效应酶联免疫斑点检测法 (enzyme linkedimmunospotasay,elis POT) 通过检测结核特异性抗原刺激后分泌细胞因子的 T 细胞数量, 评价细胞免疫功能, 从而辅助判断受检者是否曾受结核感染 2008 年美国 FDA 已批准 ELISPOT 商品化试剂盒 T SPOT.TB 应用于结核感染的诊断 [1-2] 但该试剂盒价格昂贵, 在一定程度上限制了其广泛应用本研究对本室建立的结核分枝杆菌抗原特异性 γ 干扰素酶联免疫斑点 (Epidot ELISPOT) 检测方法进行初步评价 Epidot 采用人工合成的混合肽段作为刺激抗原进行 γ 干扰素 (interferon γ,ifn γ) 酶联免疫斑点检测, 而进口 T SPOT 方法是以 ESAT 6 蛋白和 CFP 10 蛋白作为抗原刺激物虽然很多研究将结核菌重要的保护性抗原, 尤其是 ESAT 6 应用于结核的诊断中, 取得了较满意的结果, 但还存在一定局限性, 主要是该蛋白上存在其他几种致病性分枝杆菌的抗原位点, 对堪萨斯分枝杆菌苏氏分枝杆菌海水分枝杆菌有可能出现假阳性结果, 影响其特异性 [3] 且有研究认为, 重组蛋白的表位聚集程度相对较低 [4], 重组蛋白刺激物检测 CD8 + T 细胞介导的免疫反应能力有限 [5] 因此, 我们选择特异性多肽表位而不用全长蛋白或重叠多肽进行诊断, 希望能提高特异性和反应性且我们自行筛选出 2 株抗 γ 干扰素的单克隆抗体株用于试剂盒, 极大降低了成本本研究中, 我们应用本室建立的结核 Epidot ELISPOT 方法检测结核组和健康对照组分泌 γ 干扰素的 T 淋巴细胞数量, 即斑点形成细胞 (spot formingcels,sfcs) 的数量, 同时用进口 T SPOT.TB 试剂盒进行平行检测, 初步评价本室建立的结核 Epidot ELISPOT 方法在结核病诊断中的应用价值 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器自行研发的 Epidot ELISPOT 检测方法主要试剂为结核菌混合多肽刺激物其中的多肽抗原主要来源于 ESAT 6 和 CFP 10, 合成经过本室筛选鉴定的中国人群 MHC Ⅰ MHC Ⅱ 类抗原限制性 T 细胞表位多肽库, 多肽库由不同抗原多肽组合而成, 并经过了小样本的免疫应答检测, 选择能有效区分结核患者和结核菌素试验 (PPD) 皮试阴性的健康对照的多肽组合 MHC Ⅰ 类抗原多肽长度一般为 8~10 [ 基金项目 ] 南京市医学科技发展重大项目 (2007 年第 18 号 ); 南京市卫生局重大科研资助项目 (ZKX08020) : 通讯作者, 丁洁, 博士, 主任技师,E mail:yu2an2002@yahoo.com; 孙美艺, 博士,E mail:meiyisun2003@163.com

2 石利民, 等.Epidot 酶联免疫斑点检测方法应用于结核诊断的初步评价 445 个氨基酸,MHC Ⅱ 类抗原多肽长度多为 13~20 个氨基酸多肽合成由赛百盛公司完成, 其纯度超过 95% 包被抗人 IFN γ 抗体和生物素化抗人 IFN γ 检测抗体均由本室自行筛选链霉亲和素碱性磷酸酶碱性磷酸酶底物 NBT/BCIP 购自 ThermoScien tific 公司阳性刺激物 PHA 购自 Sigma 公司 T SPOT.TB 结核感染 T 细胞检测试剂盒 ( 英国牛津 Lmmunotec 公司 ); 细胞分离管 (BD 公司 ); 二级生物安全柜 ( 新加坡 EscoMicroPte 公司 );CO 2 细胞培养箱 (Memmer 公司 ); 离心机 ( 美国 Beckman Coulter 公司 );Ficol 淋巴细胞分离液 (TBD 公司 ); Elispot 读数系统 ( 德国 Autoimmun Diagnostika 公司 ) 1.2 研究对象 60 名结核患者均来源于南京市胸科医院 2008 年 1 月至 2010 年 12 月的初治肺结核住院患者, 男 44 例, 女 16 例, 年龄 20~72 岁, 平均 35.1 岁结核病的诊断参照中华医学会结核病学分会颁布的肺结核诊断和治疗指南中的诊断标准包括菌阳肺结核 23 例菌阴肺结核 31 例, 另外 6 例患者无菌阳或菌阴资料记录入选标准 :1 菌阳肺结核为痰抗酸杆菌涂片连续 2 次 (+) 或 1 次 (++) 或 1 次痰分枝杆菌培养阳性 2 菌阴肺结核为 3 次痰抗酸杆菌涂片及 1 次痰分枝杆菌培养阴性, 具有典型肺结核临床症状和胸部 X 线表现抗结核治疗有效临床可排除其他非结核性肺部疾患所选病例均无人类获得性免疫缺陷病毒感染急性病毒感染等病史, 未应用免疫抑制剂, 女性患者未妊娠健康人群为南京地区 2008 年 1 月至 2010 年 12 月的汉族献血员, 其中男 40 例, 女 35 例, 年龄 19~49 岁, 平均 28.0 岁 1.3 方法标本采集所有对象均采集 5ml 静脉血于肝素抗凝的真空采血管内, 轻轻颠倒 5 次, 充分混匀, 并置于室温保存,4h 内进行外周血单个核细胞 (PBMCs) 分离 PBMCs 的分离和计数将 5ml 血液与预热至室温的 Hanks 液按体积比 1 1 混匀, 按照混合血样与 Ficol 淋巴细胞分离液 2 1 的体积比, 小心将血样加在离心管中的 Ficol 淋巴细胞分离液上层, 2000r/min20 离心 20min, 用吸管吸起白细胞层, 加入预温的 Hanks 液至 30ml 1500r/min 20 离心 10min, 弃上清, 细胞用吸管悬浮于 10ml Hanks 液中,1500r/min20 离心 10min, 细胞沉淀悬浮于 1ml 预温培养基中, 计数, 调整细胞浓度为个 /ml T SPOT.TB 试剂盒体外检测 γ 干扰素分泌性 T 细胞按试剂盒说明书操作简述如下 : 分别加 50μl 培养基阳性质控物结核分枝杆菌特异性抗原 A 和 B 于相对应孔对于每个标本, 分别加 100μl 含个活细胞 /ml 的培养液到阴性孔阳性孔和两个检测孔 37 5% CO 2 孵育 16~ 20h 洗板, 加入 50μl 标记抗体工作液,2~8 孵育 60min 洗板, 加入 50μlBCIP/NBT 底物溶液, 室温避光孵育, 干燥, 计数自行研制的 Epidot 试剂检测 γ 干扰素分泌性 T 细胞将 100μl 包被抗人 IFN γ 抗体 ( 浓度 10 μg/ml) 预先加入 PVDF 膜的 ELISPOT 微孔板中,4 过夜 ; 弃包被抗体, 洗涤后加入 3% BSA/PBS250 μl, 室温封闭 2h; 分离外周血单个核细胞后, 将细胞浓度调整为个活细胞 /ml; 每个样本分别取 100μl 上述细胞悬液至阴性孔阳性孔和两个检测孔阴性孔加入 10μl 培养液, 阳性孔加入 10μl 阳性刺激物 ( 植物血凝素 10μg/ml), 两个检测孔分别加入结核菌混合多肽刺激物 10μl 37 5% CO 2 孵育 16~20h 200μlPBS 洗板 3 次, 每孔加入生物素化抗人 IFN γ 检测抗体 (1μg/ml), 室温孵育 2h,200μlPBS 洗板 3 次 ; 加入 100μl 稀释好的链霉亲和素碱性磷酸酶, 室温孵育 30min,200μlPBS 洗板 3 次 ; 加入 50μlBCIP/NBT 底物溶液, 室温避光孵育 15~35min, 用蒸馏水或去离子水充分洗涤孔的内部, 反应板放置于通风良好的地方自然晾干, 计数结果判定标准 T SPOT.TB 试剂盒以下两种结果为有反应 : 空白对照孔斑点为 0~5 个时, ( 抗原 A 或抗原 B 的斑点数 - 空白对照孔斑点数 ) 6; 或空白对照孔斑点数为 6~10 个时, 抗原 A 或抗原 B 孔斑点数 2 空白对照孔斑点数如果不符合上述标准且阳性质控孔正常时, 检测结果为无反应自行研制的体外 ELISPOT 方法以下两种结果为有反应 : 空白对照孔斑点为 0~5 个时,( 任何一样品孔斑点数 - 空白对照孔斑点数 ) 6; 或空白对照孔斑点数为 6~10 个时, 任何样品孔斑点数 2 空白对照孔斑点数如果不符合上述标准且阳性质控孔正常时, 检测结果为无反应 1.4 统计学分析应用 SPSS 软件进行统计学分析, 非正态

446 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 22 卷分布的数据用中位数 ( 四分位间距 ) 表示两方法 SFCs 数的比较采用 Kolmogorov Smirnov 两组间 SF Cs 数的比较采用 Mann WhitneyU 检验计数资料采用 χ 2 检验, 以 P<0.

TB 两种方法斑点形成情况两种试验方法的斑点形成情况见图 1 图 3 Epidot ELISPOT 检测菌阳与菌阴肺结核组的 SCFs 散点图图上方数字代表每孔斑点数图 1 Epidot ELISPOT 和 T SPOT.TB 组形成的斑点 2.2 SFCs 的数量 Epidot ELISPOT 和 T SPOT.

601, 差异无统计学意义在结核人群中的 SFCs 散点图如图 2 所示图 2 结核感染组 Epidot ELISPOT 和 T SPOT 两种方法的 SCFs 散点图 Epidot ELISPOT 在结核感染人群痰菌阴性组和痰菌阳性组形成的 SFCs 数量的中位数分别为 56 和 59.5,Z=0.616,P=0.538;T SPOT.

3 Epidot ELISPOT 和 T SPOT.TB 两种诊断试验的灵敏度和特异性 Epidot ELISPOT 的灵敏度为 81.67%, 特异度为 94.67%, 阳性预测值为 92.45%, 阴性预测值为 86.59% T SPOT.TB 的灵敏度为 90.00%, 特异度为 94.67%, 阳性预测值为 93.

3 446 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 22 卷分布的数据用中位数 ( 四分位间距 ) 表示两方法 SFCs 数的比较采用 Kolmogorov Smirnov 两组间 SF Cs 数的比较采用 Mann WhitneyU 检验计数资料采用 χ 2 检验, 以 P<0.05 为差异有统计学意义阳与菌阴肺结核组的 SCFs 散点图见图 4 2 结果 2.1 Epidot ELISPOT 和 T SPOT.TB 两种方法斑点形成情况两种试验方法的斑点形成情况见图 1 图 3 Epidot ELISPOT 检测菌阳与菌阴肺结核组的 SCFs 散点图图上方数字代表每孔斑点数图 1 Epidot ELISPOT 和 T SPOT.TB 组形成的斑点 2.2 SFCs 的数量 Epidot ELISPOT 和 T SPOT.TB 两种诊断试验在健康人群中 SCFs 数量的中位数分别为 4.75 和 1.5,Z=2.112,P=0.000, 差异无统计学意义 ; 在结核感染人群中中位数分别为和 72.75,Z=0. 765,P=0.601, 差异无统计学意义在结核人群中的 SFCs 散点图如图 2 所示图 2 结核感染组 Epidot ELISPOT 和 T SPOT 两种方法的 SCFs 散点图 Epidot ELISPOT 在结核感染人群痰菌阴性组和痰菌阳性组形成的 SFCs 数量的中位数分别为 56 和 59.5,Z=0.616,P=0.538;T SPOT.TB 在痰菌阴性组和痰菌阳性组形成的 SFCs 数量的中位数分别为 71 和 54,Z=0.365,P=0.715, 差异均无统计学意义, 如图 3 所示 Epidot ELISPOT 检测菌阳与菌阴肺结核组的 SCFs 散点图见图 3,T SPOT.TB 检测菌图 4 T SPOT.TB 检测菌阳与菌阴肺结核组的 SCFs 散点图 2.3 Epidot ELISPOT 和 T SPOT.TB 两种诊断试验的灵敏度和特异性 Epidot ELISPOT 的灵敏度为 81.67%, 特异度为 94.67%, 阳性预测值为 92.45%, 阴性预测值为 86.59% T SPOT.TB 的灵敏度为 90.00%, 特异度为 94.67%, 阳性预测值为 93.10%, 阴性预测值为 92.21% Epidot ELISPOT 与 T SPOT.TB 的灵敏度差异没有统计学意义 (χ 2 =1.313,P=0.252); 特异性差异也没有统计学意义 (χ 2 =0.000,P= 1.000) 两种方法比较,Kappa 值为 0.66 Epidot ELISPOT 在菌阳肺结核和菌阴肺结核组的灵敏度分别为 73.91% 和 87.10%, 两组比较差异无统计学意义 (χ 2 = 1.521,P=0.217) T SPOT. TB 在菌阳肺结核和菌阴肺结核组的灵敏度分别为 86.96% 和 93.55%, 两组比较差异无统计学意义 (χ 2 =0.683,P=0.409) 3 讨论结核分枝杆菌感染后, 首先引起固有免疫反应, 被吞噬细胞吞噬但是, 单纯的固有免疫并不足以抑制细菌增殖, 抗原递呈细胞将抗原递呈给 CD4 CD8 淋巴细胞 γδt 细胞后, 由 T 细胞介导的免疫反

4 石利民, 等.Epidot 酶联免疫斑点检测方法应用于结核诊断的初步评价 447 应在宿主抵抗结核菌中起重要作用抗原特异性的记忆 T 淋巴细胞再次受到抗原刺激后, 迅速释放各种细胞因子, 发挥免疫学效应, 其中最关键的细胞因子是 IFN γ [6] 目前, 在单细胞水平检测细胞因子生成能力的方法有流式细胞术免疫组化原位杂交 ELISPOT 方法等上述方法均可检测单个淋巴细胞对特异性抗原的反应性, 进而对特定抗原刺激下分泌特定细胞因子的效应淋巴细胞进行计数和监控其中,ELISPOT 方法操作简单稳定灵敏结核检测的 ELISPOT 方法中, 常用的抗原刺激物有结核菌素 (PPD) ESAT 6 蛋白 ( 早期分泌抗原靶, 相对分子质量 6000) CFP 10 蛋白 ( 培养滤液蛋白, 相对分子质量 10000) ESAT 6/CFP 10 融合蛋白 Rv3873 Rv3879c 等, 这些物质使 PBMCs 产生高水平的 IFN γ 其中 PPD ELISPOT 易受卡介苗 (BCG) 接种的影响, 诊断活动性结核病的特异性较低 ;ESAT 6 和 CFP 10 分别是 RD1 区域 rv3875 和 rv3874 编码的相对分子质量较小的蛋白, 是激发细胞免疫反应最主要的靶抗原之一 ;ESAT 6/CFP 10 融合蛋白的敏感性较单独抗原高 ;Rv3873 是 PPE68 蛋白的编码基因, 属蛋白超家族 PPE 成员, 是 RD1 区免疫原性的重要组成部分之一, 但与结核菌的毒力无关 [7] 总体而言 ESAT 6 有较高的诊断准确性, 而 Rv3873 和 Rv3879 是检测结核菌感染的潜在新抗原 [8] 我们自行研发的结核 ELISPOT 方法所采用的抗原刺激物是针对中国人群各种 HLA 抗原的混合多肽抗原, 包含 MHC Ⅰ 和 MHC Ⅱ 限制性 T 细胞表位, 多肽来源于多种结核菌相关蛋白, 其中主要为 ESAT 6 蛋 [9] 白 CFP 10 蛋白等 S rensen 等认为,ESAT 6 蛋白只存在于结核菌群 ( 包括人型分枝杆菌牛型分枝杆菌 ) 和其他少数几种致病性分枝杆菌中, 不存在于卡 [10] 介苗哥本哈根株中 ;Harboe 等的实验中, 所有受检的 8 个卡介苗株均缺乏该蛋白 CFP 10 作为一种重要的保护性抗原, 也在卡介苗减毒和反复传代过程中缺失 [11] 进口 T SPOT 试剂盒是以 ESAT 6 蛋白和 CFP 10 蛋白作为抗原刺激物, 而我们的 Epidot 试剂主要选择来源于 ESAT 6 蛋白和 CFP 10 蛋白的多肽表位为抗原刺激物, 这些多肽表位均不存在于卡介苗中因此,Epidot 实验和 T.SPOT 实验中, 抗原刺激物均能刺激 T 淋巴细胞产生 IFN γ, 但可以避免卡介苗接种产生的假阳性反应本实验结果表明, 两种方法敏感性和特异性类似在我国存在较高潜伏感染率的情况下, 本研究中 Epidot ELISPOT 和 T SPOT.TB 特异性均达到 94.67%, 可能主要与我们选取的对照人群为健康献血员有关一般认为, 酶联免疫斑点实验的结果存在着结核活动程度越高, 斑点越多的趋势 [12], 但并不精确地与结核活动程度呈正相关, 无法鉴别潜伏性和活动性结核不过也有研究认为, 可以用一个界值鉴 [13] 别活动性与潜伏性结核感染, 如 Jansens 等的分析显示,T.SPOT TB 以 49.5SFCs 为分界值可以鉴别活动性与潜伏性结核感染, 其敏感性为 83%, 特异性为 74%, 但两者间交叉很大相对于菌阳肺结核, 菌阴肺结核很难得到确诊的依据本研究显示, 在菌阳肺结核菌阴肺结核各组中, 自行研发的结核 ELISPOT 方法与 T.SPOT TB 形成的 SFCs 数量差异均无统计学意义 ( 图 3), 文献报道也得出了相似的结论 [14] 因此可以认为, 如果机体已感染结核分枝杆菌, 无论痰检是否阳性, 检测机体细胞免疫功能对初治肺结核有较高的辅助诊断价值 [ 参考文献 ] [1]LalvaniA,PathanAA,McshaneH,etal.Rapiddetec tionofmycobacterium tuberculosisinfectionbyenumera tionofantigen specifictcels[j].amjrespircritcare Med,2001,163(4): [2]PaiM,RileyLW,ColfordJMJr.Interferon gammaasays intheimmunodiagnosisoftuberculosis:asystematicre view[j].lancetinfectdis,2004,4(12): [3] 李晖. 分支杆菌 ESAT 6 研究进展 [J]. 国外医学 : 预防诊断治疗用生物制品分册,2001,24(4): [4]HoughtonRL,LodesMJ,DilonDC,etal.Useofmultie pitopepolyproteinsinserodiagnosisofactivetuberculosis [J].ClinDiagnLabImmunol,2002,9(4): [5]RosenbergES,LaRosaL,FlynnT,etal.Characterization ofhiv 1 specifict helpercelsinacuteandchronicin fection[j].immunollet,1999,66(1-3): [6] 王敬萍, 刘东洋, 古淑香, 等. 胸液 γ 干扰素和 α 肿瘤坏死因子检测对结核性胸膜炎诊断价值的探讨 [J]. 中国防痨杂志,1999,21(2): [7]DemangelC,BrodinP,CocklePJ,etal.Celenvelopepro tein PPE68 contributesto Mycobacterium tuberculosis RD1immunogenicityindependentlyofa10 kilodaltoncul turefiltrateproteinandesat 6[J].InfectImmun,2004, 72(4): [8] 杜凤娇, 陈曦, 刘菲, 等. 不同抗原酶联免疫斑点检测技术对结核性胸膜炎辅助诊断价值的比较 [J]. 北京医学,2011,33(12): ( 下转第 451 页 )

5 殷泉忠, 等. 左西孟旦治疗慢性心力衰竭急性失代偿患者的临床观察 451 纤维, 有利于改善心室舒张左西孟旦还有改善神经激素分泌异常作用, 和其他正性肌力药物比较有明显优越性 [9-10] 此外, 左西孟旦可以使血管壁的 ATP 依赖性钾离子通道得以开放, 降低外周血管阻力及肺毛细血管楔压, 减轻心脏负荷, 改善心功能 [11], 并延缓心力衰竭的进展本研究表明, 左西孟旦治疗 ADHF 的显效率及总有效率均高于米力农组, 其中左西孟旦在降低 BNP, 增加 24h 尿量, 改善 LVEF 方面均显著优于米力农左西孟旦的安全性优于磷酸二酯酶抑制剂, 其不良反应发生率远低于米力农组, 左西孟旦不增加严重心律失常的发生率 [2], 其他轻微不良反应包括头痛血钾偏低和室性期前收缩等可能继发于神经内分泌系统的激活综上所述, 左西孟旦可明显改善心力衰竭患者的血流动力学指标, 提高心功能, 从而改善心力衰竭的症状与米力农相比, 其不良反应发生率较低, 安全性及患者耐受性良好, 治疗 ADHF 疗效确切, 值得推荐用于 ADHF 患者的临床治疗 [ 参考文献 ] [1]AghababianRV.Acutelydecompensatedheartfailure:op portunitiestoimprovecareandoutcomesintheemergency department[j].revcardiovascmed,2002,3 (Suppl 4):S3-9. [2]FolathF,ClelandJG,JustH,etal.Eficacyandsafety ofintravenouslevosimendancomparedwithdobutaminein severelow outputheartfailure(thelidostudy):aran domised double blind trial[j]. Lancet, 2002, 360 (9328): [3]MoiseyevVS,PoderP,AndrejevsN,etal.Safetyandef ficacyofanovelcalciumsensitizer,levosimendan,inpa tientswithleftventricularfailureduetoanacutemyocar dialinfarction.arandomized,placebo controled,doub le blindstudy(russlan)[j].eurheartj,2002,23 (18): [4]ClelandJG,GhoshJ,FreemantleN,etal.Clinicaltrials updateandcumulativemeta analysesfrom theamerican ColegeofCardiology:WATCH,SCD HeFT,DINAMIT, CASINO,INSPIRE,STRATUS US,RIO Lipidsandcar diacresynchronisationtherapyinheartfailure[j].eurj HeartFail,2004,6(4): [5] 刘晓建, 王敬萍. 重组人脑利钠肽和米力农治疗慢性心力衰竭急性发作期的对比研究 [J]. 中国药物与临床, 2011,11(07): [6] 中华医学会心血管病学分会, 中华心血管病杂志编辑委员会. 急性心力衰竭诊断和治疗指南 [J]. 中华心血管病杂志,2010,38(3): [7]McMuray J,PfeferMA.Heartfailure[J].Lancet, 2005,365(9474): [8]DecGW.Acutedecompensatedheartfailure:theshrink ingroleofinotropictherapy[j].jamcolcardiol,2005, 46(1): [9]AntoniadesC,TousoulisD,KoumalosN,etal.Levosi mendan:beyonditssimpleinotropicefectinheartfailure [J].PharmacolTher,2007,114(2): [10]AntilaS,SundbergS,LehtonenLA.Clinicalpharmacolo gyoflevosimendan[j].clinpharmacokinet,2007,46 (7): [11] 王钢. 左西孟旦对急性心功能不全的治疗作用 [J]. 心血管康复医学杂志,2011,20(5): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 何承志 ( 上接第 447 页 ) [9]S rensenal,nagais,houen,g,etal.purificationand characterizationofalow molecular mast celantigense cretedbymycobacteriumtuberculosis[j].infectimmun, 1995,63(5): [10]HarboeM,OetingerT,WikerHG,etal.Evidencefor occurenceoftheesat 6proteininMycobacteriumtuber culosisandvirulentmycobacterium bovisandforitsab senceinmycobacterium bovisbcg[j].infectimmun, 1996,64(1): [11]MahairasGG,SaboPJ,HickeyMJ,etal.Molecularanaly sisofgeneticdiferencesbetweenmycobacterium bovis BCGandvirulentM.bovis[J].JBacteriol,1996,178 (5): [12] 马丽萍, 刘菲, 张宗德. 结核病不同抗原酶联免疫斑点检测的影响因素分析 [J]. 中国防痨杂志,2010,32 (10): [13]JansensJP,Roux LombardP,PernegerT,etal.Quantita tivescoringofaninterferon gammaasayfordiferentiating activefromlatenttuberculosis[j].eurrespirj,2007,30 (4): [14]MunkME,ArendSM,BrockI,etal.UseofESAT 6and CFP 10antigensfordiagnosisofextrapulmonarytuberculo sis[j].jinfectdis,2001,183(1): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 李政萍

材料方法

材料方法生物技术通报姜燕采用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体及对照抗体羊抗鼠利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原在内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白抗体方法检测效价免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡法检测效价的结果显示鼠抗人