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1 外显子组研究 千年基因

2 MACROGEN TGACGTA A 卷首语 高通量测序的数据质量是信息分析和实验验证的基础, 其准确性将直接影响实验结果的可靠性 项目的完成时间及科研成果的及时发布 不可靠的实验结果可能导致文章发表时无法通过审核或更严重者出现退稿现象, 这将对研究人员的学术声誉及后期基金项目的申请造成不利的影响 M c o en A 低质量的测序数据将严重影响后期的信息分析 在基因组组装中, 低质量的测序数据会导致组装结果太短, 组装的准确性太低, 从而无法得到全长 准确的基因组信息 错误的组装信息在后期实验中无法得到验证, 并影响后续的功能基因挖掘及遗传育种分析 在重测序及外显子组测序中, 错误的碱基会引起很大的假阳性变异, 一则导致项目的可用数据减少, 二则形成大量的噪声数据, 候选的变异位点过多, 无法得到明确的实验结论并大幅增加实验验证及功能研究的工作量 ; 假阴性的检测结果将导致有价值的相关变异信息的遗漏 Macrogen Europe, 因此无法达到实验目的 在转录组测序中, 低质量的数据会造成组装的准确度降低, 从而引起基因上的假阳性变异, 并形成较多假阳性的新转录本, 最终导致不能得到明确的研究结论 为保证测序结果的准确性, 千年基因始终坚持以最高的质量服务于研究人员, 其质量优势源于上市公司的信誉 丰富的项目经验及 Illumina 的官方认证! Macrogen Asia 我们郑重承诺 : 严格使用 Illumina 原厂测序试剂 ; 信息分析的参数可向合作伙伴公开, 随时接受监督和验证 ; 如因千年基因的责任导致项目失败, 将免费为合作伙伴重做或全额退款 01

3 千年基因 关于千年基因 Macrogen 集团由首尔大学于 1997 年成立, 总部位于韩国首尔, 是世界领先的生物技术研发与应用企业, 目前已在中国 美国 日本 欧洲等成立了多家分部, 并与来自全球一百多个国家的万余家科研单位保持着长期的合作 2000 年,Macrogen 成为首家在韩国创业板 (Kosdaq) 上市的生物医药企业 2011 年,Macrogen 成功跻身于全球新能源企业 500 强 Macrogen 中国分部千年基因于 2009 年在深圳成立, 主要致力于为研究人员提供全球最高质量的高通量测序 生物信息分析及相关技术支持, 目前已与国内近百家科研单位建立了广泛合作 Phone: +86-(0) Website: TGACGTA A 02

4 MACROGEN TGACGTA A 千年基因的测序质量为何最高? 年上市公司的信誉 Macrogen 于 1997 年成立,2000 年上市, 完善的上市公司管理模式下所有实验流程和项目周期均受董事会严格监管, 公司信誉深受全球万余家合作单位的长期信赖! 2. 丰富的项目经验 M c o en A Macrogen 研究院已在 Nature Nature Genetics Genome Research 等高影响力杂志发表了大量文章, 近年来平均每月完成近万份外显子组样本的测序及分析, 丰富的项目经验是合作伙伴实验成功的保障 3. Illumina 官方认证 Macrogen 是亚太地区唯一一家通过 Illumina Genome Network 认证并签署 Illumina CSPro 协议的测序服务机构 Macrogen Europe Illumina Genome Network 是 Illumina 在全球的最高认证, 承诺提供最高的测序质量, 因此是研究人员选择测序服务的最佳保证 Illumina Genome Network 对其成员的测序质量 项目经验及周期均有非常严格的审核标准, 目前全球仅有 Macrogen 加拿大迈克 史密斯基因组科学中心 (BCGSC) 和国际基因组源中心 (NCGR) 三个机构通过认证, 代表 Illumina 全球最高的测序质量 ( Illumina Genome Network 的详细介绍请见附录二 Illumina CSPro 是 Illumina 与测序仪订购单位签订的基本认证, 是测序服务商真正拥有 Macrogen Asia Illumina 测序平台的有力证明 一般来说, 凡直接购买 Illumina 测序仪的服务商均可与之签署 Illumina CSPro 协议 03

5 千年基因 千年基因的测序质量高在哪里? 1. 最高的碱基质量碱基质量值是衡量测序质量的重要指标, 质量值 (Q) 越高代表碱基被测错的概率 (P) 越小, 其计算公式为 Q=-10 lgp 其中,Q20 和 Q30 分别代表碱基被测错的概率为 1% 和 1 对于 HiSeq 2000 平台, 千年基因平均 99% 碱基准确度达到 Q20, 可保证大于 85% 碱基准确度达到 Q30 2. 最高的测序覆盖率覆盖率是指被测到的碱基占总的待测序区域的比率, 覆盖率随数据量升高而提高, 在相同的数据量下, 覆盖率主要受测序试剂 实验操作和 GC bias 等因素影响 高覆盖率是评价基因组组装完整性的重要依据, 同时也为变异检测的准确性提供数据基础 千年基因严格使用 Illumina 原厂试剂, 在相同的数据量下可提供最高的测序覆盖率 3. 最高的测序均一性覆盖深度是指总测序量与待测目标区域大小的比值, 由于测序试剂 实验操作和 GC bias 等因素影响, 所有待测区域的覆盖深度并不完全一致, 即测序的不均一性 变异检测时单条 read 检测出的变异信息很可能由测序错误导致, 可靠性较低, 因此通常选取覆盖深度大于 10 的 reads 进行分析 目前已发表的外显子组文章中约 80%-90% 的外显子区域覆盖度达到 10 以上, 千年基因严格使用 Illumina 原厂试剂, 约 90% 的外显子区域覆盖度达到 10 以上, 保证最高的测序均一性 4. 最小的文库方差较大的文库方差将导致 PE 测序产生的一对 reads 间距离误差较大, 信息分析软件很可能将它们误认为是两条独立的 read, 这将影响组装结果的准确性和变异分析结果的可靠性 千年基因严格控制建库流程, 可保证最小的文库方差 TGACGTA A 04

6 MACROGEN TGACGTA A 最低的 duplicate rate 文库制备或外显子捕获过程会因 PCR 扩增引入完全一致的 DNA 片段, 即测序结果中的 duplicate reads,duplicate reads 的比率将影响测序深度的统计和变异的可靠性分析 千年基因严格控制实验流程, 可获得最低的 duplicate reads 比例 平均 clean data 占 raw data 约 90% 以上, 相同的测序数据量下可获得最高的有效数据量 科研成果举例 M c o en A Macrogen 研究院主要致力于医药学基因组研究, 并在此领域取得了大量科研成果 2000 年, 完成了韩国人基因组指纹图谱的构建 ; 2004 年, 基因工程鼠的研究结果发表于 Nature; 2005 年, 运动发酵单胞菌基因组项目成果发表于 Nature; 2009 年, 第一个韩国人基因组图谱以其高度注释的结果发表于 Nature; 2010 年, 亚洲人基因组 CNV 的研究结果发表于 Nature Genetics; 2011 年, 人类基因组和转录组多样性的研究发表于 Nature Genetics; Macrogen Europe 2011 年, 肺癌相关的基因融合研究发表于 Genome Research; 2012 年, 肺癌的深入研究结果发表于 Genome Research 合作伙伴举例 千年基因在国内已与中国科学院 中国农业科学院 中国热带农业科学院 中国林业科学研究院 中国医学科学院 山东省农业科学院 山东省海洋水产研究所 广东省农业科学院 广东省生态环境与土壤研究所 辽宁省农业科学院 福建省亚热带植物研 Macrogen Asia 究所 上海市农业科学院 北京大学 清华大学 北京师范大学 中国农业大学 中国科学技术大学 上海交通大学 复旦大学 同济大学 中山大学 华南理工大学 华南师范大学 汕头大学 西安交通大学 华中农业大学 山东农业大学 云南农业大学 浙江海洋学院 湖南师范大学 北京协和医院 广东省人民医院 中山眼科中心 南方医科大学 广东药学院 四川省人民医院 华西医院 第三军医大学 新华医院 胸科医院 中山医院 湘雅医院 武汉同济医院 国家计生委科学技术研究所 汕头国际眼科中心 香港大学 香港中文大学 香港科技大学等单位建立了广泛的合作, 测序质量得到了合作伙伴的高度认可和一致好评

7 千年基因 来自上海新华医院 : 外显子组测序结果已通过实验验证完毕,SNP 的准确率达到 100%, 非常满意! 来自清华大学 : 我的样本之前做了转基因, 你们的测序和分析结果正好和我们之前用传统测序预估的结果完全吻合, 可以直接用于写文章了 来自广东省农科院 : 一般情况下只能用 clean data 进行转录组组装, 而你们的 raw data 就可以直接进行组装, 且组装结果非常好, 可见你们的数据质量和可用数据量非常高! 来自中国医学科学院 : 你们的效率太高了, 不到一个月就完成了所有的外显子组测序和分析, 非常及时! 来自华西医院 : 很放心把项目交给你们, 因为各方面的问题都能帮我们想到 同时也非常感谢你们对所有问题的详细解答, 让我们感到你们对待每一位客户的重视和诚意! 来自中国科学院 : 你们的敬业态度让我印象深刻, 期望下次的合作! TGACGTA A 06

8 MACROGEN TGACGTA A 07 外显子组测序 技术简介...08 技术优势...08 应用举例...09 方案设计...10 M c o en A 捕获平台...12 项目流程...13 案例解析...21 Macrogen参与发表文章举例...25 附录一...26 Macrogen Europe 附录二...27 Macrogen Asia

9 千年基因 技术简介随着社会生活水平的提高, 人类健康问题也越来越多地受到社会各界的关注 传统的遗传疾病研究模式是采用显带分析 核型分析 FISH 遗传标记 PCR-DNA 测序等传统实验方法来寻找与疾病相关的 DNA 变异, 这些方法各有各的特点, 但都存在效率低 工作量大 分辨率低等一系列的限制 新一代高通量测序技术的出现, 为遗传疾病的研究提供了全新的思路 2009 年, 基因组定向捕获工具的出现使外显子组测序成为可能 2009 年 9 月, 第一篇关于外显子组测序的原理验证文章于 Nature 杂志发表 来自华盛顿大学的 Jay Shendure 通过对四名 Freeman-Sheldon 综合征患者的外显子组测序, 找到已知的致病基因 MYH3 随后, 该团队将这种技术应用于米勒综合征的研究, 通过对患者编码区序列的捕获及深度测序, 鉴定出单个候选基因 DHODH, 并经 Sanger 测序验证其他患者中也存在该基因的突变 外显子组的序列仅占全基因组序列的 1% 左右, 但大多数与疾病相关的变异位于外显子区 通过外显子组测序可鉴定约 8 万个变异, 全基因组测序可鉴定 300 万个变异, 因此与全基因组测序相比, 外显子组测序不仅费用较低, 数据阐释也更为简单 外显子组测序技术以其经济有效的优势广泛应用于孟德尔遗传病 罕见综合征及复杂疾病的研究, 并于 2010 年被 Science 杂志评为十大突破之一 近两年外显子组研究相关的 SCI 文章已发表千余篇, 已对数百种疾病展开了深入研究, 研究结果推动了人类医学的研究 技术优势直接对蛋白编码序列进行测序, 找出影响蛋白结构的变异 高深度测序, 可发现常见变异及频率低于 1% 的罕见变异 针对外显子组区域测序, 约占基因组的 1%, 有效降低费用 周期 工作量 TGACGTA A 08

10 MACROGEN TGACGTA A 应用举例 疾病 遗传模式 致病基因 Freeman-Sheldon 综合征 AD MYH3 Kabuki 综合征 AD MLL2 Schinzel-Giedion 综合征 AR SETBP1 M c o n Sensenbrenner A 综合征 AR WDR35 Fowler 综合征 AR FLVCR2 Perrault 综合征 AR HSD17B4 Hajdu-Cheney 综合征 AD NOTCH2 成骨不全 AR SERPINF1 米勒综合征 AR DHODH Brown-Vialetto-van Laere 综合征 Macrogen Europe 血磷酸脂酶过多智力迟钝综合征 AR AR C20orf54 PIGV 家族性 β- 脂蛋白过少血症 AD ANGPTL3 色素性视网膜炎 AR DHDDS 非综合征性耳聋 AR GPSM2 原发性淋巴管性水肿 AD GJC2 肌萎缩性侧索硬化 AD VCP Macrogen Asia 非综合征的智力迟钝 AR TECR Van Den Ende-Gupta 综合征 AR SCARF2 自身免疫性淋巴组织增生症 (ALPS) AR FADD 小脑共济失调 AD TGM6 逆向性痤疮 AD NCSTN 09

11 千年基因 方案设计相比传统测序, 外显子组测序能够迅速的获得所有外显子区域的遗传信息, 在大幅提升效率的同时显著降低了研究成本 ; 相比全基因组测序, 外显子组测序能够在缩短实验周期 减少数据分析量及实验投入的基础上有针对性的得到大部分全基因组测序所能得到的信息 基于外显子组测序良好的性价比, 该方法目前在国际上已经被广泛应用于遗传病和癌症研究 1. 单基因疾病研究方案首先需要按照疾病表型对家系成员进行严格筛查, 明确其患病情况并进行该疾病研究的背景调查 在找出该疾病已经有一些研究背景和相关的致病基因报道, 可通过传统 PCR 测序方法对已知的疾病相关变异进行验证和初筛 ; 确认所研究的样本中未发现相关的基因变异, 那么可挑选一个或数个相同疾病家系的核心成员成员进行外显子组测序 每个家系中的患病个体选取 3-5 个样本, 正常个体选取 1-2 名作为对照进行研究 按照疾病模型 AD,AR 等 及样品的家系信息对测序得到的结果进行分析, 以缩小候选变异的范围, 经过多种注释 筛选后过滤掉对功能无影响的变异及公共数据库中的常见变异, 再使用传统 PCR 测序进行样本扩大化验证及相关的功能研究, 最终确定疾病相关变异 单基因遗传病研究举例 : a. 家系图 : b. 分析思路 : 隐性纯合突变致病 : 两个患者共享相同的纯合突变, 父母为杂合携带者 复合杂合突变致病 : 两个患者具有相同的突变, 即在一个基因内有两个不同的杂合变异, 而父母分别为这两个杂合突变的携带者 显性模式 ( 新生突变 ): 找两个患者共有的杂合突变, 而父母不带有该突变 TGACGTA A 10

12 MACROGEN TGACGTA A c. 变异总数 : 112,491 M c o en A 若样本为散发样本, 由于样本间没有血缘关系, 遗传背景相差较大, 测序得到的结 果也较难分析 为了更为准确地得到有价值的结果, 使用散发样本进行外显子组测序要 求的样本数目比家系样本要多一些 一般建议至少做 30 个患病个体样本以上的平行测序 分析 对大量患病个体的测序数据进行多样本分析, 从而确定候选疾病相关变异, 再用 传统 PCR 测序在其他的相同疾病患病个体和正常人群中做进一步验证 2. 复杂疾病及癌症的研究方案 Macrogen Europe 对于复杂疾病, 首先应该选择具有遗传性较高的病例作为研究对象, 一般需要满足 以下几个特点 :a. 与疾病相关 ;b. 高度遗传 ;c. 在患者中表现较早, 表型一致, 高外显 率 ;d. 疾病的发病机制相似 整体的研究思路一般是通过适量样本的外显子测序 患病 和健康个体各 50 例 找到与疾病高度关联的低频突变, 然后根据这一结果订制合适的芯 片, 在大样本里进行大规模验证 从而获得精确度更高的疾病相关变异位点 接着可以 针对这些位点进行生物学功能研究, 从而得到有意义的结果, 开发出疾病诊断及治疗的 相关产品等 Macrogen Asia 选取遗传性较高的样本 (case+control) 外显子区域筛选 剩余 : 27,845 外显子测序 非同义变异筛选 剩余 : 14,061 多样本分析, 筛选相关性较高的低频变异 数据库过滤 剩余 : 842 设计芯片进行大规模样品的验证 疾病模式筛选 生物学功能研究 结果 : 隐形纯合 :2 复合杂合 :2 新生突变 :21 11

13 千年基因 在各种环境因素的作用下, 机体某些体细胞染色体上发生的变异破坏或改变了某些 重要的生物学过程, 体细胞可能会因此异常增生而转变为肿瘤细胞 由于肿瘤细胞具有 异质性, 同一块肿瘤组织里可能含有不同时期的肿瘤细胞以及正常体细胞, 因此它的基 因变异情况相对其遗传疾病来说更为复杂 对于肿瘤组织的外显子组测序研究, 其最关 键的步骤在于样本的选取 目前最常见的情况是分别取同一癌症患者的癌组织和癌旁组 织进行比较, 样本数目建议至少 20 对以上 测序后成对的样本进行分析后再进行不同病 人间的多样本分析, 以此来发掘肿瘤相关的基因变异 由于肿瘤产生的原因包括基因突 变, 基因表达水平变异, 表观遗传变异等多个方面, 在利用 NGS 研究肿瘤的时候, 通常 会使用多种实验方法相结合的方法, 例如转录组测序 全基因组测序 甲基化测序等, 相互进行印证, 多数据整合分析可以进一步的提高数据的可靠性 捕获平台 千年基因可提供目前主流的捕获平台, 各平台的特点如下 捕获平台 Illumina TruSeq Exome Enrichment Kit Roche SeqCap EZ Human Exome Library Agilent SureSelect Human All Exon 捕获量 62M 64M 51M 捕获区域 外显子及旁翼区, 部分 UTR 及 mirna 外显子区及 mirna 外显子区 探针 95 mer DNA mer DNA 120 mer RNA 探针数量 340,427 2,100, ,872 对常用数据库的覆盖率 97.2% CCDS 96.4% RefSeq 93.2% Gencode 77.6% mirbase 99.8% CCDS 98.4% RefSeq 96.7% Gencode 98.67% mirbase 1.22% of human genomic regions, > 700 human mirnas, > 300 additional human non-coding RNAs TGACGTA A 12

14 MACROGEN TGACGTA A 项目流程 M c o en A 1. 样本检测 Macrogen Macrogen Europe 拥有通过 ISO9001 & ISO13485 & CLIA 国际质量标准认证的大型基因组学实验室, 为了严格保证测序质量, 检测合格后方可进行建库实验 用于建库的 DNA 样品标准为样品浓度大于 60ng/μl, 体积大于 20μl,OD260/OD280 为 通过以下三种方式进行样本检测 : 采用荧光定量的方法对 DNA 样品进行定量 ; NanoDrop 检测 OD260/OD280; 凝胶电泳检测 DNA 的状态, 是包含蛋白质 RNA 污染及是否存在 DNA 降解 Macrogen Asia 13

15 千年基因 2. 建库应用 TruSeq DNA Sample Prep Kits 进行文库制备, 起始 DNA 量为 1.2μg 通过超声或雾化将 DNA 样品随机打断成 bp 通过末端修复将 DNA 片段两端变为平末端,5 加磷酸基团 DNA 片段 3 加 A 通过 TA 连接将接头序列 (60bp) 加到片段两端 经过一轮扩增后成为完整的可测序的片段文库 TGACGTA A 14

16 MACROGEN TGACGTA A 3. 捕获以 Illumina 的捕获平台为例, 应用 TruSeq Exome Enrichment Kit 捕获外显子组及旁翼区, 部分 UTR 及 mirna, 总捕获范围为 62M 样品文库变性成单链 DNA M c o en A 加入与目标区域特异的生物素标记 DNA 探针 (95mer) 进行液相杂交 Macrogen Europe 加入可与生物素化探针结合的链霉亲和素磁珠, 富集目标区域 Macrogen Asia 与链霉亲和素磁珠结合的生物素化 DNA 片段通过磁性从溶液中脱离 富集的 DNA 片段随后从磁珠上洗脱, 并杂交进行第二次富集反应 15

17 千年基因 4. 测序捕获得到的 DNA 序列可于 Illumina 的任一测序仪中进行测序, 以 HiSeq 2000 为例, 每 run 可运行两张 flowcell, 每个 flowcell 包括 8 个 lane,100 PE 模式下每 run 运行约 11 天, 数据产出 600G 捕获样品经桥式 PCR 后, 置于 flowcell 中进行测序, 外显子组样本一般建议测序 125X, 便足够进行遗传疾病分析, 如肿瘤样本可根据情况适度增加测序深度 5. 质控作为 Illumina Genome Network 全球三家成员之一,Macrogen 严格使用 Illumina 原厂试剂, 遵循 Illumina Genome Network 管理, 是 Illumina 全球最高测序质量的代表 平均大于 99% 碱基准确度达 Q20, 保证大于 85% 碱基准确度达 Q30, 平均 clean data 占 raw data 90% 以上 对于外显子组项目, 约 90% 的外显子区域覆盖度达到 10 以上, 保证最高的测序均一性 a. 原始数据 HiSeq 2000 平台产出的原始数据为 Fastq 格式, 以下是对该格式的详细说明 1:N:0:AGTCAA TTCCACTTAAAAATACAAGAGCACAAATCCACATTTATTTATTGATTTTTCGTTAGTTTAAATCCTTGAG GGGTACAGCATCACTCGGATTCTGTGTCCAA + CCCFDFFFHHHHHJJJJIJJJJJJJJIJIJIJFHJJGJEIEIGIIJIJIIGIDGGIIHI@HHEHIIIIIJ=CHABBDFFFFEEDEE 对于以上 Fastq 序列, 开头, 后面是 read 的 ID 以及其他信息 ; 第二行代表 read 的序列 ; 第三行一般以 + 表示 ; 第四行代表 read 的质量信息, 与第二行的碱基序列相对应 其中, 为了便于计算机进行存储, 质量值以字符来表示, 每个字符所代表的 ASCII 码减去 33 即为该碱基对应的质量值 根据相应的公式 (Q=-10lgP), 即可计算每个碱基被测错的概率, 其中 Q20 代表碱基被测错的概率为 1%,Q30 代表碱基被测错的概率为 1 TGACGTA A 16

18 MACROGEN TGACGTA A 将以上 Fastq 序列的质量信息转换成相应的质量值, 结果如下 在该 read 中, 只有一个碱基的质量值为 28, 其余碱基的质量值均大于 30 34,34,34,37,35,37,37,37,39,39,39,39,39,41,41,41,41,40,41,41,41,41,41,41,41, 41,40,41,40,41,40,41,37,39,41,41,38,41,36,40,36,40,38,40,40,41,40,41,40,40, 38,40,35,38,38,40,40,39,40,31,39,39,36,39,40,40,40,40,40,41,28,34,39,32,33, 33,35,37,37,37,37,36,36,35,36,36,35,33,33,35,35,34,35,35,34,34,35,35,34,35, 34. M c o en A b. 质量评估下图是千年基因测序数据的质量评估结果, 横坐标表示碱基的质量值, 纵坐标表示大于该质量值的碱基所占百分比 其中几乎所有碱基的质量值在 20 以上,90% 以上碱基的质量值在 30 以上 120% Macrogen Europe 100% 80% 60% 40% 20% 0% Macrogen Asia 碱基质量评估 千年基因 变异检测时单条 read 检测出的变异信息很可能由测序错误导致, 可靠性较低, 因此通常选取覆盖深度大于 10 的 reads 进行分析 目前已发表的外显子组文章中约 80%-90% 的外显子区域覆盖度达到 10 以上, 千年基因严格使用 Illumina 原厂试剂, 约 90% 的外显子区域覆盖度达到 10 以上 下图是测序深度分布的统计结果 17

19 千年基因 测序深度分布 6. 信息分析 a. 原始数据的过滤及统计通过 FastQC FastX-toolkit 等软件对测序质量进行评估, 去除低质量 reads 大于 5 个碱基质量低于 Q20, 剩余的数据作为 clean data 进行分析 千年基因平均 clean data 占 raw data 90% 以上 b. Mapping 通过 bwa 软件将 reads map 到标准参考基因组上 (UCSC hg19), 去除无法 map 到参考基因组和多重 map 的 reads 后进行后续分析, 大约有 99.5% 的 reads 能进行下一轮分析 c. 去除完全一致 reads(duplicate reads) 样品制备和外显子组捕获过程中含有 PCR 扩增步骤, 会引入完全一致的 DNA 片段, 由于这些 DNA 序列会对后期的分析造成影响, 故要使用 PICARD 软件去除数据中的 duplicate reads, 不同的捕获平台中这类序列所占的比例不一样,Illumina 捕获平台中的 duplicate reads 数目约占总数据的 15-20%,Agilent 平台中的这一数值约为 1-3% TGACGTA A 18

20 MACROGEN TGACGTA A d. 变异检出 使用 Samtools 对测序结果与参考基因组进行比对, 找出样品中存在的变异信息, 包 括 SNV InDel 等, 并对其进行注释及功能预测, 包括 dbsnp 1000G 数据库 SIFT Polyphen-2 及 GERP 等软件 e. 多样本分析 根据研究内容的不同, 将多个样本分为不同的组别, 对其中的变异信息进行汇总, M c o en A 统计变异在群体内出现的频率, 位置等相关信息, 通过 KEGG 等信号通路注释分析其与疾 病之间的关联 f. 报告提交 包括样品检测与建库报告 pdf 格式 测序结果报告 pdf 格式 单样本变异检 出报告 excel 格式 多样本汇总分析报告 excel 格式 原始数据 Fastq BAM 等格 式 和发表文章所需的各类图表 Macrogen Europe 7. 结果展示 英文参数 统计结果 中文说明 Sample Name Example 样本名 Total reads 100,256,834 Reads 数目 Total yield (bp) 10,125,940,234 数据量 Macrogen Asia Read length (bp) 读长 Target regions (bp) 62,085,286 目标区域大小 Average throughput depth of target regions 平均测序深度 Initial mappable reads (mapped to human 100,097,762 可比对序列数 genome) % Initial mappable reads (out of total reads) 99.8% 可比对序列比例 19

21 千年基因 英文参数 统计结果 中文说明 Non-redundant reads (de-duplicated by Picard 82,401,028 非冗余序列数 tools) % Non-redundant reads (out of initial mappable 82.3% 非冗余序列比例 reads) Non-redundant unique reads (uniquely mapped 73,028,083 非冗余单一比对序列数 to human genome) % Non-redundant unique reads (out of 88.6% 非冗余单一比对序列比例 non-redundant reads) On-target reads (mapped to target regions) 50,349,303 目标区域序列数 % On-target reads (out of non-redundant 68.9% 目标区域序列比例 unique reads) % Coverage of target regions (more than 1X) 95.1% 测序深度大于 1 的覆盖度 Number of on-target genotypes (more than 1X) 59,032,909 测序深度大于 1 的区域 % Coverage of target regions (more than 10X) 91.6% 测序深度大于 10 的覆盖度 Number of on-target genotypes (more than 10X) 56,865,579 测序深度大于 10 的区域 Mean read depth of target regions 65.4 目标区域平均测序深度 Number of SNPs 78,241 SNP 数目 Number of coding SNPs 20,593 编码区 SNP 数目 Number of synonymous SNPs 10,654 同义 SNP 数目 Number of nonsynonymous SNPs 9,391 非同义 SNP 数目 Number of Indels 8,447 InDel 数目 Number of coding Indels 411 编码区 InDel 数目 TGACGTA A 20

22 MACROGEN TGACGTA A 案例解析 1. 孟德尔遗传疾病致病基因发掘 M c o en A Macrogen Europe Macrogen Asia 注 : 图 a 和图 b 为挑选进行测序的家系以及后期致病位点 PCR 验证结果, 图 c 为扩大样本实验后确认的致病基因上的数种突变类型 21

23 千年基因 背景非典型溶血尿毒综合症 ahus 是一种隐性孟德尔遗传疾病 现有的研究表明该疾病的发病机理可能与某些补体级联放大反应通路蛋白的基因突变相关 ( 补体包括 CFB, CFH,CFI,C3,MCP,THBD), 而这些突变会引起其下游的级联放大反应被激活, 从而导致 ahus 病发 但是几乎有一半的 ahus 病人中找不到遗传学或免疫学方面的病因 目的对 ahus 发病机理进行深入研究, 找出其致病基因 方法对两个患有未知原因 ahus 家庭的 7 个样本进行外显子组测序, 其中包括 4 个 ahus 病人和 3 个正常人 找出致病基因后扩大样本量 83 名未知原因 ahus 患者, 使用传统 PCR 测序方法验证结果 结果与结论在对比了正常人的外显子组序列后, 发现这些 ahus 病人的 DGKE 基因都存在突变 其中 1 号家庭患者表现为纯合的突变, 而 2 号家庭患者表现为复合杂合突变 样本扩大实验发现其中有 7 个家系在这个基因上也出现了各种形式不一的突变 其中 6 个家系为父母遗传的纯合或复合杂合突变,1 个家系为患者自身新产生的突变 在这一发现的基础上, 研究人员进行了 DGKE 的生物学功能研究, 通过一系列分子生物学实验方法, 确认了该基因的突变引起的表达沉默最终会导致 DAG-PKC 通路的激活, 影响血栓形成, 并最终引发 ahus, 从分子生物学的角度对 ahus 的发病机理做出了一个很好的解释 参考文献 Lemaire M, Frémeaux-Bacchi V, et al. Recessive mutations in DGKE cause atypical hemolytic-uremic syndrome. Nat Genet Mar 31. TGACGTA A 22

24 MACROGEN TGACGTA A 2. 肿瘤相关体细胞突变模式研究 M c o en A Macrogen Europe 注 : 图 a 为肿瘤基因组上各类型变异的分布及频率 ; 图 b 为 149 例样本中的突变频率与性别 肿瘤分期和肿瘤发生区域的关系 ; 图 c 左为带有对应基因突变的肿瘤占所有样本的比例, 每行表示一个基因 ; 图 c 中为发生显著突变的基因, 不同颜色表示不同的突变类型, 每列表示一例肿瘤样本 ; 图 c 右为显著性水平分析 Macrogen Asia 背景食管腺癌 (EAC) 在发达国家的发病率非常高, 目前关于 EAC 细胞体突变方面的研究非常有限, 在其发生发展的分子机理研究方面也缺乏确切的实验基础 目的研究体细胞突变对 EAC 的影响, 从 DNA 的层次对 EAC 进行解释 23

25 千年基因 方法对 149 对 EAC 样本 肿瘤 - 正常组织 进行外显子组测序, 其中挑选 15 对进行全基因组测序 测序采用的是 Illumina HiSeq 2000 平台 接着构建了 7 种不同 ELMO1 基因突变型的细胞株模型对分析得到的结果进行验证及功能学研究 结果与结论在全基因组重测序中, 肿瘤细胞的平均测序深度为 49, 对照组细胞为 30, 测序结果表明 :(1) 食管癌的基因突变率很高, 为 9.9 mutations/mb;(2) 基因重排率也非常高, 为 172 每样本 ;(3)AA 位点 A>C 替换率也很高, 同时在 EAC 中还发现了高频的 AA>AC 替换 EAC 的突变频率比大多数的肿瘤都要高, 与肺癌和黑色素瘤相类似, 这一结果表明此类组织很可能经常暴露在严重的损伤源环境中, 可能与胃容物或炎症相关 在外显子组测序中, 肿瘤细胞的平均测序深度为 83.3,89% 的外显子区域测序深度大于 8, 正常细胞的平均测序深度为 85.9,89% 的外显子区域测序深度大于 14 整体突变频率中位数为 3.51 mutations/mb 在这些 EAC 样本中有 26 个基因突变率非常高, 其中包括两个抑癌基因 TP53 和 CDKN2A 除此之外, 作者发现了两个高突变的基因 :ELMO1 和 DOCK2( 突变率 17%), 它们能与 RAC1 形成二聚体并参与 RAC1 的信号通路 如 ELMO1 或 DOCK2 发生突变, 将会导致 RAC1 无法被激活, 并最终增强细胞活力 7 种不同 ELMO1 基因突变型的细胞株的功能学实验发现其中 ELMO1 的突变型细胞的入侵性明显高于对照组 (wt/gfp) 从而证明了上述假设,ELMO1 突变能够帮助 EAC 肿瘤细胞入侵 同时, 一些肿瘤抑制因子如 ARIDIA SMARCA4 和 ARID2 突变率也非常高, 通常他们的突变会导致其丧失功能 除此之外, 作者还发现了一些高突变率基因, 包括 SPG20(7%),TLR4(6%), AKAP6(8%),HECW1(8%),AJAP1(6%),NUAK1(3%), 这些基因的突变与 EAC 的发生也非常相关 该文章对 EAC 进行了一个全面深刻的探索性研究, 为后期的诊断及治疗靶点的开发提供了很好的研究基础 参考文献 Dulak AM, Stojanov P, et al. Exome and whole-genome sequencing of esophageal adenocarcinoma identifies recurrent driver events and mutational complexity. Nat Genet Mar 24. TGACGTA A 24

26 MACROGEN TGACGTA A Macrogen 参与发表文章举例 1. Kim, J. I. et al. A highly annotated whole-genome sequence of a Korean individual. Nature 460, (2009). 2. Park, H. et al. Discovery of common Asian copy number variants using integrated high-resolution array CGH and massively parallel DNA sequencing. Nature Genetics 42, (2010). 3. Ju, Y. S. et al. Extensive genomic and transcriptional diversity identified through massively M c o en A parallel DNA and RNA sequencing of eighteen Korean individuals. Nature Genetics 43, (2011). 4. Ju, Y. S. et al. A transforming KIF5B and RET gene fusion in lung adenocarcinoma revealed from whole-genome and transcriptome. Genome Res 22, (2011). 5. Ju, Y. S. et al. The transcriptional landscape and mutational profile of lung adenocarcinoma. Genome Research 22, (2012). 6. Lim, B. C. et al. Genetic diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophy using Macrogen Europe next-generation sequencing technology: comprehensive mutational search in a single platform. J Med Genet 48, (2011). 7. Kim, J. J. et al. Exome sequencing and subsequent association studies identify five amino acid-altering variants influencing human height. Hum Genet 131, (2012). 8. Lohmann, E. et al. A homozygous frameshift mutation of sepiapterin reductase gene causing parkinsonism with onset in childhood. Parkinsonism and Related Disorders 18, (2012). Macrogen Asia 9. Lim, Y. M. et al. Exome sequencing identifies KIAA1377 and C5orf42 as susceptibility genes for monomelic amyotrophy. Neuromuscular Disorders 22, (2012). 10. Markello, TC. et al. Recombination mapping using Boolean logic and high-density SNP genotyping for exome sequence filtering. Molecular Genetics and Metabolism 105, (2012). 25

27 千年基因 附录一高通量测序相关名词外显子组测序 : 是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域 DNA 捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法 外显子测序相对于基因组重测序成本较低, 对研究已知基因的 SNP InDel 等具有较大的优势 测序深度 : 测序得到的总碱基数与待测区域大小的比值 如使用 Illumina TruSeq Exome Enrichment Kit, 该试剂盒的捕获范围为 62M, 测序得到 620M 数据量时, 测序深度为 620/62=10 覆盖率 : 指测序获得的序列占整个待测区域的比例 如外显子组测序的覆盖率是 98%, 则表示仍有 2% 的序列区域是没有通过测序获得的 Read: 就是读长, 就是高通量测序时一个反应所能测出的碱基数 SNP(single nucleotide polymorphism): 单核苷酸多态性, 个体间基因组 DNA 序列同一位置单个核苷酸变异 ( 替代 插入或缺失 ) 所引起的多态性 ; 不同物种个体基因组 DNA 序列同一位置上的单个核苷酸存在差别的现象, InDel(Insertion/Deletion): 插入 / 缺失, 是指两种亲本在全基因组中的差异, 相对另一个亲本而言, 其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失 CNV(copy number variation): 基因组拷贝数变异, 是基因组变异的一种形式, 通常使基因组中大片段的 DNA 形成非正常的拷贝数量 SV(structure variation): 基因组结构变异, 染色体结构变异是指在染色体上发生了大片段的变异 主要包括染色体大片段的插入和缺失, 染色体内部的某块区域发生重复复制 翻转颠换 易位 两条染色体之间发生重组等 TGACGTA A 26

28 Illumina Genome Network Delivering whole human genome sequencing services using the industry s most respected sequencing platforms. Genome Network Highlights Most Widely Adopted and Published Technology Cited in over 3,200 publications Uncompromising Data Quality Highest sensitivity and specificity Expert Sequencing Service Providers CSPro partners have extensive sequencing and data analysis experience Cost-Effective Services with Fast Turnaround Times Committed to providing industry-leading turnaround times Simplified Data Analysis Standard analysis included, with raw data provided in the most widely adopted formats All Illumina Genome Network partners have multiple HiSeq 2000 systems, ensuring the capacity and scalability necessary to manage large projects. Current members include the National Center for Genome Resources (NCGR); the Macrogen Genomic Medicine Institute; Canada s Michael Smith Genome Sciences Centre (BCGSC). Proven Technology Illumina sequencing platforms employ sequencing by synthesis (SBS) chemistry, the most effective, widely used, proven next-generation sequencing chemistry, with an unsurpassed 3,200 publications. Sequencing whole genomes with SBS chemistry yields the highest quality data, providing access to more rare variants, with the accuracy and reliability needed to move research forward. Whole-Genome Sequencing When You Need It Next-generation sequencing systems, such as the Illumina HiSeq 2000, provide the throughput and data quality necessary to support a broad range of applications to advance human genomics research. For example, whole-genome sequencing can identify the genetic underpinnings of human disease, determine the differences and similarities between distinct human populations, or identify the gene variations that make each person genetically unique. Follow-on studies such as targeted resequencing, SNP discovery, structural variation analysis, and RNA-Seq can provide in-depth information on exact genes and mutations, and their impact on gene expression. The Illumina Genome Network enables researchers to leverage whole human genome sequencing even if they have low sample volumes without the time and expense of acquiring equipment and training personnel. It completes whole-genome sequencing projects quickly and affordably, by providing access to Illumina Certified Service Providers (CSPro)* and their expert sequencing teams using Illumina platforms. What is the Illumina Genome Network? The Illumina Genome Network is a group of leading institutions worldwide, all experts in Illumina technology, that offer sequencing services to individual researchers. Illumina acts as the primary point of contact, linking researchers with the Network partner of their choosing to create a service package that meets their individual needs. Expert Genome Network Partners Illumina hand picks its Genome Network partners to ensure that sequencing projects are completed to the highest standard of quality with rapid turnaround. All have proven their sequencing expertise with numerous publications and extensive training, enabling them to achieve Illumina CSPro status. Researchers benefit from their skill and vast amount of data analysis knowledge. High-Quality Data TruSeq technology is Illumina s latest advancement in next-generation sequencing technology, delivering the most accurate human genome at any coverage. Powering all Illumina sequencing systems, TruSeq technology provides the highest yield of error-free reads, and fewer false negatives and false positives than competing technologies. With Illumina sequencing platforms, researchers can count on the highest data quality. Sequence More Cost-Effectively, Quickly Illumina has negotiated competitive prices with its Genome Network partners. The per genome cost will be at the same level as a similar service that uses less accepted technologies performed by less experienced users. In addition, the Illumina Genome Network is committed to providing industry-leading turnaround times. Analysis Assistance Sequencing through the Illumina Genome Network provides more than a virtual instrument. Illumina Genome Network partners offer simplified data analysis solutions. Customers receive raw data in the most widely adopted formats with access to the broadest selection of commercial and open-source analysis tools in the industry. Standard analysis is included at no charge, with premium data analysis services also available. Follow-On Study Support The Illumina Genome Network offers researchers an affordable entry point to Illumina next-generation sequencing. Once a whole-genome sequencing project is completed, follow-on sequencing projects can be performed by Illumina Genome Network or CSPro partners using Illumina SBS-based platforms, ensuring efficient analysis. * The Illumina CSPro program is a collaborative service partnership dedicated to ensuring delivery of the highest quality data available for genetic analysis applications. Learn more at

29 Data Sheet: Genome Network Services Figure 1: The Illumina Genome Network Process Table 1: Illumina Genome Network Service Details Performed by customer Performed by Illumina Performed by IGN partner Customer submits project to the Illumina Genome Network (IGN) Illumina provides a quote per submitted project partners who can perform the service terms and ranks IGN partners of choice (including Illumina FastTrack Services) Illumina approaches the IGN partners according to ranking order IGN partner (or Illumina) accepts project Customer sends samples to the IGN partner to begin project that data have been delivered to customer and project is complete Sample Input Requirements Input DNA requirement = 3 μg Service Performance Specifications Average autosomal fold coverage of 30 (higher coverage offered) Percent of non-n reference coverage > 90% for non-cancer samples At least 3,000,000 SNPs detected for non-cancer samples Data Deliverables Variants Single-nucleotide polymorphisms (SNPs) Indels (1-150 bp) Copy number variation (losses and gains) Structural Variants (SVs) Large insertions Large deletions Annotations dbsnp comparisons Concordance with whole-genome genotyping arrays Summary report Raw data (reads and quality scores) and analyzed data in industry-standard format (archival BAM) Delivery Data visualization in GenomeStudio software or third-party open-source tools Premium data analysis packages available through select Genome Network partners Data Quality > 80% of sequencing reads passing filters align uniquely to the reference genome > 80% of all reads passing filter have a Q value of Q30 or greater Customer receives an invoice from Illumina How Does it Work? To make accessing Illumina sequencing technology as easy as possible, Illumina remains an active part of the service, coordinating activities between customers and Genome Network partners to ensure the quality and timeliness of all projects (Figure 1). A project begins when the customer fills out a submission form (visit The input DNA amount required per sample is as low as 3 μg, with lower input amounts enabled through IGN partnerships. An Illumina representative provides a quote and contacts the customer-designated Genome Network partners to initiate the project. If the chosen partners are unavailable, Illumina will take on the project in its FastTrack Services Laboratory. Customers then send samples to their Illumina Genome Network partner and look forward to receiving high-quality, accurate data. What Does the Service Include? Illumina Genome Network partners perform whole human genome sequencing at 30 average coverage, from short-insert paired-end reads using a single library (Table 1). Data analysis is performed using CASAVA (consensus sequence from ELAND alignment, called SNPs, and indels). The delivered data set will include reads and quality scores for further downstream analysis. Whole Human Genome Sequencing Without Compromise Reliable. Accurate. Affordable. Customers can trust their large whole human genome sequencing projects to Illumina Genome Network partners, with their proven ability to obtain results using the most widely adopted sequencing technology. Start today at Illumina toll-free (U.S.) tel techsupport@illumina.com For research use only Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, illuminadx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cbot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Infinium, iselect, MiSeq, Nextera, Sentrix, SeqMonitor, Solexa, TruSeq, VeraCode, the pumpkin orange color, and the Genetic Energy streaming bases design are trademarks or registered trademarks of Illumina, Inc. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners. Pub. No Current as of 30 August 2012

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