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鹭舒
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1 第 25 卷第 2 期北京石油化工学院学报 Vol.25 No 年 6 月 JournalofBeijingInstituteofPetrochemicalTechnology Jun.2017 췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍文章编号 : (2017) 功能化表阿霉素脂质体的主药含量测定及体外释放考察居瑞军 1, 沐黎敏 2, 李学涛 3, 刘磊 2, 吕万良 2* (1. 北京石油化工学院制药工程系, 北京 ;2. 北京大学药学院药剂学系, 北京 ; 3. 辽宁中医药大学药学院药物制剂教研室, 辽宁大连 ) 摘要 : 建立了功能化表阿霉素脂质体的主药含量及体外释放率的测定方法采用薄膜分散法和硫酸铵梯度法制备各种类型的表阿霉素脂质体, 建立了一种梯度洗脱方法, 利用高效液相色谱仪测定脂质体中表阿霉素与塞来昔布的质量浓度及其体外释放度结果显示脂质体中表阿霉素质量浓度在 0.5~50.0 μg/ml, 塞来昔布质量浓度在 0.3~30.0μg/mL 范围内线性关系良好各种脂质体中表阿霉素的质量浓度分别为 (101.2±2.0) (103.1± 1.8) (98.7±1.3)g/mL, 塞来昔布的质量浓度分别为 (65.5±0.5) (63.5±1.1) μg /ml 72h 内表阿霉素的释放度均低于 5%,36h 塞来昔布的累积释放度均低于 20% 所建立的 HPLC 方法准确可靠, 简单快速, 重复性好, 各脂质体中表阿霉素与塞来昔布的体外释放缓慢, 稳定性良好关键词 : 表阿霉素 ; 塞来昔布 ; 脂质体 ; 高效液相色谱法 ; 含量测定中图分类号 :R943 文献标志码 :A DOI: /j.issn DeterminationofContentsofFunctionalEpirubicin LiposomesandInvitroReleaseRate JU Ruijun 1,MU Limin 2,LIXuetao 3,LIU Lei 2,LV Wanliang 2* (1.DepartmentofPharmaceuticalEngineering,BeijingInstituteofPetrochemicalTechnology, Beijing102617,China;2.SchoolofPharmaceuticalSciences,PekingUniversity,Beijing100191,China; 3.SchoolofPharmacy,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Dalian116600,China) Abstract:Inthisresearch,aparticularmethodisestablishedtodeterminethemaincomponentsand invitroreleaserateofthefunctionalepirubicinliposomes.thefunctionalepirubicinliposomes wereprepared by using the ammonium sulfate gradient method and membrane dispersion method.thecontentsofepirubicinandcelecoxibintheliposomes,along withtheirin vitro release rates were determined viathe HPLCgradient elution.results showed that the concentrationrangesofepirubicinandcelecoxibinliposomeswere0.5~50.0μg/ml,0.3~30.0 μg/ml,respectivelywithgoodlinear;theconcentrationofepirubicininthevariousliposomes was101.2±2.0,103.1±1.8,98.7±1.3μg/mlrespectively;theconcentrationofcelecoxibinal kindsofliposomeswas65.5±0.5,63.5±1.1μg/mlrespectively.resultsofinvitrorelease showedthatwithinthefirst72h,thereleaserateofepirubicinwaslowerthan5%,andthatof celecoxibin36hwaslessthan20%.theestablishedhplc methodwassimple,preciseandreplicable,andthein vitroreleaseofepirubicinandcelecoxibin variousliposomes wereslow, 收稿日期 : 作者简介 : 居瑞军 (1986 ), 男, 博士, 讲师, 研究方向为药剂学, juruijun@bipt.edu.cn; 吕万良 (1966 ), 男, 博士, 教授, 研究方向为药剂学, 通信联系人, luwl@bjmu.edu.cn

2 第 2 期居瑞军. 功能化表阿霉素脂质体的主药含量测定及体外释放考察 7 showingagoodstabilityandasustainedreleasebehavior. Keywords:epirubicin;celecoxib;liposomes;HPLC;contentdetermination 表阿霉素是阿霉素的同分异构体, 属于蒽醌类 [1-2] 抗肿瘤药物表阿霉素是目前临床上最有效的抗肿瘤药物之一, 主要对治疗各种实体瘤有效, 如乳 [3-4] 腺癌恶性淋巴瘤软组织肉瘤和胃癌等, 其作用机制主要是直接嵌入 DNA 核碱基对之间, 干扰转录过程, 阻止 mrna 的形成, 从而抑制 DNA 和 [5] RNA 的合成塞来昔布是一种新型非甾体抗炎 [6] 药, 具有抗炎镇痛及退热作用, 同时具有明显的 [7-8] 抗肿瘤活性, 塞来昔布可以增强肿瘤细胞对放疗的敏感性, 其机制与抑制 DNA 的修复或使细胞在 [9] 放疗敏感的 G2/M 期比例增加有关脂质体是由具有类脂质双分子层结构的物质形成的具有类生物膜结构的超微囊, 可包裹水溶性和脂溶性药物, 具有明显的肿瘤靶向性和良好的生物相容性, 可以降 [10] 低药物的毒副作用将表阿霉素和塞来昔布制备成脂质体可望联合发挥二者的抗肿瘤作用, 实现协同增效作用, 目前尚缺乏相关联合载药的报道此外, 表阿霉素的塞来昔布联合测定方法也未见报道笔者旨在构建一种功能化脂质体, 联合包载表阿霉素和塞来昔布, 并建立一种同时测定二者浓度的高效液相方法 (HPLC) 脂质体表面修饰的功能化分子是 PTD 蛋白结构域, 最初是从人类免疫缺陷病毒 (HIV)Tat 蛋白中发现的, 能够介导与之相连的多肽或者全长蛋白 [11] 质穿膜进入细胞胞浆或胞核的多肽结构 PTD 蛋白结构域具有非组织特异性明显的细胞膜黏附 [12] 性, 可以增强药物的靶向性笔者以磷脂胆固醇 DSPE-PEG 2000 为基础材料制备脂质体, 将 PTD 蛋白结构域修饰在脂质体的表面, 增强脂质体的主动靶向性 ; 将塞来昔布包封在脂质体的磷脂双分子层中, 达到与化疗药协调诱导肿瘤细胞凋亡的目的 ; 将表阿霉素作为化疗药包封在脂质体水溶性空腔中利用 HPLC 法分别测定功能化表阿霉素与塞来昔布脂质体中药物质量分数以及脂质体的体外释放度, 以便对所构建的脂质体进行合理的质量控制 1 实验材料和设备 1.1 实验材料 DSPE-PEG 2000-PTD HIV-1, 实验室合成 ; 卵磷脂 (EPC) 聚乙二醇 - 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (DSPE- PEG 2000 ), 日本油脂株式会社生产 ; 胆固醇 (cholesterol), 北京双旋微生物培养基制品厂生产 ; 盐酸表阿霉素塞来昔布, 南京天尊泽众化学试剂公司生产 ;Sephedex G-50,Sigma-Aldrich 公司生产 ; 聚碳酯过滤器 ( 孔径为 nm),Milipore 公司生产 ; 胎牛血清 (FBS),Gibco 公司生产 ; 分析纯甲醇乙腈,Burdick &Jackson 公司生产 ; 其余所用试剂均为分析纯, 北京国药试剂公司生产 1.2 仪器 BT-25S 十万分之一克精密电子天平, 德国 Sartorius 公司生产 ;PHS-3C 精密 ph 计, 梅特勒 - 托利多仪器有限公司生产 ;RE52CS 旋转蒸发仪, 上海亚荣生化仪器厂生产 ;SB-5200 超声机, 宁波新芝生物科技有限公司仪器生产 ;JY92-ID 型超声波细胞粉碎机, 宁波新芝生物科技有限公司仪器公司生产 ; 高效液相色谱仪 (HPLC),Agilent 公司生产 2 方法与结果 2.1 脂质体的制备脂质体制备方法参照文献 [13] 即精密称取卵磷脂胆固醇 DSPE-PEG 2000 DSPE-PEG 2000-PTD 和塞来昔布 ( 摩尔比为 70/30/2/3/2.8) 置于茄形瓶中, 加入适量氯仿溶解, 然后在 40 水浴减压蒸发除去溶剂, 在瓶底和内壁形成一层均匀的脂膜加入适量 250mmol/L (NH 4 ) 2SO 4 溶液水化, 在水浴中超声 5min, 后利用探头超声 10min( 工作时间为 1s, 间歇时间为 1s, 保护温度为 35, 功率为 200 W) 将超声后的脂质体依次通过孔径为 nm 的聚碳酸酯膜各 3 次, 将过膜后脂质体封装于透析膜袋 (MWCO Da) 中, 在 10 倍体积的磷酸盐缓冲溶液 (PBS,pH7.4) 中透析 24h, 每 12h 更换 1 次透析液, 与适量的表阿霉素混合 ( 药脂质量比为 1 20), 在 40 水浴振摇 20min, 即可制得功能性表阿霉素脂质体表阿霉素脂质体和表阿霉素塞来昔布脂质体的制备方法相同, 分别不加塞来昔布和 DSPE-PEG 2000-PTD 以及 DSPE- PEG 2000-PTD 2.2 表阿霉素与塞来昔布质量分数的测定色谱条件色谱柱 :EclipseXDB-C 18 柱 (Agilent,5μm,4.6 mm 250 mm); 测定温度为 30 ; 检测波长为 254nm; 流速为 1.0mL/min; 流动相 : 乙腈作为有

3 8 北京石油化工学院学报 2017 年第 25 卷机相与水相 (0.02mol/L NaH 2PO 4 / 三乙胺, 磷酸调节 ph 为 4.0) 的梯度洗脱, 结果如表 1 所示, 在此色谱条件下表阿霉素和塞来昔布对照品谱图如图 1 所示表 1 高效液相色谱梯度洗脱测量盐酸表阿霉素和塞来昔布 Table 1 Gradient elution of epirubicin and celecoxib measuredbyhplc 时间 /min w( 水相 )/% w( 有机相 )/% 流速 /(ml min -1 ) 图 1 表阿霉素和塞来昔布高效液相色谱图 Fig.1 HPLCchromatogramsofepirubicinandcelecoxib 表阿霉素的保留时间在 4min 左右, 峰型良好 ; 塞来昔布的保留时间为 10min 左右, 峰型良好溶液的制备供试品溶液的制备 : 精密量取功能性表阿霉素与塞来昔布脂质体 1.0mL, 加甲醇 9.0mL, 超声破乳,0.45μm 微孔滤膜滤过, 即得对照品溶液的制备 : 精密称取表阿霉素和塞来昔布对照品, 置 100mL 的容量瓶中, 加入甲醇溶解并定容, 制备表阿霉素质量浓度为 50μg/mL, 塞来昔布的质量浓度为 30μg/mL 的混合对照母液空白溶液的制备 : 制备出不含表阿霉素与塞来昔布的空白脂质体, 再按供试品溶液方法制备, 即得线性关系的考察取表阿霉素与塞来昔布混合对照母液, 分别稀释并制备 μg/mL 和 50.0μg/mL 的质量浓度梯度表阿霉素对照品溶液, 相应的塞来昔布质量浓度为 μg/mL 和 30.0μg/mL 分别按照上述色谱条件, 取不同质量浓度的对照品溶液分别进样, 用 HPLC 检测每一浓度的峰面积 A 值, 并以质量浓度 C( μ g/ml) 为自变量, 对相应的色谱峰面积 A 进行线性回归, 获得表阿霉素和塞来昔布的标准曲线表阿霉素与塞来昔布的标准曲线如图 2 所示图 2 表阿霉素与塞来昔布的标准曲线 Fig.2 CorrelationrelationshipbetweenconcentrationsofepirubicinandcelecoxibbyHPLC 结果表明表阿霉素的标准曲线为 y=41.984x ,R 2 =0.9995; 塞来昔布的标准曲线为 y =62.679x ,R 2 = 精密度考察取表阿霉素与塞来昔布混合对照品溶液, 其中表阿霉素表柔比星质量浓度分别为 μg/ ml 和 50.0μg/mL, 含塞来昔布质量浓度分别为 μg/mL 和 30.0μg/mL, 于 5 日内分别利用 HPLC 检测, 记录峰面积, 在上述色谱条件下测定峰面积, 计算精密度和 RSD 精密度测定结果如表 2 所示表 2 结果显示, 表阿霉素与塞来昔布的精密度均大于 98%,RSD <2%, 表明该测定方法精密度良好

4 第 2 期居瑞军. 功能化表阿霉素脂质体的主药含量测定及体外释放考察 9 表 2 表阿霉素和塞来昔布的精密度考察 Table2 Precisions of epirubicin and celecoxib via the gradientelution 质量浓度 /( μg ml -1 ) 精密度 /% RSD/% 2.0 (98.92±1.49) 1.37 表阿霉素 10.0 (98.41±0.83) (99.70±1.42) (101.59±1.59) 1.12 塞来昔布 6.0 (101.17±1.35) (102.15±3.38) 回收率考察取适量空白脂质体溶液, 加入 9 倍体积的甲醇然后加入表阿霉素和塞来昔布对照品适量, 配制成按表阿霉素计算质量浓度分别为 μg/mL 和 25.0μg/mL 溶液各 3 份 ( 其中塞来昔布质量浓度分别为 3 6μg/mL 和 15μg/mL), 分别在上述色谱条件下测定峰面积, 计算回收率和 RSD 表阿霉素与塞来昔布的回收率如表 3 所示表 3 表阿霉素和塞来昔布的回收率实验结果 Table3 Recoveries of epirubicin and celecoxib via the gradientelution 质量浓度 / ( μg ml -1 ) 回收率 /% RSD/% ± 表阿霉素 ± ± ± 塞来昔布 ± ± 由表 3 可以看出, 表阿霉素和塞来昔布的回收率在 (100±5%) 范围内,RSD<2% 表明测定方法具有较好的准确性检测限测定取表阿霉素和塞来昔布对照品溶液, 加流动相稀释, 按倍比稀释法配制系列质量浓度的样品, 分别按照上述色谱条件测定样品的色谱峰, 当信噪比约为 3 1 时的质量浓度为本方法的最低检测限采用高效液相色谱法测量表阿霉素和塞来昔布的检测限分别为 10.0ng/mL 和 6ng/mL 样品质量浓度的测定取不同批号样品各 3 份, 精密量取脂质体 1.0mL, 按供试品溶液制备方法进行制备, 在上述色谱条件下测定表阿霉素与塞来昔布的质量浓度, 结果如表 4 所示表 4 样品含量测定结果 (n=3) Table4 Contentdeterminationofsampleliposomes(n=3) 样品表阿霉素质量浓度 /( μg ml -1 ) 塞来昔布质量浓度 /( μg ml -1 ) 表阿霉素脂质体 101.2±2.0 - 表阿霉素塞来昔布脂质体 103.1± ±0.5 功能化表阿霉素脂质体 98.7± ± 脂质体中药物体外释放的测定精密量取表阿霉素脂质体表阿霉素与塞来昔布脂质体和功能化表阿霉素与塞来昔布脂质体各 2 ml, 加入 2mL 质量分数为 10% 胎牛血清的 PBS 缓冲液混匀后放入透析袋 ( 分子截留质量为 8000~ 12000Da) 内, 将透析袋两端扎紧后置于 20.0mL 释放介质中, 在 r/min 的条件下在摇床上振荡分别于 h 和 72h 时取出 0.2mL 释放介质, 并立即补入同等体积的新释放介质利用 HPLC 测定其中表阿霉素和塞来昔布的质量浓度, 并计算药物的体外释放率 : 体外释放率 %=( 第 i 时间点释放液中药物的质量 / 与透析体积相同的透析前脂质体溶液中药物的质量 ) 100% 各脂质体中表阿霉素与塞来昔布的体外释放结果如图 3 所示由图 3 可以看出, 表阿霉素在各种脂质体中的释放率, 在最初的 72h 内, 释放率均低于 5%; 而含有塞图 3 载药脂质体的体外释放考察 (n=3) Fig.3 Releaseratesofdrugḻoadedliposomes(n=3)

5 10 北京石油化工学院学报 2017 年第 25 卷来昔布的脂质体在第 36h 累积释放率不超过 20 % 3 结论利用高效液相色谱仪建立了一种梯度洗脱方法测定功能化脂质体中表阿霉素与塞来昔布的质量浓度及其体外释放度结果显示, 表阿霉素和塞来昔布在各自的范围内线性关系良好, 各脂质体中表阿霉素和塞来昔布含量均一 ; 脂质体在体外释放实验中表现出缓释行为参考文献 [1] 马保玉, 耿耘, 李永超, 等. 近 10 年国内抗肿瘤中药作用机理的研究进展 [J]. 中华中医药学刊,2012,30 (11): [2] 邢来全, 孙晓圆, 张丽.HPLC 测定注射用盐酸表柔比星的含量 [J]. 食品与药品,2013,15(3): [3] 杨峰, 黄国祥, 袁淑仪, 等. 表阿霉素免疫纳米微粒的制备及体外抗肿瘤作用研究 [J]. 中国当代医药,2013,20 (16): [4] 胡燕. 索拉非尼联合表阿霉素对乳腺癌 MCF-7 细胞的协同杀伤作用 [D]. 广州 : 南方医科大学,2010. [5] 赵晓旭, 潘运龙, 胡杨志, 等. 纳米金 - 表阿霉素复合体的体外抗肿瘤作用 [J]. 中山大学学报 ( 医学科学版 ), 2012,33(2): [6] 牛国梁, 王辉, 谢荣俊, 等. 选择性 COX-2 抑制剂塞来昔布对乳腺癌的放疗增敏作用及其机制研究 [J]. 肿瘤学杂志,2011,17(3): [7] 马骏, 霍介格. 塞来昔布抗肿瘤作用研究进展 [J]. 现代肿瘤医学,2012,20(5): [8] 徐志刚, 陈立, 吕晓艳. 塞来昔布对 H22 肝癌组织环氧合酶 2 及磷脂酶 A2 抑制作用 [J]. 中国实验诊断学, 2010,14(2): [9] 闫怡轩, 李伟忠. 塞来昔布提高耐长春新碱细胞株 KB/ VCR 细胞化疗敏感性的研究 [J]. 华西口腔医学杂志, 2013,31(4): [10] 王燕. 新型脂质体作为中药靶向载体在肿瘤治疗中的作用 [J]. 中国实验方剂学杂志,2010,16(16): [11] 张新科. 穿膜肽 TatPTD 介导的内皮抑素穿透眼球屏障及对眼部血管增生抑制作用的研究 [D]. 济南 : 山东大学,2012. [12] 刘晓雯.PTD4-apoptin 融合蛋白治疗宫颈癌的应用研究及机制初探 [D]. 武汉 : 华中科技大学,2013. [13] JU R J,LI X T,SHIJ F,etal.Liposomes, modified with PTD (HIV-1) peptide,containing epirubicin and celecoxib, to target vasculogenic mimicrychannelsininvasivebreastcancer[j].biomaterials,2014,35(26):

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.