1826 临床与病理杂志, 2017, 37(9) Keywords egatively related to the lymph odes metastasis, TNM ad cliical stage. Overall survival (O

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1 临床与病理杂志 J Cli Pathol Res 2017, 37(9) doi: /j.iss View this article at: 长链非编码 RNA WIF1-1 在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义 许海蓉 1, 黄磊 2, 姚国亮 3 1, 司新敏 (1. 南京医科大学第一附属医院消化内科, 南京 ;2. 南京医科大学附属南京市儿童医院普外科, 南京 ;3. 苏州大学第三附属医院心胸外科, 江苏常州 ) [ 摘要 ] 目的 : 探究食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织中长链非编码 RNA(log ocodig RNA,lcRNA) WIF1-1 的表达水平, 并评估其对患者预后的价值 方法 : 使用实时荧光定量 PCR 检测 50 例食管鳞状细胞癌组织样本及其对应同源的癌旁组织样本中 lcrna WIF1-1 的表达水平, 分析临床病理特征及其与患者预后的相关性 结果 : 食管鳞状细胞癌组织中 lcrna WIF1-1 的表达水平明显低于癌旁组织, 差异有统计学意义 (P<0.001) 进一步分析发现:lcRNA WIF1-1 的表达水平与食管鳞状细胞癌的淋巴结转移 TNM 分期和临床分期之间呈负相关 对预后资料分析发现 :lcrna WIF1-1 表达水平较低的食管鳞癌患者的总生存时间 (overall survival,os) 以及无进展生存期 (progressiofree survival,pfs) 均较短 单因素及多因素分析结果显示 :lcrna WIF1-1 可作为食管鳞状细胞癌患者 OS 和 PFS 的独立危险因素 结论 :lcrna WIF1-1 可能在食管鳞状细胞癌中发挥抑癌基因的作用, 其表达量与患者预后具有相关性, 有可能成为食管鳞状细胞癌的治疗靶点 [ 关键词 ] WIF1-1; 长链非编码 RNA; 食管鳞癌 ; 预后 Expressio ad cliical sigificace of log ocodig RNA WIF1-1 i esophageal squamous cell carcioma XU Hairog 1, HUANG Lei 2, YAO Guoliag 3, SI Ximi 1 (1. Departmet of Gastroeterology, Jiagsu Provice Hospital Affiliated to Najig Medical Uiversity, Najig ; 2. Departmet of Pediatric Surgery, Najig Childre s Hospital Affiliated to Najig Medical Uiversity, Najig ; 3. Departmet of Cardiothoracic Surgery, Third Affiliated Hospital of Soochow Uiversity, Chagzhou Jiagsu , Chia) Abstract Objective: To ivestigate the expressio level of log ocodig RNA (lcrna) WIF1-1 ad its related progostic value i esophageal squamous cell carcioma (ESCC). Methods: The expressios of lcrna WIF1-1 i 50 ESCC tissues ad the correspodig ormal tissues were detected via RT-qPCR method. The associatio betwee log o-codig RNA WIF1-1 expressio ad cliical characteristics was evaluated via Chi-square test. Results: The expressio of WIF1-1 i ESCC tissues decreased sigificatly compared with that i the correspodig ormal tissues, the differece was statistically sigificat (P<0.5). Furthermore, WIF1-1 was 收稿日期 (Date of receptio): 通信作者 (Correspodig author): 司新敏, siximi@126.com

2 1826 临床与病理杂志, 2017, 37(9) Keywords egatively related to the lymph odes metastasis, TNM ad cliical stage. Overall survival (OS) ad progressiofree survival (PFS) were sigificatly shorter i ESCC patiets with lower expressio level of lcrna WIF1-1. Moreover, the dow-regulated WIF1-1 expressio was sigificatly correlated with the shorter survival of ESCC patiets. The results of uivariate ad multivariate aalysis revealed the WIF1-1 expressio acted as a idepedet progostic factor both i OS ad PFS. Coclusio: The lcrna WIF1-1 ca be a importat ad potetial suppressor of ESCC, ad the expressio of WIF1-1 may serve as aother promisig therapeutic target ad progostic biomarker i future cliic. WIF1-1; log o-codig RNA; esophageal squamous cell carcioma; progosis 食管癌是世界上第九大常见的恶性肿瘤 [1] 在中国, 食管癌的发病率在所有恶性肿瘤中排第 五位, 病死率排第四位 在食管癌中, 最为常见 的病理亚型是食管鳞状细胞癌 [2] 大多数的食管 鳞状细胞癌患者在初次就诊时就已出现晚期转 移, 这也导致食管鳞状细胞癌患者的 5 年存活率 较低, 给患者家庭带来噩耗的同时也增加患者家 庭的经济负担 因此, 目前迫切需要找出新的生 物标志物, 用于改善食管鳞状细胞癌患者的不良 预后和临床治疗 长链非编码 RNA(log o-codig RNA, lcrna) 是一组长度大于 200 bp 的 RNA, 在各种生物学过程中发挥重要的作用 [3] 先前一 [4-6] 些相关实验室研究的结果表明 :lcrna 对多 种恶性肿瘤的增殖或者迁移起着重要的作用, 包括肝癌 肺癌 食管鳞状细胞癌等 近期一 [7] 些相关研究发现 :lcrna WIF1-1 存在于多种 恶性肿瘤组织和细胞中 然而, 至今为止, 尚 无相关研究探索 lcrna WIF1-1 在食管鳞状细 胞癌所扮演的角色 本次研究旨在评估 lcrna WIF1-1 在食管鳞状细胞癌组织的表达水平, 以 及其与食管鳞状细胞癌的临床特点和预后之间的 关系 1 对象与方法 1.1 一般资料 50 份新鲜食管鳞癌肿瘤组织样本及其对应 的正常组织标本选取自 2008 至 2012 年在南京医科 大学附属第一临床医学院接受食管癌根治术的食 管鳞状细胞癌患者 所有患者术前均无放射治疗 及化学药物治疗史 相关临床数据取自患者的临 床病历记录 在手术的过程中采集组织样本, 并 迅速冷冻于液氮中, 长期保存于液氮中 术后根 据世界卫生组织的标准, 对肿瘤组织进行严格分 期 [8] 每 6 个月对患者进行一次随访, 直到手术治疗后 5 年 总生存时间 (overall survival,os) 指从患者接受手术开始, 至最后一次随访或者死亡的时间 无进展生存期 (progressio-free survival,pfs) 指从患者接受手术开始, 至疾病复发的时间 本次研究获得南京医科大学伦理委员会的批准, 所有食管鳞状细胞癌患者均签署书面知情同意书 1.2 方法 总 RNA 提取收集组织样品 : 离心机温度设定于 4 预冷 30 mi; 将待研磨的组织样品置于液氮中研磨成小块状, 置于装有 1 ml TRIzol 的 1.5 ml 去酶 EP 管后, 放于冰上用匀浆机尽量匀碎 ; 收集细胞样品 : 向长满 70% 细胞的六孔板中加入 1 ml TRIzol, 充分混匀后室温静置 5 mi, 后转至 1.5 ml 去酶 EP 管 ;EP 管中加入 200 µl 氯仿 (1/5 总体积 ), 上下颠倒混匀 15 s, 后室温静置 5 mi;4, r/mi 高速离心机离心 15 mi, 将管中上层液体小心移入新去酶的 1.5 ml EP 管 ; 向 EP 管中添加等体积异丙醇, 颠倒混匀,4 静置 10 mi;4, r/mi 高速离心机中离心 10 mi, 弃上清 ; 向 EP 管中加入 75% 冰乙醇 (DEPC 水配制 )1 ml, 轻微洗涤 ;4, r/mi 离心 5 mi, 弃上清 ; 室温下干燥沉淀至基本透明 ; 根据沉淀的大小, 用适量 DEPC 水 (20~30 µl) 完全溶解 保存于 80 冰箱 RNA 纯度及浓度的测定 :NaoDrop 2000 分光光度计测定 RNA 在 260 及 280 m 波长的吸光度比值 ( 以 1.7~2.0 为最佳 ) cdna 合成使用 Ta k a r a 反转录试剂盒, 按 15 µl 反应体系, 顺序加入如下混合物 :100 mmol/l dntps Mixture 0.15µL, 10 Reverse Trascriptio Buffer 1.50 µl,reverse Trascriptase TM 1.00 µl,

3 长链非编码 RNA WIF1-1 在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义许海蓉, 等 1827 RNase 抑制剂 0.19 µl,dh µL,5 RT 引物 3.00 µl, 总 RNA 5.00 µl, 混匀,4 下 r/mi 离心 3 mi 按如下步骤进行反转录:16 30 mi; mi;85 5 mi;4 维持保存 qrt-pcr 检测使用 Takara SYBR Master Mixture 试剂盒, 按 20 L 反应体系, 参照说明书步骤进行 其中 dh20 4 µl, SYBR premix ex taq 10 µl, PCR 正向引物 2 µl, PCR 反向引物 2 µl, cdna 2 µl, 总容积 20 µl 引物序列 lcrna WIF1-1 上游 : 5'-GATGGAAATCGTCAGAGGCT-3', 下游 : 5'-TGGCACTTAGTTGGAAATGC-3' 1.3 统计学处理采用 SPSS 21.0 软件进行数据分析 采用配对 t 检验对食管鳞状细胞癌组织样本及对应的正常组织间 lcrna WIF1-1 的不同表达水平进行对比 采用 χ 2 检验评估 lcrna WIF1-1 水平和临床病理参数之间的关联 通过 Kapla-Meier 生存曲线方法检验 OS 和 PFS 使用对数秩检验评估统计学意义 采用单因素和多因素 Cox 分析评估食管鳞状细胞癌的独立危险因素 以 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 食管鳞状细胞癌组织中 lcrna WIF1-1 的表达水平下调实时荧光定量 PCR 技术评估 50 例食管鳞状细胞癌组织和对应的正常组织中 lcrna WIF1-1 的表达水平 结果显示 : 与癌旁组织相比, 在食管鳞 状细胞癌组织中 lcrna WIF1-1 的表达水平明显下调 ( 图 1) *** Relative WIF1-1 expressio level Adjacet ormal tissues ESCC tissues 图 1 RT-qPCR 检测 ESCC 及同源正常食管组织中 lcrna WIF1-1 表达水平 (***P<0.001) Figure 1 Expressio levels of lcrna WIF1-1 was moitored i huma ESSC tissues ad correspodig ormal tissues by RT-qPCR (***P<0.001) 2.2 LcRNA WIF1-1 表达水平与食管鳞状细胞癌患者临床病理资料之间的关系根据 lcrna WIF1-1 相对表达倍数的中值, 将患者分为 lcrna WIF1-1 高表达组及 lcrna WIF1-1 低表达组 结果显示,lcRNA WIF1-1 的表达水平与食管鳞状细胞癌的 T 分期 (P=0.034) 临床分期 (P=0.002) 以及淋巴结转移 (P<0.001) 呈负相关 而 lcrna WIF1-1 的表达水平和食管鳞状细胞癌患者的性别 年龄 吸烟史 饮酒史以及食管鳞状细胞癌的发生部位与分化等无明显相关性 ( 表 1) 表 1 WIF1-1 mrna 表达水平与 ESCC 患者临床病理特征之间的关系 Table 1 Correlatio betwee lcrna WIF1-1 expressio ad cliicopathological characteristics i ESCC patiets 低表达组 (=21) lcrna WIF1-1 表达水平 高表达组 (=29) P 年龄 / 岁 > 性别 男 女

4 1828 临床与病理杂志, 2017, 37(9) 续表 1 低表达组 (=21) lcrna WIF1-1 表达水平 高表达组 (=29) P 吸烟史 无 有 饮酒史 无 有 肿瘤位置 食管上 中段 食管下段 T 分期 T1~ T3~ 淋巴结转移 <0.001 阴性 阳性 临床分期 I~II III~IV 分化程度 高 中 低 食管鳞状细胞癌组织中 lcrna WIF1-1 的表达水平对预后判断的价值生存分析结果显示 : 与 lcrna WIF1-1 表达水平无上调的食管鳞状细胞癌患者相比,WIF1-1 表达水平上调的食管鳞状细胞癌患者其 5 年 OS 和 PFS 均比较长, 提示 lcrna WIF1-1 的高表达与较好的 临床预后相关 ( 图 2,3) 单因素及多因素分析的结果显示 :lcrna WIF1-1 的表达水平及食管鳞状细胞癌的临床分期是患者 OS 的独立预后因素 ( 表 2) 除此以外,lcRNA WIF1-1 的表达水平 食管鳞状细胞癌的临床分期和 T 分期则是患者 PFS 的独立预后因素 ( 表 3)

5 长链非编码 RNA WIF1-1 在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义许海蓉, 等 High expressio of Ic-WIF1-1 Low expressio of Ic-WIF High expressio of Ic-WIF1-1 Low expressio of Ic-WIF1-1 Overall survival Progressio-free survival Follow-up time (moths) 图 2 食管癌根治术后 ESCC 患者 Kapla-Meier 生存曲线 Figure 2 Kapla-Meier survival curves of ESCC patiets after esophagectomy WIF1-1 高表达组 ESCC 患者总生存时间明显优于低表达组 (log-rak test,p=0.004) The overall survival of patiets i the lcrna WIF1-1 highexpressio group was sigificatly better tha that of patiets i the low-expressio group (log-rak test, P=0.004) Follow-up time (moths) 图 3 食管癌根治术后 ESCC 患者 Kapla-Meier 生存曲线 Figure 3 Kapla-Meier survival curves of ESCC patiets after esophagectomy WIF1-1 高表达组 ESCC 患者无进展生存时间明显优于低表 达组 (log-rak 检验,P<0.001) The progressio-free survival of patiets i the lcrna WIF1-1 high-expressio group was sigificatly better tha that of patiets i the low-expressio group (log-rak test, P<0.001). 表 2 单因素及多因素分析 ESCC 患者临床病理特征与总生存时间之间的关系 Table 2 Uivariate ad multivariate aalysis o the correlatio betwee overall survival ad cliicopathological features i patiets with ESCC 单因素分析 多因素分析 HR (95%CI) P HR (95%CI) P WIF1-1 表达 (0.111~0.768) (0.128~0.574) 高 29 低 21 年龄 / 岁 (0.471~2.713) > 性别 (0.508~3.698) 男 36 女 14 吸烟史 (0.487~4.740) 有 28 无 22 饮酒史 (0.478~2.852) 有 23 无 27

6 1830 临床与病理杂志, 2017, 37(9) 续表 2 单因素分析 多因素分析 HR (95%CI) P HR (95%CI) P 肿瘤位置 (0.448~3.655) 食管下段食管上段 中段 T 分期 (0.825~6.636) T3~4 32 T1~2 18 淋巴结转移 (0.437~2.790) 阳性 25 阴性 25 临床分期 (0.941~6.331) (1.299~6.911) III~IV 30 I~II 20 分化水平 (0.312~3.061) 低 10 中 高 40 表 3 单因素及多因素分析 ESCC 患者临床病理特征与无进展生存时间之间的关系 Table 3 Uivariate ad multivariate aalysis o the correlatio betwee progressio-free survival ad cliicopathological features i patiets with ESCC 单因素分析 多因素分析 HR (95%CI) P HR (95%CI) P WIF1-1 表达 (0.126~0.814) (0.161~0.699) 高 29 低 21 年龄 / 岁 (0.590~3.211) > 性别 (0.477~3.201) 男 36 女 14 吸烟史 (0.597~5.551) 有 28 无 22

7 长链非编码 RNA WIF1-1 在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义许海蓉, 等 1831 续表 3 单因素分析 多因素分析 HR (95%CI) P HR (95%CI) P 饮酒史 (0.500~2.811) 有 23 无 27 肿瘤位置 (0.440~3.538) 食管下段食管上段 中段 T 分期 (1.013~7.616) (0.998~5.956) 0.05 T3~4 32 T1~2 18 淋巴结转移 (0.537~3.304) 阳性 25 阴性 25 临床分期 (0.892~5.366) (1.069~5.310) III~IV 30 I~II 20 分化水平 (0.304~2.786) 低 10 中 高 40 3 讨论 食管鳞状细胞癌是一种全世界范围内高发 病率以及高病死率的恶性肿瘤, 尤其在今天的 中国 [9] 尽管食管鳞状细胞癌早期手术的成功率 较高, 但仍有许多食管鳞状细胞癌患者在不久后 出现癌症转移 [10] 为提高食管鳞状细胞癌患者的 存活率, 我们迫切需要更清楚 深入地解食管鳞 [11-12] 状细胞癌的发病机制 最新的研究结果显示 : lcrna 可能在食管鳞状细胞癌的细胞生物学过程 中发挥关键作用 这些细胞生物学过程主要包括 [11] 迁移 增殖和分化, 如相关研究表明 :lcrna SPRY4-IT1 能够促进食管鳞状细胞癌的转移 除此 之外,lcRNA MALAT1 能够通过 Ezh2 靶向调控 β- 连环蛋白, 进而促进食管鳞状细胞癌的恶变 [12] lcrna WIF1-1 最初由 Esembl 基因组生物信 息学发现 lcrna WIF1-1 位于反向链 12q14.3 区, [13-14] 其长度为 447 bps 相关研究表明 : 该区域的 一系列基因簇在食管鳞状细胞癌的转移和进展中 发挥重要作用, 包括食管鳞状细胞 WIF1(WNT 抑 制因子 -1) 尚未探究 lcrna WIF1-1 在食管鳞状细 胞癌中所起的具体作用 本研究结果显示 : 在食 管鳞状细胞癌组织中,lcRNA WIF1-1 的表达水平 明显下调, 提示 lcrna WIF1-1 可能作为抑癌因子 参与调控食管鳞状细胞癌发展过程 转移是导致食管鳞状细胞癌患者预后较差的 主要原因, 并且对患者造成巨大的身心及经济负 担 最近有研究结果表明 :lcrna 可能参与食管 鳞状细胞癌的转移过程 例如,lcRNA SPRY4- IT1 促进食管鳞状细胞癌的迁移和侵袭 [15] 敲除 lcrna CASC9 明显抑制食管鳞状细胞癌的细胞迁 移和侵袭 [16] [17] 此外, 体外试验中 lcrna PEG10 能够明显促进食管鳞状细胞癌的转移 本研究首 次探讨 lcrna WIF1-1 的表达水平与食管鳞状细胞

8 1832 临床与病理杂志, 2017, 37(9) 癌患者临床预后之间的关系 结果显示 :lcrna WIF1-1 的表达水平与食管鳞状细胞癌的 T 分期 临床分期和淋巴结转移明显呈现负相关, 这提示 lcrna WIF1-1 可能对食管鳞状细胞癌的发展起抑制作用 进一步分析结果表明 :lcrna WIF1-1 的表达水平与食管鳞状细胞癌患者的 OS 和 PFS 之间存在明显关联, 高表达 WIF1-1 对食管鳞状细胞癌患者的生存期起明显的保护作用 此外,lcRNA WIF1-1 还是食管鳞状细胞癌患者 OS 和 PFS 的独立危险因素, 可参与指导后续治疗 对低长链非编码 RNA WIF1-1 表达组的患者进行严密的随访是提高该部分患者存活率的重要途径, 并且在必要时需对患者进行术后辅助治疗 综上所述,lcRNA WIF1-1 对于食管鳞状细胞癌的发展过程起重要作用 lcrna WIF1-1 的表达水平可能能够作为食管鳞状细胞癌发病及预后判断的新型生物标志物并成为食管鳞状细胞癌潜在的治疗靶点 因此, 需要进一步进行体内和体外试验, 探讨 lcrna WIF1-1 对食管鳞状细胞癌的作用机制 参考文献 1. Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cacer statistics, 2015[ J]. CA Cacer J Cli, 2015, 65(1): Zeg H, Zheg R, Zhag S, et al. Esophageal cacer statistics i Chia, 2011: Estimates based o 177 cacer registries[ J]. Thorac Cacer, 2016, 7(2): Zuckerwise L, Li J, Lu L, et al. H19 log ocodig RNA alters trophoblast cell migratio ad ivasio by regulatig TβR3 i placetae with fetal growth restrictio[ J]. Ocotarget, 2016, 7(25): Che FJ, Su M, Li SQ, et al. Upregulatio of the log o-codig RNA HOTAIR promotes esophageal squamous cell carcioma metastasis ad poor progosis[ J]. Mol Carciog, 2013, 52(11): Zhao J, Liu Y, Zhag W, et al. Log o-codig RNA lic00152 is ivolved i cell cycle arrest, apoptosis, epithelial to mesechymal trasitio, cell migratio ad ivasio i gastric cacer[ J]. Cell Cycle, 2015, 14(19): Yag Y, Li H, Hou S, et al. The ocodig RNA expressio profile ad the effect of lcrna ak o cisplati resistace i o-small-cell lug cacer cell[ J]. PLoS Oe, 2013, 8(5): e Derrie T, Johso R, Bussotti G, et al. The GENCODE v7 catalog of huma log ocodig RNAs: Aalysis of their gee structure, evolutio, ad expressio[ J]. Geome Res, 2012, 22(9): Takeo S, Noguchi T, Takahashi Y, et al. Assessmet of cliical outcome i patiets with esophageal squamous cell carcioma usig TNM classificatio score ad molecular biological classificatio[ J]. A Surg Ocol, 2007, 14(4): Lv XB, Lia GY, Wag HR, et al. Log ocodig RNA HOTAIR is a progostic marker for esophageal squamous cell carcioma progressio ad survival[ J]. PLoS Oe, 2013, 8(5): e Li Y, Totsuka Y, He Y, et al. Epidemiology of esophageal cacer i japa ad chia[ J]. J Epidemiol, 2013, 23(4): Zhag CY, Li RK, Qi Y, et al. Upregulatio of log ocodig RNA spry4-it1 promotes metastasis of esophageal squamous cell carcioma via iductio of epithelial-mesechymal trasitio[ J]. Cell Biol Toxicol, 2016, 32(5): Wag W, Zhu Y, Li S, et al. Log ocodig RNA malat1 promotes maligat developmet of esophageal squamous cell carcioma by targetig beta-catei via ezh2[j]. Ocotarget, 2016, 7(18): Yag SH, Li SL, Dog ZM, et al. Epigeetic iactivatio of Wt ihibitory factor-1 i huma esophageal squamous cell carcioma[ J]. Ocol Res, 2012, 20(2/3): Guo Q, Wag HB, Li YH, et al. Correlatios of promoter methylatio i WIF-1, RASSF1A, ad CDH13 gees with the risk ad progosis of esophageal cacer[ J]. Med Sci Moit, 2016, 22: Cui F, Wu D, He X, et al. Log ocodig RNA spry4-it1 promotes esophageal squamous cell carcioma cell proliferatio, ivasio, ad epithelial-mesechymal trasitio[ J]. Tumour Biol, 2016, 37(8): Pa Z, Mao W, Bao Y, et al. The log ocodig RNA casc9 regulates migratio ad ivasio i esophageal cacer[ J]. Cacer Med, 2016, 5(9): Zag W, Wag T, Huag J, et al. Log ocodig RNA peg10 regulates proliferatio ad ivasio of esophageal cacer cells[ J]. Cacer Gee Ther, 2015, 22(3): 本文引用 : 许海蓉, 黄磊, 姚国亮, 司新敏. 长链非编码 RNA WIF1-1 在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义 [ J]. 临床与病理杂志, 2017, 37(9): doi: /j.iss Cite this article as: XU Hairog, HUANG Lei, YAO Guoliag, SI Ximi. Expressio ad cliical sigificace of log ocodig RNA WIF1-1 i esophageal squamous cell carcioma[ J]. Joural of Cliical ad Pathological Research, 2017, 37(9): doi: / j.iss

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