食管鳞状细胞癌组织中 mir-21 与 ERK1/2 表达及临床意义的研究刘凤霞, 等 1131 Keywords of ESCC, the two key moleculars may be coordinated to promote malignant degree of ESCC by ly

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1 1130 临床与病理杂志 J Clin Pathol Res 2015, 35(6) doi: /j.issn View this article at: 食管鳞状细胞癌组织中 mir-21 与 ERK1/2 表达及临床意义的研究刘凤霞 1, 杨文清 1, 李建勇 1 2, 刘文亚 ( 新疆医科大学 1. 基础医学院人体解剖学教研室 ;2. 第一附属医院影像中心, 乌鲁木齐 ) [ 摘要 ] 目的 : 研究 mir-21 和 ERK1/2 在食管鳞状细胞癌 (esophageal squamous carcinoma,escc) 组织中的表达并分析二者的临床意义方法 : 原位杂交技术和免疫组化方法分别检测 80 例食管鳞状细胞癌及癌旁正常组织中 mir-21 和 ERK1/2 的表达,Spearman 相关统计方法分析 mir-21 和 ERK1/2 表达的相关性, 并分析二者与 ESCC 患者临床病理资料的关系结果 :mir-21 和 ERK1/2 在 ESCC 组织中的阳性表达率和表达量都显著高于癌旁正常组织, 尤其在有淋巴结转移的 ESCC 组织中显著增高, 但在 ESCC 不同性别年龄民族病理类型肿瘤侵及范围和肿瘤大小间的差异无统计学意义进一步分析发现 mir-21 与磷酸化的 ERK1/2(p-ERK1/2) 在 ESCC 及癌旁正常组织的表达呈正相关, 相关系数为结论:miR-21 和 p-erk1/2 与 ESCC 发生发展密切相关, 二者可能协同通过促进肿瘤细胞淋巴结转移增加 ESCC 的恶性程度 [ 关键词 ] 食管鳞状细胞癌 ;mir-21;erk1/2 MiR-21 and ERK1/2 expression and the clinical sense in esophageal squamous carcinoma LIU Fengxia 1, YANG Wenqing 1, LI Jianyong 1, LIU Wenya 2 (1. Department of Anatomy, College of Basic Medicine; 2. Department of Radiology, the First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi , China) Abstract Objective: To explore the expression of mir-21 and ERK1/2 in esophageal squamous carcinoma (ESCC) tissue and the clinical significance. Methods: MiR-21 and ERK1/2 expression in 80 cases of ESCC tissues and adjacent normal tissues were detected by in situ hybridization and immunohistochemical methods respectively. Relationship between mir-21, ERK1/2 and clinicopathological parameters of 80 cases of ESCC was analysed by Spearman analysis. Results: MiR-21 and ERK1/2 expression rate and number were significantly higher than that of adjacent normal tissue, especially in the ESCC tissues of lymph node metastasis, but have no statistical significance in different gender, age, nationality, ESCC pathological type, tumor invasion and tumor size. Further analysis found that mir-21 expression had obvious positive correlation with p-erk1/2 in ESCC, the correlation coefficient is Conclusion: MiR-21 and p-erk1/2 are closely related to the occurrence and development 收稿日期 (Date of reception): 通信作者 (Corresponding author): 刘文亚, wenyaliu2002@163.com.cn 基金项目 (Foundation item): 新疆自治区科技厅面上项目 ( A080) The work was supported by Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, General Program ( A080), P. R. China.

2 食管鳞状细胞癌组织中 mir-21 与 ERK1/2 表达及临床意义的研究刘凤霞, 等 1131 Keywords of ESCC, the two key moleculars may be coordinated to promote malignant degree of ESCC by lymph node metastasis. esophageal squamous cell carcinoma; mir-21; ERK1/2 食管癌 (esophageal cancer, EC) 是一种消化系统最常见的恶性肿瘤, 其发生在食管粘膜上皮组织, 组织学类型主要包括腺癌鳞状上皮癌 (esophageal squamous cell carcinoma,escc) 和未分化癌, 其中 ESCC 在亚洲人中最多见, 恶性程度高, 能够侵袭性生长, 容易转移复发手术切除后预后差等特点, 化疗和放疗缺乏组织和细胞特异性, 而且大多数食管癌患者来就诊时, 多已发展到中晚期, 患者的五年生存率低, 是病死率较高的消化道恶性肿瘤, 所以早期诊断, 早期防治显得尤为重要前期基于细胞水平的研究发现 MiR-21 和 ERK1/2 能够促进 ESCC 细胞增殖抑制细胞凋亡和加速细胞周期, 最终导致 ESCC 细胞异常生长 [1-3] 本研究我们通过组织水平检测 MiR-21 和 ERK1/2 在 ESCC 组织中的表达并分析二者与 ESCC 患者临床病理资料的相关性, 探讨 ESCC 发生的分子机制, 有望为 ESCC 的分型及早期防治提供线索 1 材料与方法 1.1 研究对象本研究使用的 80 对组织标本为手术切除的 ESCC 组织 (T) 及同一患者的癌旁正常食管粘膜上皮 (N), 收集于 2010 年 3 月至 2012 年 3 月, 均系新疆医科大学第一附属医院胸心外科住院治疗的维吾尔族哈萨克族和汉族 ESCC 患者纳入标准 : 病变位于食管, 有明确的 ESCC 病理学诊断依据, 肿瘤的组织类型及病理分型依照医院对活检标本或者术后送检标本的组织病理学诊断进行 TNM 分期依照美国癌症联合会 (American Joint Commission on Cancer, AJCC) 的标准进行术前未接受放疗和化疗, 入院后行 ESCC 根治性切除术该研究使用的 ESCC 组织及同一患者的癌旁正常食管粘膜上皮的样本均得到新疆医科大学第一附属医院伦理委员会的审批和通过排出标准 :l) 其他民族 ESCC 患者 ;2) 术前进行放化疗治疗, 近期进行激素等其他治疗的患者 ;3) 有糖尿病等代谢性疾病免疫性疾病遗传病其他系统性疾病的患者本部分实验所收集的 80 例患者的临床病理资料见表 1 表 1 ESCC 中 mir-21 表达阳性率 Table 1 Positive rate of mir-21 expression in ESCC tissue 分组阳性阴性合计 χ 2 P T 77(96.25%) N 57(71.25%) 材料 MiR-21 原位杂交试剂盒 (Takara), 探针序列 : UGUCGGGUAGCUUAUCAGAC UGAUGUUGAC UGUUGAAUCUCAUGGCAACACCAGUCGAUGG GCUGUCUGACA; 免疫组化染色试剂盒二步法免疫组化检测试剂浓缩型 DAB 试剂盒抗体稀释液苏木素染液柠檬酸盐缓冲液 ( 北京中杉金桥 );ERK1/2 抗体 (Celling Signaling Technology 公司 ), 二甲苯盐酸乙醇 ( 西安三浦 );DEPC PBS H2O2 柠檬酸胃蛋白酶多聚甲醛 ( 上海生工 );APES 防脱载玻片盖玻片 ( 上海尚宝 ); 原位杂交专用盖玻片 ( 北京博迈德 ) 1.3 方法原位杂交常规脱蜡,PBS 快速洗 2 次,3% H 2 O 2 孵育 30 min, 胃蛋白酶 37 消化 8~30 min, 原位杂交用 PBS 清洗多聚甲醛室温固定 10 min, 蒸馏水洗涤 3 次预杂交 : 加预杂交液 20 μl, 恒温箱 38~42, 2~4 h 杂交: 加杂交液 20 μl, 恒温箱 38~42 杂交过夜, 杂交后洗涤滴加 30 μl 封闭液,37 封闭 30 min 滴加生物素化鼠抗地高辛 50 μl,37 孵育 1 h; 滴加 35 μl SABC,37 孵育 20 min; 滴加生物素化过氧化物酶 35 μl,37 孵育 20 min 滴加显色液, 自来水反复终止反应苏木素复染细胞核 1 min, 自来水反复终止反应, 放入盐酸乙醇 5 s, 自来水反复冲洗至无色, 返蓝梯度酒精脱水透明, 晾干, 树胶封片, 显微镜观察并采集图像原位杂交结果判定及量化方法同免疫组化实验免疫组化脱蜡后立即放入二甲苯无水乙醇 95% 乙醇 70% 乙醇中浸泡 ; 枸橼酸钠缓冲溶液进行抗原修复 ;3% H 2 O 2 去离子水孵育阻断内源性过氧化物酶一抗 4 孵育过夜,PBS 或 TBS 浸洗二抗

1132 临床与病理杂志, 2015, 35(6) http://www.lcbl.

3 1132 临床与病理杂志, 2015, 35(6) 37 孵育 25 min,pbs 清洗,DAB 显色, 自来水终止显色 ; 苏木素染色, 自来水冲洗 ; 盐酸乙醇分化, 自来水冲洗 ; 返蓝, 脱水, 透明, 封片, 显微镜观察并采集图像免疫组化结果按文献方法量化 [4-5], 上皮细胞中的染色密度分别赋予分值 : 0( 阴性 ),1( 弱阳性 ),2( 中阳性 ),3( 强阳性 ), 染色范围分别赋予分值 :0(<5%),1(5%~25%), 2(26%~50%), 3(51%~75%), 4(>75%) 每个样本的免疫组化量化结果 =1 (% 弱阳性 )+2 (% 中阳性 )+3 (% 强阳性 ), 因此量化结果范围在 0( 无免疫反应 ) 到 300( 最大免疫反应 ) 之间 1.4 统计学处理 SPSS 17.0 统计软件 (Chicago, IL, USA) 对所有数据进行统计学分析, 实验结果是连续性变量时, 两组检测结果间比较采用 LSD t 检验, 两组以上用单因素方差分析, 计算结果均以 x± s 表示实验数据是非连续性变量时, 采用卡方检验和 Spearman 的相关分析,P<0.05 为差异有显著性所有分析图的制作由 Prism 5.0 软件 (GraphPad Software,San Diego,CA,USA) 完成 2 结果 2.1 MiR-21 在 ESCC 组织中表达结果如表 1-2, 图 1 所示,miR-21 基因阳性信号定位于细胞核和细胞质, 呈浅黄棕黄或棕褐色颗粒 mir-21 在 80 例 ESCC 组织中有 77 例 (96.25%) 为阳性表达 ; 在 80 例 ESCC 癌旁正常组织中有 57 例 (71.25%) 为阳性表达 ;mir-21 在 ESCC 组织中的阳性表达率显著高于癌旁正常组织, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 进一步分析 mir-21 表达量在 ESCC 组织中的变化发现,miR-21 在癌旁正常组织中表达量为 47.81±44.51, 在 ESCC 肿瘤组织中表达量为 ±83.20,ESCC 肿瘤组织中 mir-21 表达增多了 %, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 表 2 ESCC 中 mir-21 及 ERK1/2 的表达 (x±s) Table 2 Expression of mir-21 and ERK1/2 in ESCC tissue(x±s) 表达方法 N T P 增高率 % MiR ± ±83.20* t-erk1/ ± ± p-erk1/ ± ±94.94* 与 N 相比,*P<0.05 T 100 T 200 T 400 N 100 N 200 N 400 图 1 mir-21 在 ESCC 中的表达 Figure 1 Expression of mir-21 in ESCC tissue

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4 食管鳞状细胞癌组织中 mir-21 与 ERK1/2 表达及临床意义的研究刘凤霞, 等 ERK1/2 在 ESCC 组织中的表达结果如表 2-4, 图 2-3 所示, 总 -ERK1/2(t- ERK1/2) 和磷酸化 -ERK1/2(p-ERK1/2) 基因蛋白产物阳性信号主要定位于细胞浆, 少量定位于细胞核, 呈浅黄棕黄或棕褐色颗粒 80 例 ESCC 组织中,t-ERK1/2 阳性表达的有 74 例 (92.50%); p-erk1/2 阳性表达的有 73 例 (91.25%) 80 例 ESCC 癌旁正常组织中,t-ERK1/2 阳性表达的有 72(90.00%); p-erk1/2 阳性表达的有 62 例 (77.50%) 与癌旁正常组织相比,t-ERK1/2 在 ESCC 组织中的阳性表达率差异无统计学意义 (P>0.05);p-ERK1/2 在 ESCC 组织中的阳性表达率增高了 13.75%, 差异具有统计学意义 ( P<0.05) 免疫组化实验量化结果发现, 癌旁正常组织中, t-erk1/2 表达量为 ±96.98, p-erk1/2 表达量为 51.25±44.63; ESCC 肿瘤组织中 t-erk1/2 表达量为 ±109.43, p-erk1/2 表达量为 ±94.94; 与癌旁正常组织相比,ESCC 肿瘤组织中 t-erk1/2 表达量增多了 8.3%, 差异无统计学意义 (P>0.05),p-ERK1/2 表达增多了 %, 差异有统计学意义 (P<0.05) 2.3 MiR-21 和 ERK1/2 在 ESCC 组织中表达的临床意义分析 mir-21 和 p-erk1/2 在 80 例 ESCC 及癌旁正常组织的表达及与临床病理参数之间的关系, 如表 5 6 所示,miR-21 和 p-erk1/2 在 ESCC 及癌旁正常组织的表达有相关性 ( P<0.05), 相关系数为 mir-21 和 p-erk1/2 的表达在有淋巴结转移的 ESCC 组织中表达显著增高 (P<0.05), 但在 ESCC 不同性别年龄民族病理类型肿瘤侵及范围和肿瘤大小间的差异无统计学意义 (P>0.05) 表 3 ESCC 中 t-erk1/2 表达阳性率 Table 3 Positive rate of t-erk1/2 expression in ESCC tissue 分组阳性阴性合计 χ 2 P T 74(92.50%) N 72(90.00%) 表 4 ESCC 中 p-erk1/2 表达阳性率 Table 4 Positive rate of p-erk1/2 expression in ESCC tissue 分组阳性阴性合计 χ 2 P % T N T 100 T 200 T 400 N 100 N 200 N 400 图 2 ESCC 中 t-erk1/2 的表达 Figure 2 Expression of t-erk1/2 in ESCC tissue

1134 临床与病理杂志, 2015, 35(6) http://www.lcbl.

5 1134 临床与病理杂志, 2015, 35(6) T 100 T 200 T 400 N 100 N 200 N 400 图 3 ESCC 中 p-erk1/2 的表达 Figure 3 Expression of mir-21 and p-erk1/2 in ESCC tissue 表 5 ESCC 中 mir-21 与 ERK1/2 表达的相关性 (x±s) Table 5 Correlation of mir-21 and ERK1/2 in ESCC tissue(x±s) 表达方法 x±s r P mir ± t-erk1/ ± p-erk1/ ± * *P<0.05,miR-21 和 p-erk1/2 表达具有相关性 3 讨论 MicroRNA-21(miR-21) 是微小 RNA 家族成员中的其中之一, 位于 17q23. 2 染色体 FRA17B 脆性区域上 MiR-21 与靶基因 mrna 的 3'-UTR 端结合, 通过抑制下游靶基因的翻译或降解靶基因 mrna 来下调靶基因蛋白质的表达水平, 影响细胞的增殖凋亡和周期等生物学活动在大多数肿瘤中, 如胃癌 [6] 结直肠癌 [7] 胰腺癌 [8] [9] 肝癌等细胞或组织中,miR-21 的表达均显著升高, 而且与肿瘤的发生发展息息相关 ERK 在染色体 1p34~35, 主要有 ERK1 和 ERK2 两个亚型,ERK1 的相对分子量是 44 kd,erk2 的相对分子量是 42 kd,erk1/2 中的酪氨酸和苏氨酸残基磷酸化才会被活化,ERK1/2 由细胞浆转移至细胞核, 调控其下游靶基因表达 ERK1/2 MAPK 信号传导通路抑制剂 U0126 在子宫颈癌 [10-11] 乳腺 [12] 癌等体外细胞实验中均可抑制细胞增殖和细胞克隆形成尽管 mir-21 和 ERK1/2 MAPK 信号通路与肿瘤的发生密切相关, 而且我们前期有关 ESCC 体外细胞实验也已经发现 mir-21 和 ERK1/2 MAPK 信号传导通路可协同调控 ESCC 细胞的克隆形成细胞凋亡细胞周期等细胞活动, 但这两大具有致癌基因功能的分子在 ESCC 组织中表达及临床意义尚不完全清楚因此本实验研究了 mir-21 和 ERK1/2 MAPK 信号通路在 ESCC 组织中的表达并分析二者与食管癌患者临床病理资料的相关性结果发现 mir-21 和 ERK1/2 在 ESCC 组织中的阳性表达率和表达量都显著高于癌旁正常组织, 提示 mir-21 和 ERK1/2 与 ESCC 发生发展密切相关目前, 我国进展期 ESCC 患者接受手术治疗的比例仍占大多数, 而 ESCC 的发生发展以及术后预后都与淋巴结转移密切相关淋巴结转移是肿瘤最常见的转移方式, 也是食管癌 TNM 分期标准的重要参考因素食管癌的分期是判断病情指导治疗了解预后比较疗效的重要依据 [13] 也有研究发现淋巴结转移率预测胃癌患者术后 5 年生存率的准确性与淋巴结转移转移多少的预测能力相同, 而且淋巴结转移率是影响胃癌患者预后的独立性危险因素 [14] 本研究分析 mir-21 和 ERK1/2 在 ESCC 组织中表达与患者临床病理参数之间的关

6 食管鳞状细胞癌组织中 mir-21 与 ERK1/2 表达及临床意义的研究刘凤霞, 等 1135 表 6 ESCC 患者临床病理资料与 mir-21 ERK1/2 的关系 Table 6 Correlation between clinicopathologic parameters and mir-21, ERK1/2 expression of ESCC patients 临床病理资料 n MiR-21 p-erk x±s P x±s P 性别男 ± ±99.40 女 ± ±82.67 年龄 ± ± > ± ±85.35 民族哈 ± ±95.98 汉 ± ± 维 ± ±81.55 分化高 ± ± 中 ± ± 低 ± ±90.81 病理类型溃疡型 ± ±95.54 隆起型 ± ±88.45 髓质型 ± ± 绞窄型 ± ±94.90 淋巴结转移无 ± ±78.42 有 ± ± 侵及范围粘膜层 ± ±75.00 粘膜下层 ± ± 肌层 ± ±84.46 外膜层 ± ±97.46 肿瘤大小 ± ± > ± ±90.40 系发现,miR-21 和 ERK1/2 表达在有淋巴结转移的 ESCC 组织中显著增高, 但在 ESCC 不同性别年龄民族病理类型肿瘤侵及范围和肿瘤大小间的差异无统计学意义, 提示 mir-21 和 ERK1/2 可能通过促进肿瘤细胞淋巴结转移增加 ESCC 的恶性程度进一步分析发现, 在 ESCC 及癌旁正常组织中,miR-21 和总 ERK1/2 表达无显著相关, 但与 p-erk1/2 表达呈正相关, 相关系数为本研究结果可作为判断 ESCC 发病和淋巴结转移潜能的分子指标, 也可为临床治疗和预后判断等提供丰富的分子生物学理论依据 4 结语研究发现 mir-21 和 ERK1/2 在 ESCC 组织中的阳性表达率和表达量都显著高于癌旁正常组织, 而且二者在有淋巴结转移的 ESCC 组织中显著增高, 提示 mir-21 和 ERK1/2 可能通过促进肿瘤细胞淋巴结转移增加 ESCC 的恶性程度相信随着基因组学蛋白组学和分子生物学技术的进一步发展,miR-21 和 ERK1/2 MAPK 信号传导通路在 ESCC 的发生发展中的作用及其相关的作用机制将逐步被揭开神秘的面纱, 也将能够在 ESCC 的早期筛

7 1136 临床与病理杂志, 2015, 35(6) 查临床治疗和预后判断过程中提供理论指导和新策略 expression in colorectal cancer patients and effects of its inhibition on DLD1 colon cancer cells[j]. Int J Colorectal Dis, 2012, 27(11): Moriyama T, Ohuchida K, Mizumoto K, et al. MicroRNA-21 modulates biological functions of pancreatic cancer cells including 参考文献 1. 刘凤霞, 张盼盼, 李建勇, 等. MicroRNA-21 通过正调控 ERK1/2 通路促进食管鳞状细胞癌的增殖和迁移 [ J]. 生物技术通报, 2013, 257(12): LIU Fengxia, ZHANG Panpan, LI Jianyong, et al. MicroRNA-21 Promotes the Proliferation and Migration of Esophageal Squamous Carcinoma Cell via Activating ERK1/2/MAPK Pathway[ J]. Biotechnology Bulletin, 2013, 257(12): 刘凤霞, 牛淑亮, 李建勇, 等. ERK1/2 MAPK 通路在 Eca109 细胞体外增殖和迁移中的作用及其机制 [ J]. 基础医学与临床, 2014, 34(3): LIU Fengxia, NIU Shuliang, LI Jianyong, et al. The role and mechanism of ERK1/2 MPAK pathway in proliferation and migration of Eca109 cell line in vitro[ J]. Basic & Clinical Medicine, 2014, 34(3): Zheng ST, Huo Q, Tuerxun A, et al. The expression and activation of ERK/MAPK pathway in human esophageal cancer cell line EC9706[ J]. Mol Biol Rep 2011;38(2): Gatius S, Velasco A, Azueta A, et al. FGFR2 alterations in endometrial carcinoma. Mod Pathol, 2011, 24(11): Yang B, Ma C, Chen Z, et al. Correlation of immunoglobulin G expression and histological subtype and stage in breast cancer[ J]. PLoS One, 2013, 8(3): e Yamanaka S, Olaru AV, An F, et al. MicroRNA-21 inhibits Serpini1, a gene with novel tumour suppressive effects in gastric cancer[ J]. Dig Liver Dis, 2012, 44(7): Faltejskova P, Besse A, Sevcikova S, et al. Clinical correlations of mir-21 their proliferation, invasion, and chemoresistance[ J]. Mol Cancer Ther, 2009, 8(5): Zhu Q, Wang Z, Hu Y, et al. mir-21 promotes migration and invasion by the mir-21-pdcd4-ap-1 feedback loop in human hepatocellular carcinoma[ J]. Oncol Rep, 2012, 27(5): Yuan JY, Liu LY, Wang P, et al. Small-interfering RNA-mediated silencing of the MAPK p42 gene induces dual effects in HeLa cells[ J]. Oncol Lett, 2010, 1(4): Zhao LY, Huang C, Li ZF, et al. STAT1/2 is involved in the inhibition of cell growth induced by U0126 in HeLa cells[ J]. Cell Mol Biol (Noisyle-grand), 2009, 55 Suppl: OL Ahn HJ, Kim G, Park KS. Ell3 stimulates proliferation, drug resistance, and cancer stem cell properties of breast cancer cells via a MEK/ERKdependent signaling pathway[ J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 437(4): 吴健波, 刁力, 阎其涛. 淋巴结转移及分化程度对食管鳞癌术后预后的影响 [ J]. 中国医学创新, 2012, 09(3): WU Jianbo, DIAO Li, YAN Qitao. The influence of lymph node metastasis and differentiation degree on postoperative prognosis of esophageal squamous cell carcinoma [ J]. Medical Innovation of China, 2012, 09(3): 冯润华, 朱正纲, 燕敏, 等. 淋巴结转移率对 T2~T3 期胃癌患者预后评估的价值 [ J]. 中华胃肠外科杂志, 2007, 10(5): FENG Runhua, ZHU Gangzheng, YAN Min, et al. Prognostic significance of metastatic lymph nodes ratio in patients with T2-T3 stage gastric cancer [ J]. Chinese Journal of Gastrointestinal Surgery, 2007, 10(5): 本文引用 : 刘凤霞, 杨文清, 李建勇, 刘文亚. 食管鳞状细胞癌组织中 mir-21 与 ERK1/2 表达及临床意义的研究 [ J]. 临床与病理杂志, 2015, 35(6): doi: / j.issn Cite this article as: LIU Fengxia, YANG Wenqing, LI Jianyong, LIU Wenya. MiR-21 and ERK1/2 expression and the clinical sense in esophageal squamous carcinoma[ J]. Journal of Clinical and Pathological Research, 2015, 35(6): doi: / j.issn

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戊酸雌二醇片联合宫颈注射利多卡因用于绝经后妇女取环的临床效果评价陆琴芬, 等 371 Keywords groups, no removal difficulties and failure, was statistically s 370 临床与病理杂志 J Clin Pathol Res 2015, 35(3) http://www.lcbl.net doi: 10.3978/j.issn.2095-6959.2015.03.009 View this article at: http://dx.doi.org/10.3978/j.issn.2095-6959.2015.03.009 戊酸雌二醇片联