2011,31(7) 孙颖等 :mpt64 卡介苗重组疫苗的构建免疫原性及抗结核作用 15 室保存重组蛋白和人型 PPD ESAT6 MPT64 Ag85A Ag85B 重组蛋白为本研究室克隆表达纯化 ; 人型 PPD 购自中国药品生物制品检定所 1 2 方法 PCR

Size: px

Start display at page:

Download "2011,31(7) 孙颖等 :mpt64 卡介苗重组疫苗的构建免疫原性及抗结核作用 15 室保存重组蛋白和人型 PPD ESAT6 MPT64 Ag85A Ag85B 重组蛋白为本研究室克隆表达纯化 ; 人型 PPD 购自中国药品生物制品检定所 1 2 方法 PCR"

台驻顾
5 years ago
Views:

1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2011,31(7):14?19 mpt64 卡介苗重组疫苗的构建免疫原性及抗结核作用孙 1,2 颖 3 张灵霞 3 吴雪琼 3 董恩军 (1 中国科学院北京基因组研究所北京北京技术交易促进中心北京 ) (3 中国人民解放军第 309 医院结核病研究所北京 ) 摘要通过基因工程重组技术将结核分枝杆菌保护性抗原 MPT64 的编码基因与穿梭质粒载体 pyub295 重组, 采用电穿孔技术将重组质粒导入到卡介苗中, 应用聚合酶链反应 (PCR) 扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 对 mpt64 卡介苗重组疫苗鉴定 : 成功地构建了 MPT64 基因 pyub295 重组质粒,MPT64 蛋白在卡介苗中能分泌表达卡介苗重组疫苗免疫原性试验表明 : 只有 mpt64 卡介苗重组疫苗组有 MPT64 特异性抗体产生,45 天时达到最高水平脾淋巴细胞增殖试验表明各组小鼠平均刺激指数达 2 0 以上,mpt64 卡介苗重组疫苗组小鼠脾淋巴细胞的刺激指数与对照组差异无统计学意义预防试验表明 :mpt64 卡介苗重组疫苗及卡介苗与生理盐水对照组比都能延长结核分枝杆菌感染小鼠的半数死亡时间, 降低 2 个月内的死亡率结核分枝杆菌攻击后 2 个月, 处死小鼠时, 小鼠脏器大体病变脏器培养抗体检测结果及淋巴细胞增殖结果, 各组间差别无统计学意义初步实验结果表明 :mpt64 卡介苗重组疫苗对结核分枝杆菌感染有明显的预防作用, 但预防效果与卡介苗相比没有提高关键词卡介苗重组卡介苗抗结核作用免疫原性中图分类号 Q78 近年来, 结核病疫情严重卡介苗保护效力不尽如人意, 新疫苗的研究势在必行卡介苗作为一种疫苗, 它的免疫原性和安全性已经在半个多世纪的使用过程中得到验证卡介苗作为宿主在其中表达外源基因在国内外疫苗界及结核病研究中受到重视 MPT64 是一种 24kDa 的分泌蛋白 [1], 能诱导结核病人或结核菌素阳性者产生 T 淋巴细胞增殖反应, 可能是结核分枝杆菌的一种保护性抗原 ; 而且 MPT64 只存在结核分枝杆菌复合群中, 且大部分卡介苗中缺乏 MPT64 编码基因, 使卡介苗表达 MPT64 理论上也可提高卡介苗对结核病的保护力将 MPT64 的基因通过基因重组技术导入到卡介苗中得到卡介苗重组疫苗, 对其进行免疫原性鉴定, 通过 mpt64 卡介苗重组疫苗对结核病预防收稿日期 : 修回日期 : 共同第一作者通讯作者, 电子信箱 :zhanglingxia7@yahoo.com.cn 实验来评价 mpt64 卡介苗重组疫苗对结核病的保护效果 1 材料与方法 1 1 材料主要试剂 TaqDNA 聚合酶 ( 上海生工生物技术公司 ) T4DNA 连接酶 ATP dntp HindⅢ BamH Ⅰ T 载体 (Promega 公司产品 ) DNAMarker 1kbDNA Ladder(MBI 公司 ),Middlebrook7H10 琼脂培养基 (Difco 公司产品 ), 其余试剂均为国产或进口分装结核分枝杆菌和卡介苗结核分枝杆菌 H37Rv 购自中国药品生物制品检定所, 卡介苗购自北京生物制品研究所质粒和宿主菌大肠杆菌 - 分枝杆菌穿梭表达质粒 pyub295 FR01 由内蒙古大学达来教授惠赠, puc19 ag85a 质粒由本室改造大肠杆菌 DH5α 由本

2 2011,31(7) 孙颖等 :mpt64 卡介苗重组疫苗的构建免疫原性及抗结核作用 15 室保存重组蛋白和人型 PPD ESAT6 MPT64 Ag85A Ag85B 重组蛋白为本研究室克隆表达纯化 ; 人型 PPD 购自中国药品生物制品检定所 1 2 方法 PCR 扩增及产物纯化根据 mpt64 基因序列结合所用载体序列, 设计引物,T21:5 GGA TCCGGT GCGCATCAAGATCTTCATG 3 ;T22:5 GAATTC TCTAGGCCAGCATCGAGTCG 3 扩增条件如下: 在 100μlPCR 反应体系中,4 种 dntp 终浓度各为 0 2mmol/L, 上下游引物的终浓度各为 0 4μmol/L, 纯化的结核分枝杆菌 H 37 RvDNA 模板 50ng,TaqDNA 聚合酶 4IU 置 DNA 热循环仪, 扩增循环参数为 :95 预变性 5min;94 变性 1min,62 退火 1min,72 延伸 1min,30 个循环 ;72 延伸 7min 将扩增产物进行 2% 的琼脂糖凝胶电泳, 切下扩增条带, 用博大生物公司的 DNA 回收试剂盒回收质粒 DNA 的提取大肠杆菌质粒提取参照分子克隆碱裂解法 [2], 卡介苗质粒提取参考文献 [3] 感受态细胞的制备 DH5α 感受态细胞的制备参照分子克隆, 卡介苗感受态细胞的制备 : 将生长至对数生长期的卡介苗, 冰浴后 4 离心收集菌体, 用 1/ 10 体积的 10% 的甘油洗涤 2 次, 将感受态细胞保存在 1/25 体积的 10% 的甘油中重组质粒的构建及蛋白表达参照分子克隆 [2] 重组质粒卡介苗的转化在 eppendorf 管中混匀 200μl 感受态细胞和 5μl 质粒 DNA, 冰浴 5min 后, 转入预冷的脉冲电转化杯, 去除气泡, 置于基因脉冲仪, 在 1500 伏 6μF 参数下进行电转化, 电击 2 次将转化产物冰浴 10min 后, 转入 eppendorf 管, 于 37 温育 1h, 涂四环素抗性的 Middlebrook7H10 固体平板,37 培养卡介苗重组疫苗表达重组蛋白的鉴定将卡介苗 pyub295 MPT64 卡介苗重组疫苗接种于苏通液体培养基中, 于 37 培养 4 周后, 由于所采取的重组蛋白的表达方式是分泌到细胞外, 取培养卡介苗重组疫苗后的液体培养基 500μl, 加 2 SDS 电泳缓冲液 500μl, 取 40μl 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳卡介苗重组疫苗的免疫原性分析从中国预防医学科学院购进 30 只 18~22gBalb/c 小鼠, 雌雄各半, 随机分为 3 组, 每组 10 只, 雌雄各半 A 组后腿腹股沟皮内注射 mpt64 卡介苗重组疫苗 0 05mg;B 组后腿腹股沟皮内注射卡介苗 0 05mg;C 组后腿腹股沟皮内注射生理盐水对各组小鼠, 免疫前采血 1 次, 分别于注射后 15 天 30 天 45 天 2 个月时, 眼眶下静脉窦采血 1 次, 分离血清 ;5 个月后处死时, 采血, 分离血清, 取脾, 用 ELISA 检测抗体 [3], 用 MTS 方法分析脾淋巴细胞增殖 [4] 卡介苗重组疫苗对结核分枝杆菌感染的预防作用从中国预防医学科学院流行病学研究所购进 30 只 13~16gBalb/c 小鼠, 雌 ; 雄各半, 随机分为 3 组, 每组 10 只, 雌雄各半 A 组后腿腹股沟皮内注射 mpt64 卡介苗重组疫苗 0 05mg;B 组后腿腹股沟皮内注射卡介苗 0 05mg;C 组后腿腹股沟皮内注射生理盐水攻击前共免疫 3 次, 每次间隔 10 天, 称量小鼠体重达到 18g 以上尾静脉攻击 0 4mg 结核分枝杆菌, 置强毒室喂养每周称量体重, 观察半数死亡时间和 2 个月内的死亡率 ;2 个月后处死小鼠, 分离血清, 用 ELISA 分析各组抗体水平 ; 取肝脏脾脏和肺组织, 观察病变情况 ; 将肝脏脾脏和肺组织进行研磨, 稀释不同浓度后用罗氏培养基进行培养 ; 同时分离脾淋巴细胞, 用不同抗原刺激, 分析其增殖情况 2 结果 2 1 mpt64 卡介苗重组疫苗的构建用 MPT64 基因特异性引物对结核分枝杆菌基因组 DNA 进行扩增, 在琼脂糖凝胶中电泳分别可见一条约 600bp 左右的条带, 用限制性内切酶 BamHⅠ EcoRⅠ 酶切质粒 puc19 ag85a 得到约为 3000bp 的线性片断, 将线性片断切下后回收与 MPT64 基因按 1 3 的比例连接, 转化大肠杆菌 DH5α, 筛选阳性克隆, 提取质粒用限制性内切酶 HindⅢ EcoRⅠ 酶切, 在琼脂糖凝胶中电泳分别可见一条约 1160bp 左右的条带, 即含有 ag85a 启动子和增强子的 mpt64 基因用限制性内切酶 HindⅢ EcoRⅠ 酶切质粒 pyub295, 得到约为 6000bp 的线性片断, 回收, 与含 ag85a 启动子与增强子的 mpt64 基因片断按 1 3 的比例连接, 连接产物转化大肠杆菌 DH5α, 在含四环素抗性的 LB 固体培养基中培养筛选阳性克隆, 提取质粒对提取的质粒用限制性内切酶 HindⅢ EcoRⅠ 酶切, 在琼脂糖凝胶中电泳分别可见一条约 1160bp 左右的条带, 说明成功地构建了分枝杆菌 mpt64pyub295 载体

3 16 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.31No 克隆对该质粒进行 DNA 测序进一步证实了构建正确 ( 图 1) 图 1 pyub295 mpt64 重组质粒的鉴定 Fig 1 IdentificationofpYUB295 mpt64 recombinantplasmid 1:1kb DNA ladder;2:plasmid pyub295;3:pyub295 mpt64 recombinantplasmid;4:plasmidpyub295hindⅢ EcoRⅠdigestion; 5:pYUB295 mpt64recombinantplasmidhindⅢ EcoRⅠdigestion 2 2 卡介苗重组疫苗的鉴定卡介苗重组疫苗基因组水平的鉴定将 mpt64 卡介苗重组疫苗卡介苗的基因组 DNA 稀释至 1ng/μl, 用 mpt64 引物进行 PCR 扩增, 扩增产物电泳结果显示 : 卡介苗基因组 DNA 扩增阴性, 而 mpt64 卡介苗重组疫苗基因组 DNA 扩增则可见一条 600bp 左右的条带卡介苗重组疫苗表达重组蛋白的鉴定对卡介苗及 mpt64 卡介苗重组疫苗的培养上清液进行 PAGE 电泳, 结果显示 :mpt64 卡介苗重组疫苗在 24kDa 左右有 1 表达条带, 而卡介苗无相应的表达条带, 表达量占分泌蛋白的 5% 左右 2 3 卡介苗重组疫苗的免疫原性卡介苗重组疫苗免疫小鼠抗体水平检测通过 ELISA 方法检测各组小鼠免疫前及免疫后 15 天 30 天 45 天 2 月 5 月时血清中特异性抗体水平用不同抗原对各卡介苗重组疫苗免疫小鼠的血清进行检测, 所得到的结果有显著的差异, 用 MPT64 蛋白检测, 只有 mpt64 卡介苗重组疫苗组抗体水平显著升高 ; 用 ESAT6 蛋白检测, 各组均无特异性抗体产生 ; 用 Ag85A Ag85B 蛋白检测, 各组抗体水平均比生理盐水对照组明显升高 (P<0 05); 用 PPD 检测, 各组小鼠抗体水平均比生理盐水对照组明显升高 (P<0 05), 结果表明 mpt64 卡介苗重组疫苗中 MPT64 蛋白在卡介苗内有一定程度的表达并能刺激小鼠 B 淋巴细胞产生特异性抗体各卡介苗重组疫苗免疫后 15 天, 特异性抗体水平已有升高,30 天时继续升高,45 天时达到最高水平,2 个月时抗体水平有所下降, 到 5 个月处死时抗体水平仍保持在 2 个月的水平卡介苗重组疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞增殖的检测各组小鼠免疫 5 月后采血处死, 取脾脏分离脾淋巴细胞, 以 cona PPD ESAT6 MPT64 Ag85A Ag85B 为刺激抗原, 进行淋巴细胞增殖试验结果可见 ( 表 1): 各组小鼠的脾淋巴细胞用不同抗原刺激, 平均刺激指数均达 2 0 以上, 即均有明显的刺激作用对数据应用 state 统计软件进行方差分析表明 : 抗原 cona PPD ESAT6 MPT64 Ag85A Ag85B 刺激 mpt64 卡介苗重组疫苗组卡介苗组以及生理盐水对照组, 各组之间刺激指数均无显著差异 (P>0 05) 小鼠分组表 1 用不同抗原刺激卡介苗重组疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞的平均刺激指数 Table1 Averagedstimulationindextospleenlymphocyteofimmunologicalmice withbcg recombinantvaccinestimulatedbyvariousantigens 刺激抗原 cona PPD ESAT6 MPT64 Ag85A Ag85B mpt64 卡介苗重组疫苗组 2 61± ± ± ± ± ±0 99 卡介苗对照组 2 37± ± ± ± ± ±1 06 生理盐水对照组 2 17± ± ± ± ± ± 卡介苗重组疫苗对结核分枝杆菌感染的预防作用各组小鼠半数死亡时间及两个月内的死亡率卡介苗及 mpt64 卡介苗重组疫苗免疫组小鼠的半数死亡,mpt64 卡介苗重组疫苗组效果与卡介苗组比无显著差别 ; 卡介苗及 mpt64 卡介苗重组疫苗免疫组小鼠两个月内的死亡率比生理盐水对照组也有降低 ( 表 2) 表 2 各组小鼠半数死亡时间及两个月内的死亡率 Table2 Themortalityintwomonthsand 50% lethaldateofeachteam 实验指标实验分组 A 组 B 组 C 组半数死亡时间 ( 天 ) 个月死亡率 (%) 50% 60% 80%

4 2011,31(7) 孙颖等 :mpt64 卡介苗重组疫苗的构建免疫原性及抗结核作用各组小鼠脏器大体病变在结核分枝杆菌攻击后 7 天内死亡的各组小鼠, 肺脏可见严重粟粒状病变, 肝脏未见明显病变, 脾脏发白, 大小基本不变 ;7 天后死亡的各组小鼠肺脏和肝脏病变同前, 但脾脏巨大结核分枝杆菌攻击 2 个月后, 各组小鼠脾脏巨大, 肺和肝病变有所不同 mpt64 卡介苗重组疫苗组 5 只小鼠存活,1 只小鼠肺实变, 肝上有白点, 肠系膜可见淋巴结 ;1 只肺气肿, 肝发黑 ;1 只肺气肿, 肝未见明显病变 ; 另外 2 只小鼠肺肝均未见明显病变卡介苗对照组小鼠 4 只小鼠存活,2 只小鼠肺实变, 肝未见明显病变 ; 另外 2 只小鼠肺肝均未见明显病变生理盐水对照组仅 2 只小鼠存活,1 只小鼠部分肺叶轻微糜烂, 肝未见明显病变 ; 另外 1 只小鼠肺肝均未见明显病变各组小鼠脏器结核分枝杆菌培养取各小鼠肺肝脾研磨后, 用生理盐水从 10-1 至 10-9 进行系列稀释, 各稀释度取 100μl 分别接种罗氏培养基, 置 37 培养箱培养 5 周, 取出培养基进行菌落计数, 发现菌落在试管下部密集生长, 无法计数, 但各组结核分枝杆菌生长的最低稀释度有区别 mpt64 卡介苗重组疫苗免疫小鼠卡介苗组免疫小鼠以及生理盐水对照组免疫小鼠肺脏培养的结核分枝杆菌生长最低稀释度主要集中在 10-5, 肝脏脾脏培养结核分枝杆菌生长的最低稀释度主要集 10-4 预防试验中各组小鼠的抗体水平及淋巴细胞的增殖能力无显著区别 3 讨论国际上用于构建卡介苗重组疫苗的载体主要有两类 [5] 一类是不含整合酶但含有分枝杆菌质粒复制位点和大肠杆菌复制位点, 能在大肠杆菌和分枝杆菌的细胞内独立于基因组而复制的非整合型载体 ; 另一类是含有大肠杆菌复制位点和 int 整合酶以及 atp 整合位点, 能在大肠杆菌内独立复制, 但却整合入分枝杆菌基因组内的整合型载体这两类载体各具有优点和局限性, 非整合型载体一般在宿主内可有多个拷贝, 目的蛋白的表达量可能较高, 但在传代中质粒有可能丢失 ; 整合型载体一般只有一个拷贝整合进基因组, 但稳定性较好, 在传代中一般不会有丢失现象实验采用整合型质粒 pyub295, 它含有大肠杆菌质粒复制位点 int 整合酶 atp 整合位点四环素抗性基因在大肠杆菌中以质粒的形式存在, 而在卡介苗中则整合进基因组内构建时需将目的蛋白编码基因插入信号肽编码序列后的酶切位点 BamHⅠ EcoRⅠ 之间, 但 atp 整合位点序列内有 BamHⅠ 酶切位点因此构建需用 HindⅢ EcoRⅠ 将包含 Ag85A 蛋白编码基因的增强子启动子以及信号肽序列的整个片断切下, 插入质粒 puc19 中, 在 puc19 重组质粒内分别插入 MPT64 的编码基因, 鉴定正确后, 再用 HindⅢ EcoRⅠ 将包含 AG85A 蛋白编码基因的增强子启动子以及信号肽序列以及 MPT64 编码基因的整个片断切下, 插入质粒 pyub295 中, 得到重组质粒, 鉴定正确后, 以含质粒 pyub295 的菌株为对照, 在大肠杆菌内进行表达 PAGE 电泳表明各重组质粒均无目的蛋白条带出现可能是因为构建时用的启动子是结核分枝杆菌 ag85a 的启动子, 该启动子在大肠杆菌内无法启动蛋白表达得到重组质粒后可通过原生质体转化磷酸钙沉淀法及低温氯化钙法等方法, 将重组质粒导入卡介苗内, 但这两种操作方法不仅操作复杂, 而且转化效率极低, 筛选的工作量大电穿孔是近年来发展起来的一种新的基因转化技术, 即利用高压脉冲电场将 DNA 导入细胞或细菌, 可以高效转化原核和真核细胞 [6] 转化效率达到 10 4 /μgdna, 以往转化卡介苗等分枝杆菌的缓冲液含 HEPES,MgCl 2 等复杂成分, 用 10% 甘油作电转化缓冲液, 同样获得较高的转化效率, 降低了实验成本卡介苗重组疫苗的免疫途径多种多样, 有经呼吸道口服皮内注射静脉注射等, 不同的免疫途径可获得不同的免疫效果, 只有针对性地选择免疫途径, 才能 [7] 达到最佳免疫效果 Winter 等研究了几种免疫途径对卡介苗 LacZ 表达的外源抗原免疫原性的影响经口呼吸道皮内免疫豚鼠, 观察 6 周, 相继出现对 β gal 特异性增殖反应,DTH 和抗体反应结果表明 : 对 β gal 特异性体液免疫和细胞免疫应答在三种免疫途径的豚鼠都能产生经呼吸道, 尤其是经口服接种诱导局部和全身免疫应答高于经皮内途径的免疫应答, 但经口服接种需要菌体量大 (50~200mg), 经呼吸道免疫需要特殊设备, 皮内接种简单易行, 需要菌体量少 (0 05mg), 因此, 研究采用皮内接种进行免疫一般实验中常用的实验动物是豚鼠和小鼠, 二者对结核杆菌的敏感程度不同豚鼠对结核杆菌敏感, 适于小剂量攻击的 CFU 及脏器病变观察 ; 小鼠对结核杆菌有较强的抵抗力, 适于大剂量攻击以观察半数死亡时间及一定时间内的死亡率试验对 13~16g(3~4 周龄 ) 的小鼠进行免疫, 攻击前共免疫 3 次, 每次间隔

5 18 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.31No 天, 此时小鼠体重达 18~22g, 用 1mg 结合分枝杆菌进行尾静脉攻击, 观察半数死亡时间及一定时间内的 [8] 死亡率不同于 Bao 等采用 6~8 周鼠进行免疫,8 周后, 攻击 10 6 的结核菌预试验结果表明 : 采用 6~8 周鼠进行免疫,8 周后 ( 此时小鼠体重已达 40g 左右 ), 尾静脉攻击 1mg 的结核菌喂养 2 个月, 大部分生理盐水对照小鼠均不死亡, 不适合半数死亡时间的观察, 可能是因为, 小鼠体重已达 40g 左右时其自身的免疫力已经很强, 患病较轻, 卡介苗及卡介苗重组疫苗的效果就不是很明显研究仅进行了初步的动物试验, 试验指标也待完善今后拟在以下两个方面进一步研究 : 第一, 结核病系呼吸道传染病, 采用呼吸道器物攻击的感染途径, 将使动物模型的结核病发展过程更接近实际情况 ; 第二, 小鼠对结核分枝杆菌较不敏感, 若采用更敏感的豚鼠制备结核病动物模型, 各组保护效力的差异可能会更明显, 以更好地评价卡介苗重组疫苗的免疫保护效力参考文献 [1] 张灵霞, 吴雪琼, 史迎昌, 等. 几种结核分支杆菌重组蛋白诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究. 中国防痨杂志,2002,24 (4): ZhangLX,WuXQ,ShiYC,etal.ChinJAntitub,2002,24 (4): [2]SambrookJ,FristschEF,Maniatist. 分子克隆实验指南. 第 2 版. 北京 : 科学出版社, SambrookJ,FristschE F,Maniatist.ProtocolsinMolecular Clone.2 nd ed.beijing:sciencepres, [3] 熊志红, 庄玉辉. 结核分枝杆菌 mpt64 基因的克隆及其在大肠杆菌种的表达纯化和诊断运用. 中国现代医学杂志, 2004,14(21): XiongZH,ZhuangYH.ChinaJModernMedicine,2004,14 (21): [4] 张灵霞, 吴雪琼, 李洪敏, 等. 结核分枝杆菌重组 MPT64 蛋白对豚鼠淋巴细胞增殖反应的影响. 中国防痨杂志,2004, 26(4): ZhangLX,WuXQ,LiHM,etal.ChinJAntitub,2004,26 (4): [5] 路艳艳, 冯作化, 皇铺永穆, 等. 新型大肠杆菌 - 分枝杆菌穿梭载体的构建及卡那酶素抗性基因表达的研究. 同济医科大学学报,1998,27(2): LuY Y,FengZH,HuangpuY M,etal.JTongjiMedical University,1998,27(2): [6] 路艳艳, 皇铺永穆. 电穿孔法对分枝杆菌进行高效基因转化. 北京医科大学学报,2000,32(2): LuYY,HuangpuYM.JPekingUniversity(HealthSciences), 2000,32(2): [7] WinterN,LagranderieM,GanglofS,etal.RecombinantBCG strainsexpresingthesivmac251nefgeneinduceproliferativeand CTLresponsesagainstnefsyntheticpeptidesinmice.Vaccine, 1995,13(5): [8] BaoL,ChenW,ZhangHD,etal.Virulence,Immunogenicity, andprotectiveeficacyoftworecombinantmycobacterium bovis BacilusCalmete GuérinStrainsExpresingtheAntigenESAT 6 frommycobacteriumtuberculosis.infectionandimmunity,2003, 71(4): TheStudyOnConstruction,ImmunogenicityandProtectionAgainst Mycobacterium tuberculosisofmpt64 recombinantbcg Vaccine SUNYing 1,2 ZHANGLing xia 3 WUXue qiong 3 DONGEn jun 3 (1BeijingInstituteofGenomics,ChineseAcademyofSciences,Beijing ,China) (2BeijingTechnologyExchange&PromotionCenter,Beijing ,China) (3The309 th HospitalofPLA,Beijing ,China) Abstract Itwasaimedtoconstructmpt64 recombinantbcgvaccinetofindanimprovedvaccinetoreplace BCGandtopreventTB efectively.thegeneofmpt64wasamplifiedbypcr andrecombinedwithshutle plasmidspyub295.therecombinantshutleplasmidwasidentified bypcr, enzymedigestion and DNA sequencingandthentransformedintobcg byelectroporation.theantigen specificantibodylevelsofmouse immunizedwithrecombinantbcgwereevaluatedbyelisaandmultiplicationofmouselymph celwasdetected bymts.theprotectionagainstm.tuberculosisofrecombinantbcgvaccineswastestedbytheirpreventionand

6 2011,31(7) 孙颖等 :mpt64 卡介苗重组疫苗的构建免疫原性及抗结核作用 19 treatmentexperiments.pcr,enzymedigestion,dnasequencingandsds PAGEresultsshowed:Thempt64 recombinantbcgwasconstructedsuccesfulyandcanexpresextrinsicmpt64gene.theimmunityexperiment showed:extrinsicgenecanbeexpresedinbcgandcanstimulatebceltoproduceantibody,theantibodylevel reachedthepeakafter45days;thelymph celsofeachgroupproliferatedwhenstimulatedbydiferentantigen, alstimulationindexreached2.thestimulationindexofeachgrouphadnoobviouslydiference.theprevention experimentofrecombinantbcgagainstm.tuberculosiswasindicated:mpt64 recombinantbcgandbcgcan extendmeantimetodeathandreducedeathratein2monthofthosemouse,theprotectionefectofmpt64 recombinantbcg hadnodiferencewithbcg.itcouldbeconcludedthatthempt64 ecombinantbcg was constructedsuccesfuly.theprotectionefectofmpt64 recombinantbcghadnodiferencewithbcg. Keywords BCG RecombinantBCG Antituberculosis Im munogenicity 檪檪姜老师信箱檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪蛋白质研讨班学员问 : 姜老师, 您好! 我是蛋白质研讨班的学员, 我的课题是纤维素酶, 上您的课收获很大, 因为发现自己有好几步实验都做的不正确在此我想咨询您几个问题 : 1. 我只需要将纤维素酶脱盐脱水浓缩, 选用硫酸铵沉淀, 之后透析的方法是否正确? 有没有更好的方法? 2. 我想测纤维素酶的结构, 需要将它纯化到什么程度? 多酶混合的体系能测结构吗? 用什么方法测? 哪个单位能测? 3. 您讲的双水相的方法, 适合我这种酶吗? 我应该选择什么相? 盐和聚乙二醇可以吗? 4. 渗透冲击法适用于枯草芽孢杆菌吗? 期待您的回复, 十分感谢! 姜老师答 : 学员, 你好! 很高兴我们的课程能给你较大收获关于纤维素酶的纯化要注意的是, 纤维素酶对多糖为基质的层析介质有很强的结合作用, 包括过滤膜超滤膜透析袋因此, 只能选用高分子材质的层析介质, 以及聚醚砜的过滤超滤膜对于你的问题, 我的建议如下 : 1. 如果你的样品需要脱盐脱水浓缩, 最好是用脱盐柱 ( 不可用多糖介质 ) 对很低浓度的碳酸氢铵 (20mM,pH7.0) 脱盐, 然后采用冰冻干燥的方法彻底脱水成干粉 2. 蛋白质结构测定有三种方法, 适合你的应该是晶体结构测定需要将蛋白质纯化到 95% 以上的纯度, 关键是不可以有干扰纤维素酶晶体生长和晶体均一性的杂质, 多酶混合是不可能测到其中任何一种蛋白质分子的三维立体结构的如果你可以完成蛋白质的纯化, 其余晶体生长和三维结构测定可以在很多科研机构和大学里完成, 比如 : 生物物理所北京大学和清华大学都有高水平的蛋白质晶体结构测定实验室 3. 你的这种酶没有很特殊的地方, 很适合双水相, 建议采用盐 -PEG 体系 4. 渗透冲击最合适革兰氏阴性菌, 其他需要实际摸索, 采用方法的原则是相同的祝实验顺利!

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌

2011,31(7) 孙颖等 :mpt64 卡介苗重组疫苗的构建 免疫原性及抗结核作用 15 室保存 重组蛋白和人型 PPD ESAT6 MPT64 Ag85A Ag85B 重组蛋白为本研究室克隆 表达 纯化 ; 人型 PPD 购自中国药品生物制品检定所 1 2 方法 PCR

2011,31(7) 孙颖等 :mpt64 卡介苗重组疫苗的构建免疫原性及抗结核作用 15 室保存重组蛋白和人型 PPD ESAT6 MPT64 Ag85A Ag85B 重组蛋白为本研究室克隆表达纯化 ; 人型 PPD 购自中国药品生物制品检定所 1 2 方法 PCR