第二十章 高效液相色譜法 (High Performance Liquid Chromatography,HPLC)
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- 暴 乐
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1 高效液相層析法與 PDA HPLC High Performance Liquid Chromatography
2 Basic Principle Liquid chromatography Mobile phase: Liquid Stationary phase: Solid or Liquid Samples dissolved in mobile phase can be analysed.
3 Chromatography by M. Tswett ether Chromatography chlorophyll colors CaCO 3
4 概述 高效液相層析法 ( HPLC ; High Performance Liquid Chromatography ) 是 1960 年代末 70 年代初發展出來的一種新型分析技術, 隨著不斷改進與發展, 目前已成為應用極為廣泛的化學分析方法 它是在古典液相層析基礎上, 引進了氣相層析的理論, 在技術上採用了高壓泵 高效固定相和高靈敏度檢測器, 因而具備速度快 效率高 靈敏度高 操作自動化的特點 為了更瞭解 HPLC, 現從兩方面進行比較 :
5 2.HPLC 原理 構造 LC 的移動相是液體, 若靜態固定相為 固態體 (Solid), 例如 10μm 粒徑的矽膠 (Silica Gel) 等此分析過程稱之為 Liquid Solid Chromatography (LSC)
6 1 HPLC 與古典液相層析法 HPLC 比起古典液相層析法的最大優點在於高速 高效 高靈敏度 高自動化 高速是指在分析速度上比古典液相層析法快數百倍 由於古典層析是以重力來驅使溶劑流動, 因此溶劑流速極慢 ; 而 HPLC 配備了高壓輸液設備, 溶劑流速相當高 對氨基酸分離, 用古典層析法, 柱長約 170 cm, 柱徑 0.9cm, 需用 20 多小時才能分離出 20 種氨基酸 ; 而用 HPLC 只需 l 小時之內即可完成
7 2 HPLC 與 GC (l)gc 所分析的樣品只限於氣體和沸點較低的化合物, 它們僅占有機物總數的 20% 對於占有機物總數近 80% 的那些高沸點 熱穩定性差 分子量大的物質, 目前主要採用 HPLC 進行分析 (2)GC 的流動相是氣體, 它對樣品沒有親和力, 即不產生相互作用力, 僅起運載作用 而 HPLC 的流動相可選用不同極性的液體, 選擇性大, 它對樣品可產生一定親和力, 並參與固定相對樣品作用的劇烈競爭 因此, 流動相對分離起很大作用, 相當於增加了一個控制和改進分離條件的參數, 這為選擇最佳分離條件提供了極大方便
8 (3)GC 一般都在較高溫度下進行的, 而 HPLC 則經常可在室溫條件下工作 總之,HPLC 是吸取了 GC 與古典液相層析優點, 並用現代化手段加以改進, 因此得到快速的發展 目前 HPLC 已被廣泛應用於分析生物學和醫藥上有重大意義的大分子物質, 例如蛋白質 核酸 氨基酸 多糖類 植物色素 高聚物 染料及藥物等物質的分離和分析 HPLC 的儀器設備費用昂貴, 操作嚴格, 這是它的主要缺點
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10 4-2 液 - 固吸附層析法 (Absorption) 液 - 固吸附層析法是基於吸附劑 ( 固定相 ) 表面對樣品中不同成分分子具有不同的吸附能力, 使混合樣品得到分離而加以分析 固定相吸附劑是填充在管柱內 由於固體吸附劑的表面為多孔性, 在表面上有許多活性吸附中心, 當流動相攜帶樣品分子經過層析柱時, 樣品分子便被吸附劑所吸附, 同時取代了吸附劑表面上所吸附的溶劑分子 此時樣品分子和溶劑分子在吸附劑表面上的活性中心發生了競爭吸附 樣品中帶有不同官能基的分子, 其彼此間在吸附劑表面上也發生競爭吸附, 有一部分的分子被脫附 (deadsorption) 因此在吸附劑表面上進行吸附 - 脫附的平衡
11 4-2-4 液 - 固吸附層析法的應用 液 - 固吸附層析法是以表面吸附的性能為依據, 因此它常常使用於分離極性不同的化合物 但也可使用於分離數量不同而極性相近的官能基 此外, 液 - 固吸附層析法還可用於分離異構物, 這是利用異構物有不同的空間排列方式, 對吸附劑表面的吸附力有差別而得到分離
12 4-3 液 - 液分配層析法 (partition) 液 - 液分配層析法的基本原理和氣相層析法相似, 在載體上覆蓋一層固定液作為固定相, 而流動相使用不與固定相及樣品發生反應的溶劑 根據固定液和流動相溶劑間的極性不同, 可分為正相液 - 液分配層析法 (normal-phase partition chromatography) 及逆相分配層析法 (reversephase partiton chromatography)
13 4-4 離子交換層析法 離子交換層析法是以離子交換樹脂為固定相, 一般以水作為流動相, 來分離及鑑定離子的一種層析法 在離子交換樹脂的網狀結構骨架上, 有許多可以與溶液中離子交換作用的活性官能基 被分析物質首先在載液中電離成離子, 然後與樹脂上帶有相同電荷的離子進行交換 根據樣品中各種離子對於離子交換樹脂的親和力不同, 而將它們分離
14 4-6-4 紙層析法 4-7 薄層層析法
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16 4-8-4 高效液相層析法的特點 1. 高壓 : 由於溶劑 ( 流動相 ) 的粘度比氣體大很多, 而層析柱內填充了緊密的微粒 ( 固定相 ), 當溶劑通過管柱時會受到很大阻力 一般在 1 m 長的管柱其壓力降約為 75Xl0 5 Pa 故需要採用高壓泵輸液系統, 壓力可達 150~350xl0 5 Pa 2. 高速 : 溶劑通過管柱的流量可達 3~10mL/min, 製備層析圖之速度可達 10~5OmL/min, 使分離速率加快 管柱製成封密型, 可重複使用 3. 高效 : 使用高效固定相, 其填充料的微粒均勻, 直徑小於 10μm, 表面孔穴淺, 質量傳送快 管柱效率高, 理論平板數可達 10 4 塊 /m 4. 高靈敏度 : 採用高靈敏度偵測器, 例如紫外線吸收偵測器的靈敏度可達 5x10-10 g/ml, 示差折光偵測器的靈敏度可達 g/ml
17 HPLC 儀器構造 HPLC 的結構一般可分為 4 個主要部分 : 1. 高壓輸液系統 2. 進樣系統 3. 分離系統 4. 檢測系統此外還配有輔助裝置 : 如溶劑梯度, 自動進樣及資料處理等 其工作過程如下 : 首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經過進樣器送入層析管, 然後從控制器的出口流出 當注入欲分離的樣品時, 流經進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入層析管進行分離, 然後依先後順序進入檢測器, 記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來, 由此得到液相層析圖
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19 Hardware Flow-line Degasser Autosampler Oven Column Detector Pump Reservoir Waste Data processor
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22 9060 Polychrom (Diode Array) Detector Computer Workstation HPLC Solvent Reservoirs 9010 Solvent Delivery System 9050 Variable UV/Vis Detector Rheodyne Injector HPLC Column Keep an eye on these 4 screens!
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24 %A %B %C Flow Rate Pressure {H 2 O} {MeOH} (ml/min) (atmos.) to column load Ready Varian 9010 Solvent Delivery System to injector inject Rheodyne Injector through pump through pulse dampener A B C Column Ternary Pump from solvent reservoir to detector
25 Variable UV/Vis Detector ABS AUFS λ RunTime EndTime min 10.0 min Ready
26 Ready UV Spectrum UV Spectrum {shows full UV abs.} Reset Chromatogram ABS. UV max UV max Wavelength ABS. R t R t Varian 9060 Polychrom Detector Time Chromatogram {shows peaks, R t }
27 HPLC Chromatograms Approximation of peak area by triangulation Absorbance Peak A Peak B height Time (minutes) base R t = 3.0 min. faster moving less retained R t = 5.2 min. slower moving more retained Area = base x height 2
28 1. 高壓輸液系統 由於 HPLC 所用固定相顆粒極細, 因此對流動相阻力很大, 為使流動相順利流動, 必須配有高壓輸液系統 一般由儲液罐 高壓輸液泵 壓力脈動阻力器等組成, 其中高壓輸液泵是核心部件 對於一個好的高壓輸液泵應符合密封性好, 輸出流量恒定, 壓力平穩, 可調範圍寬, 便於迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求
29 Pump Motor & Cam( 突輪 ) Pump head Check valves Plunger( 活塞 ) Plunger seal
30 Dual plunger pump (LC-10ADVP / LC-10ATVP) Check valve Parallel Plunger head Serial LC-10ADVP LC-10ATVP
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33 LOAD (the sample loop) 2. 進樣系統 Inject (move the sample loop into the mobile phase flow)
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38 Manual injector (Rheodyne 7725 / 7725i) from Pump from Pump LOAD to Column from Pump to Column from Pump INJECT to Column to Column
39 Loop injection autosampler (SIL-10AF / SIL-10AP) from Pump to Column from Pump to Column Sample Loop LOAD Sample Loop INJECT
40 3 分離系統 層析管 (column) 層析管是液相層析的心臟部件, 它包括管柱與固定相兩部分 管柱材料一般為不銹鋼 長 5~30cm, 內徑為 4~ 5mm, 製備型管柱內徑較大, 可達 25mm 以上 一般在分離管柱前備有一個前置管柱 (precolumn) 或保護管柱 (guard column), 前置柱內填充物和分離柱完全一樣, 這樣可使沖提溶劑由於經過前置柱為其中的固定相飽和, 使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相, 保證分離柱的性能不受影響
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42 4. 檢測系統 (detection system) 在液相層析中, 有兩種基本類型的檢測器 一類是溶質性檢測器, 它僅對被分離組分的物理或化學特性有回應, 屬於這類檢測器的有紫外 螢光 電化學檢測器等 另一類是總體檢測器, 它對試樣和沖提液總的物理或化學性質有回應, 屬於這類檢測器的有示差折光, 電導檢測器等
43 (l) 紫外線 / 可見光檢測器 (UV/VIS detector) (2) 螢光檢測器 (3) 示差折射率檢測器 (Refractive Index, RI): 幾乎所有物質都有各自不同的折射率, 因此示差折射檢測器是一種通用型檢測器 靈敏度可達 10-7 g cm - 3 主要缺點是對溫度變化敏感, 並且不能用於溶劑梯度 (4) 電導檢測器 (5) 附屬系統 : 它包括脫氣 溶劑梯度 恒溫 自動進樣 分液收集以及資料處理等裝置 其中溶劑梯度淋洗裝置是高壓液相層析儀中尤為重要的附屬裝置
44 Detectors UV-Vis Works w/all molecules Non-specific; complex samples; absorption wavelength PDA(Photo Diode Array Detector) Works for all wavelengths High LOD (limits of detection) Fluorescence Very specific; low LOD Not everything fluoresces IR Works w/all molecules Many solvents IR active Refractive Index Works w/nearly all molecules Temperature sensitive; high LOD Scattering Uniform response; 5ng/25μL LOD Non-specific; interference from solvent Electrochemical Commercially available Non-specific; high LOD Mass Spec Low LOD; analyte identification Ability to ionize analyte
45 螢光偵測器 螢光偵測器分為兩類, 色散型 和非色散型 螢光儀與原子 吸收儀相似, 但光源與其他 部件不在一條直線上, 而是 90 0 直角, 而避免激發光源發 射的輻射對原子螢光檢測信 號的影響
46 Instrumentation Lens Sample Source Dispersing Lens Computer Detector Dispersing
47 UV/VIS
48 吸收光譜儀的架構 Sample Detector Source 光源 Dispersing 波長選擇器 ( 分配器 ) Computer
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52 雙光束 單光束
53 波長的角分散是發生在反射表面上之繞射所造成優點是提供較好的波長分離, 且呈線性輻射分散 光柵單色器
54 最適分析條件層析圖 (2D) Chrom Type: Fixed WL Chromatogram, 280 nm Internal standard
55 Photo Diode Array Detector (PDA) ( 凹透鏡欄柵 ) 光二偶極陣列偵測器 (DAD) ( 對照孔洞 ) 光線分開器 重氫燈
56 光電二極體陣列檢測器 Photo Diode Array (PDA)
57 Photo Diode Array (PDA)
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59 PDA detector (SPD-M10AVP) Cell 光柵 Grating D 2 / W Lamps 1 nm / element 512 photodiodes
60 PDA data Spectrum Chromatogram Absorbance Wavelength Retention time
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62 最適分析條件層析圖 (3D)
63 1.PDA (Photo Diode Array)detector 的作用原理為何? 也稱快速掃描紫外可見分光檢測器 (190 nm-800nm) 800nm), 它採用光電二極體陣列作為檢測元件, 構成多通道並行工作, 同時檢測由光柵分光, 再入射到陣列式接收器上的全部波長的光信號, 然後對二極體陣列快速掃描採集資料, 得到吸收值 (A) 保留時間 (tr) 和波長 (l) 函數的三度空間層析光譜圖 由此可及時觀察與每一組分的色譜圖相應的光譜資料, 從而迅速決定具有最佳選擇性和靈敏度的波長
64 下圖是單光束二極體陣列檢測器的光路圖 光源發出的光先通過檢測樣品 (flow cell), 透射光由全息光柵色散成多色光, 射到陣列元件 (array) 上, 使所有波長的光在接收器上同時被檢測 陣列式接收器上的光信號用電子學的方法快速掃描提取出來, 每幅圖像僅需要 10ms, 遠遠超過色譜流出峰的速度, 因此可隨峰掃描
65 PDA (Photo Diode Array)detector 可以偵測到哪些化合物 因其可同時以 nm 檢測所以 會吸收 UV 或 / 及可見光的化合物都可 同時檢測
66 使用 PDA (Photo Diode Array)detector 的好處為何? (1) 傳統的 HPLC 偵測器是 UV/viscible fixed or variable wavelength, 即在每一次檢驗只能在單一波長檢測, 假使不知道待測試樣品的最佳吸收波長則要碰運氣或先以分光計掃描其 UV 吸收, 又假使現在有一待測試樣品是混合物 ( 如中藥粗萃物 ) 其中含有的一些化合物只可在 <210nm 偵測, 另外有些則可在 250 nm 甚至可在 360nm 那傳統的單一波長檢測器便不能同時看, 除非以 210 nm 但低波長的觀察的 baseline noise 較大, 況且也不知那訊號代表此化合物的最佳吸收是 250 nm 或 360nm PDA 則沒此問題可先設 nm 同時觀察
67 (2) 確認是否為分析之物質 ( 標準品 ): ): 假使現在有一樣品以單一波長偵測器測試, 其滯留時間與標準品一樣, 我們能說其就是與標準品同樣化合物嗎? 不成, 除非這樣品是已知富含這化合物, 若是這樣品從沒作過或報導過則只有 50% 把握, 尤其是中藥粗萃物, 差不多每幾分鐘便有一個訊號 ( 曾看過每分鐘都有 peak) 但是以 PDA 則除了可得到單一波長時的層析圖外, 我們也可在結果處理時改變波長得到某一波長時之二度空間層析圖 ( 下圖上方右圖 ) 與傳統的層析圖一樣 y- 軸為吸收值 x- 軸為滯留時間, 假使我們測試的樣品與標準品滯留時間差不多, 我們可以選這訊號再比對彼此的 UV 吸收 ( 例如 nm 下圖下方 UV 圖 ), 甚至我們可以電腦處理將兩個或以上樣品標準品的 chromatogram 或 UV scan 圖重疊比較, 重疊性愈高與標準品同樣化合物的可能性愈高
68 吸光強度長Y 軸 吸光強度 X 軸 時間 軸波長Z
69 (3) 可檢查樣品純度, 假使現有一樣品 於 5.1 分開始出現 5.5 分到尖峰 6.2 分回 歸到基線, 我們在數據處理時取 5.2 分鐘 5.5 分及 6.1 分時的 UV 圖重疊比 較, 重疊性愈高則此滯留時間 5.5 分的 愈純, 若有不純物在 5.5 分左右出來而 UV 吸收又不一樣的話,UV 圖重疊性 便差
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