Chapter 26 Introduction to chromatographic separations

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1 Chapter 26 Introduction to chromatographic separations

2 There are very few, if any, methods for chemical analysis that are specific for a single chemical species. At best, analytical methods are selective for a few species or a class of species. Until the middle of the twentieth century, analytical separations were largely carried out by such classical methods as precipitation, distillation, and extraction. Today, however, analytical separations are most commonly carried out by chromatography and electrophoresis, particularly with samples that are multicomponent and complex.

Until the middle of the twentieth century, analytical separations were largely carried out by such classical methods as

3 層析分析法簡介層析分析法 (chromatography, 簡稱層析法 ) 最早稱為色層分析法, 係蘇俄植物學家茲偉特 (Michael Tswett) 於 1906 年利用已填充了細顆粒碳酸鈣的玻璃管柱, 來分離植物葉汁中的色素將植物葉汁的色素混合汁液通過該玻璃管柱時, 由於各種色素分子大小不同及對碳酸鈣顆粒之吸附力不同, 使其由管柱流下的速率不同, 結果在玻璃管柱不同高度呈現不同顏色之層帶因此他將此種分離法命名為色層分析法, Greek Chroma=color

素混合汁液通過該玻璃管柱時, 由於各種色素分子大小不同及對碳酸鈣顆粒之吸附力不同, 使其由管柱流下的速

4 Separation of leaf carotenes and leaf xanthophylls by chromatographic adsorption, obtained in 1938 by Harold Strain is illustrated above. I. Separation of a carotene from b carotene by adsorption of petroleum ether extracts of leaves on a magnesia column. II. Separation of leaf xanthophylls by adsorption of a dichloroethane solution of these pigments on a magnesium column; note the separation of violaxanthin, zeaxanthin and lutein, mentioned in the text. The figure is taken from Strain (1938, p. ii, frontpiece). vindjee/papers/carfin1.html

Separation of leaf xanthophylls by adsorption of a dichloroethane solution of these pigments on a magnesium column; note the separation of

5 1941 年英國二位化學家馬丁 (A. J. P. Martin) 與欣革 (R. L. M. Synge) 發展出液相 - 液相層析分析法 (liquid-liquid - chromatography, LLC), 使用靜相或稱固定相 (stationary phase) 液體分散在吸附劑表面上代替上述的固體吸附劑, 它與流動相 (mobile phase, 簡稱動相 ) 不互溶根據樣品中之各成分在此二液相間的溶解度不同, 而達到分離的目的, 進而可做定性及定量分析他們二人於 1952 年又發展出氣相層分析法 (gas - chromatography, GC), 由於他們在此領域的研究成果, 二人同時獲得 1952 年諾貝爾化學獎, 而發展出今日許多類型的層析分析法, 用來有效率地鑑定及分離許多複雜的混合物

6 層析分析法 ( 簡稱層析法 ) 是一種有效的物理分離分析方法, 它根據試樣混合物中各成分在不互溶的兩相 ( 固定相與流動相 ) 中的吸附能力分配係數或其他親和作用之性能的差異, 使其流速不同, 作為分離的依據層析法可解決用一般之分離方法 ( 如蒸餾分餾萃取再結晶等 ) 所不易分離的混合物 ( 如化學性質相近之同系物異構物物理性質相近之多成分混合物 ) 的分離及分析

7 使用高靈敏度的偵測器, 將被分離之成分的濃度變化轉換成電子信號, 由信號處理器產生輸出信號, 由記錄器繪製成層析圖 (chromatogram, 又稱色譜圖 ) 根據層析圖中, 各層析峰 (chromatographic peak) 的面積及峰高, 來計算出每成分的含量由於層析法的分離效率 ( 解析度 ) 高分析速度快靈敏度高準確度高等特點, 目前廣泛應用於有機合成石油加工環境保護醫葯食品工業及冶金工業等之分析

peak) 的面積及峰高, 來計算出每成分的含量由於層析法的分離效率 ( 解析度 ) 高分析速度快靈敏

8 Column chromatography and planar chromatography

9 層析分析法的基本理論層析分析法是將樣品混合物經由流動相 ( 氣體或液體 ) 的攜帶而流經固定相 ( 固體或固定在固體表面上的液體 ), 由於混合物中的各成分有不同的移動速率, 而將樣品中的成分分離如圖 26-1 所示, 樣品混合物含 A 及 B 二成分, 注入固定相管柱頂端, 藉著流動相的移動, 將樣品混合物分配成二相 A 及 B 的層帶 (band) elute partition: mobile phase stationary phase sample Fig. 26-1

如圖 26-1 所示, 樣品混合物含 A 及 B 二成分, 注入固定相管柱頂端, 藉著流動相的移動, 將樣品混合物分

10 由於二成分 A 及 B 對於流動相及固定相之吸附溶解及其他作用力不同, 使 A 及 B 之移動速率不同, 即在固定相中之滯留時間不同由偵測器可將其通過管柱下端的信號傳出, 在記錄器上顯示出來 ( 圖 26-1(b)), 稱為層析圖 (chromatogram) 由層析圖上尖峰的位置可用來鑑定樣品的成分 ( 定性分析 ), 由尖峰下的面積可提供每一成分的定量分析

11 圖 26-2 顯示樣品成分 A 及 B 在層析管柱中不同時間的濃度分佈圖由於 A 在管柱的固定相中較強滯留, 因此流動速率較慢在時間時,A 及 B 二成分濃度的層帶部分重疊, 但隨時間延長, 在時間時二成分充分分離, 其濃度層帶不再重疊, 但層帶之寬度變寬只要固定相的管柱長度足夠長, 樣品中的成分可以清楚分離 Fig. 26-2

12 partition

14 26B-1 Distribution constant, partition ratio, partition coefficient 層析管柱的分離效率部分取決於二成分物種在流動相中流動的相對速率, 而此相對速率由物種在流動相與固定相間之 distribution constant ( 分配係數 ) K 的大小所決定物種 A 在動相與固定相間形成分配平衡 : For the solute species A: A mobile A stationary a a A S A M K C a a A S A M (26-1) : is the activity of solute A in the stationary phase : is the activity of solute A in the mobile phase

種 A 在動相與固定相間形成分配平衡 : For the solute species A: A mobile A stationary a a A S A M K C a a A S A M

15 when concentrations are low or when nonionic species are involved, activity coefficients are nearly unity. K C C C (26-2) Ideally, the distribution constant is constant over a wide range of solute concentrations. Chromatography in which Eq applies is termed linear chromatography and results in such characteristics as symmetric Gaussian-type peaks and retention times independent of the amount of analyte injected. Kc is the fundamental quantity affecting distribution of components between phases and thus separations. S M n V n V S S M M

26-2 applies is termed linear chromatography and results in such characteristics as symmetric Gaussian-type peaks and retention times

16 26B-2 retention time We can measure a quantity called the retention time that is a function of Kc. 當樣品注入管柱之後至分析物種的波峰到達偵測器所需的時間, 稱為滯留時間 (retention time) 以符號表示圖 2-3 說明二成分混合物的典型層析圖左方的小波峰代表管柱對物種不會有任何滯留力的波峰, 其到達偵測器的時間大約等於一流動相分子流經管柱所需的時間, 稱為無感時間或靜止時間 [dead (or void) time] 與之差稱為調整滯留時間 (adjusted retention time), 以符號表示 : t R t S t M Fig. 26-4

物的典型層析圖左方的小波峰代表管柱對物種不會有任何滯留力的波峰, 其到達偵測器的時間大約等於一流動相分子流經管柱所需的

17 The average linear rate of solute migration through the column L (26-4) t The average linear rate of mobile phase molecules through the column 分析物種的移動平均速率也可用流動相平均速率的分率表示, 即與分析物種在動相滯留時間的分率乘積, 此滯留時間分率等於分析物種在流動相中, 在各時間之莫耳分率, 即 R L u (26-5) t M u (fraction of time solute spends in mobile phase) u (moles of solute in mobile phase/total moles of solute)

$u (fraction of time solute spends in mobile phase) u (moles of solute in mobile phase/total moles of$

18 流動相中分析物種的莫耳數等於其莫耳濃度與其體積之乘積固定相中分析物種的莫耳數等於其莫耳濃度與其體積之乘積分析物種的總莫耳數為在流動相與固定相中之莫耳數總和, 即則上式變成 C V M M u C M V M C S V S 1 u 1 (C V / C V ) S S M M 由式 (26-2) 的分配係數代入上式, 可得 1 u (26-8) 1 (KV / V ) S M 式中的 VS及 VM可由製備管柱時的數據求得或由流動相之體積流動速率 0 求得 : V t F, V t F F (ml/ min) M M 0 S R 0

1 u 1 (C V / C V ) S S M M 由式 (26-2) 的分配係數代入上式, 可得 1 u (26-8) 1 (KV / V ) S M 式中的

19 26B-5 retention factor 在層析法中,retention factor 為相當重要的參數, 可用來表示分析物種在管柱中的移動速率對於分析物種 A 而言, retention factor 可定義為 K AVS ka V (26-9) M K A 式中為分析物種 A 的分配係數將上述關係代入式 (26-8) 可得分析物種 A 的移動平均速率 : v 1 u 1 k A (26-10)

factor 可定義為 K AVS ka V (26-9) M K A 式中為分析物種 A 的分配係數將

20 Optimization of separations is then done by optimizing k values for the components of interest. 將式 (26-4) 及式 (62-5) 的關係代入式 (26-10), 可得 L t R L t M 1 1 k A (26-11) 整理式 (2-11) 可得 k A ' t t t R R A t M M t M A (26-12) t t 其中 R及 M可由圖 26-4 的層析圖求得理想上, 分離混合物的 retention factor 其值介於 1 至 10 之間

21 26B-6 relative migration rates: the selectivity factor 在層析法中, 一分析物種 A 及 B 在管柱中的分離效果由選擇性因子 (selectivity factor) 來決定選擇因子可定義為 KB (26-13) K A 為較強滯留物種 B 之分配係數, 而為較弱滯留物種 A ( 即移動速率較快的物種 ) 之分配係數則選擇性因子永遠大於 1 選擇因子也稱為相對滯留 (relativeretention) 或分離因子 (separation factor)

22 由式 (26-9) 對分析物種 A 之 retention factor 的定義, 同理對分析物種 B 而言, 其 retention factor 為, 二者代入式 (26-13) 可得選擇性因子與 retention factor 及之關係式 : kb (26-14) k A 由式 (26-12) 的關係式, 對二分析物種 A 及 B 而言, 代入式 (26-14) 可得 (t ) t (t ) t R B M R A M (26-15) 稍後再說明如何利用及 ka kb 來計算管柱之解析度 R S

23 管柱效率與平板高度馬丁 (Martin) 和欣革 (Synge) 將層析管柱視為由無數個不連續, 但相鄰的理論平板的薄層所組成, 在每一平板上, 假設分析物種在流動相和固定相間發生平衡層析峰的形狀為對稱的高斯曲線 (Gaussian curve) 層析峰的寬度 W 與測量中的變異值 (Variance) 或標準偏差 (Standard -deviation) 成正比因此可使用每單位管柱長度的變異值來定義管柱效率, 而管柱效率通常用平板高度表示平板高度 (plate height) H 可定義為 H 2 L (26-17) 其中 L 為管柱填充之長度 ( 單位為厘米,cm) 平板高度一般稱為理論平板相當高度 HETP (height equivalent of theoretical plate) 簡稱平板高度

24 管柱的理論板數 (number of theoretical plate) N, 可用平板高度 H 及管柱填充之長度 L 來表示 : N L H (26-17) 假若 L 管柱填充之長度增加, 則滯留時間也增加一般的層析管柱效率隨平板數 N 的增加及平板高度 H 的減少而增加由於管柱型式流動相及固定相之不同, 層析管柱的效率有很大的差異以平板數表示的效率值, 可由數百至數十萬不等平板高度範圍由數十分之一至數千分之一厘米 t R

25 H 與 N 的實驗評估由實驗的層析圖, 其層析峰的寬度 W 及滯留時間, 可用來評估層析管柱的平板高度 H 及理論平板數 N 圖 26-7 為實驗所得的層析圖, 其橫軸為時間單位, 為了區別上述橫軸為管柱填充長度之單位, 其標準偏差用表示, 而變 2 異值為以長度表示的標準偏差和以時間表示的標準偏差, 二者之關係式為 (26-18) L / t R L/ t (cm/s) 其中為分析物種的平均移動速率 R t R

26 由層析峰兩側作切線, 與底部形成三角形, 三角形的面積約為峰下總面積的 96%, 包含在最大值加減二個標準偏差 ( 2 ), 故峰寬度 W 即三角形底部為 W 4, 如圖 26-7 所示將將 W 4 代入式 (26-18) 可得 LW 4t 代入式 (26-17) 可得平板高度 H 為 R (26-19) H LW 16t 2 (26-20) 2 R

27 Fig 由層析峰測定標準偏差此處, W = 4 ; t R 為滯留在管柱填充物內的溶質滯留時間, 而 t M 為不滯留在管柱內的溶質之滯留時間, 因此約等於流動相的分子通過管柱的時間 t M

28 由式 (26-17) 及式 (26-20) 可得理論板數 N 為 N t R 16 W 2 (26-21) 另一個求 N 值的近似法是決定最大值一半高度處的峰寬, 即半高峰寬則理論板數 N 為 N t R W 1/ 2 2 (26-22)

29 26C-1 rate theory of chromatography The rate theory of chromatography describes the shapes and breadths of elution bands in quantitative terms based on a random-walk mechanism for the migration of molecules through a column. Plate theory successfully accounts for the Gaussian shape of chromatographic peaks and their rate of movement down a column. The theory was ultimately abandoned in favor of the rate theory, however, because it fails to account for peak broadening in a mechanistic way. Nevertheless, the original terms for efficiency have been carried over to the rate theory. The plate count N and the plate height H are widely used in the literature and by instrument manufacturers. They can be quite useful quantities in comparing separating power and efficiencies among columns. However, for these numbers to be meaningful in comparing columns, it is essential that they be determined with the same compound.

30 2-3-8 影響層析峰帶加寬的三個因素 Band broadening reflects a loss of column efficiency, where the column efficiency can be evaluated by the plate height, H. 根據研究層析峰帶加寬的因素是由下列三個程序所造成 : (1) 渦流擴散 (eddy diffusion),(2) 縱向擴散 (longitudinal diffusion),(3) 非平衡質量傳遞 (nonequilibrium masstransfer) 這三個程序的效應由下列控制變數來決定 : 流動速率, 填充物粒子大小擴散速率及固定相厚度 1950 年由荷蘭化學工程師凡迪姆特 (van Deemter) 導出這三個程序造成峰帶加寬對平板高度 H 的影響, 將流動相的流動速率對 H 的關係式稱為凡迪姆特方程式 (van Deemter equation):

31 B H A Cu u 式中 A 為與渦流擴散有關的量, 它與流動速率無關, 但與粒子大小幾何形狀及固定相填充之緊密度有關 B 為與縱向擴散有關的量, 它對 H 的影響與流動相的流動速率成反比當擴散隨時間增加時, 流動速率減低, 造成帶加寬的程度增加 C 為與非平衡質量傳遞有關的量, 流動相的流動速率太快時, 無法達到平衡而造成帶加寬, 它的影響與流動速率成正比若流動速率減少時, 此項因素的影響就變小

32 凡迪姆特方程式只提供一個近似平板高度, 有若干更精確的修正式已被提出例如 1983 年胡克斯 (S.J. Hawkes) 提出流動相濃度 C 及固定相濃度對平板高 M CS 度之影響的修正式 : B B H A CMu CSu A (CM C S)u u u (26-23)

34 圖顯示凡迪姆特方程式中各項對 H 的貢獻 ( 用虛線表示 ) 及對 H 的淨效應 ( 用實線表示 ) 欲得到最佳效率 ( 即最小平板高度 H) 可由圖中, 當 H 的實線最小值時即為最佳流動速率而得到由此實驗曲線可估計在某一流動率時,A, B 及 C 的影響由此數據可提供改進某一填充管柱之操作的參考 FIGURE Contribution of various mass-transfer terms to plate height. C s u arises from the rate of mass transfer to and from the stationary phase, C M u comes from a limitation in the rate of mass transfer in the mobile phase, and B/u is associated with longitudinal diffusion.

36 Total number of plates of a GC column is greater than a LC column. Overall column efficiency is usually superior with GC columns because a typical GC column is much longer than a common LC column. Fig. 26-8

37 26D-1 Column resolution 管柱解析度 R S 管柱的解析度 (resolution, 亦稱為分離度鑑別率 ) 說明管柱對於分離二分析物種之能力的定量衡量 R (t ) (t ) 2[(t ) (t ) ] 2Z R B R A R B R A S WA WB WA WB WA WB 2 (26-24) FIGURE Separation at three resolution values: R s =2ΔZ/(W A + W B ). The peak heights have been adjusted to be approximately the same in each case.

38 任一管柱的解析度 R S 可定義為二成分的滯留時間的差值 Z與其平均峰寬度的比值 : R R B R A R B R A S WA WB WA WB WA WB 假設 A 及 B 二成分的滯留時間非常接近, 二個峰寬度接近相等, 即, 代入式 (26-24) 可得 W A (t ) (t ) 2[(t ) (t ) ] 2Z W 2 B R B R A (t ) 由式 (26-21),W 以 N 及 R B表示, R S (t ) (t ) W (26-24) W 4(t ) R N B R S t R t B R A t 4 R B N (A)

39 由式 (26-12) 代入上式 (A) 化簡可得用 A 及 B 之 retention factor ka 及 kb 表示的解析度 : 由式 (26-14) 選擇性因子, 代入上式並重組以消除 ka 項後, 可得 (26-25) M A R M M A R A t t t t t k ' 4 1 N k k k R B A B S A B k k B B S k k N R 1 1 4

40 由式 (26-25) 平方, 整理可得欲達到解離度時, 所需的平板數目 N: k 1 B N R S (26-26) kb 當被分離之二成分 A 及 B 之分配係數相近時, 即 KA KB 時, 由式 (26-9) retention factor 的定義, 可得 ka kb, 則由式 (26-13) 選擇性因子的定義知 1 在此情況下, 由式 (26-25) 及 (26-26), 可簡化為 R S R S N k 4 1 k k N R S 1 k 其中 k A k k B 2 (2-32) (2-33)

41 欲確認管柱的性能, 即由完全分離二成分 A 及 B 所需的分離時間來決定最理想的層析分析是以最短的分離時間而達到最高解析度假設欲完全分離 A 及 B 所需的時間, 可由移動較慢的成分來決定, 假設成分 B 之移動平均速率較慢, 即滯留時間 (t ) 較長由式 (2-4) 知將式 (B) 式 (26-10) 及式 (26-16) 合併整理後, 可得將式 (26-26) N 代入式 (C) 可得 R B L B (B) (t ) t R B R B NH 1 k u B (C) t R B 16R u 2 S H kb k 2 B 3 (26-29)

42 Example 26-1 Substances A and B have retention times of and min, respectively, on a 30.0-cm column. An unretained species passes through the column in 1.30 min. The peak widths (at base) for A and B are 1.11 and 1.21 min, respectively. Calculate (a) the column resolution, (b) the average number of plates in the column, (c) the plate height, (d) the length of column required to achieve a resolution of 1.5, (e) The time required to elute substance B on the column that gives an Rs value of 1.5, (f) The plate height required for a resolution of 1.5 on the original 30- cm column and in the original time.

43 26D-4 Variables that affect column performance In seeking optimal conditions for achieving a desired separation, it must be kept in mind that the fundamental parameters α, k, and N (or H) can be adjusted more or less independently. For example, α and k can be varied most easily by varying temperature or the composition of the mobile phase.

44 Variation in H

45 Variation in the selectivity factor Optimizing k and increasing N are not sufficient to give a satisfactory separation of two solutes in a reasonable time when α approaches unity. A means must be sought to increase α while maintaining k in the range of 1 to 10. The options are 1. Changing the composition of the mobile phase 2. Changing the column temperature 3. Changing the composition of the stationary phase 4. Using special chemical effects (derivatization).

46 26D-5 the general elution problem optimal Solution: LC: Solvent programming GC: temperature programming Fig

47 TABLE 26-4 Important Chromatographic Quantities and Relationships

48 TABLE 26-5 Important Derived Quantities and Relationships

49 層析分析法的定性分析層析分析法之應用有四項, 可同時進行試料之分離以製備純成分鑑定試料之純度定性分析及定量分析由於層析法之靈敏度極高, 試料中含微量雜質亦可在層析圖上顯示每一純成分應顯示單一尖峰, 如主峰上有分岐的小峰, 則表示有性質相近 ( 如同系物 ) 之雜質存在因此由層析峰可鑑定試料之純度, 由峰的數目及位置, 可定性分析, 由峰的高度及峰下之面積可進行定量分析由試料中各成分的滯留時間不同, 可用來定性分析及製備純成分層析法之定性分析可依下列方法之一來進行

50 對照滯留時間法在相同操作條件 ( 管柱的種類直徑長度操作溫度流動相流動速率等 ) 下, 滯留時間為物質的特性值, 不受含量多寡的影響故未知物與已知標準物在相同操作條件下, 對照其滯留時間, 可判斷未知物所含物質的種類如圖 2-7 所示由實驗發現同系物之調整滯留時間 R的對數值與同系物的碳數 N 成線性關係 : log t mn b R 式中 m, b為實驗常數圖 2-8 為正烷類正烯類酮類正醇類同系物的線性關係, 將未知物之 t 對數值與圖 2-8 比 R 較, 可鑑定含有何種成分 t (d)

51 圖 2-7 標準物對照法定性分析

52 滯留時間對數值刻度正醇類酮類正烯類正烷類碳原子數圖 2-8 若干同系物之滯留時間對數值與碳數的線性關係

53 標準加入法標準加入法 (standard addition method) 係在未知樣品中加入已知成分之標準物, 在相同層析條件下操作, 所得的層析峰若比原來未知樣品的層析峰更高, 表示含有該已知成分, 如圖 2-9 所示圖 2-9 用標準加入法之定性

54 Retention index 滯留指數滯留指數 (retention index) I 係 Kovats 於 1958 年所提出, 可用滯留時間或滯留體積來定義 : log [t t ] log [(t ) t ] log [(t R ) n1 t M] log [(t R) n t M] R M R n M I n (2-39) log [V V ] log [(V ) V ] log [(V R ) n1 V M] log [(V R ) n V M] R M R n M I n (2-40) log s, n I n log n 1, n (2-41)

55 其中 t R R t M (t ) n 為樣品的滯留時間為流動相的滯留時間為含 n 個碳之飽和烴它在樣品之前溶析分離的滯留時間 (t R ) n 1為含 n+1 個碳之飽和烴它在樣品之後溶析分離的滯留時間 s, n 為樣品對於含 n 個碳飽和烴之相對滯留或稱選擇性因子, 為分配係數之比值 n 1, n為含 (n+1) 個碳飽和烴對於含 n 個碳飽和烴之相對滯留或選擇性因子 n 個碳飽和烴的滯留指數 I=100n 定溫時操作層析管柱, 同系物中滯留時間對數值或滯留體積對數值與碳數成線性關係, 故 I 對 log(t R t M) 或 I 對 log(v R t M) 作圖呈線性關係因此可由內插法求出樣品的滯留指數 I, 再由文獻的 I 值可進行對照來定性分析

56 如果管柱操作是使用程式溫度操作 (programmedtemperature operation) 則滯留指數 I, 式 (2-39) 式 (2-40) 將修正為 t (t ) (t ) (t ) R R n I n R n1 R n (2-42) V (V ) (V ) (V ) R R n I n R n1 R n (2-43)

57 Fig

58 結合其他儀器來定性分析雖然層析法之特點是分離能力強, 分離效率高, 但對於複雜的樣品混合物的定性鑑定很困難利用質譜 (MS) 紅外線譜 (IR) 核磁共振 (NMR) 等的高解析度, 適合與層析法連結來進行複雜混合物的定性分析例如將自 GC 層析柱之流出物進入 MS 之離子化室, 樣品各成分依流出之先後順序被分裂為碎片, 通過磁場達成分析, 每一成分由其碎片的質譜辨認目前有 GC-MS, LC-MS, GC- IR, LC-IR, HPLC-MS 連結來進行分析複雜未知物樣品, 而成為最有效的分析方法

59 層析分析法的定量分析利用層析峰的面積作為定量分析的依據測量峰面積的準確度直接影響定量結果在一定操作條件下被分析成分的量 m 與偵測器上產生的響應信號 ( 峰高或峰面積 ) 成正比, 即 m m fa f h (2-44) (2-45) 其中 m = 被分析成分之量 (g) f = 定量校正因子 h = 峰高 A = 峰面積

60 定量計算方法層析法的定量計算有下列四種方法, 各有其特點及適用範圍 ( 一 ) 標準化法標準化法 (normalization method) 又稱歸一化法, 當樣品中的 n 個成分均能被層析柱分離, 並被偵測器檢出而在層析圖上顯示各自的層析峰時, 可使用標準化法將測量的全部峰面積, 經相應的校正因子校正並標準化 ( 或稱歸一化 ) (normalization), 計算每個成分的百分含量 P% 的定量分析, 稱為標準化法 :

61 mi mi fia i P i% 100% 100% 100% n n m m f A i i i i1 i1 (2-51) 其中 m i m P% i A i 為樣品中成分 i 之質量為樣品總質量為樣品中含成分 i 之百分含量為樣品中成分 i 的峰面積 f 為樣品中成分 i 的相對校正因子 i

62 如果所得層析峰狹窄且對稱, 而其半峰寬度變化不大時, 也可使用峰高代替峰面積進行定量測定, 這樣更快速簡便計算式變成 fh i i P% 100% n fh i i i1 (2-52) 如果樣品中各成分為同分異構物或同系物時, 其 f 值相似則式 (2-51) 及 (2-52) 可簡化為 A i P% 100% n i1 A i (2-53) P% hi n 100% (2-54) h i1 i 標準化法之優點是簡便準確受到操作條件 ( 如注入量流動相流速 ) 之影響很小可適合工廠的快速控制分析

63 ( 二 ) 內標準法內標準法 (internal standard method) 簡稱內標法, 係稱取一定重量且物質與樣品相似的某純物質作為內標準物, 加入至已知重量的樣品中, 混合均勻後注入管柱中進行分析根據樣品及內標準物的重量和峰面積, 可求出待測定成分之含量由式 (2-44) 知 m f A, m f A i i i s s s, 故 m i Af Af i i s s m m A f m i i i s P% 100% 100% m Asfs m s (2-55) (2-56) 其中 m 為樣品重量 ( 不包含內標準物 )

64 由於絕對校正因子不易測得故使用內標準法時, 以內標準物作為基準 ; 即令 f, 測出被測定成分的相對 s 1 重量校正因子, 則式 (2-56) 以相對重量校正因子表示, 變成 A f m i i s P% 100% As m (2-57) 內標準法的優點是對於操作條件變化所造成的誤差 ; 例如所注入量多寡的誤差, 同時反映在內標準物及樣品上, 因此可以抵消而可得到較準確的定量分析結果當樣品成分不能全部出現層析峰, 或偵測器對各成分不能產生響應值 (response), 或只需測定樣品中某幾個成分的含量時, 適合使用內標準法

65 但內標準法每次分析都要準確稱量樣品及內標準物, 而不適宜作快速的控制分析內標準物的選擇很重要, 需符合下列要求 : 1. 它應該是樣品中不存在的純物質, 否則會使層析峰重疊而無法準確測量其峰面積 2. 內標準物必頇可完全溶於樣品中, 且不能發生化學反應 3. 加入的量應接近被測定成分的含量 4. 內標準物的層析峰應接近被測定成分之層析峰附近, 或位於全部樣品成分層析峰的中間位置, 又能完全分開 5. 內標準物的性質最好與被測定成分接近, 這樣當操作條件變化時, 更有利於內標準物及被測定成分作勻稱的變化 6. 需要準確稱重

66 ( 三 ) 外標準法外標準法 (external standard method) 又稱標準曲線法 (standard curve method), 係在相同條件下, 用欲測定成分的純物質配成不同含量的標準液, 取固定量標準液進行分析, 從所得層析圖上測出響應信號 ( 峰高或峰面積 ), 然後繪製響應信號 ( 為縱坐標 ) 對於標準液濃度 ( 為橫坐標 ) 的標準線 ( 檢量線 ), 如圖 2-11 將樣品在相同操作條件下, 取與標準液相同量進行層析, 由所得層析圖的響應信號 ( 峰高或峰面積 ), 在圖 2-11 的縱坐標之值 ( Ai 或 hi ), 可得標準線上相對應的濃度值 P% i, 即為被測成分之濃度 P% ( 圖中點即為相對應之濃度 ) i

67 A i 或 h i 標準線 ( 檢量線 ) P% i 標準液含量 Ps% 圖 2-11 外標準法標準線之製作當配製的標準液含量與樣品之含量接近時, 可使用單點校正法, 係將二者在相同條件下進行層析, 由層析峰的峰高比或峰面積比, 乘以標準液的百分率含量 P% s 即得樣品之百分率含量 P% : i

68 外標準法的優點是簡便快速不必使用校正因子, 不必加內標準物常用於工廠的控制分析但需嚴格控制操作條件的穩定性 A h P % P % P % (2-58) i i i s s As hs

69 ( 四 ) 標準加入法 (standard addition method) 當找不到合適的標準物時, 也可選擇樣品中的某成分為標準物, 通過比較加入該成分後之峰面積的改變, 來計算被測定成分的含量在一定操作條件下進行層析, 先記錄原樣品的層析圖然後在 mg 原樣品中, 加入 ms 克某成分 j ( 作內標準物 ), 混合均勻後在相同操作條件下進行層析, 並記錄其層析圖測量這二個層析圖中, 欲測成分及加入內標準物後的峰面積及, 來 A 計算原樣品中之含量 A j 對原樣品中的成分 j 而言 j m f A (2-59) j j j

70 加入克成分 j 後, 對成分 j 而言由二式可得 m j s j A A j j mj ms f j(aj A s) f ja (2-60) j Am m j A jms P j% 100% 100% m (A A )m 式 (2-61) 式 (2-62) 由式 (2-56) 的內標準法分式, 以 (Aj A j) 代替 A s 可得樣品中任一成分 i 的百分組成 A f m i i s P i% 100% (Aj A j)fs m 在輕質油品的層析分析, 不易找到標準物, 此時可使用標準加入法來測定 j j (2-63)

分析物種A及B在管柱中的分離效果由選擇因子決定 3. Selectivity factor (α)(relative retention)--選擇因子(相對滯留率) α =KB/KA KB KA α 1 KB大為樣品愈慢出來 KA小為樣品愈快出來 α大表示選擇性高 4.Number of

分析物種A及B在管柱中的分離效果由選擇因子決定 3. Selectivity factor (α)(relative retention)--選擇因子(相對滯留率) α =KB/KA KB KA α 1 KB大為樣品愈慢出來 KA小為樣品愈快出來 α大表示選擇性高 4.Number of 三層析相關術語 1.基線(base line) 無試樣通過檢測器時檢測到的信號即為基線 2.滯留時間 retention time tr 組成分從進樣(樣品注入)到管柱後出現濃度極大值時所需的時間 3.層析(波)峰(peak) 組成分從柱後出現被偵檢器偵測到所產生的訊號值因此一個波峰代表一個或一個以上混合物也就是未分離成功的分析成分 1 峰高(peak height) 2 峰寬(peak