}j3 期陈万勤等 : 冷皂化 ˉ 高效液相色谱法测定乳制品中叶黄素的 5 种顺反式异构体全反式叶黄素标准溶液的配制准确称取 5.mg 全反式叶黄素标准品于 1mL 容量瓶中, 用含.3%BHT 的乙醇溶解并定容 ˉ 该溶液可在 -4 下完好保存 6 个月准确吸取叶黄素标准储备液

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亩苌
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1 箱 43 卷分析化学 (FENXIHUAXUE) 研究简报 h F 第 3 期 2 5 甲 3 月 ChineSeJOuma]OfAna]ytiCalChemiStry 44~48 DO /j issn.253ˉ38 l } 冷皂化 ˉ 高效液相色谱法测定乳制品中叶黄素的 5 种页反式异构体陈万勤刘柱郑国钢 * 茅佩卿朱炳棋丁宇畸周赛静 ( 浙江省食品药品检验研究院, 杭州 314) 摘要建立了冷皂化 ˉ 高效液相色谱法测定乳制品中叶黄素的 5 种顺反式异构体将乳制品进行冷皂化处理后. 经正己烷 ˉ 石油醚 _ 二氯甲烷 (2:2:1 wv) 提取使用 YMCC3 色谱柱分离以甲醇和甲基叔丁基醚为充功相进行梯度洗脱采用二极管阵列检测器于 445nm 波长下检测外标法定量 ; 在 O127~5.82lng/L 旭侗内的线性关系良好相关系数 (R2) 为 O9999 回收率在 967%~122% 之间 RSD 在 4l%~5 抖 % 之 ) ( l=6) 检出限为.1 队 g/g(s/ /=3) 定量限为 O3 g/g(s//\/=1) 本方法简单 ` 准确 ` 灾敏度尚适用于乳制品中叶黄素 5 种异构体的检测关键词高效液相色谱法 ; 叶黄素 ; 异构体 ; 乳制品 1 引 ˉ-叶黄素 (Lulejn) 又名黄体素是存在于蔬菜 ` 花卉 ` 水果与某些藻类生物中的天然类胡萝卜素叶黄素具有良好的预防人体衰老 ` 动脉硬化 l]` 抗氧化 ` 抗癌功效 [2] 以及独特的护眼功能 3 4 等在保健品 ` 化妆品和动禽类饲料等多个领域广泛应用美国 FDA 于 l995 年批准了叶黄素作为食品补充剂用于食品中我国 27 年批准了叶黄素作为营养强化剂添加到婴幼儿或儿童配方食品中 5 叶黄素分子结构中含多个共扼碳碳双键结构由于烯键的存在叶黄素可以存在多种几何异构体叶黄素不问异构体在生物体内的生物活性也不同其中全反式构象的生物活性较顺式构象要高很多 [6`7 目前市售的食品中很少有区分叶黄素不同异构体的含量因此建立高效的叶黄素顺反异构体的检测方法具有重要的意义目前叶黄素的检测方法主要以高效液相色谱法 [8~l] 和液质联用法 [1l l2] 为主由于叶黄素在光和热的作用下容易发生顺反异构化 [l3 l4] 因此样品的所有处理过程需在较低温度和避光条件下进行避免全反式叶黄素发生异构化所以到目前为止国际市场上也只有全反式叶黄素标准物质在售尚未有叶黄素 ) 页式异构体的标准物质对顺式异构体进行定量仍然是个难题本研究采用全反式叶黄素作为标准物质对 5 种叶黄素异构体进行定量分析并且对样品的前处理方法进行了研究采用冷皂化法迸行样品的前处理避免叶黄素在高温皂化时叶黄素发生异构化采用液相色谱法结合 YMCC3 色谱柱对叶黄素异构体进行有效分离准确定量 2 实验部分 b 2}.1 仪器与试剂 A:ilen l26 高效液相色谱仪配二极管阵列检测器 ( 美国 Agilent 公司 ); 紫外 / 可见分光光度计 ; 乙睛 ` 甲醇 ( 色谱纯,Merk 公司 ); 甲基叔丁基醚 ` 石油醚 ` 二氯甲烷 ` 正己烷 ` 乙醇 ` 四氢吹哺 ( 色谱纯, Tedj 凯公司 );2 6ˉ 二叔丁基对甲苯酚 (BHT 纯度 99.4% SigmaˉA1drich 公司 );KOH( 纯度 >8% Sigˉ ma=ald1icl1 公司 ); 实验用水为 MjⅡiˉQ 超纯水全反式叶黄素标准品 ( 纯度 99.8% ChromaDex 公司 ) ~回2l4ˉl()ˉ2 收稿 ;214 乓 l2=l7 接受 :Eˉ n 匹 l1l;z 只山 6l7@l26 com

2 }j3 期陈万勤等 : 冷皂化 ˉ 高效液相色谱法测定乳制品中叶黄素的 5 种顺反式异构体全反式叶黄素标准溶液的配制准确称取 5.mg 全反式叶黄素标准品于 1mL 容量瓶中, 用含.3%BHT 的乙醇溶解并定容 ˉ 该溶液可在 -4 下完好保存 6 个月准确吸取叶黄素标准储备液用含 3%BHT 乙醇配制成标准系列溶液 I Ⅱ ⅢⅣ 和 V 采用分光光度法 [l5: 和高效液相色谱峰面积归法校准标准系列溶液 LⅡ lⅣ,v 的浓度分别为 L 和.127mg/L 2.3 色谱条件 ` 液相色谱柱 :YMCC3 色谱柱 (25mn1 4ˉ6mm 3.5 m YMC 公司 ); 柱温 :25cC; 进样量 : ] 从 L; 以甲醇 (A) 和甲基叔丁基醚 (B) 为流动相梯度洗脱 :.~14min 85%A l5%b; l4.()~]5.min 9%A l%b;l5.~l8.min 1%A 9%B;l8.~22min 85%A l5%b 流速 l.lnlmin; 检测波长 :445nm 参考波长 :55nm 2.4 样品前处理样品的前处理过程都要在避光或者在经对紫外光过滤的灯光下进行以避免叶黄素发生异构化称取粉末样品 2g( 精确到.lg) 或液态样品 1g( 精确到.1g) 置于 5.mL 离心管中 ( 粉末样品加人 lml 实验室用水充分涡旋 2min) 加人四氢映哺 5mL 涡旋混匀加人 5%KOH 甲醇溶掖 ln]l 派涡振荡 1min 于摇床上室温振荡反应 3min 反应结束后加人含 O5%BHT 的石油醚 ˉ 正己烷 ˉ 二氯甲烷 (2:2:1 wv) 提取液 lml 加盖派涡混匀 6S 6r/min 离心 lmin 取上层有机相于玻璃试管中 ; 再用 1mL 提取液重复提取 _ 次合并有机相有机相在 35 下氮气吹十用含.3%BHT 的乙醇溶液完全溶解并定容至 5.mL, 用 22 队 m 有机滤膜过滤供 HPLC 分析 3 结果与讨论 3.1 方法定量原理十黄素属于类胡萝卜素, 其分子式为 QH56O2 分子量为 5689 热处理时全反式叶黄素异构化成为顺式叶黄素异构体其中最常见的是 13ˉ 顺式叶黄素 13 ˉ 顺式叶黄素和 9ˉ 顺式叶黄素 9 ˉ 顺式叶黄素,{ } 黄素也易被氧化及光诱导异构化, 因此实验过程必须与氧气和白光隔绝并且所有操作在室温下进行全反式叶黄素的结构如图 1 所示 c 市丰 " 卜蒂丢穴旦侩悍物仆唯! 萍但师 +Hα!}{!!:` 人龄严增 oh 由于叶黄素容易发生异构化难以获得顺式叶黄素标准物质有报道采用全反式叶黄素制备顺式 H( HO 叶黄素标准物质的方法方法虽然可行但是不适用于检测机构日常检测工作顺式叶黄素与反式叶 9 磊 cjslutejnoh 黄素在 445nm 的吸光系数存在着差异在定量顺式 ] 黄素异构体以反式叶黄素为标准使用修正 Ho 愉熊系数 ().7 以修正顺式和反式异构体吸收峰和消光系数之间的差异 ` 因此本实验通过在 445nm 下得到叶黄索 Slutejn 膨铲 9 ˉ 贝式叶黄宗 9 crs llte I] ]3ˉCjS[uteinOH HOl3 ˉCiSlutem 簿 o 日愉 " 锨罐凝 n 顺式慨素的页式叶黄素峰面积与全反式叶黄素标准品的峰面图 l 叶黄素的构型异构体积相比从而实现对全反式叶黄素的定量分析也 F1g1S ructuresof5luteinstereo1somers 顶 J 以对 4 种顺式叶黄素利全反式叶黄素同时进行计 j ˉ 最终计算总叶黄素含量 3.2 色谱条件的优化与叶黄素异构体的定性 C 8 色谱柱利 C3 色谱柱都可以用来检测类胡萝卜素但是 Cl8 色谱般用于分析类胡萝卜素的总量而 C 汕色谱柱具有良好的峰形和较长的保留时间等优越的性能通常用于类胡萝卜素的顺反异构体的分离木研究参考了文献 [16] 的方法对全反式叶黄素进行异构化反应将 1mg 反式叶黄素用少量甲苯溶解后, 加人 2mg/L 碘 ˉ 正己烷溶液使碘的含量为叶黄素质量的 2% 将混合液放在 4W 日光灯下光照 lh. 然后用 1mol/L 硫代硫酸钠溶液洗涤 2 次除去多余的碘, 有机相在 3 下氮气吹干后用

3 勺 ( ) QJ 分析化学第 43 卷含.3%BHT 的乙醇溶液复溶定容至 1OmL 得到顺式和反式叶黄素混合样品用干叶黄素的定性分析为了消除上个色谱样品杂质对下个色谱样品目标物的干扰, 在目标物完全洗脱后采用大比例的甲基叔丁基醚对色谱柱进行洗脱保证可能存在杂质完全被洗脱出来后不干扰下个样品的检测 ˉ 在液相色谱系统中对 5 种叶黄素异构体的紫外 ˉ 可见光谱图进行全扫描叶黄素 5 种异构体的紫外 ˉ I 见光谱的吸收波长见表 1 9ˉ 顺式表 l 黄素 5 种异构体的紫外 _ 可见光谱的吸收波长和 l3ˉ 页式结构与全反式结构的叶黄素的 Table1UVˉVisabsorptionWavelengthofthe5lutejnstereo1solners 异构体吸收波长擞大吸收波长相差约 4nm 这是由于顺 S isomerahsoiptjonwav 停 le" 部 }l(nm) 式结构叶黄素发生了紫移现象与文献 I3ˉ 顺式叶黄素 13ˉcislutein [8] 报道致通过光谱对照并参照采用 13 _ 顺式叶黄素 l3 ˉcislu!ein33l 全反式叶黄祟 A]l=tranSlutein332, 怨 4,472 MCC3 色谱柱实现叶黄素 5 种顺反异 9ˉ 顺式叶黄素 9ˉcis1utein33l,439,467 构体宠全分离的文献 [8 l7,l8] 对叶黄 9 ˉ 顺式叶黄素 9 ˉcis1utein 素 5 种异构体进行定性分析全反式叶 *: 采用液相色谱法 ( 以甲基叔丁醚 / 甲醇为流动相 ) 二极管阵列检测器进行谈素标准样品如图 2a 所示, 经过异构化桃鳃 [h 筐 ⅡPLc ( 叫 e h lan l) 处理的叶黄素标准样品中叶黄素 5 种顺 employingthepho[odiodeaⅡrayde[ec[or. 反异构体如图 2b 所示各种叶黄素异构伸的分离效果良好由于叶黄素标准对照品在运输和转移过程中不可避免会受光和热影响全反式叶黄素会发生微量的异构化因此采用面积归化法得到全反式叶黄素的含量从而消除了微量顺式叶黄素对计算结果的影响 6 6] 3 6 b 干 3 宁 l ] ~ 尸 =h H 5 1 l5 2 H /(min) 二<吕阁 2 叶黄素 5 种顺反异构体的高效液相色谱图司D5 l /(mj ) l5 )= Fig.2HPLCchrO1natOgramSOf5luteinStereOiSOmerS ( 隆 l) 余反式十黄素标准品 (A1lhans1eutinstandard);(b) 异构化处理后的全反式叶黄素标准品 (Aa 筐 risome1izaˉ ion)ll3 ˉ 顺式叶黄素 (l3ˉcislutein);2.13 ˉ 顺式叶黄素 (l3ˉcislutein);3, 全反式叶黄素 (Allˉ rans1uleln); 4.9ˉ 顺式叶黄素 (9ˉcislutein);5.9 皇顺式叶黄素 (9 ˉciSluteln) 3.3 样品制备方法的忧化叶黄素对光和热都很敏感操作过程要避光且防止高温因此实验在常温下对样品进行皂化使用甲醇 ˉKOH 溶液作为皂化液的皂化效果优于 KOH 水溶液减少了水溶液的稀释作用同时甲醇作为有机 L 溶剂加人 ` 有利于溶解叶黄素为了防止提取过程中发生乳化促进叶黄素的溶解提高皂化效率在皂化过程加人四氢映哺使用石油醚正己烷 ` 二氯甲烷作为提取溶剂, 发现 3 种试剂混合提取时效果较好 ; 考察了不同比例的混合溶液的提取效率发现当石油醚 ˉ 正己烷 ˉ 二氯甲烷 (2:2:l WV) 时提取效率高并且提取溶剂在提取液 k 层有利于提取操作减少了样品基质的干扰作用不同苹取溶剂的苹取效果见表 2 本研究采朋石 ] 醚 ˉ 正己烷 ˉ 二氯甲烷 (2:2:l wv) 溶液作为提取液 3.4 线性范围检出限和定量限对全反式叶黄素标准液进行检测以仪器响应的峰面积 A 对全反式叶黄素的质量浓度 C 进行线性回归在 Ol27~5.82mg/L 范围内的线性关系良好回归方程为 A=13684C 一 9.7 相关系数 (R2) 为

4 厂 ] 第 3 期陈万勤等 : 冷皂化 ˉ 高效液相色谱法测定乳制品中叶黄素的 5 种顺反式异构体 47 (}9999 在空臼样品中添加叶黄素标准品表 2 不同比例提取溶剂对全反式叶黄素提取回收率的影响 (n=3) 山八 /`=3 确定方法的检础限以 s Ⅳ=1 删 i 骂 u Ⅲ l6 " h 懂 [ l 肌确定万法的定呈限得到叶黄素的检出限石油醚 / 正己烷 / 二氯甲烷添加量测得量回收率为 ().()l 队 g/g 定量限为.3 g/g Pe[rOleumelheI 日 /nˉhexai e/spikedfollndreqo`p 叮 icl]]oγ netl]a e( / /)( 仆 g/g)( g/g) (%) 2.5 回收率和精密度 ]:; 5.42l84 2 寸不含叶黄素乳粉样品进行全反式叶 :l:o5o458l 1!ˉ 缉收率实验添加水平分别为.2, ::lo ` ` l g/g 采用优化后的前处理 ldl;l :l;l 怯 Ⅵ` 样 ] 尚进行处理每个添加水平重复 l:2 僧 lα5o4559l 6 次平均回收率分别为 97.5%,12.2%l:l:2O5O :2:l 利 967% RSD 分别为 5.4% 43% 和 2:l: l%l:2: 实际样品测定采用本方法对 5 批次标识含有叶黄素的乳粉进行检测结果见表 3 如 1 号样品的 _ 个平行样品质量! 为 l.66lg 样品处理后定容体积 V 为 5.mL, 测得 13ˉ 顺式 `13 ˉ 顺式 `9ˉ 顺式 `9 ˉ 顺式和全反式叶黄素的峰面积, 分别代人回归方程 A=1368.4Cˉ9.7, 得到 5 种叶黄素异构体的浓度为 C C C9 ( 9 盯 L 腆将上述 = 计算所得浓度代人以下公式计算 : c 二 (c c 鸣 +c; 方 ) v 7! 式中 C[ 删为产品中总叶黄素浓度 ( g/g),o7 为采用全反式叶黄素校正顺式叶黄素时吸光系数修正值! 为样品质量,v 为样品定容体积表 3 乳制品中叶黄素的含量 ( l=3) Ta] ]e3contentsofallˉtrans]uteinindaivpro(]ucts( l=3) 4 结论叶黄素 Lutejn( 队 g/g) 建立了乳制品巾叶黄素 5 种顺反蒂 3 顺式 l3ˉcis13 ˉCiS9ˉciS9 ˉciSAllˉlranSTOla1 l3 ˉ 顺式 9ˉ 顺式 9 顺式全反式总量异构体的高效液相色谱法采用冷皂 l287o248o17l93l 化前处理保证样品在皂化过程中 ` 叶 2O268O183α31 O 黄素能保持原有的构型, 使用 YMc 删 ; ;α 士鲤 α 坚 7 慧 ::!: (3 色谱柱对 [ 十黄素 5 种顺反异构体 5Ol94O124ˉˉL 进行 ˉ 有效分离,4 种顺式异构体依抓反式叶黄素标准物质进行准确定量分析方法简单快速准确度和精密度高适用于乳制品中叶黄素 5 仲顶反异构体的定量检测 (l) I;` 己睡 rences lla\\,,raolg.p α 厂 αco RCs.,27 55:27-2l6 2ll{ 虱 ll ;ˉPe :( llon,latinoˉmaitelp N )ratt,ba andone,bertraiss,galanp,hercbergs.inr.j.cα ICC 厂,21 l27 (l): 72-l84 `B `al vs,boultonm,hensond,kobhh,munayij.b./qi)hrhα/mo : Ber 庸 n({schottt,go1dbohmra l(16ppingwa vandeˉkraats vannoreiˉj VanNo enˉu/noc r.( p/l1 α/mo/.Ⅶ. `( 咙.2 4l(ll):3322 一 3326`.. 5 / 呐 ) 旷胜 α 肋 27 8BuJ/ejj 则旷 rhe 恤 j 叼旷胜 αlth 旷 ⅧePe 卯 /e sr 甲皿 b jc 旷 Ch 亦 nα nes 笛 ]tml 删 es/mohwsjdj/pggtg/284/1717(1htm { 华人民共和国卫生部公告 27 年第 8 号公告 Bo}lm\,Pusp1tasariˉNienaberNL Fe uzzimg,schw 虹 tzsj/ag 厂 jc. 凡 o Che 刀 2,22,5(1):221=226 7Khuchik 卜,BemSte1nPS,Ga1landDL.l est Op/lt/lαJmO/. 帅.Scj,1997,38(9):182 焉 l81l

5 u1 勺兰句ˉ` < ^9同 ˉoQ 厂 ; 屯 4R 分析化学第 43 卷 q \1l. l{ BiehlJ,CarleR,CO1IradJ,BeifuSS[,SChiebeIA.FOOdChem,25 92: `\N( Li-Na HUANGJul -ROng ZHANCLl FENOFeng LINOYun,CHUXiaOˉGang LIHOngˉLiang.Cht e e!! α/!/c/ o Ⅺα ogr ) 213 3l:l228=l231 ± 丽娜 ` 黄峻椿张立冯峰, 凌云储晓刚李宏梁. 色谱 213 3l(12):l l HsuBY,PuγS,StephenIn] arajb,chenbh/c 厂 omα og 厂.B :36-45 l)a( ]tleim,glasert,kohlerk Albe 扰 K.4nα/ Chem,21 73:667~674 E.naMO DdmaSoHM.FoodChe 澈 (3):l344ˉ1352 Ⅵa XM,S uparicm,sohiebera CarleR. 凡 OiChem,23 83:69~617 ( 世 l 肖 [[bnmlllerjjm WeStCE A mⅡ ReD. 厂,1998 l8:l9-38 ( uftn l //1g 厂 jc 励 OdChem.,1992,4;43l-434 llllllll Em 聪 ll li 帛二 1.C,EnglenG SanderLC,LudWigB SChWartZSJ.J.Ch 厂 OmαrOg 厂 A 1996,719:333 一 343 Em 们 h 隐 PrC.SanderLC Schwa tzsjj. 吼了 omαtog.a, (2): fla( 魁 llwl WalkinSRH,LeVyLW,RegaladOE.R1VadeneiraDM VanBIeemenRB S )hwartzsj.i g 厂 jc. 肋 OⅢ C/l 召.`1999`47:4l Co dsapom 傲 cationmeth 砸 mrdeierminationof5lutein S;ereOiSOmerSinDairyPrOduCtS!])y HighPermrmanCeLiquidChrOmatOgraphy bp7 IEⅪWanˉQin LIUZ}1u ZHENGGu[ ˉGang* ⅡAOPejˉQing ZHUBingˉQi DINGYu_Qi ZHOUSaiˉJl lg (Z/ 叼 jα 唱 mj 皿 je 允 r oodαndd ⅧgCo!r 厂 o/ 峰 /lo 皿 314 C/lj lα) AbStraCtAC )ldsaponihcationmethod 允 IdetenninatiOnOf5luteinStereOiSOmerSindairyprOductSbyhigb per ()m l(,eli(luidcl1romatography(hplc)wasde` loped.samp1eswerecoldˉsaponifiedatroom t 叁 ml)era{ureandextractedbynˉhexane/petroleum/dich]oromethane(2:2:l, / / / /V).Then51utein Sle P()iS(ll1]el. 岂 WereSeparatedOnaYMCC3CO1umnWithgTadjentelutiOnuS1ngmethanOl/methylteltˉbutVl ethprasthgmobilephase anddatawereacquiredbyaphotodiodeaitaydetectoratwavelengthof445nm. TlleCall])ra joncurvewaslinearintl1erangeof.l27ˉ5.82mg/lwithcorrelationcoe 髓 cientof.9999 an(][ ]erec()verieswereh )m96.7%tol2.2%withthersdsintherangeof4.1% 一 5.4%( l=6).the lil]γt( f(le[ecli()nwas.1 g/g(s/ /=3) andthelimitofquantjhcationwaso3 队 g/g(s//\/=1). I;>])1 esentingresu1tsofgoodaccuracy l)re(.isionandsensjtivity,thismetl1odvaljdatesitssuitabilityh}r r )lltmealialγ$isof51uteinstereoisomersindairyi)roducts I`evWOrdSHighpe 血 ImanCeliquidCh1 OmatOgraphy;Lutein;StereOiSOlnerS;DaiIyprOduCtS (Received2OOtober2l4;ac epte({l7de(oe! l)e!.2l4) O

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中华人民共和国国家标准 GB 5009.248 2016 食品安全国家标准食品中叶黄素的测定 2016-08-31 发布 2017-03-01 实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布前言本标准代替 GB/T23209 2008 奶粉中叶黄素的测定液相色谱 - 紫外检测法本标准与 GB/T23209 2008 相比, 主要变化如下 : 标准名称修改为食品安全国家标准食品中叶黄素的测定