华南预防医学 2015 年 2 月第 41 卷第 1 期 SouthChinaJPrevMed,February2015,Vol 41,No 1 17 手足口病 (Hand,foot,andmouthdisease, HFMD) 是一种常见的儿童传染性疾病,5 岁以下儿童是主要发病人群, 常在托幼机

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磨滕
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1 16 论著 1 起由 CV A6 型肠道病毒引起的手足口病疫情的快速鉴定与分析曾汉日 1,2, 李晖 1, 郑焕英 1, 刘冷 1, 郭雪 1, 管大伟 1, 孙立梅 1, 谭小华 1 1, 柯昌文摘要目的运用分子生物学方法, 对 2013 年 5 月河源市 1 所幼儿园发生的 1 起由 CV A6 型肠道病毒引起的手足口病聚集性疫情进行肠道病毒型别快速鉴定方法采集该起手足口病聚集性疫情的病例及密切接触者的粪便或咽拭子标本, 运用荧光定量 PCR 方法进行总肠道病毒 EV A71 CV A16 和 CV A6 检测, 并结合半巢式 PCR 方法进行肠道病毒 VP1 序列扩增, 通过对目的条带序列测定及分析进行肠道病毒分型鉴定结果经荧光定量 PCR 检测,26 例病例 35 份标本中共有 25 例 34 份标本检出总肠道病毒阳性,38 名密切接触者 38 份标本中有 11 人 11 份标本检出阳性, 肠道病毒阳性率分别为 96 15% 和 28 95%, 其中分别有 25 例病例和 7 名密切接触者 CV A6 阳性, 阳性率分别为 96 15% 和 18 42%, 全部标本 EV A71 和 CV A16 检测阴性 7 例病例和 3 名密切接触者的 10 份标本半巢式 PCR 扩增阳性, 测序结果显示 VP1 序列均属于 CV A6, 且核苷酸同源性为 100 0% 结论广东省河源市此次发生于幼儿园的手足口病疫情由肠道病毒 CV A6 型引起 ; 荧光定量 PCR 与半巢式 PCR 扩增肠道病毒 VP1 序列相结合的方法有利于对引起手足口病的 CV A6 型肠道病毒进行快速及准确鉴定关键词手足口病 ; 肠道病毒 ; 荧光定量 PCR 中图分类号 :R183 4;R512 5 文献标识码 :A 文章编号 : (2015) Rapiddetectionofanoutbreakofhand,foot,andmouthdiseasecausedbyCV A6enterovirus ZENGHan ri 1,2,LIHui 1,ZHENGHuan ying 1,LIULeng 1,GUOXue 1,GUANDa wei 1,SUNLi mei 1, TANXiao hua 1,KEChang wen 1 1 GuangdongProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention, Guangzhou511430,China;2 SchoolofPublicHealth,SunYat SenUniversity Abstract Objective Torapidlydetectandidentifyanoutbreakofhand,foot,andmouthdis ease(hfmd)causedbycv A6enterovirusinHeyuanCityinMay2013withmolecularbiologicaltechnol ogy Methods SpecimensofstoolandthroatswabsofHFMDcasesandclosecontactswerecolectedand detectedforpan EV,EV A71,CV A16,andCV A6byreal timepcr VP1geneticpartialfragmentsof thepositivesampleswereamplifiedwithsemi nestedpcr,andwereadoptedforsequencingandgenetica nalysis Results Inthisoutbreak,96 15% ofcases(25/26)and28 95% ofclosecontacts(11/38) werepan EVpositive;96 15% ofcases(25/26)and18 42% ofclosecontacts(7/38)werecv A6pos itive AlsampleswerenegativeforEV A71andCV A16nucleicacid PartialfragmentsofVP1weream plifiedfrom10samplesof7casesand3closecontactsbyusingsemi nestedpcr Sequenceanalysis showedthatthenucleotidehomologyofalpartialvp1was100 0% homologouswithcv A6 Conclusion TheoutbreakinakindergarteninHeyuanCityofGuangdongProvincewascausedbyenterovirusCV A6 Combiningthereal timepcrandsemi nestedpcrcanbeanefectivewayforrapiddetectionandidentifi cationofcv A6enterovirus Keywords Hand,foot,andmouthdisease; Enterovirus; Real timepcr DOI: /j scjpm 作者单位 :1 广东省疾病预防控制中心, 广东广州 ;2 中山大学公共卫生学院作者简介 : 曾汉日 (1980 ), 男, 大学本科, 主管技师, 主要从事病原微生物检测工作

2 华南预防医学 2015 年 2 月第 41 卷第 1 期 SouthChinaJPrevMed,February2015,Vol 41,No 1 17 手足口病 (Hand,foot,andmouthdisease, HFMD) 是一种常见的儿童传染性疾病,5 岁以下儿童是主要发病人群, 常在托幼机构引起聚集性疫情的发生, 临床表现以发热, 手足口腔臀部出现疱疹为主, 少数病例可出现脑炎肺水肿循环障碍等严重并发症, 部分重症患者病情进展迅速, 极易引起死亡肠道病毒 (Enterovirus,EV) 是引起手足口病的病原体, 其中肠道病毒 A71 型 (EnterovirusA71, EV A71) 和柯萨奇病毒 A16 型 (CoxsachievirusA16, CV A16) 最为常见,EV A71 可侵犯患者的中枢神经, 是重症患者和死亡患者的主要致病病原体, 而 CV A16 引起手足口病的临床症状往往较轻另外, 部分非 EV A71 非 CV A16 肠道病毒也可引起手足口病, 如肠道病毒 A 组的 CV A2 CV A4 CV A6 CV A10 CV A12 CV A14, 肠道病毒 B 组的 CV A9 CV B1 CV B5 部分 ECHO 病毒等, 其中 CV A6 较为常见 [1-6] 2013 年 5 月, 广东省河源市报告了 1 起发生于 1 所幼儿园由非 EV A71 非 CV A16 肠道病毒引起的手足口病聚集性疫情为明确引起此次手足口病疫情的肠道病毒型别, 为手足口病防控提供病原学依据, 本实验室对该幼儿园涉及此次疫情的病例和密切接触者采集病原学标本, 运用分子生物学方法进行肠道病毒型别快速鉴定与分析 1 材料和方法 1 1 基本情况 2013 年 5 月 8 日至 5 月 16 日期间, 广东省河源市 1 所幼儿园的 2 个中班共报告手足口病病例 26 例, 其中男性 15 例, 女性 11 例, 年龄 4~6 岁 25 例病例具有发热症状, 体温 >38, 并在手掌足底或口腔等部位出现红色疱疹,7 例病例具有咽痛或咳嗽症状, 没有出现重症或死亡病例 1 2 标本采集与处理标本由河源市疾病预防控制中心负责采集, 并带冰送至广东省疾病预防控制中心肠道病毒实验室共收检 26 例病例的咽拭子或粪便样本 35 份及 38 名密切接触者的粪便样本 38 份粪便样本按照世界卫生组织的脊髓灰质炎实验室手册中的方法进行处理 [7], 使用德国 Qiagen 核酸提取试剂对经过处理的标本进行病毒核酸提取, 具体操作按照试剂说明书进行 1 3 荧光定量 PCR 核酸检测运用荧光定量 PCR 方法对标本进行肠道病毒核酸检测, 检测试剂采用江苏硕世生物科技有限公司生产的单通道肠道病毒荧光定量 PCR 试剂检测原则为首先采用肠道病毒通用试剂进行总肠道病毒核酸检测, 总肠道病毒核酸阳性的标本再进行 EV A71 CV A16 和 CV A6 的分型鉴定检测 1 4 半巢式 PCR 检测与 VP1 序列测定分析运 [8] 用 Nix 等设计的半巢式 PCR(Semi nestedpcr, Sn PCR) 方法对病例及密切接触者的肠道病毒阳性标本进行肠道病毒 VP1 序列通用扩增, 通过对序列的测定与分析进行肠道病毒型别鉴定 ( 使用引物见表 1) 表 1 cdna 合成半巢式 PCR 扩增和测序引物一览表引物序列位点基因用途 AN32GTYTGCCA VP1 逆转录 AN33GAYTGCCA VP1 AN34CCRTCRTA VP1 AN35RCTYTGCCA VP1 224 GCIATGYTIGGIACICAYRT VP3 第 1 轮 PCR 222 CICCIGGIGGIAYRWACAT VP1 AN89CCAGCACTGACAGCAGYNGARAYNGG VP1 第 2 轮 PCR AN88TACTGGACCACCTGGNGGNAYRWACAT VP1 注 : 序列中的 R 为 A 或 G;Y 为 C 或 T;W 为 A 或 T;N 为 A C G 或 T;I 为次黄嘌呤 cdna 合成使用德国 QiagenRT 试剂进行逆转录反应每个反应体系为 20μL, 其中 10 RT Bufer2μL dntpmix2μl 逆转录酶 1μL 引物各 1μL RNaseH 2 O6μL 模板 RNA5μL 反应条件为 37 60min 第 1 轮 PCR 使用德国 QiagenHotstartPCR 试剂, 每个反应体系为 25μL, 其中 Premix 混合反应液 12 5μL RNaseH 2 O8μL 引物各 1μL, 逆转录产物 2 5μL 反应条件为 :95 15min;95 30s,42 30s,60 45s,40 个循环 ;60 6min 延伸,4 保存第 2 轮 PCR 使用试剂与第 1 轮相同反应条件为 :95 15min;95 30s,60 20s, 72 15s,40 个循环 ;72 6min 延伸,4 保存 VP1 序列测定及分析对第 2 轮 PCR 产物进行 1 5% 琼脂糖凝胶电泳, 把具有目的条带的 PCR 产物进行序列测定测序试剂采用美国 ABI 公司的 BigDyeterminatorv3 1CycleSequencingKit, 序列测定仪器采用 ABI3100 型全自动遗传分析仪最终获得的 VP1 序列经 DNASTAR6 0 软件拼接后上传至 NCBI 网站 (htp://www ncbi nlm nih gov/) 进行序列比对定型, 应用 Bioedit7 09 软件进行序列排列, 采用 Mega4 0 软件中的邻接法 (neighbor join ing,nj) 构建基因系统发生树, 用靴值分析法 (boot strapanalysis) 对进化树分支的可靠性进行估计, 重

3 18 复 1000 次参考序列下载自 Genbank, 系统进化树参考株的命名由 Genbank 获取号国家 ( 地区 ) 和年份 3 部分组成应用 DNASTAR 6 0 软件中 MegAlign 方法进行序列核苷酸同源性分析, 用核苷酸序列相似百分比表示, 其最大值和最小值用以预测同源性的区间 2 结果 2 1 荧光定量 PCR 核酸检测病例及其密切接触者的标本进行荧光定量 PCR 总肠道病毒核酸检测发现,26 例病例 35 份标本中共有 25 例 34 份标本检出阳性, 病例的肠道病毒阳性率达 96 15%,1 例检测阴性 ;38 名密切接触者 38 份标本中有 11 人 11 份标本检出阳性, 肠道病毒阳性率为 28 95%, 其余 27 人检测阴性对总肠道病毒核酸阳性的标本再进行 EV A71 CV A16 和 CV A63 种肠道病毒分型鉴定的检测结果显示,25 例总肠道病毒阳性病例的 34 份标本均为 CV A6 核酸阳性,11 名密切接触者的 11 份总肠道病毒阳性样本中有 7 名密切接触者的 7 份标本为 CV A6 核酸阳性,4 名密切接触者 CV A6 检测阴性 ; 全部标本的 EV A71 和 CV A16 核酸检测均为阴性具体检测结果见表 2 表 2 病例及密切接触者荧光定量 PCR 肠道病毒核酸检测情况总肠道病毒 CV A6 检测检测对象阳性数阳性率阳性数阳性率人数 ( 例 ) (%) ( 例 ) (%) 病例密切接触者合计分子分型与序列分析在 25 例总肠道病毒阳性病例中选择 25 份标本和对全部密切接触者的 11 份总肠道病毒阳性标本采用 Sn PCR 方法进行部分 VP1 序列扩增, 扩增目的序列长度为 376bp 共 7 份病例标本和 3 份密切接触者标本 VP1 序列扩增阳性, 其余 18 份病例和 8 份密切接触者标本 ( 包括 4 份肠道病毒阳性且 CV A6 阴性标本 ) 未能成功扩增经序列测定及拼接, 最终获得的 VP1 序列长度为 270bp 通过 BLAST 程序进行序列比对发现, 获得的病例和密切接触者序列与 CV A6 的 VP1 序列高度同源, 表明属于 CV A6 把获得的 CV A6VP1 序列进行基因亲缘关系分析发现, 病例及密切接触者序列之间的核苷酸同源性为 100 0%; 与 CV A6 原型株 Gdula 的核苷酸同源性为 86 1%, 与 EV A71 原型株 BrCr 和 CV A16 原型株 G10 的同源性分别为 53 1% 和 56 8%; 与中国大陆地区流行的 CV A6 比较, 与上海 CV A6 病毒株 (KC481617) 的核苷酸同源性最高, 达 98 9%, 而与福建和山东等地的病毒株 (JQ JX947704) 同源性较远, 分别为 90 5% 和 90 8%; 与其他国家或地区的 CV A6 比较, 发现与台湾和泰国的流行株 (JQ JX556446) 同源性较高, 均达 98 5%, 而与法国流行株 (HE572908) 的同源性较低, 只有 89 4% 在 Genbank 中选取国际和国内的 CV A6 代表 VP1 序列与本研究序列构建基因系统发生树发现 ( 图 1),CV A6 在系统发生树中可分为 A B C D E 等 5 个分支, 此次疫情的全部病毒株与 2010 年台湾法国,2011 年广州深圳上海,2012 年上海和泰国等地的部分流行株处于 E 分支 ;2008 年芬兰, 2010 年法国,2011 年日本和 2012 年深圳等地的部分流行株处于 D 分支 ;2008 年西班牙和英格兰的流行株同属于 C 分支 ; 年中国大陆部分省份和 2010 年法国的部分流行株则分布于 B 分支 ; Gdula 原型株则单独处于 A 分支 3 讨论手足口病是一种全球性传染病, 在大部分国家或地区均存在流行早期病原体以 CV A16 为主 [9],1972 年 EV A71 被确认也与手足口病有关 [10], 此后四十几年来,CV A16 和 EV A71 感染交替出现, 成为手足口病的 2 个主要致病病原体然而, 近几年来, 多个国家或地区相继报道了非 EV A71 非 CV A16 肠道病毒引起的手足口病疫情, 如 2008 年芬兰 [2] 2010 年法国和台湾 [3-4] 2011 年日本 [5] 2012 年泰国等均有报道 CV A6 和 ( 或 ) CV A10 引起的地区性或全国性手足口病流行 [6] 年我国部分省 ( 市 ) 在手足口病病原体监测中也从病例中检出一定比例的 CV A6 CV A10 和 ECHO 等肠道病毒 [11] 因此, 非 EV A71 非 CV A16 肠道病毒导致的手足口病引起了世界各国的广泛关注广东省是手足口病的高发地区, 自 2008 年手足口病纳入国家丙类传染病管理以来, 报告病例数一直位居全国前列监测数据显示,2008 年起广东省手足口病病原体以 EV A71 和 CV A16 为主 [12-15], 然而,2012 年 9 月份起出现了病原转换, 主要由非 EV A71 非 CV A16 肠道病毒引起 [16] 因此, 引起

4 华南预防医学２０５年２月第４卷第期ＳｏｕｔｈｃｈｉｎａｊｐｒｅｖｍｅｄＦｅｂｒｕａｒｙ２０５Ｖｏｌ４Ｎｏ９注表示手足口病病例表示病例密切接触者图基于部分ＶＰ序列２７０ｂｐ构建的ＣＶＡ６病毒基因系统发生树手足口病的非ＥＶＡ７非ＣＶＡ６肠道病毒的型别ＣＶＡ６阳性３８名密切接触者中有人的份标鉴定越来越重要本研究对广东省河源市起发生本肠道病毒阳性其中７人检测为ＣＶＡ６阳性４人Ａ７非ＣＶＡ６肠道病毒引起的于幼儿园由非ＥＶＣＶＡ６阴性全部病例和密切接触者均排除了ＥＶ手足口病聚集性疫情进行了快速肠道病毒型别鉴Ａ７和ＣＶＡ６的感染同时还选取病例和密切２６例病例的３５份标本定荧光定量ＰＣＲ结果显示接触者总肠道病毒阳性标本各２５份和份采用中共有２５例的３４份标本肠道病毒阳性且均为ＳｎＰＣＲ方法进行肠道病毒ＶＰ序列通用扩增共７

5 20 份病例标本和 3 份密切接触者标本扩增阳性, 其余的 26 份病例和密切接触者标本未能成功扩增, 可能与标本的病毒滴度较低有关在 Genbank 上进行 BLAST 序列比对发现, 获取的 VP1 序列均与 CV A6 参考序列的同源性最高, 表明属于肠道病毒 CV A6 型以上结果表明,CV A6 是引起此次幼儿园手足口病聚集性疫情的病原体对本研究获取的 CV A6VP1 序列进行亲缘关系分析发现, 病例与密切接触者的序列 100 0% 同源, 由此表明引起此次聚集性疫情的 CV A6 有着共同起源, 可能由同 1 株 CV A6 病毒的传播引起本研究从 Genbank 中下载国内外的 CV A6VP1 序列进行亲缘关系分析及构建基因系统发生树发现, CV A6 在基因系统发生树中存在 5 个分支, 本次疫情的病原体 CV A6 与 2012 年上海病毒株 (KC481617) 处于 E 分支, 二者核苷酸同源性高达 98 9%, 表明本次疫情株与上海株有较近的亲缘关系国内的福建山东重庆和河南等地流行的病毒株处于 B 分支, 深圳 2012 年流行的 CV A6 病毒株则处于 D 分支, 以上提示中国大陆地区的 CV A6 流行株基因分化较高, 可能存在多条不同基因型的传播链同样, 多个国家 ( 地区 ) 流行 CV A6 病毒株在基因系统发生树中处于不同的分支中, 表明 CV A6 在国际间流行同样可能存在着多条不同基因传播链肠道病毒常规的实验室诊断方法有病毒分离培养抗体中和检测免疫组织化学法等这些方法费时费力, 常常无法满足疾病流行期间对大量标本的快速检测而分子生物学方法克服了以上方法的缺陷, 为肠道病毒的快速检测提供了条件 Sn PCR 方法是一种能扩增全部型别肠道病毒 VP1 序列的通用方法, 具有较高的特异度和灵敏度 [8] 本研究运用 Sn PCR 方法成功地对总肠道病毒阳性标本进行肠道病毒 VP1 序列扩增, 通过序列测定达到肠道病毒分型鉴定的目的另本研究还结合荧光定量 PCR 方法对所有标本进行肠道病毒分型鉴定检测, 提高了标本的肠道病毒检出率因此,Sn PCR 扩增肠道病毒 VP1 序列与荧光定量 PCR 相结合的方法有利于对引起手足口病的非 EV A71 非 CV A16 肠道病毒的快速准确分型鉴定 ( 志谢 : 感谢河源市疾病预防控制中心工作人员的大力支持 ) 参考文献 : [1] AngLW,KohBK,ChanKPetal.Epidemiologyandcontrolof hand,footandmouthdiseaseinsingapore, [j]. AnnAcadMed,2009,38(2): [2] OsterbackR,VuorinenT,LinnaMetal.CoxsackievirusA6and hand,foot,andmouthdisease,finland[j].emerginfectdis, 2009,15(9): [3] MirandA,HenquelC,ArchimbaudC,etal.Outbreakofhand, footandmouthdisease/herpanginaasociatedwithcoxsackievirus A6andA10infectionsin2010,France:alargecitywide,prospec tiveobservationalstudy[j].clinmicrobiolandinfect,2012,18 (5):E110-E118. [4] WeiSH,HuangYP,LiuMCetal.Anoutbreakofcoxsackievirus A6hand,foot,andmouthdiseaseasociatedwithonychomadesis intaiwan,2010[j].bmcinfectdis,2011,11:346. [5] FujimotoT,IizukaS,EnomotoM,etal.Hand,foot,andmouth diseasecausedbycoxsackievirusa6,japan,2011[j].emerg InfectDis,2012,18(2): [6] PuenpaJ,ChieochansinT,LinsuwanonP,etal.Hand,foot, andmouthdiseasecausedbycoxsackievirusa6,thailand,2012 [J].EmergInfectDis,2013,19(4): [7] 世界卫生组织. 脊髓灰质炎实验手册 [M].4 版. 北京 : 中国疾病预防控制中心,2004: [8] NixWA,ObersteMS,PalanchMA.Sensitive,seminestedPCR amplificationofvp1sequencesfordirectidentificationofalen terovirusserotypesfromoriginalspecimens[j].jclinmicrobiol, 2006,44(8): [9] RobinsonCR,DoancFW,RhodesAJ.Reportofanoutbreakof febrileilneswithpharyngeallesionandexanthen:toronto,1957 isolationofgroupa Coxsackievirus[J].CanadMedAsocJ, 1958,79(3): [10] SchmidtNJ,LenneteEH,HoHH.Anapparentlynewenterovir usisolatedfrompatientswithdiseaseofthecentralnervoussyst carl[j].jinfectdis,1974,129(3): [11] LuQB,ZhangXA,WoY,etal.CirculationofCoxsackievirus A10andA6inhand foot mouthdiseaseinchina, [J].PLoSOne,2012,7(12):e [12] GuanD,vanderSandenS,ZengH,etal.Populationdynamics andgeneticdiversityofc4strainsofhumanenterovirus71inma inlandchina, [j].jplosone,2012,7(9): e [13] 曾汉日, 柳正, 黎薇, 等.2009 年广东省肠道病毒 71 型 VP1 区全序列分析 [J]. 华南预防医学,2010,36(6): [14] 肖红, 管大伟, 曾汉日, 等年广东手足口病非 CA16 非 EV71 肠道病毒株的鉴定及其 VP1 基因分型研究 [J]. 中华微生物学和免疫学杂志,2011,31(9): [15] DeW,ChangwenK,WeiL,etal.Alargeoutbreakofhand, foot,andmouthdiseasecausedbyev71andcav16inguang dong,china,2009[j].archvirol,2011,156(6): [16] LuJ,ZengH,ZhengH,etal.Hand,footandmouthdiseasein Guangdong,China,in2013:newtrendsinthecontinuingepidem ic[j/ol].[ ].htp:// pubmed/?term=hand%2c+foot+and+mouth+disease+in +Guangdong%2CChina%2Cin+2013%3A+new+trends+in +the+continuing+epidemic. ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 袁华晖, 江金女 )

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福建农业学报材料与方法毒株主要仪器主要试剂引物设计的培养反应条件的建立荧光定量检测临床样本结果与分析福建农业学报林甦朱春华陈珍刘斌琼施少华江斌蔡国漳林羽黄瑜甦男硕士助理研究员主要从事病毒学和动物传染病学研究福建农业学报材料与方法毒株主要仪器主要试剂引物设计的培养反应条件的建立荧光定量检测临床样本结果与分析林甦等鸡亚型白血病病毒荧光定量检测方法的建立福建农业学报讨论林甦等鸡亚型白血病病毒荧光定量检测方法的建立责任编辑