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1 中国热带医学 年第 卷第 期 China Tropical Medicine,February,Vol.,No. 论著 东莞市 年柯萨奇病毒 A 型流行情况及特征分析 * 李艳芬, 黄勇, 张莉萍, 陈永迪, 曾汉日. 东莞市疾病预防控制中心微检所, 广东东莞 ;. 广东省疾病预防控制中心微检所, 广东广州 000 摘要 : 目的 征 方法 研究东莞市 年手足口病 (HFMD) 病例中柯萨奇病毒 A 型 (CVA) 的流行情况及基因特 采用 RT-PCR 方法对 HFMD 疑似病例标本进行检测,CVA 阳性标本上送广东省疾病预防控制中心, 进行病 毒分离及鉴定, 扩增并测定 VP 基因序列 从 GenBank 中选取其他 CVA 代表株进行参考比对, 利用 DNASTAR 软件进 行核苷酸 氨基酸序列分析和同源性比较, 并用 Mega.0. 软件构建亲缘性进化树 结果 在 份标本中检出 CVA 阳性标本 0 份, 阳性率为 0.%(0/ ) 序列比对显示, 株 CVA 分离株 VP 基因之间核苷酸同源性为.%~%, 氨基酸同源性为 %~% 东莞市 CVA 分离株 VP 与近年来全球各地流行株核苷酸和氨基酸 的同源性分别为.%~.% 和 %~%, 与 CVA 原型株 Gdula 以及我国山东省 年分离株核苷酸和氨基酸 相似性仅为.%~.% 和.%~% 系统进化树分析显示, 年东莞地区 CVA 与近年来流行于世界 各地的 CVA 分离株同源性较高, 而与原型株进化距离较远 结论 年东莞市 HFMD 病原以 CVA 为主, 流行株为近年来流行于全国各地的 CVA 新变种 关键词 : 手足口病 ; 柯萨奇病毒 A 型 (CVA); 进化分析 中图分类号 :R. 文献标识码 :A 文章编号 :00-()0--0 DOI:0.0/j.cnki.-0/r..0.0 Prevalence and genetic characteristics of coxsackie virus A in Dongguan, - LI Yanfen, HUANG Yong, ZHANG Liping, CHEN Yongdi, ZENG Hanri Laboratory Department of Dongguan Municipal Center for Disease Control and Prevention, Dongguan, Abstract: Objective City from to. Methods Guangdong, China Corresponding author: LI Yanfen, wsunfen@.com To study the prevalence and genetic characteristics of coxsackievirus A (CVA) in Dongguan The specimens of hand foot and mouth disease (HFMD) cases were detected by the real time RT-PCR method. The entire VP genes of CVA strains were amplified by RT-PCR and then sequenced, which were finished by Guangdong CDC. The phylogenetic analysis between the strains isolated and those downloaded from GeneBank was done by using the software DNASTAR and MEGA.0.. Results Totally 0 out of samples were CVA positive, and the positive rate was 0.% (0/ ). The homogeneity of CVA strains shared.%- % in nucleotide and %-% in amino acid identity. Compared with the new variant of CVA circulating in many places around the world recently, the nucleotide sequences had.%-.% similarity and the amino acid sequence deduced had %- % similarity. Compared with Gdula and the strains isolated from the epidemic in Shandong Province, China in, the nucleotide and amino acid sequence similarity were.%-.% and.%- % respectively. The analysis of phylogenetic tree showed that CVA of Dongguan area from to had high homology with CVA isolates in recent years, and was far from the evolution of the prototype plant. Conclusion common HFMD in Dongguan City is the new variant of CAV. Key words: hand foot and mouth disease (HFMD); coxsackievirus A (CVA); phyletic evolution From to, the main aetiological agent of 手足口病 (hand foot and mouth disease,hfmd) 是一种以发热和手 足 口腔等部位皮疹或疱疹为主要特征的小儿急性传染病 目前, 多数省份的手足口监测方案中都把手足口病病原分布特征和优势病原体 [-] 变化趋势作为一项监测目的 多种肠道病毒可引起 HFMD, 以往多数省份都是重点关注肠道病毒 型 (Enterovirus,EV) 和柯萨奇病毒 A 型 (Coxsackie virus A,CVA) 的情况变化, 对于其他 的人肠道病毒的研究分析不多 近几年, 非 EV 非 CA 肠道病毒引起的手足口病疫情在多个国家和地 区相继报道, 其中以柯萨奇病毒 A 型 (Coxsackie [- ] [] virus A, CVA) 为主 曾汉日等的研究表明在 年 CVA 出现了暴发流行, 取代 EV 和 CVA 成为引起广东省手足口病的优势肠道病毒型别 自 年以来, 东莞市手足口病病原结构变化明显, 手 足口病 EV 和 CA 比例显著降低, 其他肠道病毒构 作者简介 : 李艳芬 ( ), 女, 硕士, 主管技师, 研究方向 : 微生物检验 * 通信作者 : 李艳芬, wsunfen@.com

2 中国热带医学 年第 卷第 期 China Tropical Medicine,February,Vol.,No. 成比快速增长, 在这种背景下, 有必要对东莞市其他肠道病毒引起的手足口病的病原谱构成有一个新的认识 本研究选取 年非 EV 和非 CA 的其他肠道病毒核酸阳性标本进行 CVA 的分型, 对 CVA 阳性者, 扩增其 VP 基因并测序后进行进化分析, 以了解 CVA 在本地区的流行情况及其基因特征 材料与方法. 标本采集所有标本来源于东莞市手足口病监测哨点医院每月的监测送样 年共收集 HFMD 病例粪便 / 肛拭子样本 0 份, 所有标本均 冷链运输至本实验室,- 保存备用, 进行病原学检测. 病毒 RNA 提取试剂和仪器采用病毒核酸提取试剂盒 ( 西安天隆科技股份有限公司 ) 进行病毒 RNA 提取, 按照试剂说明书进行操作 主要仪器为天隆核酸自动提取仪. 肠道病毒的分子鉴定采用实时荧光定量 PCR 方法进行肠道病毒分型, 所用试剂盒为江苏硕世生物科技有限公司生产的肠道病毒通用型 柯萨奇病毒 A 和肠道病毒 型核酸检测试剂盒 之后对非 EV 非 CVA 的肠道病毒阳性标本, 采用柯萨奇病毒 A 型和 A0 型核酸检测试剂盒 ( 江苏硕世生物科技有限公司 ) 进一步分型 主要仪器为 ABI 00 荧光 PCR 仪. 病毒分离 鉴定以及 VP 区基因扩增及基因测序荧光定量 PCR 结果为 CVA 的阳性标本上送至广东省疾病预防控制中心, 进一步做病毒分离培养和毒株鉴定 随机挑取 株分离毒株进行 VP 区的基因扩增, 并对扩增产物进行序列测定 此项实验由广东省疾病预防控制中心完成. 序列比对与进化分析测序结果应用 DNASTAR 软件进行分析比较, 从 GenBank 下载 CVA 基因型参考毒株, 用 Mega.0. 构建系统进化树 选取的代表株为 AF0(Gdula/USA) AB (Japan) HE(France0) JQ (ShanDong) JQ0(Taiwan0) JX(ShenZhen0) JX (ShenZhen) KC (ShangHai ) KC0(GuangZhou) KF(Shen Zhen) KJ(ShangHai) KJ0 (HeNan ) KP(ZheJiang) KP (Zhe Jiang) KR(GuangZhou) 结果. HFMD 病毒核酸检测结果 共收集监测标本 0 份, 共检出肠道病毒阳性 (EV) 份, 阳性率为.%( / 0), 其中 EV 型阳性 份,CVA 型阳性 份,CVA 型阳性 0 份, CVA0 型阳性 0 份 分型结果见表 表 年东莞市 HFMD 病原型别构成 Table Etiology distribution of HFMD cases in Dongguan, 肠道病毒血清型别 Type EV CVA CVA CVA0 未分型 Others 合计 Total. CVA VP 序列进化分析从 CVA 阳性样本 中分离到 株 CVA 毒株, 并对其进行 VP 区域的扩 增, 经测序和拼接后获得的序列长度均为 bp, 可 编码 0 个氨基酸. VP 基因的序列同源性和系统进化分析 株 CVA 分离株 VP 基因之间核苷酸同源性为.%~ %, 氨基酸同源性为 %~%, 结果见表 结果显示, 号和 号毒株的核苷酸和氨基酸同源 性为 00%, 可视为同一株毒株, 号 号和 号 ;0 和 号 ; 和 号也是如此 株分离株与 GeneBank 中 CVA 原型株 Gdula (AF0) 以及其他参考序列进行比对, 其核苷酸 和氨基酸同源性比对结果见表 核苷酸分析结果 显示, 株东莞市 CVA 流行株与近年来全球各地流 行株核苷酸和氨基酸的同源性分别为.%~.% 和 %~%, 但与分离于 年的 CVA 原型株 以及我国山东省 年分离株 (JQ) 相似性较 低, 相似性仅在.%~.% 和.%~% 将 株 CVA 分离株 VP 区全基因序列与 GenBank 中的原型株及其他参考序列进行遗传进化 分析, 采用 Neighbor-Joining 法构建系统进化树 ( 图 ) 分析显示, 株 CVA 分离株处于同一分支, 其 中 -CVA-,-CVA-,-CVA- 和 -CVA- 这 株 年流行株与 年浙江株 (KP, KP) 亲缘关系比较近, 其他 株 年流行株和 株 流行株 年的深圳株 (KF) 0 年中国台湾株 (JQ0) 的亲缘关系最近 株东莞流行 株 年日本株 (AB), 年山东株 (JQ) 和原型株 (AF0) 处于不同分支, 亲 缘关系较远 - 数量 Case 0 0 比例 Proportion/%

3 中国热带医学 年第 卷第 期 China Tropical Medicine,February,Vol.,No. Table 序列 No. 0 表 东莞市 年 CVA 分离株之间 VP 基因核苷酸和氨基酸序列同源性分析 /% Homology comparison of nucleotide sequence and amino acid sequence among CVA strains based on VP regions in Dongguan City, - /% 注 Note:. -CVA-;. -CVA-0;. -CVA-;. -CVA-;. -CVA-;. -CVA-;. - CVA- ;. - CVA- ;. - CVA- ;0. - CVA- ;. - CVA- ;. - CVA- ;.- CVA- 0;. -CVA-;.-CVA-;.-CVA-0;.-CVA-;.-CVA-000;. -CVA-;.-CVA- 以上为样本间的核苷酸序列同源性 ; 以下为样本间的氨基酸序列同源性 Above were comparisons of nucleotide sequence, those below were comparisons of amino acid sequence 样本 Sample 0 Table 表 株 CVA 分离株与参考序列 VP 核苷酸和氨基酸序列的相似性 /% AF0././..0/..0/../././././../../..0/../../..0/../..0/../.././ Similarity of sequences of VP nucleotide and amino acid of strains of CVA /% AB./ /./././././././././ /././ /./ / /././ HE./././././././././.0/.0/./././././././././ JQ./../../../../../../../../.0/..0/../.0/../.././.././../../ JQ0././././././././././././././././././././ JX./ /./././././././././././ /././././././ JX./ /././././ /./ /././ /././ /./ /././ /

4 中国热带医学 年第 卷第 期 续表 China Tropical Medicine,February,Vol.,No. 样本 Sample 0 KC././././ / / / /./././.0/././.0/./.0/ /./ / KC0././././ / / / /./././ /././ /./ /./ /./ KF./ /./././././././ / / / /./ / / /./././ KJ././.0/.0/./././././././././ /./.0/././ /./ KJ0././././ / /./ /././././ /././ /././././ KP /./././././././ /./././.0/ /./././ /./ / KP././././ / / / /./ / /././ /./././ /././ KR /./././ / / / /./.0/.0/./././././././././ 注 Note:. -CVA-;. -CVA-0;. -CVA-;. -CVA-;. -CVA-;. -CVA-;. - CVA- ;. - CVA- ;. - CVA- ;0. - CVA- ;. - CVA- ;. - CVA- ;.- CVA- 0;. -CVA-;.-CVA-;.-CVA-0;.-CVA-;.-CVA-000;. -CVA-;.-CVA- / 左侧数据为核苷酸序列同源性 ; / 右侧数据为氨基酸序列同源性 Data on the left of / were comparisons of nucleotide sequence, those on the right were comparisons of amino acid sequence. Fig. 图 CVA 分离株 VP 区基因进化关系树 Phylogenetic tree of VP nucleotide acids of CVA strains 讨论 HFMD 是婴幼儿时期常见的肠道病毒传染病 手足口病的病原谱构成较为复杂 [], 历史上, 手足口病 主要病原体为肠道病毒 型 (EV) 和柯萨奇病毒 A 型 (CVA) 近年来,CVA 引起的手足口病暴 发和流行在很多国家和地区陆续报道 [-,0-] 0 [] 年, 芬兰的 HFMD 暴发由 CVA 引起, 主要表现为脱 [] [] 甲症 0 年中国台湾和日本 HFMD 暴发的主要 [] 病原体也是 CVA 在国内, 陈炜等报道, 年福建省手足口病病原谱发生较大变化,CVA [] 成为该省手足口病的主要病原体之一 何雅清等 对深圳市 HFMD 病原学监测结果显示, 虽然 EV 仍 然是这一地区的主要病原 (0%), 但从 0 年,CVA 已经代替 CVA 成为引起深圳市 HFMD 的 第二大病原体 广东地区监测数据发现,0 年广东地区引起手足口病的病原体以 EV 和 CVA 为主, 然而 年 CVA 取代 EV 和 CVA 成为了 优势病原体 [-] 因此, 有必要对 CVA 的流行情况 作进一步的研究 本文的监测结果显示,CVA 已经 成为本地区手足口病的重要病原 CVA 基因序列的系统进化树显示, 年东莞市流行的 CVA 病毒株序列同源性较高,

5 中国热带医学 年第 卷第 期 China Tropical Medicine,February,Vol.,No. 年与 年的分离株在进化树上位于同一分支, 表明本地区的 CVA 病毒来源较为单一, 变异很小 株东莞地区流行株与近年来全球各地毒株也高度同源, 表明 CVA 在全球流行的同时, 变异比较小 但是, 由于我市近年来流行的 CVA 毒株与原型株和 年山东株的同源性比较低, 可以认为随着时间的推移,CVA 病毒在流行过程中逐渐形成新变种 东莞市 年手足口病病原谱结果显示, 引起手足口病的主要病原体为 CVA,CVA 次之,EV 第三 鉴于我国 HFMD 监测网络中非 EV 和非 CVA 肠道病毒比例的上升, 以及国内 国外均有 CVA 暴发流行的报道, 应尽快加强对手足口病病原体 CVA 型的监测和研究, 为今后 HFMD 疫苗研发, 病原监测提供更充足的依据 参考文献 [ ] 王连森, 毕振强, 房玉英, 等. 0 年山东省手足口病流行病学分析 [J]. 山东医药, 0, (): -. [ ] 韩剑峰, 安康, 刘洪, 等. 河南新乡 0 年手足口病病原分离鉴定及病毒基因组特征 [J]. 军事医学科学院院刊, 0, (): -. [ ] 杨晓华, 李克伟, 张广武, 等. 洛阳市非 EV 非 CA 肠道病毒中优势毒株状况分析 [J]. 重庆医学,, (): -. [ ] MONTES M, ARTIEDA J, GASTESI M, et al. Hand, foot and mouth disease outbreak and coxsackievirus A, Northern Spain, [J]. Emerg Infect Dis,, ():-. [ ] FUJIMOTO T, IIZUKA S, ENOMOTO M. et al. Hand, foot, and mouth disease caused by coxsackie virus A, Japan, [J].Emerg Infect Dis,, ():-. [ ] ANG L W, KOH B K, CHAN K P, et al. Epidemiology and control of hand, foot and mouth disease in Singapore, 0-0[J]. Ann Acad Med Singap, 0, (): 0-. [ ] PUENPA J, CHIEOCHANSIN T, LINSUWANON P, et al. Hand, foot, and mouth disease caused by coxsackievirus A, Thailand, [J]. Emerging Infect Dis,, (): -. [ ] 曾汉日, 陆靖, 郑焕英, 等. 中国广东省 株柯萨奇病毒 A 型分离株全基因组特征分析 [J]. 病毒学报,, (): -. [ ] 王琦, 王子军. 0 年中国手足口病流行特征分析 [J]. 疾病监测, 0, (): -. [ 0 ] 谢国良, 崔大伟, 郑书发, 等. ~ 年杭州地区手足口病柯萨奇病毒 A 型和 A0 型 VP 基因特征分析 [J]. 临床检验杂志,, (): -. [ ] 寸建萍, 田子颖, 徐闻, 等. 云南省 年柯萨奇病毒 A 型基因特征分析 [J]. 中国病毒病杂志,, ():-. [ ] 伍仕敏, 项杰, 周虹, 等. ~ 年武汉地区柯萨奇病毒 A 型 VP 基因的遗传进化分析 [J]. 临床检验杂志,, (): -. [ ] BLOMQVIST S, KLEMOLA P, KAIJALAINEN S, et al. Cocirculation of coxsackieviruses A and A0 in hand, foot and mouth disease outbreak in Finland[J]. J Clin Virol, 0, (): -. [ ] WEI S H, HUANG Y P, LIU M C, et al. An outbreak of coxsackievirus A hand, foot, and mouth disease associated with onychomadesis intaiwan, 0[J]. BMC Infect Dis, (): -. [ ] 陈炜, 翁育伟, 何文祥, 等. ~ 年福建省手足口病相关病原柯萨奇病毒 A 组 型的分子流行病学研究 [J]. 病毒学报,, 0(): -. [ ] HE Y Q, CHEN L, XU WB, et al. Emergence, circulation, and spatiotemporal phylogenetic analysis of coxsackievirus a- and coxsackievirus a0- associated hand, foot, and mouth disease infections from 0 to in Shenzhen, China[J]. J Clin Microbiol,, (): 0-. [ ] LU J, ZENG H, ZHENG H, et al. Hand, foot and mouth disease in Guangdong, China, in : new trends in the continuing epidemic [J]. Clin Microbiol Infect,, (): O-O. [ ] 曾汉日, 陆靖, 李晖, 等. 广东省 0- 年柯萨奇 A 型肠道病毒的流行及其基因特征分析 [J]. 中华微生物学和免疫学杂志, (0):-. 收稿日期 :-0- 编辑 : 谢永慧

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