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1 716 中国人兽共患病学报 ChineseJournalofZoonoses 2018,34 (8) DOI: /j.issn 实验研究 2013 年贵州省急性弛缓性麻痹病例中非脊髓灰质炎肠道病毒的鉴定分析 王宇, 任刚, 王寅寅, 苏飞, 唐小敏, 叶绪芳 摘要 : 目的研究 2013 年贵州省急性弛缓性麻痹 (acuteflaccidparalysis,afp) 病例中非脊髓灰质炎肠道病毒 (nong polioenterovirus,npev) 的基因型别, 并对分离的柯萨奇病毒 A4 型 (coxsackievirus,cva4) 进行基因特征分析. 方法 2013 年贵州省共报告 15 岁以下 AFP 病例 235 例, 采用 RD 细胞和 L20B 细胞对 235 例 AFP 病例粪便标本进行病毒分离, 对分离到的 NPEV 进行 VP1 基因序列测定分型. 通过 MEGA7.0 软件采用邻位相接法 (neighborjoiningmethod) 构建遗传进化树进行基因特征分析, 可靠性通过 1000bootstrap 值评估. 结果 235 例 AFP 病例中共检测到 24 株 NPEV(10.2%), 有 2 株无法定型, 另外 22 株共包括 12 个血清型, 其中人类肠道病毒 (humanenterovirus,hev)a 组包括 4 个血清型 6 株, 其中 3 株为 CVA4, 均属于 C2 基因亚型 ;HEVGB 组包括 7 个血清型 15 株,1 株为 HEVGC 组, 未分离到 HEVGD 组病毒. 结论 2013 年贵州省 AFP 病例病原谱包括多种型别的 NPEV, 其中 CVA4 基因特征分析表明 2013 年贵州地区流行的 CVA4 毒株为 C2 基因亚型. 关键词 : 急性弛缓性麻痹 ; 非脊髓灰质炎肠道病毒 ; 基因特征中图分类号 :R373.2 文献标识码 :A 文章编号 : (2018) IdentificationandgeneticcharacteristicsofnonGpolioenterovirusesisolated fromacuteflaccidparalysiscasesinguizhouprovinceofchina,2013 WANG Yu,REN Gang,WANG YinGyin,SU Fei,TANG XiaoGmin,YEXuGfang (GuizhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Guiyang550004,China) Abstract:TostudythegenotypeofnonGpolioenterovirus (NPEV)isolatesfrom acuteflaccidparalysis (AFP)casesin GuizhouProvinceofChinain2013andtoanalyzethegeneticcharacteristicsofcoxsackievirusA4 (CVA4)strains,atotalof 235casesunder15yearsoldwithAFPwerereportedofGuizhouProvinceofChina.Humanrhabdomyosarcoma(RD)celsand L20Bcelswereusedforvirusisolation.TheserotypesofisolatedNPEVstrainswereidentifiedbyVP1sequencing,phylogeG netictreewasconstructedbymega7.0softwareforgeneticcharacterizationbasedonneighborjoiningalgorithmandthereliag bilityofthephylogenetictreeswasdeterminedbybootstrapanalysiswith1000pseudoreplicatedatasets.theresultsshowed that24npevstrainswereisolatesfrom235afpcases,including2strainsungtyped.amongthe22strains,atotalof12serog typeswereidentified,6strainsbelongedtohumanenterovires(hev)avirusesincluding4serotypes,3strainswascva4 andbelongedtothec2subgenotype.atotalof15strainsbelongedto HEVGBvirusesincluding7serotypesandtheother1 strainsbelongedtohevgcgroup.nonpevstrainofhevgdgroupwasdetected.in2013,thepathogenspectrumofafpcag sesincludedseveralserotypesofhevandthegeneticcharacteristicsshowedthatcva4strainsofc2subgenotypewerethe predominantgenotypeinguizhouprovince. Keywords:acuteflaccidparalysis;nonGpolioenterovirus;geneticcharacteristics SupportedbytheGuizhouHealthandFamilyCommissionScienceFoundation (No.gzwjk2016G1G054) Correspondingauthor:YeXuGfang, @qq.com 贵州省卫生计生委科学基金项目 (No.gzwjk2016G1G054) 资助 通讯作者 : 叶绪芳, @qq.com 作者单位 : 贵州省疾病预防控制中心, 贵阳 人类肠道病毒 (huamnenteroviruses,hevs) 属于小 RNA 病毒科肠道病毒属的成员,HEVs 是 人类普遍的致病病毒之一, 目前根据病毒株的基因

2 8 期王宇等 :2013 年贵州省急性弛缓性麻痹病例中非脊髓灰质炎肠道病毒的鉴定分析 717 特征及生物学遗传特性分析已知肠道病毒超过 100 多种型别, 并可分成肠道病毒 A B C 和 D4 组 [1G2]. 肠道病毒主要包括脊髓灰质炎病毒 (poliovirus, PV) 柯萨奇病毒 (coxsackievirus,cv) 埃可病毒 (echovirus,echo) 以及新型肠道病毒 (newereng teroviruses),hevs 的主要传染源为病人或无症状 带毒者, 其可引起多种疾病, 特别是引起儿童的疱疹 性咽峡炎 手足口病 急性出血性结膜炎 心肌炎和 神经系统疾病等亦成为严重的公共卫生问题 [3]. 急性弛缓性麻痹 (Acute Flaccid Paralysis, AFP) 系统监测对象主要针对 15 岁以下儿童出现急 性弛缓性麻痹症状的病例, 是全球消除脊髓灰质炎 ( 脊灰 ) 和维持无脊灰状态的重要工作组成, 但伴随 着全球野脊灰病毒的逐渐消灭由非脊灰肠道病毒 (nongpolioenterovirus,npev) 引起的麻痹病例引 起人们重视.1999 年 Oberste 等提出了基于肠 道病毒 VP1 区序列的分子生物学定型方法, 加速了 对非脊灰肠道病毒分型及基因特征的研究工作. 贵 州省自 1994 年后未发现本土脊灰野病毒病例 [5], 但 每年都会在 AFP 病例的粪便标本中分离到大量的 NPEV, 为了解贵州地区 NPEV 毒株的血清型别特 征, 依据 VP1 区基因定型原理, 本研究对 2013 年从 贵州省 AFP 病例粪便标本中分离到 NPEV 进行了 回顾性检测分析, 并分析 CVA4 的 VP1 基因特征, 为今后对 NPEV 所致相关疾病的防控提供科学依据. 1 材料与方法 1.1 标本与资料来源肠道病毒分离物来源于贵 州省 2013 年 AFP 病例监测系统报告的 AFP 病例 的粪便标本, 粪便标本由各县区疾病预防控制中心 采集, 冷藏运送至省级脊灰实验室. 粪便标本均按 [6] 照 WHO«脊髓灰质炎实验室手册» 第四版的方法 用 RD( 人横纹肌肉瘤细胞 ) L20B( 转人脊灰病毒 受体的小鼠肺细胞 ) 细胞进行培养及病毒分离, 收集 盲传两代后 RD 细胞病变而 L20B 不变的阳性分离 物判定为非脊灰肠道病毒 (NPEV), 将毒株置于 -20 保存. 本研究所用的肠道病毒各基因型代 表株的 VP1 基因序列均来源于美国国家生物技术 信息中心网站 (NCBI). 1.2 病毒 RNA 提取采用德国 QIAGEN 公司的 QIAampViralRNA MiniKit 试剂盒, 根据试剂盒 的操作说明从病毒分离物中提取病毒 RNA. 向每 管病毒 RNA 中加入 1μLRNA 酶抑制剂后 -80 保存备用. 1.3 VP1 区 RTGPCR 及核苷酸序列测定采用一 步法 AccessQuick TM RTGPCR System 试剂盒 ( 美 国 Promega 公司产品 ) 进行 (reversetranscriptpolg ymerasechainreaction,rtgpcr) 扩增 NPEV 毒株 VP1 基因.cDNA 合成 RTGPCR 反应及测序中所 [4,7] 用引物参照 Oberste 等的方法进行,PCR 反应 体系 :2 反应缓冲液 25μL,AMV 酶混合物 1μL, 上下游引物各 1μL, 模板 RNA5μL, 补足无 RNA 酶水至总体积 50μL. 反应条件为 45 30min,94 2min,94 30s,55 30s,72 60s,35 个循 环后 72 延伸 10 min.pcr 产物行 1.5% 琼脂糖 凝胶电泳鉴定, 对阳性 PCR 产物进行切胶回收后测 序分析. 1.4 基因序列分析和系统进化树构建采用 SeG quencher 软件对 VP1 区核苷酸进行拼接整理, 通过肠道病毒分子定型数据库 EnterovirusGenotyping ToolVersion0.1 对序列定型分析 ; 从 GenBank 数 据库中下载肠道病毒各基因型参考毒株 VP1 区序 列, 利用 MEGA7.0 软件通过邻位相接法 (neighbor joiningmethod,nj) 构建系统进化树, 可靠性通过 1000bootstrap 值评估. 2 结果 2.1 病毒分离与鉴定 2013 年共采集 235 例 AFP 病例粪便标本, 共分离到 25 株肠道病毒, 其中 NPEV 为 24 株, 分离率约为 10.2%(24/235). 另外 1 株为 PV 病毒并送国家脊灰实验室进行型内鉴定 为 PVⅡ 型疫苗株, 未发现脊灰野病毒. 2.2 NPEV 的测序及分子定型通过 RTGPCR 对 NPEV 毒株进行扩增定型, 结果见图 1. 根据 OberG ste 等提出的基于肠道病毒 VP1 区核苷酸同源性 大于 75% 对病毒株进行型别鉴定, 本研究 24 株 NPEV 毒株中, 有 2 株无法扩增定型, 另外 22 株共 包括 12 个血清型, 其中人类肠道病毒 A 组包括 4 个血清型 6 株, 其中 3 株为 CVA4,15 株人类肠道 病毒 B 组包括 7 个血清型,1 株 CVA21 为人类肠道 病毒 C 组, 未分离到人类肠道病毒 D 组病毒. 各分 离株与其对应原型株的核苷酸 (nucleotide,nt) 一致 性在 75.5% ~86.8% 之间 氨基酸 (aminoacid,aa) 一致性在 88.0%~96.7% 之间. 本次分离的 NPEV 毒株编号 病毒型别 与对应原型株毒株之间的 nt 和 aa 一致性性见表 1.

3 718 中国人兽共患病学报 2018,34(8) 2.3 系统进化树分析通过 GenBank 下载已鉴定到的肠道病毒各血清型原型株,22 株 NPEV 贵州分离株与对应原型株之间的亲源关系见图 2, 相同型别的分离株与对应的原型株聚集在一起, 但 ECHG O7 贵州株与其原型株之间进化相对较远. M:DNA 标志物 ; 泳道 1G6: 肠道病毒 A 组 PCR 产物 ; 泳道 8G22: 肠道病毒 B 组 PCR 产物 ; 泳道 24: 肠道病毒 C 组 PCR 产物 ;7, 23,25 阴性对照 图 1 对 NPEV 毒株进行 RTGPCR 扩增定型 Fig.1 RTGPCRamplificationofNPEVstrainsforgenotyG ping 表 1 贵州省 2013 年分离到的 22 株 NPEV 的基本信息 Tab.1 Basicinformationof22NPEVisolates inguizhouprovincein2013 样本名称 核苷酸氨基酸血清肠道病一致性一致性型别毒分组 (%) (%) 64GGZ/CHNG2013 CVA4 A GGZ/CHNG2013 CVA4 A GGZ/CHNG2013 CVA10 A GGZ/CHNG2013 EV71 A GGZ/CHNG2013 CVA2 A GGZ/CHNG2013 E30 B GGZ/CHNG2013 E30 B GGZ/CHNG2013 E30 B GGZ/CHNG2013 E27 B GGZ/CHNG2013 E25 B GGZ/CHNG2013 E25 B GGZ/CHNG2013 E25 B GGZ/CHNG2013 E15 B GGZ/CHNG2013 E11 B GGZ/CHNG2013 E11 B GGZ/CHNG2013 E7 B GGZ/CHNG2013 E7 B GGZ/CHNG2013 E3 B GGZ/CHNG2013 E3 B GGZ/CHNG2013 E3 B GGZ/CHNG2013 CVA21 C 注 : 原型株用 标识 (Theprototypestrainisindicatedby ) 图 2 本研究中的 22 株 NPEV 与对应原型株之间的基因进化发育树 Fig.2 Phylogenetictreeof22strainsofNPEVandtheir correspondingprototypestrains 2.4 CVA4 贵州分离株与其各亚型代表株之间 VP1 区序列对比分析本研究分离到 3 株 CVA4, 分离率为 12.5% (3/24). 将 3 株 CVA4 贵州分离株与从 GenBank 中下载的 CVA4 原型株 High point(ay421762) 以及 CVA4 各基因型参考株 VP1 序列进行平均遗传距离分析见表 2, 发现 CVA4 贵州分离株序列与原型株 A 基因型 High point 之间的核苷酸平均遗传距离较远, 可达 18 4%; 与 CVA4 的 B 基因型代表株 Kenya (GQ ) 之间的核苷酸平均遗传距离最大达 20.6%. 通过多重序列比对并构建遗传进化树见图 3, 发现 3 株 CVA4 贵州分离株 VP1 区之间的核苷酸与氨基酸序列几乎一致, 推测可能来源于同一传播链, 并与 CVA4 的 C2 基亚因型聚为一支, 提示 CVA4 贵州地方株为 C2 基因亚型.

4 8 期王宇等 :2013 年贵州省急性弛缓性麻痹病例中非脊髓灰质炎肠道病毒的鉴定分析 719 表 2 本次分离的 CVA4 与其各基因型代表株的 nt 和 aa 差异率 Tab.2 MeangeneticdistancesofCVA4strainswithstrainsofdiferentsubgenotypes 毒株编号 (ID) GGZ/CHNG2013/AFP GGZ/CHNG2013/AFP GGZ/CHNG2013/AFP KU /SZ/CHNGSK KJ /HuN10G GQ / /Kenya/ JN /NG357/IND/ AY /10439a/USA/ GQ /236/SD/CHN/ JQ /JL/CHN/AFP/ JQ /JL/CHN/ AB /163/YN/CHN/ LC /R165/YN/CHN/ AY /High_Point 注 : 左下角为核苷酸 (nt) 平均差异率, 右上角为氨基酸 (aa) 平均差异率 注 :CVA4 贵州株用 标识,CVA4 原型株用标识 图 3 Fig.3 3 讨论 本研究中分离的 3 株 CVA4 与其各基因亚型代表 株基因进化树 Phylogenetictreeof3strainsofCVA4andtheir correspondingrepresentativesubprototypestrains 肠道病毒是人类普遍易感且分布广泛的致病 原, 随着近年来肠道病毒导致的手足口病在全球的 暴发流行越来越受到人们的重视 [8].1999 年 OberG ste 等提出了基于肠道病毒 VP1 区序列的分子定 型方法, 使得以前不能被血清学鉴定的肠道病毒得 以发现.VP1 基因是主要决定肠道病毒抗原性, 具 有与血清型完全对应的遗传多样性, 基于该技术的 运用近年来国内外多个地区相继报道了肠道病毒的 [9] [10] 分子流行病学特征. 国内如山东省和云南省 [11] [12] [13] 等, 国外如印度 尼日利亚和巴基斯坦等, 而贵州地区对肠道病毒所致疾病的流行病学特征 临床症状表现以及分子流行病学方面的研究较少, 因此本研究对贵州省 2013 年从 AFP 病例标本中分 离到的 NPEV 进行分型鉴定, 了解贵州省肠道病毒 的病原谱及分离到的 CVA4 的基因特征. 研究发现,2013 年贵州省 AFP 病例中的 NPEV 以 HEVGB 为主, 其次是 HEVGA HEVGC [14] 组, 没有 HEVGD 组毒株, 研究结果与陈苏等对 云南省 2015 年的 NPEV 毒株鉴定结果相似, 均以 HEVGB 组毒株为主, 提示我国西南地区 B 组肠道 病毒可能分布广泛. 本研究中各分离株与其对应原 型株的核苷酸一致性在 75.5% ~86.8% 之间 氨基 酸一致性在 88.0% ~96.7% 之间, 通过构建进化树 分析发现各分离株与对应的原型株聚集在一起, 但 ECHO7 贵州株与其原型株之间进化相对较远, 提 示 ECHO7 贵州株可能与原型株之间的 VP1 区存 在较大的变异, 也可能与肠道病毒 B 组其它毒株存 在重组, 值得进一步关注研究. 目前研究证明肠道病毒中有 66 个血清型的病 毒与人类疾病有关联 [15], 但其是否与引起麻痹有关 联还待研究. 但近年来人类肠道病毒中除引起手足 口病的病原 EV71 和 CVA16 的研究报道较多外, CVA4 可引发手足口病 疱疹性咽峡炎和急性弛缓 性麻痹等疾病也引起广泛关注 [16]. 本研究中分离 到的 3 株 CVA4 均属于 C2 基因亚型, 与我国陕西 吉林和云南等大多数地区对 CVA4 的分析类似 [17], 说明中国大陆 CVA4 均属于 C2 基因亚型为优势基

5 720 中国人兽共患病学报 2018,34(8) 因亚型并存在共同进化. 目前 CVA4 尽管没在贵州地区暴发流行, 但考虑到在贵州省手足口病聚集性疫情病原谱监测中发现属于非 EV71 非 CVA16 的肠道病毒致病原最多, 占 32.20% [18], 加之肠道病毒大多数为无症状感染状态, 提示在实验室中应加强包括 CVA4 等其他肠道病毒的监测力度, 进一步完善区域性肠道病毒流行特征与规律分析, 明确毒株之间的遗传进化关系与演替趋势, 对制定肠道病毒所致疾病的防控策略提供依据. 参考文献 : [1]Adams MJ,King AM,CarstensEB.RatificationvoteontaxoG nomicproposalstothetheinternationalcommiteeontaxonomy ofviruses[j].arch Virol,2013,158(9):2023G2030.DOI: /s00705G013G1688G5 [2]LinJY,ShihSR.Celandtissuetropism ofenterovirus71and otherenterovirusesinfections [J].JBiomedSci,2014,21:18. DOI: /1423G0127G21G18 [3]David M,Peter M.Fieldsvirology [M].6thed.Philadelphia: LippincotWiliams& Wilkins,2013:490G531. Oberste MS,MaherK,KilptrickDR,etal.Molecularevolution ofthehumanenteroviruses:correlationofserotypewithvp1seg quenceandapplicationtopicornavirusclassification[j].jvirol, 1999,73 (3):1941G1948. [5] 宋群锋, 叶绪芳, 朱青, 等. 贵州省 年脊髓灰质炎疫苗病毒阳性的急性弛缓性麻痹病例流行病学分析 [J]. 中国计划免疫,2003,9(4):205G207. [6]WHO.Poliolaboratory manual[m].4thed.geneva:who, 2004:1G157. [7]ObersteMS,MaherK,WiliamsAJ,etal.SpeciesGspecificRTG PCRamplificationofhumanenteroviruses:atoolforrapidspeG ciesidentificationofuncharacterizedenteroviruses [J].J Gen Virol,2006,87:119G128.DOI: /vir G0 [8]ZhangZC,KouZQ,BaiYJ,etal.Epidemiologicalresearchon hand,foot,and mouthdiseasein mainlandchina [J].Viruses, 2015,7:6400G6411.DOI: /v [9]TaoZX,Wang HY,LiuY,etal.NonGPolioEnterovirusesfrom acuteflaccidparalysissurveilanceinshandongprovince,china, 1988G2013[J].SciRep,2014,4:6167.DOI: /srep06167 [10]TangJJ,Yoshida H,DingZR,etal.Molecularepidemiology andrecombinationofhumanenterovirusesfrom AFPsurveilG lanceinyunnan,chinafrom2006to2010[j].scirep,2015, 4:6058.DOI: /srep06058 [11]LaxmivandanaR,YergolkarP,GopalkrishnaV,etal.CharacG terizationofthe NonGPolio enterovirusinfectionsassociated withacuteflaccidparalysisinsouthgwesternindia[j].plos one,2013,8(4):e61650.doi: /journal.pone [12]OyeroOG,AduFD,AyukekbongJA.MolecularcharacterizaG tionofdiversespeciesenterovirusgbtypesfromchildren with acuteflaccidparalysisandasymptomaticchildreninnigeria[j]. VirusRes,2014,7:189G193.DOI:org/ /j.virusres [13]AngezM,ShaukatS,ZahraR,etal.CharacterizationofgroupB coxsackievirusesisolatedfrom nongpolioacuteflaccidparalysis patientsinpakistan:vitalassessmentbeforepolioeradication [J]. Epidemiol Infect,2017,7:1G9. DOI: / S [14] 陈苏, 田炳均, 汤晶晶, 等.2015 年云南省急性弛缓性麻痹病例中非脊髓灰质炎肠道病毒的鉴定分析 [J]. 中华微生物学和免疫学杂志,2016,36(9):676G680.DOI: /cma.j.issn. 0254G [15]BlomqvistS,KlemolaP,KaijalainenS,etal.CoGcirculationof coxsackievirusesa6anda10inhand,footand mouthdisease outbreakinfinland[j].jclinvirol,2010,48(1):49g54.doi: /j.jcv [16]ParkSH,ChoiSS,OhSA,etal.Detectionandcharacterization ofenterovirusassociated withherpanginaandhand,foot,and mouthdiseaseinseoul,korea[j].clinlab,2011,57(11/12): 956G967. [17] 王东艳, 徐艺, 张勇, 等. 陕西省急性迟缓性麻痹病例中柯萨奇病毒 A 组 4 型的基因特征 [J]. 病毒学报,2016,32(2):145G149. DOI: /j.cnki.bingduxuebao [18] 姚光海, 郭军, 王丹, 等. 贵州省 2013 年 年手足口病聚集性疫情病原监测分析 [J]. 中国卫生检验杂志,2016,26(7): 1016G1019. 收稿日期 :2017G09G21 编辑 : 张智芳

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