华南预防医学 2017 年 10 月第 43 卷第 5 期 SouthChinaJPrevMed,October2017,Vol 43,No %)andaminoacids(99.3%).Phylogenetictreeanalysisshowedthatthetwostrain

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侥贵
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1 406 华南预防医学 2017 年 10 月第 43 卷第 5 期 SouthChinaJPrevMed,October2017,Vol 43,No 5 论著渭南市 2016 年手足口病病原学及型基因特征分析魏明敏, 王露婕, 李通情, 张系忠, 刘玮, 郭欣, 刘腾, 魏慧琴, 焦莉萍, 沈托摘要目的了解 2016 年渭南市手足口病病原学特征和肠道病毒 71 型 () 基因特征方法收集渭南市 2016 年疑似手足口病病例咽拭子样本, 采用实时荧光定量 PCR 法进行核酸分型检测, 同时对 2 株型病毒株 VP1 片段进行核苷酸序列测定以及同源性及系统进化分析结果共检测手足口病病例咽拭子样本 1019 份, 检出肠道病毒阳性 689 份, 总阳性率为 67.62%; 各型别病毒阳性率由高到低依次为 26.89% 型 24.63% 和型 16.09%, 差异有统计学意义 (P<0.01) 病毒核酸检出阳性主要集中在 5 10 月, 占总阳性数的 91.04% (549/603) 病毒核酸检出阳性病例男女性别比为 ; 年龄集中在 5 岁以下儿童, 占 93.90% (647/689); 散居儿童占 67.94%, 托幼儿童占 32.06% 重症病例以阳性率最高 (72.22%), 普通病例以阳性率最高 (29.04%), 差异有统计学意义 (P<0.01) 2 株毒株 VP1 区序列与 C4a 基因亚型核苷酸和氨基酸同源性最高, 分别为 96.6% ~96.7% 和 99.3%; 系统进化树分析显示,2 株毒株与福建流行株 (KU ) 同源性最高结论 2016 年渭南市手足口病主要病原体为, 是引起渭南市手足口病重症病例的优势病毒型别, 渭南市型毒株属于 C4a 基因亚型关键词手足口病 ; 病原 ; 肠道病毒 71 型 ; C4 基因亚型中图分类号 :R512.5 文献标识码 :A 文章编号 : (2017) Etiologiccharacteristicsofhand,foot,andmouthdiseaseandgeneticfeaturesofinWeinan, 2016 WEIMing min,wanglu jie,litong qing,zhangxi zhong,liuwei,guoxin,liuteng,wei Hui qin,jiao Li ping,shen Tuo.CenterforDiseaseControlandPreventionofWeinanCity,Weinan ,China Abstract Objective Toanalyzeetiologiccharacteristicsofhand,foot,andmouthdisease (HFMD)andgeneticfeaturesofinWeinanCityin2016.Methods SpecimensofsuspectedHFMD casesinweinanin2016werecolectedfordeterminationofenterovirustypesbyusingreal timequantitative PCR(RT qpcr).meanwhile,nucleotidesequence,homologyandphylogeneticanalysisofvp1encoding genewereperformedintwostrainsof.results Atotalof1019throatswabsspecimensofHFMD weredetectedand689specimenswerefoundtobepositiveforev,withatotalpositiverateof67.62%. Thepositiveratesofvirusesrangingfrom hightolowwere26.89% fortheotherhumanenteroviruses (HEV),24.63% for,and16.09% for(p<0.01).thenucleicacidpositivecasesof EVweremainlyoccuredfromMaytoOctober,accountingfor91.04%(549/603)ofthetotalpositiveca ses.themaletofemalesexratioofthenucleicacidpositivecaseswas Thenucleicacidpositive casesweremainlythechildrenagedunderfiveyears(93.90%,647/689),thenscateredchildren (67 94%)andthechildreninkindergarten(32.06%).Thepositiverateofwashighestinsevere cases(72.22%)andthatofotherhevwashighestincommoncases(29.04%;p<0.01).these quenceofvp1regionoftwostrainsofhadhighhomologywithc4agenesubtype(96.6% - DOI: /j.scjpm 作者单位 : 渭南市疾病预防控制中心, 陕西渭南作者简介 : 魏明敏 (1983 ), 男, 硕士研究生, 主管技师, 主要从事病原微生物检测工作通讯作者 : 沈托,E mail: @qq.com

2 华南预防医学 2017 年 10 月第 43 卷第 5 期 SouthChinaJPrevMed,October2017,Vol 43,No %)andaminoacids(99.3%).Phylogenetictreeanalysisshowedthatthetwostrainsofhad veryhighhomologywiththeepidemicstrainoffujian(ku ).conclusion TheotherHEVwas majorviruscausinghfmdinweinanin2016.wasthepredominantvirussubtypecausingsevere casesofhfmdinweinancityandbelongedtoc4agenotype. Keywords Hand,foot,andmouthdisease; Pathogeny; Enterovirus71; C4genesubtype 手足口病是由肠道病毒引起的传染病, 主要表现为手足口腔等部位的皮疹疱疹或疱疹性咽峡炎等特征, 大多数患者症状比较轻微, 少数患者可出现脑炎脑膜炎心肌炎肺水肿等症状 [1] 其中以柯萨奇病毒 A16 型 () 和肠道病毒 71 型 () 最为常见渭南市从 2010 年开始监测手足口病, 近年来渭南市手足口病实验室确诊病例数逐年增多 [2], 其中个别患者为手足口病重症病例重症病例除了威胁患儿生命安全外, 还给患儿家庭造成沉重的经济负担为掌握渭南市手足口病病原学特征, 为手足口病的预防控制提供病原学依据, 本研究对渭南市 2016 年 1019 份手足口病病例样本进行了病原学分析, 同时对普通和重症病例病毒的 VP1 基因序列进行了初步分析, 现将结果报道如下 1 材料和方法 1.1 材料样本来源 2016 年渭南市蒲城县富平县大荔县等 11 个县区疾病预防控制中心按照手足口病预防控制指南 (2009 年版 ) 和手足口病标本采集及检测技术方案要求, 每月最少采集 5 份首次就诊的手足口病普通病例样本, 当月县 ( 区 ) 病例总数少于 5 例时, 全部采样并按照方案要求将样本送至渭南市疾病预防控制中心进行检测全部样本均为咽拭子样本仪器和试剂仪器 :TL988 双通道荧光定量 PCR 仪试剂 : 病毒 RNA 提取试剂采用西安天隆生物科技有限公司生产的 RNA 提取试剂盒 ( 磁珠法 );RNA 扩增试剂为江苏硕世生物科技有限公司生产的肠道病毒通用型 / 型核酸检测试剂盒 ( 荧光 PCR 法 ) 1.2 研究方法病毒 RNA 核酸提取采用西安天隆公司全自动核酸提取仪进行提取, 按照说明书操作肠道病毒核酸检测将提取的核酸分别加入硕世生物科技公司的肠道病毒通用型 / 型 2 种商品化核酸检测试剂盒 ( 荧光 PCR 法 ) 反应液中, 将 PCR 管放入荧光定量 PCR 仪 (TL 986), 按说明书设置反应条件进行扩增病毒 VP1 基因 RT PCR 扩增和测序对 Real timert PCR 检测为的样本直接进行 VP1 基因扩增,VP1 基因扩增 2 个片段, 第 1 个扩增片段上下游扩增引物分别为 YF _VP1 2(5 ATAATAGCACTAGCGGCAGC 3 ) 和 YF _VP1 3(5 CCCAAACAAGATTTGCCCA 3 ), 第 2 个扩增片段上下游扩增引物分别为 YF _VP1 4(5 ATTCACCTACATGCGCTTTGA 3 ) 和 YF _ VP1 5(5 CCCAAACAAGATTTGCCCA 3 ),2 个扩增片段进行拼接, 输出 VP1 基因全序列 891bp 用于后续分析 VP1 基因序列分析将所测 VP1 序列与 Genkbank 中其他毒株的 VP1 序列进行比较, 序列分析和进化树分析采用 BioEdit 软件进行核苷酸和氨基酸同源性比较, 利用 Mega5 软件采取邻近归并法 (neighbor joining,n J 法 ) 构建系统进化树 1.3 统计分析方法采用 SPSS13.0 软件和 Excel 2003 进行统计学分析, 采用 2 检验对手足口病病例的病原阳性率进行比较,P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 病原学检测结果 2016 年共检测手足口病病例咽拭子样本 1019 份, 检出肠道病毒阳性 689 份, 总阳性率为 67.62%; 其中阳性 251 份 ( 占 36.43%) 阳性 164 份 ( 占 23.80%), 阳性 274 份 ( 占 39.77%) 各型别病毒阳性率由高到低依次为 26.89% 型 24.63% 和型 16.09%, 各型别病毒阳性率差异有统计学意义 ( 2 =43.97,P<0.01) 2.2 流行病学特征时间分布对 2016 年发病日期信息完整的 857 份样本进行时间分布分析, 结果显示, 病毒核酸检出阳性主要集中在 5 10 月, 占总阳性数的 91 04%(549/603) 详见表年龄分布 689 例肠道病毒核酸阳性病例中,5 岁以下儿童阳性数最多, 占 93.90%

3 408 华南预防医学 2017 年 10 月第 43 卷第 5 期 SouthChinaJPrevMed,October2017,Vol 43,No 5 (647/689), 见表性别分布 689 例肠道病毒核酸阳性病例中, 男性 384 例, 女性 305 例, 男女性别比为不同性别病例间的和阳性率差异均无统计学意义 ( 均 P>0.05) 见表 3 检测数月份表年渭南市不同月份手足口病病毒核酸检测结果构成比 (%) 合计年龄组检测数 ( 岁 ) 表年渭南市不同年龄手足口病病例病毒核酸检测结果构成比 (%) 合计值 P 值 <0.05 >0.05 <0.05 >0.05 表年渭南市不同性别手足口病病例病毒核酸检测结果检测数性别阳性数阳性率阳性数阳性率阳性数阳性率阳性数阳性率男性女性合计值 P 值 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05

4 华南预防医学 2017 年 10 月第 43 卷第 5 期 SouthChinaJPrevMed,October2017,Vol 43,No 职业分布选取职业分布信息完整的 462 例手足口病疑似病例进行分析, 检出病毒核酸阳性 315 例, 其中散居儿童检出阳性 214 例, 占 67.94%, 托幼儿童检出阳性 101 例, 占 32.06% 不同职业病例间的和阳性率差异均有统计学意义 (P<0.05 或 P<0.01), 其中托幼儿童以阳性率最高 (23.38%), 散居儿童以阳性率最高 (33.37%) 详见表 4 检测数职业表年渭南市不同职业手足口病病例病毒核酸检测结果构成比 (%) 散居儿童托幼儿童合计值 P 值 <0.05 >0.05 <0.01 > 病例类型分布选取类型信息完整的 1018 例手足口病疑似病例进行分析, 其中普通病例 ( 轻型 )878 例聚集病例 122 例重症病例 18 例不同类型病例间的和阳性率差异均有统计学意义 ( 均 P<0.01), 其中重症病例以 EV 71 阳性率最高 (72.22%), 普通病例以阳性率最高 (29.04%) 详见表 5 检测数类型表年渭南市不同类型手足口病病例病毒核酸检测结果普通病例聚集病例重症病例合计值 P 值 <0.01 >0.05 <0.01 < 毒株 VP1 基因同源性和系统进化分析毒株 VP1 基因同源性分析本研究从 Genkbank 中下载的各代表基因亚型, 将渭南市与 A B C1 C2 C3 C4 C5 等各基因型及亚型代表株进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较渭南市 2 株毒株与 A B C 各基因型代表株的 VP1 区核苷酸序列同源性分别为 80 6% 82.8% ~83.0% 和 86.1% ~96.7%, 氨基酸序列同源性分别为 93.9% 95.6% 96.6% ~ 99 3% 尤其与 C4a 亚型同源性最高, 与 C4a 基因型的核苷酸和氨基酸同源性分别为 96.6% ~ 96 7% 99.3%, 结果显示, 渭南市毒株属于 C4a 亚型 ; 轻型病例和重症病例核苷酸及氨基酸同源性分别为 99.2% 和 100.0%, 表明手足口病轻型病例和重症病例与 VP1 区氨基酸变异无关详见表 6 表 6 渭南市 2 株毒株与其他毒株 VP1 核苷酸和氨基酸序列同源性比较毒株核苷酸同源性 (%) 氨基酸同源性 (%) A B C1 C2 C3 C4a C4b C5 A B C1 C2 C3 C4a C4b C5 WN16-571( 轻型 ) WN16-649( 重症 ) 注 : 基因代表株的 Genkbank 号 :A:U22521;B:AF ;C1:DQ ;C2:AB ;C3:AY ;C4a:AY ; C4b:AF ;C5:AM

5 ４１０华南预防医学２０１７年１０月第４３卷第５期２３２ＥＶ７１毒株ＶＰ１基因系统进化分析ＳｏｕｔｈｃｈｉｎａｊｐｒｅｖｍｅｄＯｃｔｏｂｅｒ２０１７Ｖｏｌ４３Ｎｏ５本研７１毒株均与Ｃ４ａ亚型位于进化树的同一分支上属究从Ｇｅｎｋｂａｎｋ中选取了国内１０个省及其他国家或于Ｃ４ａ亚型且与２０１５年福建ＥＶ７１毒株地区的２５株ＥＶ７１代表株以Ｃｏｘａ１６型代表株ＫＵ５９５８９９１亲缘性最近重症病例和普通病例Ｇ１０为组外对照与渭南市２株ＥＶ７１毒株的ＶＰ１在进化树上分布未见差异见图１序列构建系统进化树结果显示渭南市２株ＥＶ图１基于ＶＰ１核酸序列８９１ｎｔ构建的系统进化树Ａ１６以外的分型检测掌握手足口病病原谱变化特征为更好地做好手足口病防控工作３讨论提供病原学依据２０１６年渭南市手足口病流行以ＥＶ７１占从时间分布上看渭南市手足口病病毒核酸检３６４３Ｃｏｘａ１６占２３８０和其他肠道病毒占３９７７同时并存随着渭南市近年对ＥＶ７１０月其中７月份阳性数最出阳性主要集中在５! １多占１９７３研究表明气象因素是手足口病和Ｃｏｘａ１６防控力度的加大ＥＶ７１和Ｃｏｘａ１６毒株发病的影响因素之一３５手足口病发病随平均气占比逐渐下降逐渐成为渭南市近年温升高而升高这与渭南市７月份手足口病发病数１２报道了手足口病流行为全年最高相一致９月份检出阳性数均较８月份期间中Ｃｏｘａ６引起的重症感染比例有所增多分析原因可能与学校秋季开学相关开学明显增多提示渭南市今后应开展ＥＶ７１和Ｃｏｘ后造成托幼儿童接触机会增多此外１０! １１月的主要流行毒株赵奇等

6 华南预防医学 2017 年 10 月第 43 卷第 5 期 SouthChinaJPrevMed,October2017,Vol 43,No 检出阳性样本主要为型, 分析原因可能与该时间段送检样本大多为聚集性病例样本有关从年龄分布上看,2016 年渭南市手足口病多发生于 5 岁以下儿童 ( 占 93.90%), 其中,0~2 岁儿童发病以为主,3~5 岁儿童以为主, 与文献报道结果一致 [6-7], 与渭南市年报道的结果基本一致 [8] 提示今后应加强对 3~5 岁儿童肠道病毒尤其是型病毒的监测工作从病例职业分布看, 托幼儿童以阳性率最高, 散居儿童以阳性率最高, 与 [9] 周晓红等报道的结果一致今后应重点做好托幼机构的手足口病防控工作, 及早发现感染患者, 并做好隔离防护措施, 防控的暴发和流行从不同类型病例检测结果看, 渭南市手足口病普通病例以感染为主, 重症病例以感染病毒为主, 与文献报道的是引起手足口病重症病例的主要病原体结果相一致 [10-11] [12] 据隋美丽等学者研究发现, 可能会引起神经系统方面的并发症虽然目前我国型疫苗已经上市, 但在短期内难以实现型疫苗的接种率和保护率全覆盖, 所以仍需加强手足口病重症病例病毒的监测工作, 以减少重症病例的发生病毒核酸同源性分析结果显示, 渭南市 2 株毒株与系统树中各省份的 VP1 序列同源性在 90.7% ~99.1% 之间, 氨基酸同源性在 95 6% ~100.0% 之间其中与福建省毒株 (KU ) 同源性最高, 核苷酸同源性为 98 9% ~99.1%, 氨基酸同源性为 100.0% 进化树分析结果显示, 渭南市 2 株毒株属于 C4a 基因亚型据报道的 VP1 基因可能受环境因素社会因素宿主的遗传因素和免疫反应以及病毒载量等多方面影响 [13] 在今后的研究工作中应进一步分析渭南市病毒基因及其流行特征, 为渭南市手足口病的科学防控提供依据参考文献 : [1] 赵奇, 朱俊萍. 中国手足口病的流行状况及病原谱变化分析 [J]. 病毒学报,2015,31(5): [2] YangF,YuanJ,WangX,etal.Severehand,foot,andmouth diseaseandcoxsackievirusa6 Shenzhen,China[J].ClinInfect Dis,2014,59(10): [3] OnozukaD,HashizumeM.Theinfluenceoftemperatureandhu midityontheincidenceofhand,footandmouthdiseaseinjapan [J].SciTotalEnviron,2011, (41): [4] 陈思, 马文军. 手足口病发病的危险因素研究进展 [J]. 华南预防医学,2016,42(3): [5] 黄嘉迎, 杜玉忠, 孙小康, 等. 清远市清城区手足口病流行状况及与气象因素的关系分析 [J]. 华南预防医学,2014, 40(4): [6] 王小军, 申明星, 刘海军, 等年甘肃省陇南市手足口病流行特征分析 [J]. 华南预防医学,2016,42(3): [7] 李艳芬, 杨华可, 袁达康, 等年东莞市手足口病病原学监测结果分析 [J]. 华南预防医学,2014,40(3): [8] 魏明敏, 王露婕, 李通情. 渭南市 2010 至 2014 年手足口病病原学监测结果分析 [J]. 现代预防医学,2017,44(6): [9] 周晓红, 张孝艳, 徐佩华, 等. 乡镇卫生院手足口病病原检测研究 [J]. 中国卫生检验杂志,2016,26(20): [10] 陈瑞珊, 邸菁华, 王岩, 等.290 例重症手足口病患者的流行病学及病原学特征分析 [J]. 中国病原生物学杂志,2016, 11(1):65-67,72. [11] 刘继艳, 赵银枝, 王亚丽, 等. 开封市年手足口病重症病例流行特征分析 [J]. 中华疾病控制杂志,2012, 16(4): [12] 隋美丽, 李懿, 刘新奎, 等. 手足口病流行病学病原学及重症化机制的研究进展 [J]. 中国病原生物学杂志,2017,12(1): [13] 侯晓巨. 重症手足口病患儿肠道病毒 71 型的检测及基因特征分析 [D]. 天津 : 天津医科大学,2014. ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 刘惠玲 )

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