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侔己暨
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1 中国人兽共患病学报２０１８,３４ ( １２) １０９５ Ch J Z 实验研究 DOI:１０３９６９/ １００２２６９４２０１８００１５１２０１７年南京市２株肠道病毒７１型分离株全基因组序列测定分析王子鸣１,余摘要:目的倩１,张曾娣２,黄赞１对２０１７年南京市２株肠道病毒７１型分离株进行全基因组序列测定,分析其进化及遗传变异特征,为手足口病疫情的监控与防治提供依据.方法通过对临床检测 EV７１阳性的标本进行病毒分离,设计８对特异性引物对病毒全基因组进行 PCR 分段扩增,经序列测定及拼接获得 EV７１基因组序列,将其与其他代表毒株序列分别进行核苷酸和氨基酸同源性比对,并进行遗传进化分析.结果基因组核苷酸同源性分析显示, ２株分离株的同源性为９４０.以 EV７１NJ ２０１７２作为参照,与２００８年安徽流行株 Fg１７０８０２的同源性最高( ９６９ ),而与原型株 BC的同源性较低 ( ７９８ ). 同时基于 VP１基因和全基因组序列构建的进化树均可以看出, ２株分离株与 C４亚型代表株聚为一簇,与国内各地既往的 C４流行毒株相比,未发生大的变异.结论２株 EV７１分离株均属于 C４型,虽病毒核苷酸序列之间差异显著,但大多为无明显的突变,其相应的氨基酸序列的遗传变化相对稳定. 关键词:肠道病毒７１型;全基因组;同源性分析;系统进化分析中图分类号: R３７３２文献标识码: A 文章编号: １００２２６９４( ２０１８) ０９１０９５０７ Cmp g m hm ７１ d N g, Ch WANGZ m g１, YU Q １, ZHANGZg d ２, HUANGZ１ ( １ Lb G M b g,n g Ag U g ２１００９５,Ch ;,N ２ N gch d H p,n g ２１０００８,Ch ) Ab :Tp db m gd HFMD db ７１ N g２０１７,w d wev７１ m EV７１ RNAp mp Th dg h h w w d m db h wh gm d T h d,w d hgm b q mp PCR w h８p p m,d d h mp p hwh gm Th ddm dhm q g mp dph g w d dw h h Hm g gm dhwd h hhm g h w w ９４ W hev７１nj ２０１７２, hd hh hm gh gw h h Fg１７０８０２ ( ９６９ ),b w hm gw h hp BC( ７９８ ) M wh,ph p g b dvp１g gm d d h NJ ２０１７ w dw h q C４bg h w m m mp dw h h p p dc４p dm Ch Th pd, h ww dev７１ b g hc４ hgh h d w p A q g d m h h,m w m d h pd gm d w q b K d : ７１; mp gm;hm g ;ph g w 国家自然科学基金 (N ３１５００９４４)和江苏省自然科学基金 (N BK２０１５０６８７, N BK２０１７０１４７)联合资助通信作者:黄赞,Em :hg z d 作者单位: 南京农业大学动物科技学院消化道微生物研究室,南京１２１００９５; 南京市儿童医院,南京２１０００８２ Spp dbg d m hn N S F d Ch ( N ３１５００９４４)d hn S F d J g P ( N BK２０１５０６８７,BK２０１７０１４７) C pd g h :Z Hg,Em :hg z d

2 1096 中国人兽共患病学报 2018,34(12) 手足口病 (hd,d mh d, HFMD) 是一种儿童常见的自限性传染病, 多发于 1 ~5 岁的儿童, 其临床症状为婴幼儿发热和手足 [1G2] 口腔和臀等处的皮疹或疱疹. 引起 HFMD 的病原体有多种, 其中以肠道病毒 71 型 (E 71,EV71) 和柯萨奇病毒 A16 型 (Cxk [3] A16,CA16) 最为常见.EV71 属于小 RNA 病毒科肠道病毒属 A 组的成员, 为单股正链 RNA 病毒. 基因组全长约 7400bp, 位于基因组两端的 5 和 3 非编码区 (dg,utr) 在病毒 [4] 的复制和蛋白的翻译中发挥着重要作用. 病毒基因组仅含有一个开放阅读框 (pdgm, ORF), 编码一个由 2193 个氨基酸组成的多聚蛋白, 分为结构前体蛋白 P1 和非结构前体蛋白 P2 P3.P1 蛋白可进一步加工为结构蛋白 VP1~VP4, 其中 VP1 区是病毒基因分型的主要依据. 一般情况下, 儿童感染 EV71 与感染 CA16 病毒后的临床 [5] 症状不易区分, 但相对而言,EV71 感染所引起的 HFMD 可能伴有神经性肺水肿和急性弛缓性麻痹无菌性脑膜炎等神经系统并发症, 严重地危害了婴 [1,6] 幼儿的健康. 近年来 EV71 在国内的流行呈显著上升趋势, [7] 其中以 C4 基因型为主. 在江苏省境内每年都能检测出 EV71 病毒的疫情, 比对这些毒株的序列后 [8] 发现, 流行的毒株主要属于 C4 亚型. 因此加强对中国大陆各地区 EV71 流行毒株的基因特征分析, 对于有效地预防和控制手足口病的流行具有重要的意义. 本文通过从患者粪便样品中分离出的 2 株 EV71 病毒, 对其进行全基因组序列比对基因分型和种系进化关系分析等研究, 以期为 EV71 的变异研究提供依据. 1 材料与方法 1.1 材料标本来源 EV71 感染粪便标本收集自南京市儿童医院 2017 年 5-7 月经临床诊断为 EV71 感染手足口病的入院治疗患儿. 粪便采集后立即分装至 2mL 冻存管, 于 -80 低温冷冻保存主要试剂仪器非洲绿猴肾细胞 (V 细胞 ) 由南京儿童医院儿科研究所提供.DMEM 0 25% TpGEDTA PBS 购于美国 Gb 公司 ; 胎牛血清 (FBS) 购于南京维森特生物技术有限公司 ;HSp R 逆转录试剂盒和 Ph R PCR 试剂盒,RNAI 试剂购于南京诺唯赞生物科技有限公司 ;DNA MkDL2000 购于大连 Tk 公司 ; 琼脂糖购于西班牙 Bw 公司 ; 三氯甲烷异丙醇无水乙醇购于上海九亿化学试剂有限公司. 1.2 方法粪便中 EV71 的分离复制取粪便标本 0.3 g, 加入 1.5mLPBS 制成 20% 粪便悬液, 充分混匀, 12000/m 离心 20m. 取上清液 1mL 至新的离心管, 加入 100μL 氯仿, 充分混匀,12000/m 离心 15m, 离心后取 200μL 上清加入 2.8 ml 含有 2%FBSDMEM 中, 接种于致密单层的 V 细胞上. 细胞置于 37 5%CO2 的细胞培养箱中培养, 接种后每天观察细胞病变效应 (CPE), 若出现 CPE, 则取 100μL 阳性上清液传至新的 V 细胞中,2h 后吸弃上清液, 换成含有 2%FBSDMEM, 继续观察细胞 CPE 变化.CPE 达到 75% 以上时, 收集病变细胞液,-80 保存. 如 7d 后没有出现 CPE, 盲传 3 代, 仍未见 CPE 出现, 则判为阴性引物设计与合成引物设计参考文献 [9]. 选取 GBk 中 EV71 各地区代表株的全基因组序列, 经序列比对后找出病毒基因序列的保守区域, 采取分段扩增方式依序设计 8 对首尾相互重叠覆盖基因组全长的引物 ( 见表 1). 引物序列由通用生物系统有限公司合成. 表 1 EV71 全基因组分段扩增和测序的引物 Tb.1 Pmdmpd qgwhgmev71 引物名称引物序列 (5 3 ) 引物位置 /bp EV711 F:GCTTTWAAACAGCTGTGGGTTG 1~22 R:ACTTCCAGTACCATCCCTTG 1193~1174 EV712 F:ATAGTCGGYTATGGTGAGTG 1043~1062 R:TGAGTGTTGCTGATCCAKGG 2217~2198 EV713 F:TGTTYACTGGATCCTTCATGGC 2070~2091 R:GCCAGCRTAATTTGGRTTGGCT 3282~3260 EV714 F:TRCCATTCATGTCACCTGCGA 3012~3032 R:TACGACACATTCCCAAACAT 4320~4301 EV715 F:ATCAGCAARTTYATTGATTGG 4147~4168 R:ATACACCAAYGAGACAACCGC 5290~5270 EV716 F:GAGGCTCTTTTCCAAGGTCC 5048~5067 R:TAGCARGCYTCCTCCATRCTC 6230~6210 EV717 F:CATYAAYGGRCCAACCCGCA 5972~5991 R:YATGGTCAGACCATAYTCCTT 6997~6979 EV718 F:AGRGAGATAGGSTATAGTGA 6684~6703 R:TAGGAGCTATTCTGGTTATAACA 7408~ RTGPCR 扩增待测的 EV71 毒株感染 VG

3 9 期王子鸣等 :2017 年南京市 2 株肠道病毒 71 型分离株全基因组序列测定分析 1097 细胞,CPE 达 50% 后, 加 RNAI 试剂裂解细胞, 根据说明书提取总 RNA. 将提取的总 RNA 用 HSp R 逆转录试剂盒反转为 DNA, 以此 DG NA 为模板应用表 1 中的 8 对引物, 经 Ph R 高保真 DNA 聚合酶进行 PCR 扩增反应, 获得覆盖整个 EV71 基因组的 8 条 DNA 片段.PCR 条件为 :95 3m;95 15,56 15,72 60,30 个循环 ;72 5m. 取 PCR 扩增产物 5μL, 经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳分离, 根据 DNA MkDL2000 位置对扩增片段大小进行确认序列测定与数据分析 8 段特异性扩增得到的 PCR 产物送至通用生物系统有限公司进行序列测定. 通过 Chm 软件显示各段产物依序位置的碱基峰图对测序所得的序列进行可靠性分析, 通过 SqM 软件将比对的序列依序组装成一条完整的全基因序列. 同时从 NCBI 基因数据库 (GG Bk) 中下载 EV71 各基因型代表毒株序列共 24 条, 见表 2. 应用 Mgg 软件对 EV71 分离毒株的核苷酸和氨基酸序列进行同源性比对分析, 应用 MEGA7.0 软件构建系统进化树 (Bp 值为 1000). 表 2 序列分析中所用 EV71 毒株信息 Tb.2 BkgdEV71q 毒株来源分离时间基因组序号多聚蛋白序号 BC USA 1970 U AAB TW/2086/98 Tw,Ch 1999 AF AAD SHZH98 Ch 2000 AF AAG N3340GTWG02 Tw,Ch 2007 EU ABW Fg17.08G02 Ch 2008 EU ACD BJ08GZ020G1 Bg,Ch 2008 FJ ACM Zhg08 Ch 2008 EU ACF GZG08G02 Ggzh 2008 FJ ACJ SZ/HK08G5 Shzh,Ch 2008 GQ ADG GX/LZ08G04/08/CHN Ggx 2008 GQ ACX H10G08GCh H 2008 GU ADC EV71/Lzh01 Ch 2009 GU ADC Shgh036G2009 Ch 2009 FJ ACN Ggdg2009 Ch 2009 JF AEO EV71/Xm/2009 Ch 2009 JN AFC HbG09GCh Ch 2010 GU ADD Wh/3018/2010 Ch 2010 KF AHA M/AUS/4/99 A 2007 EU ACA FGAUSG6G99 A 2014 DQ ABC GSING98 Sgp 2014 DQ ABC GYmgGg Jp 2011 AB BAJ GKORG00 ShK 2014 DQ ABC SB2864GSARG00 M 2005 DQ ABC S10862GSARG98 M 2014 DQ ABC 结果 2.1 病毒分离将临床检测为 EV71GRNA 阳性的 36 份手足口病患者的粪便标本, 处理后分别接种至致密生长的 V 细胞, 培养分离出 2 个阳性分离物. 阳性分离物再次接种 V 细胞, 培养 2d 后, 镜下观察可见细胞圆缩透亮聚堆的病变现象, 见

1098 中国人兽共患病学报 2018,34(12) 图 1. A:C V;B:CPE Vd wh NJ2017148 h;c:cpe Vd wh NJ2017248h 图 1 V 细胞感染 NJ2017 分离株后的细胞病变 ( 200) Fg.1 CPEVdwhEV71 2.

M:DNA MkDL2000;A:EV71GNJ20171dGpdG wmpdbpcr wh8pp pm;b:ev71gnj20172dgpdwmpd bpcr wh8pppm 图 2 NJ2017 分离株 8 对引物 PCR 产物电泳图 Fg.2 Ephgm PCR pdev71g 2.

4 1098 中国人兽共患病学报 2018,34(12) 图 1. A:C V;B:CPE Vd wh NJ h;c:cpe Vd wh NJ h 图 1 V 细胞感染 NJ2017 分离株后的细胞病变 ( 200) Fg.1 CPEVdwhEV PCR 产物鉴定 EV71 阳性粪便分离物感染 V 细胞后提取 RNA, 采用 8 对特异性设计的引物进行 RTGPCR 扩增,PCR 产物经 1.5% 浓度琼脂糖凝胶电泳, 显示各条扩增片段均与引物设计的理论扩增长度相符, 见图 2. M:DNA MkDL2000;A:EV71GNJ20171dGpdG wmpdbpcr wh8pp pm;b:ev71gnj20172dgpdwmpd bpcr wh8pppm 图 2 NJ2017 分离株 8 对引物 PCR 产物电泳图 Fg.2 Ephgm PCR pdev71g 2.3 基因组序列的测定及分析经分段扩增, 序列测定和比对拼接后, 获得 NJ20171 和 NJ 的全基因组序列, 并将序列提交至 GBk 数据库, 基因序列号分别为 MG 和 MG EV71GNJ20171 基因组全长为 7365bp, 其中 5 UTR 区长为 692bp,3 UTR 区为 89bp;NJ 基因组全长为 7358bp, 其中 5 UTR 长为 705 bp,3 UTR 区长 81bp. 两株 EV71 基因组编码区均为 6582 个核苷酸, 仅含有一个开放阅读框, 编码一含 2193 个氨基酸残基的多聚蛋白 (ppg ), 经基因组序列比对, 两分离株核苷酸同源性达到 94.0%. 从表 3 可看出,NJ20172 与 EV71 BC 原型株基因组的核苷酸和氨基酸同源性分别为 79.8% 和 95.0%. 2.4 基因组核苷酸序列同源性比对将 NJ2017 1,2 株与来自 GBk 中不同 EV71 代表株的核苷酸序列进行同源性分析, 选择 NJ20172 作为参照. 从表 3 中可以看出, 无论是全基因组, 或是在 5 UTR, 衣壳蛋白 (VP1,VP4), 非衣壳蛋白 (2A, 3C,3D) 的各个分区中,NJ20172 与 Fg17. 08G02 的核苷酸同源性最高, 为 96.9%, 与 EV71 BC 的同源性最低, 为 79.8%. 同时还发现, 南京市分离株之间的 5 UTR 和 3D 区存在显著的差异性, 分别为 74.4% 和 37.6%. 2.5 编码蛋白氨基酸序列同源性比较 NJ2017 1,2 株病毒基因组编码区全长 6582 个核苷酸, 共编码 2193 个氨基酸. 将 NJ20172 株与其他 EV71 型毒株氨基酸序列进行同源性比对, 见表 3. 从编码的氨基酸组成成分分析,NJ20172 株与 Fg17.08G02 的氨基酸同源性最高, 与 NJ 株同源性最低. 虽然在核苷酸序列上,NJ2017 分离株与这 24 株病毒株序列之间的差异变化显著, 但氨基酸序列的同源性均高达 95% 以上, 说明 EV71 病毒基因组中大多数核苷酸序列变异属无义突变, 相应氨基酸序列的遗传变化相对稳定. 表 3 南京市分离株 NJ20172 与其它分离株的核苷酸 () 及氨基酸 () 的同源性比较 (%) Tb.3 HmgmphddmdqbwNJ20172dhEV71(%) 同源性毒株亚型 Gm/ pp 5 UTR () VP1 (/) VP4 (/) 2A (/) 3C (/) 3D () BC A 79.8/ / / / / TW/2086/98 C2 81.3/ / / / / SHZH98 C4b 89.1/ / / / / N3340GTWG02 C4b 91.6/ / / / / Fg17.08G02 C4 96.9/ / / / / BJ08GZ020G1 C4 96.7/ / / / /

5 9 期王子鸣等 :2017 年南京市 2 株肠道病毒 71 型分离株全基因组序列测定分析 1099 表 3( 续 ) 同源性毒株亚型 Gm/ pp 5 UTR () VP1 (/) VP4 (/) 2A (/) 3C (/) 3D () Zhg08 C4 95.8/ / / / / GZG08G02 C4 94.8/ / / / / SZ/HK08G5 C4 93.9/ / / / / GX/LZ08G04/08/CHN C4 96.0/ / / / / H10G08GCh C4 95.1/ / / / / EV71/Lzh01 C4 96.5/ / / / / Shgh036G2009 C4 95.1/ / / / / Ggdg2009 C4 90.2/ / / / / Xm/2009 B5 81.5/ / / / / HbG09GCh A 80.0/ / / / / Wh/3018/2010 A 79.4/ / / / / M/AUS/4/99 B3 83.0/ / / / / FGAUSG6G99 C2 81.8/ / / / / GSING98 B3 83.2/ / / / / GYmgGg C4 93.5/ / / / / GKORG00 C1 82.4/ / / / / SB2864GSARG00 B4 81.7/ / / / / S10862GSARG98 C1 81.7/ / / / / NJ20171 C4 94.0/ / / / / 病毒基因的种系进化分析从 GBk 上下载 24 株中国大陆各省市和亚太国家及地区的 EV71 代表株的全基因组序列, 使用 MEGA7.0 软件通过邻位归并法 (NghbGg), 基于病毒外壳蛋白 VP1 基因和全基因组核苷酸序列, 对 NJ20171,2 株与 25 株代表株进行遗传进化分析. 无论在 VP1 基因 ( 图 3) 还是在全基因组序列 ( 图 4) 水平上构建的进化树中均可以看出,NJ2017 1,2 株与 C4 亚型 Fg17.08G2 BJ08GZ020G1 Lzh01 等株进化关系密切, 同属于 C4 进化分支, 而与 A 型 BC 国际标准株 B 亚型 Xm/ M/AUS/4/ GSING98 等株在进化上较远, 这与核昔酸序列同源性比对的结果相符. NJ20171,2 株与中国大陆各省市分离的 10 株代表株之间进化关系较近, 分析结果与有关国内 [10] EV71 主要代表毒株的基因型是 C4 亚型相符. 3 讨论近年来,EV71 已逐渐成为继脊髓灰质炎病毒后又一重要的嗜神经肠道病毒. 自 1969 年首次在图 3 NJ20171,2 株 VP1 序列遗传进化树 Fg.3 PhgbdhVP1gbw NJ20171,2dhphbG gp 美国加州被报道以来,EV71 病毒已经在世界范围

6 1100 中国人兽共患病学报 2018,34(12) 用的区域. 基于 VP1 序列的同源性差异, 目前将 EV71 分为 A B C 基因型. 其中,A 基因型为 [12] EV71 的原型株 ;B 基因型可进一步分为 B1~B5 亚型, 主要包括澳大利亚新加坡部分地区台湾省和马来西亚的病毒株 ;C 基因型可划分为 C1~C5 亚型, 主要是在亚太地区, 包括中国大陆及台湾省新加坡和马来西亚等地. 本研究采用 RTGPCR 方法分段扩增 EV71 南京市分离株 NJ20171,2 的基因组序列, 并对其核苷酸序列进行了测定及分析, 经序列拼接后得到 ThpdGbkmb dphg,whhhwhbh Bp 图 4 NJ20171,2 株全基因组序列遗传进化树 Fg.4 PhgbdhGghgm bwnj20171,2dhp hbgp 内引起多次大规模的暴发, 但不同国家和地区的流行毒株的基因型存在显著差异. 如年新加坡澳大利亚等亚太国家是以 B3 亚型感染为主 ; 台湾省在 1998 年以 C2 亚型感染为主, 而 2000 年之后逐渐被 B4 亚型取代.2008 年以来在中国大陆的 EV71 感染引发的 HFMD 流行中, 神经系统并发症的发病率逐年上升, 因而加强对 EV71 毒株基因型的特征分析和流行病学的监控, 在 HFMD 的预防及控制中有着重要的临床价值. 本文通过对南京市 2017 年分离的 2 株 EV71 型病毒株的全基因组进行了序列测定同源性分析及亲缘进化关系等方面的研究, 为了解目前南京地区流行的 EV71 毒株的病原特征及遗传变异情况提供了重要的信息. EV71 病毒基因组仅含有 1 个开放阅读框, 编码的一个多聚蛋白在自身蛋白酶的酶解作用下形成 P1 P2 P3 区前体蛋白,P1 区可进一步加工形成病毒衣壳蛋白 VP1 VP2 VP3 和 VP4.P2 和 P3 区主要编码非结构蛋白如 2A 3C 蛋白酶及 3D RNA [11] 聚合酶, 进化上具有高度保守性.EV71 的 4 种结构蛋白中, 被广泛用于 EV71 基因分型的是 VP1 和 VP4.VP4 区核苷酸序列仅为 207bp, 易扩增, 但其高度保守, 和 VP1 区相比核苷酸变异较少. 而 VP1 位于病毒衣壳外侧, 是目前 EV71 分型最常应病毒全基因组序列. 本文主要对 EV71 的 5 UTR 区的核苷酸序列, 结构蛋白 VP1 和 VP4 以及非结构蛋白 2A 3C 3D 的核苷酸和氨基酸序列进行同源性分析. 经同源性比对发现,NJ20171,2 之间全基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为 94 0% 和 90.1%,VP1 VP4 2A 3C 蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列也具有高度同源性, 但 5 UTR 区 (25.6%) 和 3D 蛋白 (62.4%) 的核苷酸序列差异较明显. 本研究将 NJ20171,2 株与下载自 GG Bk 中 EV71 流行株的核苷酸和氨基酸序列分别进行同源性分析, 选择 NJ20172 作为参照. 分析显示,NJ20172 与 A 基因型和 B 基因型病毒株在 VP1 区的核苷酸序列差异均在 15% 以上, 而与 C 基因型毒株在 VP1 区核苷酸序列差异均低于 12%, 其中与 C4 亚型各毒株的同源性较高, 表明南京分离株均属于 C4 亚型毒株. 经序列比对发现, NJ20172 与 2008 年安徽阜阳分离株 Fg17. 08G02(96.9%) 以及 2008 年北京分离株 BJ08GZ020G 1(96.7%) 的核苷酸同源性最高, 与 EV71 原型株 BC(79.8%) 的同源性最低. 从同源性分析表中可以直观地发现, 虽然南京市分离株与其他地区 EV71 分离株之间核苷酸序列差异显著, 但其氨基酸序列变化相对稳定. 2A 3C 蛋白不仅作为病毒自身合成的蛋白裂解酶, 在 EV71 的固有免疫逃避中也发挥着关键作用 [13].2A,3C 蛋白的核苷酸和氨基酸同源性分析可以看出, 南京市 2 株 EV71 分离株之间同源性很高, 这为病毒的体外感染和逃避宿主免疫起到了重要的作用. 本实验中 2 株分离株的 3D 区核苷酸序 [14] 列比对在所有区域中差异最大, 这与 Jg 等和 [15] L 等的研究结果相一致.3D 蛋白可启动正链 RNA 的复制和 VPg 尿苷酸化的起始及终止 [16],3D 区核苷酸序列部分碱基的突变为病毒的进化提供了条件, 同时自然选择压力又使病毒蛋白保持着较高的稳定性. 同源性分析表中还可以发现,EV71 南

7 9 期王子鸣等 :2017 年南京市 2 株肠道病毒 71 型分离株全基因组序列测定分析 1101 京市分离株之间的 5 UTR 区核苷酸序列差异性显著.5 UTR 通过自身折叠形成的多个特异性结构与宿主的相关细胞蛋白结合, 在起始病毒基因组 RNA 的合成以及病毒蛋白翻译的过程中发挥重要 [17] 作用. 此外,5 UTR 区还涉及病毒的毒力等方面的功能. 南京市分离株之间 5 UTR 区核苷酸的显著性差异可能对其致病性产生的影响还需要进一步的研究. 基于 VP1 区构建的系统进化树显示, 南京市分离株 NJ2017 与 C4 基因亚型毒株聚成一簇, 因此我们判断其为 C4 亚型, 这符合中国大陆地区近年 [18] 来 EV71 病毒暴发的流行趋势, 也说明南京市 2017 年 EV71 分离株没有出现明显的亚型变异. 从进化树上可知, 南京市分离株与上海浙江等地的病毒分离株有较高的亲缘关系, 同属于 C4 基因亚型, 可能是由于南京往返于上海浙江等地的人员较为频繁, 为病毒的快速传播提供了条件. 然而 EV71 全基因组中结构蛋白基因仅占 35%, 而非结构蛋白则超过 55%, 肠道病毒之间的同源重组位点 [19] 多位于非结构编码区, 因此有研究认为仅以 VP1 区进行基因分型及进化分析会忽略 EV71 其他基因 [20] 突变的信息, 不能提供完整的种系发生关系, 因此应参考 EV71 的全基因组序列对毒株完成基因分 [21] 型及进化分析. 通过对全基因组的进化分析显示,A B C 型分别位于 3 个大的分支中, 与 VP1 区构建的进化树结构大体相似, 但各基因亚型所在的分支并不完全相同, 可能是不同的亚型之间存在着其他的变异信息. 从两株进化树中可以看出, 基于 VP1 基因序列分型的 C4 亚型 Ggdg2009 株在全基因组水平构建的进化树中被 C4b 亚型毒株分隔开以及 B4 亚型 SB2864GSARG00 株单独成枝, 说明仅依据 VP1 基因序列对 EV71 毒株进行基因分型是不能提供完整的种系进化信息. 近年来中国内地各地区 EV71 的暴发常以 C4 基因型为主, 在病毒感染的早期阶段多为隐性感染, 这为 HFMD 疫情的防控增加了难度. 本研究通过对南京市 EV71 感染引发的 HFMD 患者的粪便样品进行了 EV71 病毒的分离并完成了病毒全基因组序列的测定及基因同源性和遗传进化分析, 结果显示本研究中 2017 年南京市分离株均为 C4 基因型, 研究结果为南京市 EV71 的流行趋势研究和防控工作提供了参考依据. 目前 EV71 的发病率仍呈上升 [22G23] 趋势, 但相应疫苗的研发已进入了临床阶段, 相信不久的将来肠道病毒 71 型也会同脊髓灰质炎病毒一样被完全治愈. 参考文献 : [1]OMH,WgSC,LwhwP,.C,dG g,dmgm71[j].ln, 2010,9(11):1097G1105.DOI: /S1474G4422(10)70209G X.Rw [2]SmT.Vg,pdmg,phg,d 71[J].LID,2010,10(11):778G790. DOI: /S1473G3099(10)70194G8 [3]LJY,ShhSR.Cdpm71d h[j].jbmds,2014,21(1):18g 23.DOI: /1423G0127G21G18.Rw [4]WgX,WgH,LY,.TIAG1dTIARwh 5 GUTR71gmdp [J].Bhm BphRC,2015,466(2):254G259.DOI: /.bb [5] 李学超, 于哩哩, 刘元辉, 等. 手足口病患儿感染肠道病毒 71 型全基因组基因特征分析 [J]. 中国病原生物学杂志,2014,9 (8):744G746. [6]KkCC.Thpdpgghm 71[J].WdJV,2015,4(2):78G95. DOI: /w Rw [7]LKY.E71dgmp [J].KJPd,2016,59(10):395G401.DOI: / kp [8] 周晋, 曹喜华, 曹彤, 等.1 株肠道病毒 71 型南京分离株的全基因组序列的测定及遗传进化分析 [J]. 江苏大学学报 ( 医学版 ), 2014,24(4):312G315. [9] 李华, 邵聪文, 潘玥, 等.2009 年云南省 2 株肠道病毒 71 型分离株全基因组序列遗传特性分析 [J]. 病毒学报,2012,28(2): 108G113. [10] 常彦敏, 许沙沙, 徐霖, 等.2009 年肠道病毒 71 型广州分离株的全基因组序列分析 [J]. 热带医学杂志,2011,11(2):113G116. [11]BbJM,PdP,ChPKS,.G 71:pdmgd phgmp [J].RMdV,2007,17(6):371G379.DOI: /m. 538 [12]HgY,LT,HL,.GddC2Gk bggp71,tw,2008[j].vg J,2010,7(1):277G287.DOI: /1743G422XG7G277 [13]PhkP,HA,WkP.Immdmm b71[j].v,2015,7(12):6613g6630. DOI: / Rw [14]JgH,WgL,ZhgN,.Bhmhz 713D RNApm[J].BhmBph A,2011,1809(3):211G219.DOI: /.bbgm [15]LJ,HX,DY,.EdpdG pmbev71hd,dmhdg dgpdm HbP,Ch,2011[J]. VR,2012,169(1):195G202.DOI: / ( 下转第 1118 页 )

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽