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2 渔业科学进展 YUYE KEXUE JINZHAN 第 38 卷 第 5 期 中国科技核心期刊中文核心期刊 (CSCD) RCCSE (CNKI) ( ) (CODS) (ZR) (ASFA) (CSA) (UPD) 2017 年 10 月 (DOAJ) 目 次 研究论文双齿围沙蚕 (Perinereis aibuhitensis Grube) 典型自然栖息地的沉积环境特征 房景辉王海青方建光蒋增杰杜美荣高亚平周凯张丽瑶 (1) 美洲鲥 (Alosa sapidissima) 胚胎发育形态学及组织切片观察 高小强刘志峰黄滨王耀辉薛国平秦巍仑关长涛洪磊 (9) 鲈鲤 (Percocypris pingi) 染色体核型及 C- 带分析 黎树铁槐茂段靖赵仲孟杨淞郭秀兰杨世勇 (19) 养殖裸盖鱼 (Anoplopoma fimbria) 疥疮病病原菌的分离与鉴定 王晓冉陈四清莫照兰李贵阳刘长琳王有廷李杰黄倢 (25) 美洲黑石斑鱼 (Centropristis striata) 突眼症 的病原菌分离鉴定 陈建国陈超李炎璐孙曙光邵彦翔张廷廷刘莉孙涛 (32) 金乌贼 (Sepia esculenta) 早期发育阶段内壳形态学指标的主成分分析 李达刘长琳李昂杜腾飞柳淑芳庄志猛 (41) 黄斑篮子鱼 (Siganus oramin) 对北方养殖网箱网衣附着藻类的生物清除作用 吕旭宁蒋增杰方建光邹健房景辉高振锟姜娓娓郭晓亮 (50) 不同水泥类型混凝土人工鱼礁的生物附着效果... 李真真公丕海关长涛李娇王腾腾 (57) 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 工厂化养殖系统微藻的群落特征分析 沈明明李健王清印葛红星刘萍常志强 (64) 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 循环水养殖塘挂膜式生物滤器内微生物的多样性 张健龙江敏王城峰童晓岚金婧顾德平胡伟国于忠利戴习林 (73) 循环水养殖欧洲鲈鱼 (Dicentrarchus labrax) 重金属污染状况与富集分布特征 万慧珊程波宋晓红李乐宋怿 (83) 光照对不同规格番红砗磲 (Tridacna crocea) 氧 氨氮及活性磷酸盐代谢的影响 刘小霞李乐郑兴顾志峰刘春胜 (92) 复合益生菌制剂对大西洋鲑 (Salmo salar) 生长 消化酶和非特异性免疫指标的影响 刘淑兰陈娟李杰刘豪胡佳平张黎黎韩厚伟孙国祥王纯 (100) 脱脂磷虾粉对圆斑星鲽 (Verasper variegatus) 幼鱼生长 非特异性免疫力和血清生理代谢指标的影响 郑建明严俊丽陈四清常青王贞杰赵捷杰刘长琳胡建成 (107) 刺参 (Apostichopus japonicus) 9 月龄主要经济性状遗传力的估计 和飞王印庚廖梅杰李彬孙明超杜佗张文泽范瑞用 (114) 不同浒苔型饲料对幼刺参 (Apostichopus japonicus) 生长 消化及非特异性免疫的影响 李猛廖梅杰常青王印庚李彬荣小军高磊范瑞用 (122) 发酵豆粕替代藻粉对刺参 (Apostichopus japonicus) 生长及体组成的影响 李宝山张利民张德瑞孙永智王世信王际英 (130) 氟苯尼考对脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 免疫和抗氧化功能的影响 冯艳艳李健李吉涛许杨连春盎翟倩倩 (140) 致病性粪肠球菌对脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 免疫相关基因表达的影响 段亚飞李健李吉涛张喆刘萍 (148) 野生条斑紫菜 (Pyropia yezoensis) 叶状体对干出胁迫的抗氧化生理响应特征 李晓蕾汪文俊梁洲瑞刘福利孙修涛曹原姚海芹王飞久 (156) 基于钨丝原子阱与直接进样技术的原子荧光光谱法快速测定贝类中的镉 徐正翟明丽翟毓秀冯礼刘霁欣尚德荣赵艳芳宁劲松 (164) 期刊基本参数 :CN /S * 1980 * b * A4 * 170 * zh+en * p * * 800 * 21 *

3 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES CONTENTS Vol.38 No.5 October 2017 The Characteristics of the Sedimentary Environment in a Typical Habitat of Pernereis aibuhitensis Grube... FANG Jinghui, WANG Haiqing, FANG Jianguang, JIANG Zengjie, DU Meirong, GAO Yaping, ZHOU Kai, ZHANG Liyao (1) Morphological and Histological Observation of the Embryo of American Shad (Alosa sapidissima)... GAO Xiaoqiang, LIU Zhifeng, HUANG Bin, WANG Yaohui, XUE Guoping, QIN Weilun, GUAN Changtao, HONG Lei (9) The Karyotype and C-Banding of Percocypris pingi LI Shu, TIE Huaimao, DUAN Jing, ZHAO Zhongmeng, YANG Song, GUO Xiulan, YANG Shiyong (19) Isolation and Identification of Aeromonas salmonicida Associated with Furunculosis in Cultured Sablefish (Anoplopoma fimbria)... WANG Xiaoran, CHEN Siqing, MO Zhaolan, LI Guiyang, LIU Changlin, WANG Youting, LI Jie, HUANG Jie (25) Isolation and Classification of Exophthalmic Disease-Inducing Pathogenic Bacterium from Centropristis striata CHEN Jianguo, CHEN Chao, LI Yanlu, SUN Shuguang, SHAO Yanxiang, ZHANG Tingting, LIU Li, SUN Tao (32) Principal Component Analysis of the Morphometric Traits of the Cuttlebone of Sepia esculenta at Early Developmental Stages... LI Da, LIU Changlin, LI Ang, DU Tengfei, LIU Shufang, ZHUANG Zhimeng (41) Biological Control of Macroalgae Fouled on the Net of Marine Cage Using Siganus oramin in Northern China... LÜ Xuning, JIANG Zengjie, FANG Jianguang, ZOU Jian, FANG Jinghui, GAO Zhenkun, JIANG Weiwei, GUO Xiaoliang (50) Study on the Organisms Attachment of Artificial Reefs Constructed with Five Different Cements LI Zhenzhen, GONG Pihai, GUAN Changtao, LI Jiao, WANG Tengteng (57) Analysis of the Microalgae Community in Industrial Aquaculture Ponds of Pacific White Shrimp (Litopenaeus vannamei)... SHEN Mingming, LI Jian, WANG Qingyin, GE Hongxing, LIU Ping, CHANG Zhiqiang (64) Microbial Diversity in Bio-Filter of the Recirculating Aquaculture System for Litopenaeus vannamei... ZHANG Jianlong, JIANG Min, WANG Chengfeng, TONG Xiaolan, JIN Jing, GU Deping, HU Weiguo, YU Zhongli, DAI Xilin (73) Contamination and Accumulation of Heavy Metals in Dicentrarchus labrax Cultured in Recirculating Aquatic Systems WAN Huishan, CHENG Bo, SONG Xiaohong, LI Le, SONG Yi (83) Effects of Illumination and Size on Metabolism of Oxygen Consumption, Ammonia and Active Phosphate Excretion in Giant Clam Tridacna crocea... LIU Xiaoxia, LI Le, ZHENG Xing, GU Zhifeng, LIU Chunsheng (92) Effects of Complex-Probiotic-Preparation on the Growth, Digestive Enzymes and the Nonspecific Immune Indices of Atlantic Salmon (Salmo salar) LIU Shulan, CHEN Juan, LI Jie, LIU Hao, HU Jiaping, ZHANG Lili, HAN Houwei, SUN Guoxiang, WANG Chun (100) Effects of Dietary Skimmed Krill Meal on the Growth, Non-Specific Immunity and Serum Physiological Metabolism Indices of Juvenile Spotted Halibut (Verasper variegatus)... ZHENG Jianming, YAN Junli, CHEN Siqing, CHANG Qing, WANG Zhenjie, ZHAO Jiejie, LIU Changlin, HU Jiancheng (107) Estimation of the Heritability of Three Economic Traits in 9-month-old Sea Cucumber Apostichopus japonicus HE Fei, WANG Yingeng, LIAO Meijie, LI Bin, SUN Mingchao, DU Tuo, ZHANG Wenze, FAN Ruiyong (114) Effects of Different Diets Containing Enteromorpha prolifera on Growth, Digestion and Non-Specific Immunity of Juvenile Sea Cucumber (Apostichopus japonicus)... LI Meng, LIAO Meijie, CHANG Qing, WANG Yingeng, LI Bin, RONG Xiaojun, GAO Lei, FAN Ruiyong (122) Effects of the Fermented Soybean Meal as a Replacement of Algae Powder on the Growth Performance and Body Composition of Juvenile Sea Cucumber (Apostichopus japonicus)... LI Baoshan, ZHANG Limin, ZHANG Derui, SUN Yongzhi, WANG Shixin, WANG Jiying (130) Effects of Florfenicol on the Immune and Antioxidant Activities of Exopalaemon carinicauda FENG Yanyan, LI Jian, LI Jitao, XU Yang, LIAN Chunang, ZHAI Qianqian (140) The Expression Profiles of Immunity-Related Genes After Pathogenic Enterococcus faecalis Challenge in Exopalaemon carinicauda... DUAN Yafei, LI Jian, LI Jitao, ZHANG Zhe, LIU Ping (148) Antioxidant Physiological Characteristics of Wild Pyropia yezoensis Under Desiccation Stress LI Xiaolei, WANG Wenjun, LIANG Zhourui, LIU Fuli, SUN Xiutao, CAO Yuan, YAO Haiqin, WANG Feijiu (156) Rapid Determination of Cadmium in Shellfish Based on Direct Sampling Electrothermal Vaporization Atomic Fluorescence Spectrometry with a Tungsten Coil Trap... XU Zheng, ZHAI Mingli,... ZHAI Yuxiu, FENG Li, LIU Jixin, SHANG Derong, ZHAO Yanfang, NING Jinsong (164)

4 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 双齿围沙蚕 (Perinereis aibuhitensis Grube) * 典型自然栖息地的沉积环境特征 房景辉 1,4 王海青 1,3 方建光 1,4 蒋增杰 1,4 杜美荣 1,4 高亚平 1,4 周 凯 21 张丽瑶 5 (1. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛 ; 2. 农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室中国水产科学研究院东海水产研究所上海 ; 3. Norwegian University of Science and Technology, Department of Biology, Trondheim 7491, Norway; 4. 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室青岛 ; 5. 中国科学院大学中丹学院北京 ) 摘要在山东沿海选取了双齿围沙蚕 (Perinereis aibuhitensis Grube) 的典型栖息地 河口潮间带, 通过测定 分析不同潮区 ( 高潮区 中潮区和低潮区 ) 和同一潮区不同深度 (5 cm 15 cm 25 cm 和 50 cm) 沉积物中 H 2 S 有机物 碳 氮 含水率以及粒度等指标, 对其沉积环境特征进行了研究 结果显示, 高潮区沉积物 H 2 S 浓度显著低于其他 2 个潮区 (P<0.05),25 cm 深度处的沉积物 H 2 S 浓度显著高于其他深度 (P<0.05) 3 个不同潮区的间隙水中 H 2 S 浓度和含水率无显著性差异 (P>0.05), 不同深度沉积物的间隙水中 H 2 S 浓度和含水率也无显著性差异 (P>0.05) 低潮区有机物含量和氮含量显著低于中潮区和高潮区 (P<0.05), 不同潮区之间的碳含量无显著性差异 (P>0.05), 不同深度的沉积物中有机物含量 氮含量和碳含量随深度的增加而逐渐升高 粉砂在 3 个潮区以及各个潮区不同深度的沉积物中所占的比例均为最大, 砂所占比例最小 低潮区沉积物的中值粒径显著高于其他 2 个潮区 (P<0.05), 而不同深度沉积物的中值粒径无显著差异 (P>0.05) 实验显示, 本研究所选取的双齿围沙蚕典型自然栖息地沉积物中的 H 2 S 含量较高, 并且随沉积物深度的增加而逐渐升高 沉积物中的有机物和碳含量极显著相关, 碳氮含量显著相关 沉积物粒度分类属粘土质粉砂, 高潮区沉积物的中值粒径显著小于低潮区, 可能是造成高潮区沉积物的有机物含量和含水率显著高于低潮区的原因之一 关键词双齿围沙蚕 ; 沉积物 ;H 2 S; 有机物 ; 碳 ; 氮 ; 含水率 ; 粒度中图分类号 X826 文献标识码 A 文章编号 (2017) 双齿围沙蚕 (Perinereis aibuhitensis Grube) 广泛分布在我国沿海滩涂和河口区域 ( 张柏东等, 2013), 主要 摄取沉积物和其中的动植物碎片, 在近岸水域生态系统食物链的能量流动和物质循环中占有重要地位 其 * 农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室开放课题 (2013K06) 国家自然科学基金青年基金项目( ) 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室开放课题 (2016LMFS-A18) 山东省重点研发计划项目 (2016GSF115027) 和青岛海洋科学与技术国家实验室鳌山科技创新计划项目 (2015ASKJ02) 共同资助 [This work was supported by the Key Laboratory of East China Sea & Oceanic Fishery Resources Exploitation and Utilization, Ministry of Agriculture of China(2013K06), National Natural Science Foundation of China ( ), Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, P. R. China (2016LMFS-A18), the Key Research and Development Project of Shandong Province (2016GSF115027), and the Scientific and Technological Innovation Project Financially Supported by Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology (2015ASKJ02)]. 房景辉, hui861@163.com 1 通讯作者 : 周凯, 研究员, zhoukai69@126.com 收稿日期 : , 收修改稿日期 :

5 2 渔业科学进展第 38 卷 营养丰富, 是目前公认的鱼 虾 蟹等生物的最佳鲜活饵料 (Fish et al, 1989; 顾晓英等, 2002), 也是游钓业的 万能饵料, 国内和国际市场需求量大, 是我国重要的出口创汇产品 ( 冯善聪等, 2014) 近年来, 因其较高的经济价值, 双齿围沙蚕的养殖业发展很快, 在其自然栖息地滥采滥捕的现象也随之加重 目前, 关于双齿围沙蚕的研究已有较多报道, 其中涉及生物学特性 养殖技术 生理学 生态学等方面 ( 冷忠业等, 2001; 邓锦松等, 2006; 张青田等, 2008; 洪秀云等, 1982; 周一兵等, 2007; 赖祖鹏等, 2014; 雷艳等, 2013; 赵欢等, 2016) 同时, 双齿围沙蚕也具有重要的环境修复功能, 其对沉积环境的生物地球化学循环具有积极作用, 可以有效降低生源要素和硫化物在底质环境中的累积 ( 邓锦松等, 2006; 江小桃等, 2012), 通过生物扰动作用可以有效降低鱼类网箱养殖产生的残饵和粪便对底质环境的影响 ( 房景辉等, 2014) 作者前期研究发现, 双齿围沙蚕对 H 2 S 毒性的耐受能力很强, 这是否与其自然栖息环境特点有关? 以往研究中关于双齿围沙蚕自然栖息地沉积环境特点的研究很少, 缺少其栖息生物学数据 本研究通过对双齿围沙蚕自然栖息地沉积物中重要环境因子的调查研究, 分析不同因素的变化特征, 为其人工养殖 资源保护及科学研究提供参考资料 1 材料与方法 1.1 样品采集 2015 年 9 月, 在山东海阳市丁字湾白沙河河口 ( N, E) 的双齿围沙蚕自然栖息地, 使用滩涂柱状泥样采集和保存装置 ( 房景辉等, 2016) 分别在潮间带的高潮区 中潮区 低潮区 3 个区域采集 4 根直径为 5 cm 深度为 50 cm 的沉积物柱状样品 及时将保存装置用 PE 保鲜膜密封并放入保温箱, 带回实验室后立即进行分析测定 水率 烘干样品用研钵磨碎后取 1.5 g 左右于坩埚中, 450 条件下在马弗炉 (SX3-4-10X, 龙口市电炉制造厂 ) 里煅烧 6 h 后称重, 测定有机物含量 采用元素分析仪 (Vario Elementar, 德国 ) 测定烘干样品的碳 氮含量 不同深度样品的粒径采用马尔文激光粒度仪 (maz3000, Malvern, 英国 ) 进行测定 1.3 数据处理与分析采用 SPSS 13.0 统计分析软件分析数据, 采用双因素方差分析 (Two-way ANOVA) 检验不同潮区和深度对各参数的影响, 采用 Bonferroni 修正法修正显著水平, 以 P<0.05 作为差异显著水平 2 结果 2.1 H 2 S 沉积物中的 H 2 S 双因素方差分析显示, 沉积物中 H 2 S 浓度受潮区和深度影响显著 ( 潮区 : F=12.476, P<0.01; 深度 : F=7.791, P<0.01), 潮区和深度的交互作用显著 (F=6.716, P<0.01) 低潮区和中潮区 H 2 S 浓度没有显著性差异 (P>0.05), 高潮区 H 2 S 浓度显著低于其他 2 个潮区 (P<0.05) 沉积物中深度在 25 cm 处的 H 2 S 浓度显著高于其他深度 (P<0.05) 在低潮区, 随着深度的增加, 沉积物中的 H 2 S 浓度呈先升高后降低的变化趋势,25 cm 的 H 2 S 浓度显著高于其他深度 (P<0.01, 图 1) 在中潮区,H 2 S 浓度随着沉积物深度的增加而逐渐升高, 到 50 cm 处达到最大值并显著高于 5 cm 和 15 cm 处的 H 2 S 浓度 (P<0.01) 高潮区的 H 2 S 浓度随着深度的增加没有显著变化 (P>0.05) 1.2 样品分析与测定 在厌氧手套箱 (YQX-1, 长沙天创粉末技术有限公司 ) 进行 H 2 S 相关样品的测定操作 将柱状沉积物样品按深度分为 5 cm 15 cm 25 cm 和 50 cm, 使用微电极 (Unisense, 丹麦 ) 测定对应深度位于样品柱中部的 H 2 S 含量 采集不同深度沉积物于 10 ml 离心管中, 封口后在离心机 (L-550, 长沙湘仪离心机有限公司 ) 4000 r/min 离心 10 min, 使用微电极测定间隙水中的 H 2 S 含量 在不同深度取 5 g 左右沉积物样品, 使用电热恒温鼓风干燥箱 (DHG-9240A, 上海精宏实验设备有限公司 ) 在 70 下烘 72 h 至恒重, 测定沉积物含 图 1 不同潮区的不同深度沉积物中的 H 2 S 浓度 Fig.1 The concentration of hydrogen sulphide in the sediment at different depths of different tidal zones 图中不同字母表示相同潮区不同深度沉积物中的数据差异显著 (P<0.05) 下同 Data with different letters were significantly different among different depths in the same tidal zone (P<0.05). The same as below

6 第 5 期房景辉等 : 双齿围沙蚕 (Perinereis aibuhitensis Grube) 典型自然栖息地的沉积环境特征 间隙水中的 H 2 S 双因素方差分析显示, 不同潮区和深度对间隙水中 H 2 S 浓度无显著影响 ( 潮区 : F=0.735, P=0.493; 深度 : F=0.335, P=0.786), 并且两者无交互作用 (F=0.915, P=0.507) 3 个不同潮区间隙水中 H 2 S 浓度无显著性差异 (P>0.05) 不同深度沉积物的间隙水中 H 2 S 浓度无显著性差异 (P>0.05); 相同潮区不同深度的间隙水中,H 2 S 浓度也无显著性差异 (P>0.05, 图 2) 2.3 沉积物的碳氮含量 碳含量双因素方差分析显示, 潮区对沉积物中的碳含量影响不显著 (F=0.799, P=0.458), 而深度对沉积物中的碳含量影响显著 (F=3.760, P=0.019), 潮区和深度之间无交互作用 (F=2.329, P=0.053) 不同潮区之间的碳含量无显著差异 (P>0.05), 不同深度的沉积物中碳含量随深度的增加而升高,50 cm 深处的碳含量显著高于 5 cm 深处的碳含量 (P<0.05) 图 2 不同潮区的不同深度间隙水中的 H 2 S 浓度 Fig.2 The concentration of hydrogen sulphide in the pore water at different depths of different tidal zones 2.2 沉积物中的有机物含量双因素方差分析显示, 沉积物中有机物含量受潮区和深度影响显著 ( 潮区 : F=7.208, P<0.01; 深度 : F=5.026, P<0.01), 而潮区和深度之间无交互作用 (F=1.673, P=0.158) 低潮区的有机物含量显著低于中潮区和高潮区 (P<0.05), 深度在 50 cm 处的有机物含量显著高于其他深度的有机物含量 (P<0.05) 对于相同潮区 不同深度下沉积物的有机物含量来说, 每个潮区基本上都随着深度的增加有机物含量升高 低潮区 50 cm 深处沉积物的有机物含量显著高于 5 cm 处 (P<0.01, 图 3); 中潮区 50 cm 深处的沉积物中的有机物含量高于其他深度 ; 但高潮区不同深度的有机物含量无显著差异 (P>0.05) 图 3 不同潮区的不同深度沉积物中的有机物含量 Fig.3 The content of organic matter in the sediment at different depths of different tidal zones 表 1 不同潮区的不同深度沉积物中的碳含量 (%) Tab.1 The carbon content in the sediment at different depths of different tidal zones (Mean±SD) (%) 深度 Depth (cm) 低潮区 Low tidal zone 中潮区 Middle tidal zone 高潮区 High tidal zone ±0.012 a 0.830±0.025 a 1.000± ±0.022 b 0.910±0.035 a 1.053± ±0.035 b 0.960±0.061 ab 1.000± ±0.031 b 1.200±0.034 b 0.965±0.016 注 : 表中同一栏内带有不同字母的数据相互之间差异显著 (P<0.05) 下同 Note: Data with different letters were significantly different among different depths in the same tidal zone (P<0.05). The same as below 在低潮区,5 cm 深处的沉积物中的碳含量显著低于其他 3 个碳含量无显著性差异的区域 在中潮区,50 cm 深处的沉积物中碳含量显著高于 5 cm 深处的碳含量 (P<0.01) 而在高潮区, 不同深度的沉积物中碳含量之间无显著性差异 (P>0.05) 氮含量双因素方差分析显示, 沉积物中的氮含量受潮区和深度影响显著 ( 潮区 : F=6.938, P<0.01; 深度 : F=8.718, P<0.01), 而潮区和深度之间无交互作用 (F=2.322, P=0.054) 高潮区沉积物中的氮含量显著低于低潮区和中潮区 (P<0.05), 低潮区和中潮区沉积物的氮含量无显著性差异 (P>0.05) 不同深度的沉积物中氮含量随深度的增加而逐渐升高,50 cm 深处的氮 表 2 不同潮区的不同深度沉积物中的氮含量 (%) Tab.2 The nitrogen content in the sediment at different depths of different tidal zones (Mean±SD) (%) 深度 Depth (cm) 低潮区 Low tidal zone 中潮区 Middle tidal zone 高潮区 High tidal zone ±0.004 a 0.093±0.003 a 0.095± ±0.005 b 0.098±0.004 a 0.093± ±0.006 b 0.108±0.002 a 0.095± ±0.006 b 0.138±0.006 b 0.102±0.001

7 4 渔业科学进展第 38 卷 含量显著高于 5 cm 深处的氮含量 (P<0.05) 在低潮区,5 cm 深处沉积物中的氮含量显著低于其他 3 个深度的氮含量 (P<0.05); 而在中潮区,50 cm 深处沉积物中的氮含量显著高于其他 3 个区域 (P<0.05); 在高潮区, 各个深度的沉积物中氮含量无显著性差异 (P>0.05) 2.4 沉积物的含水率双因素方差分析显示, 潮区和深度对沉积物含水率无显著影响 ( 潮区 : F=2.528, P=0.095; 深度 : F=0.025, P=0.995), 潮区和深度之间无交互作用 (F=1.812, P= 0.126) 对于相同潮区 不同深度沉积物的含水率, 在低潮区深度为 15 cm 处的沉积物含水率显著高于 50 cm 处 (P<0.05, 图 4); 中潮区深度为 50 cm 处的沉积物含水率显著高于深度为 5 cm 处 (P<0.05); 高潮区不同深度的含水率无显著性差异 (P>0.05) 影响显著 (F=6.630, P<0.01), 而深度对沉积物的中值粒径无显著影响 (F=0.786, P=0.512), 潮区和深度之间无交互作用 (F=0.796, P=0.581) 沉积物中值粒径随着潮区的由低到高呈现逐渐减小的趋势, 低潮区沉积物的中值粒径显著高于其他两个潮区 (P<0.05) 不同深度下沉积物的中值粒径无显著差异 (P>0.05, 表 3) 表 3 Tab.3 深度 Depth (cm) 不同潮区的不同深度沉积物的中值粒径 (μm) The median diameter of sediment at different depths of different tidal zones (μm) 低潮区 Low tidal zone 中潮区 Middle tidal zone 高潮区 High tidal zone ±2.86 a 11.03± ± ±4.93 ab 10.02± ± ±3.52 ab 9.76± ± ±3.24 b 9.98± ±0.42 从沉积物粒度分布来看 ( 图 5), 粉砂在不同潮区和不同深度的沉积物中所占的比重均为最大 (66.77% 75.37%), 而砂含量最低, 均低于 20% 在相同潮区, 不同深度的同一沉积物类型的含量间均无显著差异 (P>0.05) 根据我国海洋调查规范(GB/T ), 此沉积物粒度分类均属粘土质粉砂 3 讨论 图 4 不同潮区的不同深度沉积物的含水率 Fig.4 The moisture content of the sediment at different depths of different tidal zones 2.5 沉积物粒度 双因素方差分析显示, 潮区对沉积物的中值粒径 硫化物以不同形式广泛存在于海洋底栖环境中, 在一些网箱自然栖息地的沉积物中硫化物含量可达 949 mg/kg 干重, 部分非网箱自然栖息地的硫化物含量也在 142 mg/kg 干重以上 ( 甘居利等, 2003) Abele- Oeschger(1996) 发现, 一些潮间带底质间隙水中的硫化物含量达到 665 µmol/l Miron 等 (1993) 在对 3 种沙蚕栖息环境中的硫化物水平进行研究时发现, Nereis succinea 和 N. diversicolor 生存环境间隙水中 Fig.5 图 5 不同潮区的不同深度沉积物的粒度 The grain size of sediment at different depths of different tidal zones

8 第 5 期房景辉等 : 双齿围沙蚕 (Perinereis aibuhitensis Grube) 典型自然栖息地的沉积环境特征 5 含有的可溶性硫化物最高可达 2000 µmol/l, 而 N.virens 生境中的硫化物水平低于 50 µmol/l 沙躅栖息地间隙水中硫化物的浓度为 µmol/l (Oeschger et al, 1992) 这些研究仅关注了可溶性硫化物的浓度, 忽略了毒性最强的 H 2 S 浓度, 而 H 2 S 浓度又与 ph 值等环境条件密切相关, 因此, 这就使以上研究难以比较相关物种生活环境中 H 2 S 的浓度 例如, 在 Wang 等 (1999) 有关硫化物毒性作用的综述中涉及 23 个种类对硫化物的毒性作用反应, 均没有给出 H 2 S 的具体浓度 但是, 可以根据实验所调整的 ph 值, 通过 H 2 S 的电离公式求出体系中 H 2 S 的浓度 (Knezovich et al, 1996) 通过计算,Polychaete nereis 在 H 2 S 浓度为 16.2 µmol/l 时的半致死时间为 24 d (Vismann, 1990); Rhepoxynius abronius 在 H 2 S 溶液中暴露 48 h 的半致死浓度和安全浓度分别为 50 和 45 µmol/l, 而 Eohaustorius estuarius 的 H 2 S 半致死浓度和安全浓度分别为 和 60 µmol/l (Knezovich et al, 1996) 相关研究较少直接测定沉积物中的 H 2 S 浓度, 而本研究中, 双齿围沙蚕自然栖息地沉积物 H 2 S 的最高浓度为 µmol/l, 间隙水的 H 2 S 浓度最高为 µmol/l, 因此, 双齿围沙蚕自然栖息地沉积物中的 H 2 S 含量较高, 甚至达到或接近某些多毛类的半致死浓度, 水生底栖多毛类的生存环境中 H 2 S 含量通常较高, 它们在长期进化过程中对 H 2 S 产生了较高的耐受能力 (Wang et al, 1999) 但本研究发现, 在同一栖息地的不同潮区和深度,H 2 S 的浓度是不同的 在低潮区和中潮区, 沉积物 H 2 S 的浓度随深度的增加而逐渐增加, 但在低潮区的 50 cm 深处,H 2 S 浓度显著下降 这是因为随深度增加, 环境还原性增强 ( 马洪波等, 2002),H 2 S 在还原性环境中更稳定, 低潮区 50 cm 深处已经超出了自然淤积的沉积物深度, 因此, 其 H 2 S 含量显著降低, 并且与高潮区沉积物的 H 2 S 含量相当 不考虑低潮区 50 cm 深处的 H 2 S 含量影响, 沉积物的 H 2 S 含量随潮区的降低而逐渐升高, 沉积物在空气中暴露的时间与潮区高低关系密切, 较高潮区的沉积物在空气中暴露时间要长于低潮区, 硫化物的氧化也更充分 本研究中, 沉积物的有机物含量为 2.47% 3.53%, 这与桑沟湾贝类 (3.25%±0.51%) 和藻类 (2.87%±0.54%) 养殖区表层沉积物的有机物含量相当 ( 姚永锋, 2014) 1), 说明双齿围沙蚕自然栖息地的有机物含量比较丰富, 保 证了其摄食需要 对于受人类活动影响较强的大鹏湾, 其 年间的总碳含量为 2.0% 2.6%, 显著高于本研究沉积物的碳含量 而本研究沉积物的氮含量又显著高于山东南部近海, 包括胶州湾内浅海 ( 吕桂才等, 2010), 而两者均低于胶州湾潮间带的沉积物氮含量 ( 吕欣欣等, 2008), 所以, 沉积物的有机质组分含量存在较大的随机性, 随不同区域环境特点而变化 沉积物中的有机物 碳和氮含量间往往存在较高的相关性 ( 吕桂才等, 2010; 李绪录等, 2012), 本研究中的有机物和碳含量极显著相关 (P<0.01), 碳氮含量显著相关 (P<0.05), 而有机物与氮含量相关性不显著 (P=0.092) 对于吞食沉积物的多毛类, 每天处理沉积物的量至少相当于其本身的体重 ( 干重 ) ( 张青田等, 2008), 双齿围沙蚕的颗粒分选行为可能发生在吞食沉积物之前, 并且双齿围沙蚕倾向于摄食粒径较小的沉积物颗粒 (Lopez et al, 1987) 张青田等(2008) 实验证明, 双齿围沙蚕摄食沉积物的平均粒径为 µm, 此粒度范围正好处在粉砂的粒度范围内, 而本研究的沉积物绝大部分是粉砂和粘土, 其中又以粉砂为主, 属于粘土质粉砂底质类型 (GBT ) 其中, 高潮区沉积物中粉砂和粘土所占比重高于低潮区 ; 砂占了很少的一部分, 由低潮区到高潮区砂的含量逐渐减少 由于沉积颗粒物越细小, 对有机物的富集能力越大, 因此, 沉积物中有机物的含量和沉积物的组分分布有关 ( 高建华等, 2007), 高潮区沉积物的中值粒径显著小于低潮区, 这可能是造成高潮区沉积物的有机物含量和含水率显著高于低潮区的原因之一 4 结论本研究通过对双齿围沙蚕典型自然栖息地沉积环境特点研究, 进一步明确了双齿围沙蚕的栖息环境中的 H 2 S 含量较高的环境特点, 有助于证明其较强的环境耐受性 H 2 S 含量随沉积物深度的增加而逐渐升高, 在双齿围沙蚕的栖息深度范围内,H 2 S 含量在中潮区和低潮区随深度的增加显著增加 沉积物中的有机物和碳含量极显著相关, 碳氮含量显著相关, 并且三者含量随着沉积物深度的增加呈现逐渐升高的趋势 沉积物粒度分类属粘土质粉砂, 高潮区沉积物的中值粒径显著小于低潮区, 可能是造成高潮区沉积物的有机物含量和含水率显著高于低潮区的原因之一 1) Yao YF. Feeding and sea ranching equipment of sea cucumber Apostichopas japonicus in Sungo Bay. Master s Thesis of East China University of Science and Technology, 2014, [ 姚永锋. 桑沟湾海区刺参摄食与笼养的初步研究. 华东理工大学硕士研究生学位论文, 2014, 13 21]

9 6 渔业科学进展第 38 卷 参考文献 Abele-Oeschger D. A comparative study of superoxide dismutase activity in marine benthic invertebrates with respect to environmental sulphide exposure. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 1996, 197(1): Deng JS, Ma S, Niu HX, et al. Effects of introduction of Perinereis aibuhitensis Grube on the sediment quality of shrimp ponds. Periodical of Ocean University of China, 2006, 36(SuppⅡ): [ 邓锦松, 马甡, 牛化欣, 等. 投放双齿围沙蚕对虾池底质的修复作用. 中国海洋大学学报, 2006, 36( 增刊 Ⅱ): ] Fang JH, Fang JG, Wang HQ, et al. A device for collecting and preserving mud sample in tidal flat , ZL [ 房景辉, 方建光, 王海青, 等. 一种滩涂柱状泥样采集和保存装置 , ZL ] Fang JH, Zhang JH, Wu WG, et al. Carbon and nitrogen budget and environmental optimization in an integrated cage culture model of Japanese flounder with Perinereis aibuhitensis. Journal of Fishery Science of China, 2014, 21(2): [ 房景辉, 张继红, 吴文广, 等. 双齿围沙蚕 牙鲆网箱综合养殖模型碳氮收支的实验研究. 中国水产科学, 2014, 21(2): ] Feng SC, Huang GQ, Lai ZP, et al. Tolerance studies on the temperature, salinity and desiccation in Perinereis aibuhitensis. Transactions of Oceanology and Limnology, 2014(1): [ 冯善聪, 黄国强, 赖祖鹏, 等. 双齿围沙蚕对温度 盐度和干露的耐受性研究. 海洋湖沼通报, 2014(1): ] Fish JD, Fish SA. Students guide to the seashore. London: Unwin Hyman Ltd, 1989 Gan JL, Lin Q, Huang HH, et al. Distribution, variation and pollution of the sulfide in surfacial sediment at cage culture area in Dapengao Bay. Journal of Fisheries of China, 2003, 27(6): [ 甘居利, 林钦, 黄洪辉, 等. 大鹏澳网箱自然栖息地底质硫化物分布 变化和污染分析. 水产学报, 2003, 27(6): ] Gao JH, Wang YP, Pan SM, et al. Source and distribution of organic matter in seabed sediments of the Changjiang River estuary and its adjacent sea area. Acta Geographica Sinica, 2007, 62(9): [ 高建华, 汪亚平, 潘少明, 等. 长江口外海域沉积物中有机物的来源及分布. 地理学报, 2007, 62(9): ] General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of PRC and Standard Administration of PRC. GB/T , Specifications for oceanographic survey Part 8: Marine geology and geophysics survey. Beijing: Standard Press of China, 2007, 1 85 [ 中华人民共 和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. GB/T , 海洋调查规范第 8 部分 : 海洋地质地球物理调查. 北京 : 中国标准出版社, 2007, 1 85] Gu XY, Jiang XM, Zheng ZM. Biological characteristics of Perinereis aibuhitensis Grube and status of its utilization. Modern Fisheries Information, 2002, 17(8): [ 顾晓英, 蒋霞敏, 郑忠明. 双齿围沙蚕 (Perinereis aibuhitensis Grube) 的生物学特征和开发利用现状. 现代渔业信息, 2002, 17(8): 33 34] Hong XY, Tan KF. A study on the life history of Pernereis aibuhitensis Grube and the morphology of the mature maternal body. Journal of Fisheries of China, 1982, 6(2): [ 洪秀云, 谭克非. 双齿围沙蚕的研究 生活史及异沙蚕体形态研究. 水产学报, 1982, 6(2): ] Jiang XT, Tan YH, Ke ZX, et al. Effects of introduction of Perinereis aibuhitensis and Sargassum hemiphyllum on nitrogen and phosphorus in overlying water. Journal of Tropical Oceanography, 2012, 31(4): [ 江小桃, 谭烨辉, 柯志新, 等. 投放双齿围沙蚕和马尾藻对养殖底泥上覆水氮 磷含量的影响. 热带海洋学报, 2012, 31(4): ] Knezovich JP, Steichen DJ, Jelinski JA, et al. Sulfide tolerance of four marine species used to evaluate sediment and pore-water toxicity. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 1996, 57(3): Lai ZP, Feng SC, Liang WQ, et al. Acute toxicity of several conventional disinfectants to sand worm Perinereis aibuhitensis. Fisheries Science, 2014, 33(3), [ 赖祖鹏, 冯善聪, 梁伍气, 等. 几种常用消毒剂对双齿围沙蚕的急性毒性试验. 水产科学, 2014, 33(3), ] Lei Y, Song YY, Wang LL, et al. Preliminary study on effects of cadmium on metallothionein like protein content in Perinereis aibuhitensis. Modern Agricultural Sciences and Technology, 2013(11), [ 雷艳, 宋莹莹, 王丽丽, 等. 镉对双齿围沙蚕类金属硫蛋白诱导的初步研究. 现代农业科技, 2013(11), ] Leng ZY, Yu TF. Artificial breeding of Perinereis aibunitensis and culture test. Fisheries Science, 2001, 20(1): 30 [ 冷忠业, 于天飞. 双齿围沙蚕人工育苗及养殖试验. 水产科学, 2001, 20(1): 30] Li XL, Zhou YP, Xia HY. Multi-year measurements of carbon, nitrogen and phosphorus and sources of organic matter in the surface sediments of the Mirs Bay. Acta Scientiae Circumstantiae, 2012, 32(5): [ 李绪录, 周毅频, 夏华永. 大鹏湾表层沉积物中碳 氮 磷的多年调查结果和有机质来源分析. 环境科学学报, 2012, 32(5): ] Lopez GR, Levinton JS. Ecology of deposit-feeding animals in

10 第 5 期房景辉等 : 双齿围沙蚕 (Perinereis aibuhitensis Grube) 典型自然栖息地的沉积环境特征 7 marine sediments. Quarterly Review of Biology, 1987, Lü GC, Zhang Z, Wang JT, et al. Distribution characteristics of carbon, nitrogen and phosphor in the sediments of southern Shandong adjacent seas. Marine Science, 2010, 34(9): 1 4 [ 吕桂才, 张哲, 王江涛, 等. 山东南部近海沉积物中碳 氮 磷的分布特征. 海洋科学, 2010, 34(9): 1 4] Lü XX, Zou L, Liu SM, et al. Preservation of organic carbon and chlorophylls in the intertidal sediments of Jiaozhou Bay. Marine Science, 2008, 32(5): [ 吕欣欣, 邹立, 刘素美, 等. 胶州湾潮间带沉积物有机碳和叶绿素的埋藏特征. 海洋科学, 2008, 32(5): 40 45] Ma H, Song J, Lu X. Nitrogen forms and decomposition of organic carbon in the southern Bohai Sea core sediments. Acta Oceanologica Sinica, 2002, 24(5): [ 马红波, 宋金明, 吕晓霞. 渤海南部海域柱状沉积物中氮的形态与有机碳的分解. 海洋学报, 2002, 24(5): 64 70] Miron G, Kristensen E. Factors influencing the distribution of nereid polychaetes: The sulfide aspect. Marine Ecology Progress Series, 1993, 93(7): Oeschger R, Vetter RD. Sulfide detoxification and tolerance in Halicryptus spinulosus (Priapulida): A multiple strategy. Marine Ecology Progress Series, 1992, 87(2): Vismann B. Sulfide detoxification and tolerance in Nereis (Hediste) diversicolor and Nereis (Neanthes) virens (Annelida: Polychaeta). Marine Ecology Progress Series, 1990, 59: Wang F, Chapman PM. Biological implications of sulfide in sediment: A review focusing on sediment toxicity. Environmental Toxicology and Chemistry, 1999, 18(11): Zhang BD, Lian B, Wang B, et al. PCR-DGGE analysis of immobilized microbial diversity in digestive tract of sand worm Perinereis aibuhitensis. Journal of Dalian Ocean University, 2013, 28(5): [ 张柏东, 连彬, 王斌, 等. 双齿围沙蚕消化道共栖微生物菌群多样性的 PCR-DGGE 分析. 大连海洋大学学报, 2013, 28(5): ] Zhang QT, Hu GK. Study on feeding natural sediment of Perinereis aibuhitensis. Journal of Tianjin University of Science & Technology, 2008, 23(3): [ 张青田, 胡桂坤. 双齿围沙蚕摄食自然沉积物的研究. 天津科技大学学报, 2008, 23(3): 26 29] Zhao H, Li WJ, Wan L, et al. Single and synergetic effects of heavy metal Cd(Ⅱ) and Cu(Ⅱ) stress on heat shock protein 70 (HSP70) gene expression in lugworm Perinereis aibuhitensis. Journal of Dalian Ocean University, 2016, 31(2): [ 赵欢, 李婉娟, 万良, 等. Cd(Ⅱ) Cu(Ⅱ) 胁迫对双齿围沙蚕热休克蛋白 70(HSP70) 基因表达的影响. 大连海洋大学学报, 2016, 31(2): ] Zhou YB, Yang DZ, Guan ZC, et al. Technique for artificial breeding and culture of Perinereis aibnhitensis Grube in ponds. Fisheries Science, 2007, 26(3): [ 周一兵, 杨大佐, 管兆成, 等. 双齿围沙蚕人工育苗和虾池养殖技术研究. 水产科学, 2007, 26(3): ] ( 编辑冯小花 )

11 8 渔业科学进展第 38 卷 The Characteristics of the Sedimentary Environment in a Typical Habitat of Pernereis aibuhitensis Grube FANG Jinghui 1,4, WANG Haiqing 1,3, FANG Jianguang 1,4, JIANG Zengjie 1,4, DU Meirong 1,4, GAO Yaping 1,4, ZHOU Kai 21, ZHANG Liyao 5 (1. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao ; 2. Key Laboratory of East China Sea & Oceanic Fishery Resources Exploitation and Utilization, Ministry of Agriculture, East Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai ; 3. Norwegian University of Science and Technology, Department of Biology, Trondheim 7491, Norway; 4. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao ; 5. University of Chinese Academy of Sciences, Sino-Danish College, Beijing ) Abstract Perinereis aibuhitensis Grube is an important feed for fish, shrimp, and crabs in the shores of China, and there have been extensive studies in biology, culturing technology and ecophysiology of this species. Although much less is known about their habitat environment, knowledge about this is important for us to better understand the biology of polychaete. In this experiment, we investigated various features of the sediments in different depths and tidal zones in a typical natural habitat of P. aibuhitensis, including hydrogen sulfide, organic matters, carbon, nitrogen, the moisture content, and the particle size. The results showed that the hydrogen sulfide concentration in the high tidal zone was significantly lower than those in the other two tidal zones (P<0.05). The hydrogen sulfide concentration was significantly higher in the depth of 25 cm than those in others (P<0.05). There was no difference in the hydrogen sulfide concentration and the moisture content of the pore water among three different tidal zones (P>0.05). There was also no difference in different depths (P>0.05). The contents of organic matters and nitrogen in the low tidal zone were significantly lower than those in the high and mid tidal zones (P<0.05). The levels of carbon were similar among different tidal zones (P>0.05). As the depth increased, the contents of organic matters and nitrogen in the sediment went up. The proportion of silt was the highest in all three tidal zones and in different depths of the same tidal zone, while the proportion of sand was the lowest. The median particle size in the low tide was higher than those in other two tidal zones (P<0.05). The median particle size remained unchanged in different depths (P>0.05). These results suggested that the hydrogen sulfide concentration was high in the sediment of the selected habitat of P. aibuhitensis. It became higher as the depth increased. There was a significant correlation between the contents of organic matters and carbon, and so were the contents of carbon and nitrogen. The dominant ingredient of the sediment was clayey silt. Compared to the low tidal zone, the high tidal zone had higher contents of organic matters and the moisture, which was probably caused by the smaller particles in this zone. Key words Pernereis aibuhitensis; Sediment; Hydrogen sulfide; Organic matter; Carbon; Nitrogen; Moisture content; Particle size 1 Corresponding author: ZHOU Kai, zhoukai69@126.com

12 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 美洲鲥 (Alosa sapidissima) 胚胎发育形态学 * 及组织切片观察 高小强 1 刘志峰秦巍仑 1,2 3 黄滨 1 关长涛 1 王耀辉洪磊 3 11 薛国平 (1. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛 ;2. 中国海洋大学水产学院青岛 ; 3. 江苏中洋集团股份有限公司南通 ;4. 海安县水产技术推广站南通 ) 4 摘要通过显微镜及连续切片技术, 研究了美洲鲥 (Alosa sapidissima) 胚胎发育过程中的形态学及组织学特征 结果显示, 在孵化温度为 (21.0±0.5) 的条件下, 美洲鲥受精卵经过 71 h 15 min 大量孵化出膜, 其胚胎发育阶段主要分为 6 个时期 受精卵第 1 5 次卵裂均为经裂, 第 6 次卵裂 (64 细胞期 ), 纬裂出现, 胚盘被分为外部的包被层和内部的深层细胞两部分 受精 6 h 2 min, 内外卵黄合胞体层形成 受精 7 h 40 min, 囊胚腔出现 受精 10 h 39 min, 胚盘下包 30%, 胚盾形成 ; 受精 14 h 50 min, 下包 50%, 三胚层形成 ; 受精 17 h 33 min, 下包 75%, 神经板形成 ; 受精 21 h 13 min, 下包 90%, 脑原基 视囊 脊索原基和体节出现 ; 受精 24 h 15 min, 完全下包, 神经胚 听囊 前脑 中脑及后脑出现 受精 24 h 55 min, 克氏囊形成 受精 35 h 44 min, 心脏和消化管出现 ;42 h 50 min 肾小管形成 ;47 h 35 min 克氏囊消失 ;60 h 15 min 角膜出现 70 h 15 min, 仔鱼大量出膜, 初孵仔鱼具有一个大而均质的卵黄囊, 上面布有明显的色素 美洲鲥胚胎发生发育的特征与大多数报道的硬骨鱼类类似, 但在分化发育的时序上具有较大的差异 关键词美洲鲥 ; 胚胎发育 ; 形态学 ; 组织学中图分类号 S917 文献标识码 A 文章编号 (2017) 胚胎发育是指鱼类雌 雄胚子发育成熟并排出体外, 在水环境或者在鱼体内受精, 形成受精卵, 进入卵膜内发育到仔鱼脱膜初孵或卵胎生鱼类的初产仔鱼的过程, 是鱼类早期生活史中的重要环节 目前, 大部分鱼类胚胎发育主要集中在形态学方面, 如酿白鱼 (Anabarilius grahami) (Ma et al, 2008) 驼背鲈 (Chromileptes altivelis) ( 张梦淇等, 2014) 波纹唇鱼 (Cheilinus undulatus) ( 陈猛猛等, 2015) 罗非鱼 (Oreochromis niloticus) (Morrison et al, 2001) (Rhinogobio ventralis) (, 2015) 等, 而鱼类胚胎发育组织学研究还较少 (Hall et al, 2004; 佟雪红等, 2011; 何滔, ) ) 研究鱼类胚胎发育组织学不仅可 * 青岛博士后应用研究项目 (Q ) 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项( ) 和江苏省国家长江珍稀鱼类工程技术研究中心培育点 (BM ) 共同资助 [This work was supported by Qingdao Postdoctoral Application Research Project (Q ), and the Central Level Scientific Research Institutes for Basic R&D Special Fund Business ( ), and Jiangsu Province Technology Infrastructure Construction Project (BM )]. 高小强, gao @163.com 1 通讯作者 : 洪磊, 助理研究员, honglei@ysfri.ac.cn 收稿日期 : , 收修改稿日期 : ) He T. Early development and related enzymatic activity in rock bream. Doctoral Dissertation of Chinese Academy of Sciences (Institute of Oceanology), 2011, [ 何滔. 条石鲷早期发育及相关酶活性的研究. 中国科学院研究生院 ( 海洋研究所 ) 博士研究生学位论文, 2011, 1 129]

13 10 渔业科学进展第 38 卷 以直观 清晰地了解胚胎期各个发育阶段的组织 器官及系统的发生发育特征, 掌握早期发生发育规律, 而且能解释鱼类早期生理机制, 揭示其早期生活史, 为提高和优化人工繁育和养殖技术提供重要的理论依据 美洲鲥 (Alosa sapidissima) 属于鲱形目 (Clupeiformes) 鲱科(Clupeidae) 西鲱属(Alosa), 是鲱形目中个体比较大的一种, 以浮游生物 小型鱼类及虾类为食 (Piper, 2003) 1), 主要生活在北美洲大西洋西岸 太平洋海岸及亚洲东南部等, 为典型的溯河产卵鱼类, 是北美地区重要的经济鱼类之一 (Jones et al, 1978; Evermann et al, 1986; Limburg et al, 2003) 自 21 世纪引入我国, 美洲鲥繁育及养殖技术逐渐成熟, 养殖规模及产量不断扩大, 已逐步成为我国濒临灭绝鲥 (Tenualosa reevesii) 的替代品, 成为市场上备受欢迎的名贵淡水鱼类之一 目前, 关于美洲鲥研究已有较多报道, 如美洲鲥受精孵化 ( 杜浩, 2005) 2) 苗种培育技术 ( 吴文化等, 2004) 早期器官发生(Gao et al, 2015; 高小强等, 2016) 和摄食特性 ( 高小强等, 2015) 等, 徐钢春等 (2012) 和洪孝友 (2011) 3) 对美洲鲥早期胚胎发育形态进行了初步观察 而对其胚胎发育的组织学研究还未见报道 本研究在形态学观察的基础上, 结合组织切片技术, 对美洲鲥胚胎发育各个阶段的组织器官的发生发育进行观察和描述, 旨在完善美洲鲥胚胎发育时序和丰富其早期发育生物学知识, 为美洲鲥的繁育及养殖提供相应的理论知识 1 材料与方法 1.1 亲鱼催产及孵化实验于 2015 年 5 月在江苏中洋集团繁育中心进行 挑选 3 4 龄以上体质健康 无伤病 发育较好的美洲鲥亲鱼放入到 700 m 3 室内水泥池中暂养, 水温控制在 采用 LHRH-A 2 ( 促黄体素释放激素 ) 和多巴胺拮抗物进行药物催产, 雌雄比例为 1 2 取同一批次受精卵, 转移到 400 L 锥形孵化缸中进行流水孵化, 水流速为 L/min, 微量充气, 以卵 上下浮动为宜, 孵化水温为 , 溶解氧为 mg/l, 及时吸出缸内坏死长霉卵 1.2 胚胎样品采集及观察根据洪孝友 (2011) 3) 及徐钢春等 (2012) 的研究结果, 划分美洲鲥胚胎发育时期 采用光学显微镜 (NIKON YS100) 对受精卵进行连续观察拍照, 以 50% 胚胎出现新特征作为该发育阶段的起始时间, 记录胚胎发育时间及各个发育时期典型特征, 并在各个发育时期分别取 粒受精卵, 蒸馏水冲洗干净, 用 Bouin s 液在室温条件下固定 24 h,70% 酒精洗涤多次后保存 常规乙醇梯度脱水 二甲苯透明及石蜡包埋, 运用 LeiCa RM2265 轮转式切片机进行连续切片, 切片厚度为 4 5 μm,h.e 染色, 中性树胶封片,NIKON YS100 显微镜下观察并拍照, 应用 Photoshop CS 5.0 软件对图片进行编辑 1.3 数据处理 SPSS 18.0 ± (Mean±SD) 2 实验结果 2.1 受精卵美洲鲥成熟卵呈卵圆形, 透明, 卵膜较薄, 卵径为 (3.09±0.08) mm, 不具油球, 为沉性卵 当卵受精后, 卵膜吸水膨胀, 膜质分离, 受精膜出现 ( 图 2-1) 1 h 后, 受精卵原生质开始由植物极向动物极流动 集中, 最终在动物极形成盘状胚盘, 此时, 具胚盘的动物极向下, 植物极向上 未受精的卵或者坏死卵为乳白色 2.2 分裂期 2 细胞期 (1 h 26 min): 像其他硬骨鱼类, 美洲鲥的卵裂属于典型的盘状不完全卵裂 卵裂在胚盘上进行, 第 1 次有丝分裂为径裂, 形成的径裂沟将胚盘分成 2 个大小相同的分裂球, 中心粒及纺锤丝清晰可见 ( 图 1-1 图 2-1) 1) Piper TD. Fecundity of American shad, Alosa sapidissima, in the Delaware and Hudson River, USA. Washington: University of Maryland, 2003, ) Du H. Studies on key techniques in incubation, culture and transportation of American shad Alosasa pidissima. Master's Thesis of Huazhong Agricultural University. 2005, [ 杜浩. 美洲鲥 (Alosa sapidissima) 人工孵化 养殖及转运关键技术的研究. 华中农业大学硕士研究生学位论文, 2005, 15 22] 3) Hong XY. Study on the morphogenesis and histology of the early American shad Alosa sapidissima. Master's Thesis of Shanghai Ocean University, 2011, [ 洪孝友. 美洲鲥早期发育的形态学及组织学观察. 上海海洋大学硕士研究生学位论文, 2011, 20 30]

14 第 5 期高小强等 : 美洲鲥 (Alosa sapidissima) 胚胎发育形态学及组织切片观察 11 4 细胞期 (1 h 57 min): 第 2 个分裂沟形成, 与第 1 个沟垂直径裂成大小相等的 4 个分裂球 ( 图 1-2) 8 细胞期 (2 h 25 min): 第 3 次分裂垂直于第 2 次分裂沟形成 2 个分裂面, 并与第 1 次分裂面平行, 位于第 1 次分裂沟的左右两侧, 分成前后排列的 8 个细胞 ( 图 1-3), 此时细胞大小出现差异 ( 图 2-3) 16 细胞期 (2 h 57 min): 第 4 次分裂产生 2 个分裂面, 与第 1 第 3 分裂面垂直, 与第 2 分裂面平行, 位于其左右两侧, 将胚盘分裂成 16 个细胞 ( 图 1-4), 其中,4 个为中央细胞,12 个为边缘细胞 32 细胞期 (3 h 25 min): 第 5 次卵裂形成 4 个分裂面, 与第 2 第 4 分裂面垂直, 而与第 1 第 3 分裂面平行, 将胚盘分成 32 个细胞 ( 图 1-5) 此时分裂的细胞在大小及形状上不规则 64 细胞期 (3 h 56 min): 自第 6 次分裂开始, 径裂和纬裂 2 种分裂方式同时进行, 可见明显的细胞边界 ( 图 1-6) 此时, 胚盘被分为 2 部分, 胚盘最外层细胞部分称为包被层, 将发育成胚胎表皮, 起保护胚胎的作用 ; 胚盘内层细胞称为包埋细胞, 为胚胎主体细胞 ( 图 2-4) 128 细胞期 (4 h 26 min): 此细胞分裂面在显微镜下已不能辨别, 细胞体积小, 分裂开始不同步 ( 图 1-7) 多细胞期 (4 h 55 min): 随着细胞分裂的进行, 胚盘分裂面越来越多, 细胞体积越来越小, 细胞间的界限变得模糊 ( 图 1-8) 胚盘外部的包被层细胞开始发育, 逐渐扁平化 ; 胚盘下方的边缘细胞与邻近的卵黄细胞开始融合, 融合后的胚层细胞核不断在卵黄细胞质中分裂, 且排列形成核环, 此时, 卵黄合胞体形成 ( 图 2-5), 该结构为硬骨鱼类所特有 2.3 囊胚期高囊胚期 (6 h 2 min): 此时期, 由于胚盘的高度分裂, 细胞急剧增多, 胚盘呈高帽状 ( 图 1-9) 随着胚盘发育的进行, 有些卵黄合胞体在胚盘底部向内迁移, 形成内部卵黄合胞体层 (I-YSL), 其始终存在于胚胎发育的整个过程中 ; 而另外一些向植物极移动, 并停留在胚层前缘, 形成外部卵黄合胞体层 (E-YSL) ( 图 2-6) 低囊胚期 (7 h 40 min): 此时期, 囊胚边缘细胞沿着卵黄囊表面开始下包延伸, 囊胚的高度逐渐降低, 成为低囊胚 ( 图 1-10) 在胚层和内部卵黄合胞体层之间, 可见椭圆形的腔, 即为囊胚腔 ( 图 2-7) 2.4 原肠期原肠早期 (0 20%):8 h 8 min, 通过外部合胞体的牵引作用, 囊胚包被层细胞沿着卵黄囊的表面开始 下包, 标志着原肠运动的开始 ( 图 1-11) 9 h 25 min, 随着包被层细胞的不断下包, 构成胚盘的细胞逐渐向胚盘边缘迁移 内卷, 形成了一个环形加厚的结构, 即为胚环, 此时胚环分为两层 : 上面一层为上胚层, 下面一层为下胚层 ( 图 2-8) 原肠中期 (30% 50%):10 h 39 min, 下包 30%, 在胚环向植物极运动的过程中, 上 下胚层的细胞同时向将发育成胚胎背部一侧插入, 形成一个加厚的区域, 为胚盾 ( 图 1-12) 此时胚环上胚层细胞进入胚盾, 形成胚盾的上胚层, 胚环下胚层细胞则形成胚盾下胚层 胚盾上胚层将发育成胚体外胚层, 下胚层发育为胚体中胚层和内胚层 14 h 50 min, 下包 50%, 随着细胞的继续下包, 胚盾不断伸长 ( 图 1-13), 其下胚层细胞继续向前端集中和延伸, 形成胚体中胚层, 胚体原基出现, 此时胚体三胚层形成 ( 图 2-9) 原肠末期 (75% 100%):17 h 33 min, 下包 75%, 细胞进一步向植物极下包, 中线处的外胚层细胞增生呈板状, 神经板形成 ( 图 1-14 图 2-10), 此时胚盘表面的包被层逐渐扁平化, 胚胎周皮形成 ( 图 2-10) 21 h 13 min, 下包 90%, 胚体卵黄囊几乎被包裹, 在植物极未被包围的卵黄部分称为卵黄栓或原口 ( 图 1-15) 神经板前端膨大形成脑原基 ( 图 2-11), 在脑原基两侧区域形成一对对称的囊状突起即视泡 ( 图 1-15 图 2-12) 脊索原基出现, 由大且圆的细胞构成 ( 图 2-13) 神经板细胞不断扩展 膨胀, 在脊索原基上侧形成一个龙骨状结构 (Neural keel)( 图 2-11 图 2-13), 为神经索前体 第 1 对体节出现 ( 图 2-14) 24 h 15 min, 胚盘下包完成, 原口封闭, 此时体节 3 对 ( 图 1-16a) 龙骨状结构在邻近细胞的迅速挤压下, 细胞粘贴在一起, 之后合并形成实心的细胞索, 原始的神经索形成 (Neural rod) ( 图 1-16b 图 2-15) 脊索原基细胞分化为两层细胞, 其背侧的细胞扁平化, 形成神经基板原基 ( 图 2-16) 在眼囊的后侧方, 听囊形成 ( 图 2-17) 此时, 脑在形态上分化为三部分 : 前脑 中脑和后脑 ( 图 2-18) 24 h 55 min, 克氏囊在尾芽上部出现 ( 图 1-17), 由背部的立方形内胚层细胞与内卵黄合胞体组成 ( 图 2-19) 2.5 器官分化期受精 26 h 23 min, 胚体进入器官分化期, 胚体体节继续增多, 视囊增大 脑在形态上分化成了端脑 前脑 中脑和后脑, 此时视泡外皮向内凹陷, 形成双层杯状结构即视杯 ; 贴近视杯的表皮外胚层逐渐增厚内陷入视杯, 形成晶状体泡 ( 图 2-20) 35 h 44 min, 心脏原基出现, 尾牙继续延伸 增长, 逐渐偏离卵黄

15 12 渔 Fig.1 业 科 学 进 展 第 38 卷 图 1 美洲鲥的胚胎发育 Embryonic development of American shad 1. 2 细胞期 2. 4 细胞期 3. 8 细胞期 细胞期 细胞期 细胞期 细胞期 8. 多细胞期 9. 高囊 胚期 10. 低囊胚期 11. 开始下包 12. 下包 30% 13. 下包 50% 14. 下包 75% 15. 下包 90% 16. 完全下包(16a. 体 节; 16b. 神经索) 17. 克氏囊出现 18. 器官分化期 19. 胚体扭动期 20. 孵化期 21. 初孵仔鱼 es. 胚盾 hp. 心脏原基 kv. 克氏囊 np. 神经板 nr. 神经索 op. 眼囊 so. 体节 yp. 卵黄栓 1: 2-cell stage; 2: 4-cell stage; 3: 8-cell stage; 4: 16-cell stage; 5: 32-cell stage; 6: 64-cell stage; 7: 128-cell stage; 8: Morula stage; 9: High blastula stage; 10: Low blastula stage; 11: Preliminary epiboly; 12: 30%-epiboly; 13: 50%-epiboly; 14: 75%-epiboly; 15: 90%-epiboly; 16: Complete epiboly (16a: somite; 16b: neural rod); 17: Kupffer s vesicle; 18: Segmentation period; 19: Twist stage of embryo; 20: Hatching period; 21: Newly-hatched larvae es: embrynic shield; hp: heart primordia; kv: Kupffer s vesicle; np: neural plate; nr: neural rod; op: optic vesicle; yp: yolk plug; so: somite

16 第5期 高小强等: 美洲鲥(Alosa sapidissima)胚胎发育形态学及组织切片观察 13

17 14 渔 Fig.2 业 科 学 进 展 第 38 卷 图 2 美洲鲥胚胎发育组织切片观察 Histological sections of the embryos of American shad 1. 所示受精卵的细胞质 2. 2 细胞期所示中心粒及纺锤丝 3. 8 细胞期 细胞期所示胚体外层的包被层及内部的深埋细胞 5. 多细胞期所示卵黄合胞体 6. 高囊胚期所示内外卵黄合胞体 7. 囊胚腔出现 8. 原肠早期所示上 下胚层 包被层和内卵 黄合胞体 9. 原肠中期所示三胚层 10. 周皮和神经板形成 11. 脑原基出现 12. 眼泡出现 13. 可见明显的脊索和龙骨样 14. 体节形成 15. 神经索出现 16. 神经基板出现 17. 听囊出现 18. 脑分化为三部分 19. 克氏囊出现 20. 所示端脑 间 脑 中脑和后脑 21. 神经索开始中空化 下脊索出现 22. 消化管出现 体节进一步增多 23. 原始视网膜形成 听囊开始中 空化 24. 神经管形成 脊索开始中空化 可见明显的消化管 25. 肌节形成 26. 围心腔形成 27. 可见完全分化的脑及明显 中空化的听囊 28. 原肾管出现 29. 肌节进一步增多 呈 V 型 30. 克氏囊退化 鳍褶出现 31. 围心腔进一步增大 32. 可 见晶状体立方上皮 脉络膜裂出现 33. 巩膜形成 可见晶状体纤维 Bi 囊胚腔 Bp 脑原基 Ce 小脑 Cen 中心粒 CF 脉络膜裂 Cue 立方上皮 DC 深埋细胞 Die 间脑 Dt 消化管 Ec 外胚层 En 内胚层 Ep 上胚层 ES 胚盾 Evl 包被层 E-Ysl 内卵黄合胞体 Fb 前中脑 Ff 鳍褶 Fp 神经基板 H 心 脏 Hb 后部脑 Hy 下胚层 Hyp 下脊索 I-Ysl 内卵黄合胞体 Kv 克氏囊 L 晶状体 LV 晶状体泡 Me 中胚层 Mb 中部脑 Mf 肌纤维 My 肌节 Nk 神经龙骨 No 脊索 Np 神经板 Nr 神经索 Nt 神经管 Op 眼泡 Opc 视杯 Otp 听板 Ov 听囊 Pe 周皮 Pd 原肾管 Pr 原生质 R 视网膜 sf 纺锤丝 So 体节 Sof 体节沟 Te 端脑 Y 卵黄囊 1. The fertilized ovum, showing the cytoplasmic streaming; 2. The centrioles and spindle fibre at 2-cell period; 3. 8-cell period; 4. Enveloping layer and deep cells at 64-cell period; 5. The multiple period showed the yolk syncytial layer; 6. The Internal syncytium and external syncytium were visible at high stage; 7. The blastocoel appeared; 8. Epiblast, hypoblast, enveloping layer and the Internal syncytium were obvious at early-gastrula; 9. The three germ layers differentiated at middle-gastrula; 10. The periderm and neural plate formed; 11. The brain primordium was visible; 12. The optic vesicle appeared; 13. The notochord and neural keel were obvious; 14. The somite formed; 15. The neural rod appeared; 16. The floor plate was present; 17. Otic placod formed; 18. The brain was differentiated into three parts; 19. Kupffer s vesicle appeared; 20. Telencephalon, diencephalon, mesencephalon and cerebellum were obvious; 21. The vacuolization of neural rod and hypochord were visible; 22. The digestive tube appeared and the somite increased; 23. The primitive retina and the vacuolization of otic placode were presented; 24. The neural tube formed, the vacuolization of notochord and digestive tube were obvious; 25. Myotome was visible; 26. Pericardial cavity formed; 27. The brain showed compelely development, the vacuolization of otic placode was obvious; 28. Pronephric duct appeared; 29. The increase of myotome; 30. The degeneration of Kupffer s vesicle and fin fold were visible; 31. Pericardial cavity further increased; 32. The cubical epithelium of lens was seen and choroid fissure developed; 33. The cornea was formed and lens fibers were obvious Bi: blastocoel; Bp: brain primordium; Ce: cerebellum; Cen: centrioles; CF: choroid fissure; Cue: cubical epithelium; DC: deep cells; Die: diencephalon; Dt: digestive tube; Ec: ectoderm; En: endoderm; Ep: Epiblast; ES: Embryonic shield; Evl: Enveloping layer; E-Ysl: External syncytium; Fb: forebrain; Ff: fin fold; Fp: floor plate; H: heart; Hb: hindbrain; Hy: hypoblast; Hyp: Hypochord; I-Ysl: internal syncytium; Kv: Kupffer s vesicle; L: lens; LV: lens vesicle; Me: Mesoderm; Mb: midbrain; Mf: muscle fibres; My: myotome; Nk: neural keel; No: notochord; Np: neural plate; Nr: neural rod; Nt: neural tube; Op: optic vesicle; Opc: optic cup; Otp: otic placode; Ov: otic vesicle; Pe: periderm; Pd: pronephric duct; Pr: protoplasm; R: retina; sf: spindle fibre; So: somite; Sof: somitic furrow; Te: telencephalon; Y: yolk sac

18 第 5 期高小强等 : 美洲鲥 (Alosa sapidissima) 胚胎发育形态学及组织切片观察 15 囊 ( 图 1-18) 神经索中空化, 此时神经管形成, 脊索上部神经基板细胞继续扁平化, 而在脊索下部, 下脊索形成, 由单层扁平细胞构成 ( 图 2-21) 胚体体节进一步增多, 在胚体腹部, 原始的消化管出现, 由两层扁平细胞组成的狭缝 ( 图 2-22) 视杯内外两层细胞不断靠拢生长 增厚, 最终两层腔缝消失, 外细胞层发育成为视网膜色素上皮, 内细胞层发育成为原始的视网膜 此时晶状体泡开始分化, 晶状体内层细胞不断向内生长 延伸, 在中心部位聚集, 形成原始晶状体, 听囊开始中空化 ( 图 2-23) 38 h 35 min, 神经索中空化明显, 此时脊索开始空泡化, 消化管官腔增大 ( 图 2-24) 40 h 22 min, 体节细胞逐渐拉长 延伸, 形成肌纤维细胞 ( 图 2-25) 此时心脏开始跳动, 围心腔出现 ( 图 2-26) 42 h 50 min, 可见明显分化的脑和中空化的听囊及脊索 ( 图 2-27), 消化管腔进一步增大, 可见明显的立方上皮细胞, 在脊索下部 消化管上方, 肾管原基出现 ( 图 2-28) 44 h 15 min, 体节发育形成肌节, 在胚体上呈 V 型结构,V 型尖部方向朝向胚体的头部 ( 图 2-29) 胚体尾芽继续延伸, 在其外围尾鳍鳍褶出现, 此时克氏囊腔退化 ( 图 2-30) 47 h 35 min, 心脏跳动频繁, 围心腔逐渐增大 ( 图 2-31) 克氏囊消失 晶状体被单层立方上皮所包裹, 其内皮细胞增生 变长, 继续向内延伸, 形成初级晶状体纤维, 在眼腹面可见明显的脉络膜裂 ( 图 2-32) 胚体开始间歇性抽动, 开始进入孵化期 2.6 孵化期 60 h 15 min, 仔鱼出膜前期, 胚胎转动明显, 鳍原基全部出现 ( 图 1-19) 角膜在视网膜前缘的瞳孔处形成, 由单一的立方上皮构成 晶状体新生纤维继续向中央环绕 ( 图 2-33) 70 h 15 min, 仔鱼头尾剧烈摆动, 卵膜破裂, 仔鱼头部最先出膜, 仔鱼大量出膜 ( 图 1-20), 此时仔鱼卵黄囊较大, 附有轻微的色素, 卵黄囊内不具油球 ( 图 1-21) 3 讨论卵裂是在母型调控下进行的极其复杂协调的细胞性活动, 不同的生物种类, 卵裂的模式不同 卵中卵黄的含量多少及分布决定了卵裂发生的位置和卵裂球的大小 对于大多数硬骨鱼类而言, 卵均属于端黄卵, 受精卵的分裂方式为不完全卵裂, 而且由于种 间存在的差异性, 胚体细胞分裂的方式也具有一定的差别 本研究中, 美洲鲥从第 1 次到第 5 次的卵裂方式均为经裂, 自第 6 次开始出现纬裂 这与大菱鲆 (Scophthalmus maximus) ( 佟雪红等, 2010) 大西洋鳕 (Gadus morhua) (Hall et al, 2004) 和酿白鱼 (Ma et al, 2008) 类似 而条石鲷 (Oplegnathus fasciatus) 卵裂中直到第 5 次分裂 (32 细胞期 ) 才出现纬裂 ( 何滔, 2011) 1) ; 青鳉 (Oryzias latipes) 胚胎卵裂过程中第 1 次纬裂出现在第 5 次分裂 (Iwamatsu, 2004); 彼氏冰虎鱼 (Leucopsarion petersii) 纬裂出现的时间更早, 在第 3 次卵裂时出现 (Nakatsuji et al, 2009) 由此可见, 鱼类卵受精后的几次卵裂均为经裂, 且在形态发生上较为相似, 而纬裂的发生具有一定的时序性差异 胚胎神经胚由预定的原肠腔外胚层细胞分化而成, 其具有两种形成方式 : 初级神经胚形成即由脊索中胚层诱导外胚层细胞不断分裂 内陷, 同时与其表皮脱离 包裹形成中空的神经管 ; 而次级神经胚形成则是外胚层细胞向胚胎内部下陷形成实心的细胞索, 之后细胞索中心发生中空化继而形成神经管 对于大多数鱼类而言, 其神经胚形成均属于完全次级神经胚的形成方式 本研究中, 美洲鲥原始的神经索在胚体完全下包时出现, 此时为实心圆柱状 ; 在受精 35 h 44 min 后, 实心的神经索中空化, 此时, 胚体神经管形成, 为典型的次级神经胚 这与条石鲷 ( 何滔, 2011) 1) 大菱鲆 ( 佟雪红等, 2010) 和大西洋鳕 (Hall et al, 2004) 的结果类似 在胚胎发育过程中, 体节是暂时性结构, 其起源于胚体中胚层, 沿体轴两侧从前到后, 有顺序排列形成 ( 刘东, 2012) Hall 等 (2004) 对大西洋鳕的研究表明, 胚体在下包 45% 时, 第 1 对体节出现 大菱鲆 条石鲷和夏鲆 (Paralichthys dentatus) 第 1 体节均在胚体下包 90% 时形成 (Martinez et al, 2003; 佟雪红等, 2010; 何滔, 2011) 1), 而纹鳢 (Channa striatus) 斑马鱼 (Brachydanio rerio) 和青鳉的第 1 体节在胚体完全下包时形成 (Iwamatsu, 2004; Kimmel et al, 1995; Marimuthu et al, 2007) 本研究中, 美洲鲥第 1 体节在胚体下包 90% 出现, 这与大菱鲆 条石鲷和夏鲆的结果类似, 由此可见, 鱼类体节形成时间具有种的差异性 胚胎体节能够分化出肌节和生骨节等细胞, 对早期仔稚鱼骨骼和肌肉的分化发育具有重要的影响 (Hall et al, 2004) 而且 Morin-Kensicki 等 (1997) 也指 1) He T. Early development and related enzymatic activity in rock bream. Doctoral Dissertation of Chinese Academy of Sciences (Institute of Oceanology), 2011, [ 何滔. 条石鲷早期发育及相关酶活性的研究. 中国科学院研究生院 ( 海洋研究所 ) 博士研究生学位论文, 2011, 1 129]

19 16 渔业科学进展第 38 卷 出, 在斑马鱼胚体发育过程中, 一些体节细胞对血管的发育具有一定的作用 此外, 在硬骨鱼类中, 体节最终的数目也具有一定的差异, 如大西洋鳕体节共 52 对 (Hall et al, 2004), 大西洋鲱 (Clupea harengus) 体节总数为 62 对 (Hill et al, 1997), 大西洋鲑 (Salmo salar) (Gorodilov, 1996) 和海鳟 (Salmo trutta) 体节总数均为 60 对 (Killeen et al, 1999), 斑马鱼则为 32 对 (Kimmel et al, 1995) 本研究中, 美洲鲥体节总数为 55 对 这可能与养殖温度或者盐度有关 (Hempel et al, 1961) 克氏囊是胚体发育阶段存在的一种暂时性的结构, 位于胚胎后端腹面, 靠近尾芽, 为鱼类所特有, 其随着胚胎的生长发育逐渐退化 本研究中, 受精后 24 h 55 min, 克氏囊在胚体尾芽上方出现, 为一个透明的球形, 在 47 h 35 min 退化消失, 历经大约 22 h 有研究表明, 克氏囊能够通过调节囊内液体的定向流动来保证胚体左右对称性发育 (Essner et al, 2005; Okabe et al, 2008) 也有研究表明, 构成克氏囊的细胞参与了胚体消化管的形成, 因此, 认为早期克氏囊的出现可能与营养物质的消化吸收有关 (Rosenthal et al, 1973; Brummett et al, 1978) 然而, 关于克氏囊在胚胎发育过程出现的机制及功能仍然不清楚 美洲鲥受精后 35 h 44 min, 心脏原基出现 ;40 h 22 min, 围心腔出现, 心脏开始跳动, 在消化管上方一对肾管原基形成, 此时可见微弱的体液循环 大多数硬骨鱼类胚胎心跳初期并没有功能性的鳃和血细胞, 不能进行气体交换作用, 因此, 早期的循环系统可能与代谢废物的运输及卵黄营养物质的吸收有关 (Isogai et al, 2001; Hall et al, 2004) 大多数硬骨鱼类的眼囊原基出现在原肠晚期, 在器官分化期开始分化形成原始的视网膜和晶状体 条石鲷受精 10.5 h 后胚胎发育至原肠晚期, 眼囊原基出现, 至 15.5 h 后胚胎器官开始分化, 原始视网膜及晶状体形成, 受精 22 h 后, 胚胎发育至孵化期, 角膜在脉络膜裂口处形成 ( 何滔等, 2012) 大西洋鳕也具有类似的发育特点 (Hall et al, 2004) 本研究中, 美洲鲥受精 21 h 13 min, 胚盘下包 90%, 眼囊原基出现, 受精 35 h 44 min 后, 器官开始分化, 原始的视网膜和晶状体形成, 受精 60 h 15 min, 仔鱼出膜前期, 角膜形成 由此可见, 未分化的视网膜 晶状体及角膜构成了初孵仔鱼最原始的视觉系统 然而, 在河川沙塘鳢 (Odontobutis potamophila) 的研究发现, 受精后 141 h, 原始视网膜及晶状体出现 ;213 h, 晶状体开始分化, 角膜 巩膜明显, 此时视网膜分化为 6 层 ;376 h, 胚胎进入孵化前期, 角膜分化为 5 层, 视网膜分化为 10 层, 虹膜 脉络膜明显 可见, 河川沙塘鳢在孵 化前, 眼各个组织结构均开始分化发育, 初孵仔鱼已 经具备了较为完善的视觉系统 ( 胡先成等, 2007) 这种 发育模式可能与鱼类的生活环境及种质间的差异有关 参考文献 Brummett AR, Dumont JN. Kupffer s vesicle in Fundulus heteroclitus: A scanning and transmission electron microscope study. Tissue & Cell, 1978, 10(1): Chen MM, Luo J, Chen GH, et al. Embryonic development and morphologic observation of newly-hatched Cheilinus undulatus larvae. Progress in Fishery Sciences, 2015, 36(5): [ 陈猛猛, 骆剑, 陈国华, 等. 波纹唇鱼 (Cheilinus undulatus) 的胚胎发育及初孵仔鱼的形态观察. 渔业科学进展, 2015, 36(5): 38 44] Essner JJ, Amack JD, Nyholm MK, et al. Kupffer's vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut. Development, 2005, 132(6): Evermann BW, Jordan DS. The fishes of north and middle America: A descriptive catalogue of the species of fish-like vertebrates found in the waters of North America, North of the Isthmus of Panama (Volume 1). Washington: Government Printing Office, 1986: Gao XQ, Hong L, Liu ZF, et al. An integrative study of larval organogenesis of American shad Alosa sapidissima, in histological aspects. Chinese Journal of Oceanology & Limnology, 2015, 34(1): 1 17 Gao XQ, Hong L, Liu ZF, et al. The definition of point of no return of larvae and feeding characteristics of Alosa sapidissima larvae and juvenile. Journal of Fisheries of China, 2015, 39(3): [ 高小强, 洪磊, 刘志峰, 等. 美洲西鲱仔鱼不可逆点及仔 稚鱼摄食特性研究. 水产学报, 2015, 39(3): ] Gorodilov YN. Description of the early ontogeny of the Atlantic salmon, Salmo salar, with a novel system of interval (state) identification. Environmental Biology of Fishes, 1996, 47(47): Guan M, Xiao K, Hu MH, et al. Study on the embryonic and early larval development of Rhinogobio ventralis. Progress in Fishery Sciences, 2015, 36(4): [, 衎,,. (Rhinogobio ventralis)., 2015, 36(4): 57 64] Hall TE, Smith P, Johnston IA. Stages of embryonic development in the Atlantic cod Gadus morhua. Journal of Morphology, 2004, 259(3): He T, Xiao ZZ, Liu QH, et al. Histological observation of eye ontogeny in rock bream larvae (Oplegnathus fasciatus). Marine Sciences, 2012, 36(3): [ 何滔, 肖志忠, 刘清华, 等. 条石鲷视觉器官早期发育的组织学观察. 海洋科

20 第 5 期高小强等 : 美洲鲥 (Alosa sapidissima) 胚胎发育形态学及组织切片观察 17 学, 2012, 36(3): 49 53] Hempel G, Blaxter JHS. The experimental modification of meristic characters in herring (Clupea harengus L.). ICES Journal of Marine Science, 1961, 26(3): Hill J, Johnston IA. Temperature and neural development of the Atlantic herring (Clupea harengus, L.). Comparative Biochemistry & Physiology Part A Physiology, 1997, 117(4): Hu XC, Zhao YL. Visual organ development and its relationship with feeding of Odontobutis potamophila. Chinese Journal of Zoology, 2007, 42(5): [ 胡先成, 赵云龙. 河川沙塘鳢视觉器官的发育及其与摄食的关系. 动物学杂志, 2007, 42(5): 41 48] Isogai S, Horiguchi M, Weinstein BM. The vascular anatomy of the developing zebrafish: An atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology, 2001, 230(2): Iwamatsu T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mechanisms of Development, 2004, 121(8): Jones PW, Martin FD, Hardy JD. Development of fishes of the mid-atlantic Bight. An atlas of egg, larval and juvenile stages. Volume 1. Acipenseridae through Ictaluridae. Fish and Wildlife Service/Office of Biological Services, Center for Environmental and Estuarine Studies of University of Maryland. Contribution, 1978, No. 783, Killeen JR, McLay HA, Johnston IA. Temperature and neuromuscular development in embryos of the trout (Salmo trutta L.). Comparative Biochemistry and Physiology Part A Molecular & Integrative Physiology, 1999, 122(1): Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics an Official Publication of the American Association of Anatomists, 1995, 203(3): Limburg KE, Hattala KA, Kahnle A. American shad in its native range. In : Limburg KE, Waldman JR eds. Biodiversity, status, and conservation of the world s shads. American Fisheries Society Symposium, 35, Bethesda, Maryland, 2003, Liu D. Blocking connexin43 expression caused abnormal zebrafish posterior somites development. Journal of Nantong University (Medical Sciences), 2012, 31(6): [ 刘东. Connexin43 基因表达下调导致斑马鱼胚胎后部体节发育异常. 南通大学学报 ( 医学版 ), 2012, 31(6): ] Ma L, Pan XF, Wei YH, et al. Embryonic stages and eye-specific gene expression of the local cyprinoid fish Anabarilius grahami in Fuxian Lake, China. Journal of Fish Biology, 2008, 73(8): Marimuthu K, Haniffa MA. Embryonic and larval development of the striped snakehead Channa striatus. Taiwania, 2007, 52(1): Martinez GM, Bolker JA. Embryonic and larval staging of summer flounder (Paralichthys dentatus). Journal of Morphology, 2003, 255(2): Morin-Kensicki EM, Eisen JS. Sclerotome development and peripheral nervous system segmentation in embryonic zebrafish. Development, 1997, 124(1): Morrison CM, Miyake T, Wright JR. Histological study of the development of the embryo and early larva of Oreochromis niloticus. Journal of Morphology, 2001, 247(2): Nakatsuji T, Kitano T, Akiyama N, et al. Ice goby (Shiro-uo), Leucopsarion petersii, may be a useful material for studying teleostean embryogenesis. Zoologicalence, 2009, 14(Jun 1997): Okabe N, Burdine RD. Fluid dynamics in zebrafish Kupffer s vesicle. Developmental Dynamics an Official Publication of the American Association of Anatomists, 2008, 237(12): Rosenthal H, Fond M. Biological observations during rearing experiments with the garfish Belone belone. Marine Biology, 1973, 21(3): Tong XH, Ma DY, Xu SH, et al. Morphological and histological development of the embryo of turbot Scophthalmus maximus. Oceanologia Et Limnologia Sinica, 2011, 42(6): [ 佟雪红, 马道远, 徐世宏, 等. 大菱鲆 (Scophthalmus maximus) 胚胎发育的形态学和组织学研究. 海洋与湖沼, 2011, 42(6): ] Wu WH, Wang B, Shi W, et al. Study on culture technology of American shad (Alosa sapidissima) on a large scale I. juveniles culturing. Chinese Journal of Fisheries, 2004, 17(2): [ 吴文化, 王斌, 师伟, 等. 美洲鲥鱼苗种规模化养殖技术研究 稚鱼培育. 水产学杂志, 2004, 17(2): 61 64] Xu GC, Zhang CX, Zheng JL, et al. Artificial propagation and embryonic development of American shad, Alosa sapidissima. Marine Sciences, 2012, 36(7): [ 徐钢春, 张呈祥, 郑金良, 等. 美洲鲥的人工繁殖及胚胎发育的研究. 海洋科学, 2012, 36(7): 89 96] Zhang MQ, Chen C, Li YL, et al. Developmental and morphological characteristics of embryo, larval, juvenile, and young fish, Chromileptes altivelis. Progress in Fishery Sciences, 2014, 35(5): [ 张梦淇, 陈超, 李炎璐, 等. 驼背鲈 (Chromileptes altivelis) 的胚胎发育及仔 稚 幼鱼形态观察. 渔业科学进展, 2014, 35(5): ] ( 编辑冯小花 )

21 18 渔业科学进展第 38 卷 Morphological and Histological Observation of the Embryo of American Shad (Alosa sapidissima) GAO Xiaoqiang 1, LIU Zhifeng 1,2, HUANG Bin 1, WANG Yaohui 3, XUE Guoping 4, QIN Weilun 3, GUAN Changtao 1, HONG Lei 11 (1. Key Laboratory for Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Key Laboratory for Marine Fish Breeding and Biotechnology, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao ; 2. Fisheries College, Ocean University of China, Qingdao ; 3. Jiangsu Zhongyang Group, Nantong ; 4. Haian Aquatic Product Technology Promotion Department, Nantong ) Abstract American shad (Alosa sapidissima) is an abundant anadromous clupeid that is found along both coasts of the United States and part of South Canada. This fish species has high economical and ecological values. Because of its size, market demand and high economic value, the amount of American shad has quickly increased since it was introduced into China. At present, the species has become an important candidate for aquaculture. However, the study about the embryonic development of A. sapidissima is still lacking. Here we observed the morphological and histological characteristics of the embryonic development using microscope and paraffin sectioning. The results showed that at (21.0±0.5), the hatching occurred at 71 h 15 min after fertilization. The embryogenesis of A. sapidissima was divided into six main stages. The longitudinal fissure was observed from the first to the fifth cleavage; after that the horizontal cleavage was visible at the sixth cleavage (64-cell stage); and then the blastoderm differentiated into the enveloping layer at periphery and the deep cells in the center. At 6 h 2 min after fertilization, the internal syncytium and external syncytium were visible at high stage. At 7 h 40 min, the blastocoel was obvious in the blastula stage. At 10 h 39 min, the embryonic shield formed at 30%-epiboly stage. At 14 h 50 min, the three germ layers differentiated at 50%-epiboly stage. At 17 h 33 min, the neural plate was formed at 75%-epiboly stage. At 21 h 13 min, the brain rudiment, optic capsule, notochord and somite formed at 90%-epiboly period. At 24 h 15 min, the neurula, otic vesicle, forebrain, midbrain and hindbrain were visible at 100%-epiboly period. At 24 h 55 min, Kupffer s vesicle appeared. At 35 h 44 min, the heart and digestive tube appeared. Pronephric tubule was formed at 42 h 50 min, and Kupffer s vesicle degenerated at 47 h 35 min after fertilization. The cornea was formed at 42 h 50 min after fertilization. A large number of larvae were spawned from the membrane at 70 h 15 min. The hatching larvae had a large and homogeneous yolk sac with pigment cluster. In conclusion, the embryonic development of A. sapidissima has a similar general pattern but different timing compared to other teleosts. Key words Alosa sapidissima; Embryonic development; Morphology; Histology 1 Corresponding author: HONG Lei, honglei@ysfri.ac.cn

22 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 鲈鲤 (Percocypris pingi) 染色体核型 * 及 C- 带分析 黎 树杨 1,2 铁槐茂段 1 3 淞郭秀兰 1 1 靖赵仲孟 11 杨世勇 1 (1. 四川农业大学动物科技学院成都 ;2. 四川大学生命科学学院成都 ; 3. 成都大学药学与生物工程学院成都 ) 摘要鲈鲤 (Percocypris pingi) 为长江上游特有鱼类及四川省重点保护鱼类, 为验证其倍性及丰富其细胞遗传学内容, 采用植物性血凝素 (PHA) 体内注射肾细胞直接制片法研究鲈鲤的核型, 采用改进的 BSG 法研究其 C- 带 结果显示, 鲈鲤的染色体数目为 98 条, 其核型公式为 4n=98=42m 30sm 10st 16t, 臂数 NF=170 本研究发现, 鲈鲤有 16 条端部着丝粒染色体, 未发现小染色体及其他异型性染色体 鲈鲤 C- 带带纹较丰富, 显示着丝粒带 端粒带和染色体居间带 3 种类型的 C- 带, 部分染色体同时含有多种类型的 C- 带着色, 如 m 2 st 4 同时含有以上 3 种 C- 带带纹类型 鲈鲤染色体异染色质含量高达 (58.824±0.034)% 本研究再次确认鲈鲤为四倍体, 同时指出其染色体具有一定的 可塑性, 反应出鲈鲤对于地区特化的生境具有较强的适应性 关键词鲈鲤 ; 核型 ;C- 带 ; 多倍化中图分类号 S917.4 文献标识码 A 文章编号 (2017) 鲈鲤 (Percocypris pingi) 隶属鲤科 (Cyprinidae) 鲃亚科 (Barbinae) 鲈鲤属(Percocypris), 又称江鳁 江鲤 花鲤及花鱼等, 主要分布于岷江 金沙江 雅砻江等长江上游及南盘江水系, 属长江上游珍稀特有鱼类及四川省重点保护鱼类, 也是产区重要的经济鱼类 ( 丁瑞华, 1994; 乐佩奇, 2000; 刘军, 2004) 目前, 关于鲈鲤的研究主要涉及遗传及种质特性 (Li et al, 2012; Deng et al, 2015; Li et al, 2014; 岳兴建等, 2015) 分类和系统演化 ( 崔桂华等, 1990; Wang et al, 2012) 早期发育 组织胚胎学 ( 马秀慧等, 2011; 何勇凤等, 2013; 王永明等, 2013) 及人工增养殖 ( 刘必生等, 2011; 鲁增辉等, 2011) 等方面 目前, 国内外关于鲈鲤染色体核型的研究仅见昝瑞光等 (1984), 但该文没有阐述近端部和端部着丝粒染色体, 核型图为手绘且无模式图, 且缺乏染色体 C- 带分析和辅助配对 本文研究了鲈鲤染色体核型及其 C- 带带纹的相关遗传学特性, 旨在为鲈鲤的种质资源保护及遗传育种提供一定基础资料 1 材料与方法 1.1 实验鱼样本鲈鲤采集自芦山宝剑渔业有限公司人工繁殖子一代个体, 体长为 (16.6±3.6) cm, 体重为 (64.7±11.3) g 1.2 染色体核型制备及观察采用略有改进的植物性血凝素 (PHA) 体内注射肾细胞直接制片法获得鲈鲤染色体中期分裂相 ( 林义浩, 1982), 采用 Olympus 倒置显微镜及其附属的 Nikon * 国家自然科学基金 ( ) 四川省科技厅应用基础研究(2015JY0206) 和四川农业大学大学生创新性实验计划 ( ) 共同资助 [This work was supported by National Science Foundation ( ), Applied Basic Research from Technological Office of Sichuan Province (2015JY0206), and Innovation Experimental Program for Undergraduate of Sichuan Agricultural University ( )]. 黎树, @qq.com 1 通讯作者 : 杨世勇, 副教授, yangshiyong@sicau.edu.cn 收稿日期 : , 收修改稿日期 :

23 20 渔业科学进展第 38 卷 拍照系统进行观察 拍照 染色体计数和臂长测量, 采用 Photoshop CS6 并辅以人工校正进行核型配对 1.3 染色体 C- 带显带及观察 在 Sumner(1972) 的 BSG 法 (Barium hydroxide/ Saline/Giemsa) 略加改进基础上进行鲈鲤染色体 C- 带显带, 镜检和拍照同 1.2 核型制备 2 结果 2.1 鲈鲤染色体数目 选取来自不同健康个体 分散程度好 形态清楚 便于计数的 30 个中期分裂相细胞, 用显微镜进行观察统计, 确定鲈鲤染色体数目为 98( 表 1) 表 1 鲈鲤染色体数目 Tab.1 Chromosome counts of P. pingi Chromosome number Individual number Frequency of occurrence (%) 鲈鲤染色体组型 结合本研究测量 计算结果及根据 Levan 等 (1964) 的染色体命名和分类标准, 得出鲈鲤染色体的相对长度和臂比 ( 表 2) 根据本实验结果中的染色体相对长度及臂比, 鲈鲤染色体可分为 4 组 ( 图 1), 其中,m 组为中部着丝粒染色体, 包括 42 条染色体 ;sm 组为亚中部着丝粒染色体, 包括 30 条染色体 ;st 为亚端部着丝粒染色体, 包括 10 条染色体 ;t 为端部着丝粒染色体, 有 16 条染色体 鲈鲤核型公式为 4n=98=42 m 30sm 10st 16t, 臂数 NF=170 在 m 组中, 有 3 对染色体较同组其他染色体大, 分别为 m 1 m 2 m 7 号 在 sm 组中,m 1 号染色体较同组其他染色体大 整个染色体组中, 共 8 条大染色体, 占所有染色体条数的 8.16% 未发现小染色体及其他异形染色体 鲈鲤染色体模式见图 2 本实验染色体组型结果显示, 鲈鲤近端部染色体仅 10 条, 端部着丝粒染色体多出 16 条 2.3 染色体 C- 带带型 鲈鲤的 98 条染色体均呈现出 C- 带着色 ( 图 3), 来自于同源染色体的 C- 带着色大小 位置和强度均非常接近, 而不同染色体之间的 C- 带强度及类型存在差异 鲈鲤染色体 C- 带可分为 3 种类型 :1 类含有着 表 2 鲈鲤染色体组型数据 Tab.2 The karyotype data of P. pingi 染色体编号 相对长度 ( 平均值 ± 标 No. of 准差 ) Relative chromosomes length (Mean±SD) 臂比 Arm ratio 染色体类型 Chromosome type ± m ± m ± m ± m ± m ± m ± m ± m ± m ± m ± m ± m ± m ± m ± m ± m ± m ± m ± m ± m ± m ± sm ± sm ± sm ± sm ± sm ± sm ± sm ± sm ± sm ± sm ± sm ± sm ± sm ± sm ± sm ± st ± st ± st ± st ± st ±0.10 t ±0.12 t ±0.10 t ±0.06 t ±0.10 t ±0.12 t ±0.04 t ±0.16 t

24 第5期 黎 树等: 鲈鲤(Percocypris pingi)染色体核型及 C-带分析 21 图 1 鲈鲤染色体核型 Fig.1 The karyotype of P. pingi Fig.2 图 2 鲈鲤染色体核型模式 The karyotype pattern of P. pingi 丝粒 C-带 2 类含有端粒 C-带 3 类含有居间带的 C-带 部分染色体同时含有多种类型的 C-带着色 其中 m2 sm2 sm5 st4 同时含有居间带和着丝粒 C-带带纹 m1 m2 m3 m7 m11 m12 m17 sm1 sm4 sm12 sm13 st2 st4 st5 同时含有居间带和端 粒 C-带纹带 m2 m9 m14 sm7 sm11 st4 同时含 有着丝粒带和端粒 C-带带纹 m2 st4 同时含有以上 3 种 C-带带纹类型 其中异染色质含量为(58.824± 0.034)% 根据以上观测和测量数据绘制鲈鲤核型模式图 详细区分和研究染色体上基因重复区段以及着丝点 位置与 C-带关系(图 4) 讨论 鲈鲤染色体核型特点及其多倍化 本研究结果显示 鲈鲤染色体核型公式为 4n 98= 42m 30sm 10st 16t 臂数 NF 170 与先前鲈鲤染 色体核型研究结果(昝瑞光等, 1984)相比 其主要差 异体现在是否有端部着丝粒染色体 昝瑞光等(1984)

25 22 渔 Fig.3 业 科 学 进 展 第 38 卷 图 3 鲈鲤染色体 C-带 The karyotype stained by C-banding of P. pingi Fig.4 图 4 鲈鲤 C-带模式 The C-banding karyotype of P. pingi 报道鲈鲤仅有 26 条近端部着丝粒染色体 无端部着 着丝粒染色体之间无明显着丝粒结构 染色体链接或随 丝粒染色体 而本研究发现鲈鲤有 16 条端部着丝粒 体结构形成 在昝瑞光等(1984)的报道中 云南光唇鱼 染色体和 10 条近端部着丝粒 初步分析这种差异的 (Acrossocheilus yunanensis) 泉水鱼(Pseudogyrinocheilus 原因可能有以下三方面 (1)在有丝分裂中期同源染色 procheilus)和墨头鱼(garra pingi pingi)等鲃亚科鱼类 体联会配对过程中 互相靠近较为紧密 在滴片制备 也未见端粒染色体存在 然而有研究发现 在云南光 染色体过程中同源染色体没有分开 导致视为近端部 唇鱼 泉水鱼 墨头鱼 华鲮(Sinilabeo rendahli)和白 着丝粒染色体 (2)部分同源染色体出现交叉互换过 甲鱼(Onychostoma sima)等鲃亚科鱼类及部分裂腹鱼 程 而秋水仙素处理时间和浓度过高 导致染色体融 亚科鱼类中均存在不同数量的端粒染色体(李渝成等, 合部分端部着丝粒互相拼接形成近端部着丝粒染色 1986; 武云飞等, 1999; 孔磊等, 2011) 可见 鲈鲤端 体 (3)由于其他遗传学影响因素 导致罗伯逊易位和 部着丝粒染色体确实存在 与先前研究差异的原因极 着丝点融合过程发生 进而出现无端部着丝粒情况 可能是染色体制备方法造成 此外 鲈鲤整个染色体 本研究通过不同浓度实验和大量观察 发现鲈鲤端部 组中 共有 8 条大染色体 占所有染色体条数的 8.16%

26 第 5 期黎树等 : 鲈鲤 (Percocypris pingi) 染色体核型及 C- 带分析 23 未发现小染色体及其他异形染色体, 与李渝成等 (1986) 研究原始鲃类特有大染色体结果相同 多倍化是水生动物进化过程中的一种常见现象 目前普遍认为, 鲤科鱼类二倍体基本染色体数为 50 或 48, 二倍体中 2n=50 为鲤科鱼类中最为原始的一类核型 (Arai, 1982; 周暾, 1984) 本研究结果显示, 鲈鲤有丝分裂中期染色体条数为 98, 与昝瑞光等 (1984) 的结果一致 同时, 鲈鲤属于原始鲃类进化分支中的一支, 与裂腹鱼亚科较为相似, 都具备大量单臂染色体 近端部和端部着丝粒染色体, 属鱼类原始物种的染色体特征 相关研究 ( 曹文宣等, 1981; 陈自明等, 2000) 表明, 原始鲃类生活于高寒地区, 其染色体由 2n= 加倍演化出现, 后来在进化或生活过程中, 染色体功能机构趋于完整或其他遗传学诱因, 染色体由罗伯逊易位或着丝粒融合导致 2n= 演化 本研究结合染色体数及其核型特征, 再次确认鲈鲤为四倍体 Deng 等 (2015) 筛选了 12 个四核苷酸重复的鲈鲤微卫星位点, 从分子遗传的角度也佐证了上述观点 3.2 C- 带特征及其遗传可塑性 C- 带是常用的染色体显带技术, 其基本原理是通 过着丝粒型的异染色质着色的强弱程度及带纹异同 分析染色体之间的细微差异 ( 卓孝磊等, 2007) 本研究中, 鲈鲤所有染色体均出现 C- 带阳性着色, 带纹丰富且多样化, 显示着丝粒带 端粒带和染色体居间带 3 种类型的 C- 带, 部分染色体同时含有多种类型的 C- 带着色, 如 m 2 st 4 同时含有以上 3 种 C- 带带纹类型 鲈鲤异染色质比例高达近 60%, 染色体 C- 带中, 和 47 号染色体有较为丰富的异染色质区段, 而异染色质区可能发生染色体突变而形成染色体重组或数量变化 (Charlesworth et al, 2005) C- 带带纹丰富及异染色质比例高等特征暗示鲈鲤的染色体具有一定的 可塑性, 从遗传角度也说明鲈鲤作为四倍体物种对于地区特化的生境具有较强的变异能力和适应性 同时, 鲈鲤丰富的 C- 带区段可为其遗传学和种质资源及良种选育提供参考 参考文献 Arai R. A chromosome study on two Cyprinid fishes, Acrossocheilus labiatus and Pseudorasbora pumila pumila, with notes on Eurasian Cyprinids and their karyotypes. Bulletin of the National Science Museum, 1982, 8: Cao WX, Chen YY, Wu YF, et al. Origin and evolution of Schizothoracine fishes in relation to the upheaval of the Xizang Plateau. Beijing: Science Press, 1981, [ 曹文宣, 陈宜瑜, 武云飞, 等. 裂腹鱼类的起源和演化及其与青藏高原隆起的关系. 北京 : 科学出版社, 1981, ] Charlesworth D, Charlesworth B, Marais G. Steps in the evolution of heteromorphic sex chromosomes. Heredity, 2005, 95: Chen ZM, Chen YF. Genetic relationships of the specialized Schizothoracine fishes inferred from random amplified polymorphic and analysis. Zoological Research, 2000, 21(4): [ 陈自明, 陈毅峰. 用 RAPD 技术对特化等级裂腹鱼类亲缘关系的探讨. 动物学研究, 2000, 21(4): ] Cui GH, Zhu XL. Differentiation and distribution of the cyprinid fish Percocypris pingi. Acta Zootaxonomica Sinica, 1990, 15(1): [ 崔桂华, 褚新洛. 鲤科鱼类鲈鲤的亚种分化和分布. 动物分类学报, 1990, 15(1): ] Deng Y, Yang K, Gan W, et al. Development of 12 tetranucleotide microsatellite markers for the tetraploidy fish Percocypris pingi (Tchang). Conservation Genetics Resources, 2015, 7(1): Ding RH. The fishes of Sichuan, China. Chengdu: Sichuan Publishing House of Science Technology, 1994, [ 丁瑞华. 四川鱼类志. 成都 : 四川科学技术出版社, 1994, ] He YF, Wu XB, Zhu YJ. Allometric growth pattern of Percocypris pingi pingi larvae. Chinese Journal of Zoology, 2013, 48(1): 8 15 [ 何勇凤, 吴兴兵, 朱永久. 鲈鲤仔鱼的异速生长模式. 动物学杂志, 2013, 48(1): 8 15] Kong L, Hu WG, Wang JJ, et al. Primary study on karyotype and C-banding of Gymnodiptychus dybowskii Kessler. Journal of Biology, 2011, 28(1): [ 孔磊, 胡文革, 王佳君. 新疆裸重唇鱼染色体的核型及 C- 带研究初报. 生物学杂志, 2011, 28(1): 34 36] Le PQ. Fauna sinica Osteichthyes Cypriniformes Ⅲ. Science Press, 2000, [ 乐佩奇. 中国动物志 硬骨鱼纲 鲤形目 ( 下卷 ). 北京 : 科学出版社, 2000, 47 48] Levan A, Fredga K, Sandberg AA. Nomenclature for centromeric position on chromosomes. Hereditas, 1964, 52(2): Li W, Pan L, Ren Z, et al. Development and characterization of twelve novel polymorphic microsatellite loci in the Percocypris pingi. Conservation Genetics Resources, 2014, 6(3): Li Y, Wang J, Peng Z. The complete mitochondrial genome of Percocypris pingi (Teleostei, Cypriniformes). Mitochondrial DNA, 2012, 24(1): Li YC, Li K, Jiang JQ, et al. Studies on the karyotypes of Chinese cyprinid fishes Ⅹ. Karyotypes of there tetraploid species in barbinae and one tetraploid specie in cyprininae. Acta Genetica Sinica, 1986, 7(2): [ 李渝成, 李康, 蒋建桥, 等. 中国鲤科鱼类染色体组型的研究 Ⅹ. 鲃亚科五种鱼和亚科四种鱼的染色体组型. 动物学研究, 1986, 7(2): ] Lin YH. A PHA injection method in vivo for the rapid obtainment of large numbers of metaphase figures from kidney cells of teleosts. Journal of Fisheries of China, 1982, 6(3): [ 林义浩. 快速获得大量鱼类肾细胞中期分裂相的 PHA 体内注射法. 水产学报, 1982, 6(3): ] Liu BS, Li J, Li ZY, et al. Fish rate, muscle nutrition composition and quality of Percocypris pingi pingi. Guizhou Agricultural

27 24 渔业科学进展第 38 卷 Sciences, 2011, 39(11): [ 刘必生, 李建, 李正友, 等. 鲈鲤含肉率及肌肉营养成分的测定与品质评价. 贵州农业科学, 2011, 39(11): ] Liu J. A quantitative analysis on threat and priority of conservation order of the endemic fishes in upper reaches of the Yangtze River. China Environmental Science, 2004, 24(4): [ 刘军. 长江上游特有鱼类受威胁及优先保护顺序的定量分析. 中国环境科学, 2004, 24(4): ] Lu ZH, Li W, Shi P. Study on composition and generation of predominant intestinal bacteria in cultured Percocypris pingi pingi. Freshwater Fisheries, 2011, 41(3): [ 鲁增辉, 李伟, 石萍. 养殖鲈鲤肠道优势菌群组成及来源分析. 淡水渔业, 2011, 41(3): 29 33] Ma XH, Ren S, Wang ZJ. Histological studies on digestive system of young Percocypris pingi. Guizhou Agricultural Sciences, 2011, 39(3): [ 马秀慧, 任爽, 王志坚. 鲈鲤幼鱼消化系统的组织学研究. 贵州农业科学, 2011, 39(3): ] Sumner AT. A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin. Experimental Cell Research, 1972, 75(1): Wang X, Gan X, Li J, et al. Cyprinid phylogeny based on Bayesian and maximum likelihood analyses of partitioned data: Implications for Cyprinidae systematics. Science China Life Sciences, 2012, 55(9): Wang YM, Yue XJ. Embryonic development of Percocypris pingi. Sichuan Journal of Zoology, 2013, 32(4): [ 王永明, 岳兴建. 鲈鲤的胚胎发育. 四川动物, 2013, 32(4): ] Wu YF, Kang B, Men Q, et al. Chromosome diversity of Tibetan fishes. Zoological Research, 1999, 20(4): [ 武云飞, 康斌, 门强, 等. 西藏鱼类染色体多样性的研究. 动物学研究, 1999, 20(4): ] Yue XJ, Shi JR, Wang YM, et al. Population genetic diversity of Percocypris pingi in Yalong River, the tributary of the Yangtze River. Freshwater Fisheries, 2015, 45(3): [ 岳兴建, 史晋绒, 王永明, 等. 雅砻江鲈鲤种群遗传结构. 淡水渔业, 2015, 45(3): 14 18] Zan RG, Song Z, Liu WG. Studies of karyotypes of seven species of fish in Barbinae, with a discussion on identification of fish polyploidy. Zoological Research, 1984, 5(1): [ 昝瑞光, 宋峥, 刘万国. 七种鲃亚科鱼类的染色体组型研究, 兼论鱼类多倍体的判定问题. 动物学研究, 1984, 5(1): 82 90) Zhou T. Chromosome studies in Chinese fresh-water fishes. Zoological Research, 1984, 5(S1): [ 周暾. 鱼类染色体研究. 动物学研究, 1984, 5(S1): 38 51] Zhuo XL, Zhou JX. Advances in karyotype and chromosome banding studies of marine fish in China. Journal of Tropical Oceanography, 2007, 26(5): [ 卓孝磊, 邹记兴. 我国海水鱼类核型及染色体显带研究进展. 热带海洋学报, 2007, 26(5): 73 80] ( 编辑冯小花 ) The Karyotype and C-Banding of Percocypris pingi LI Shu 1,2, TIE Huaimao 1, DUAN Jing 1, ZHAO Zhongmeng 1, YANG Song 1, GUO Xiulan 3, YANG Shiyong 11 (1. College of Animal Science and Technology, Sichuan Agricultural University, Chengdu ; 2. College of Life Science, Sichuan University, Chengdu ; 3. College of Pharmacy Bioengineering, Chengdu University, Chengdu ) Abstract Percocypris pingi is one of the endemic fishes in the upper reach of the Yangtze River and is one of the protected fish species in Sichuan Province. In this study, we investigated the ploidy and other cytogenetical characteristics of P. pingi. The karyotype of the renal tissue of P. pingi was examined using PHA injection with air-dry method. The C-band of P. pingi was displayed with modified BSG method. The results showed that the number of chromosomes of P. pingi was 98, and the formula could be expressed as 4n=98=42m+30sm+10st+16t, and the arm number (NF) was 170. Sixteen telocentric chromosome of P. pingi was found in this study although unreported in previous studies. Neither small chromosomes nor other heteromorphic chromosomes were found. All the karyotype had the size of the C-band appeared. The types of C-bands of P. pingi were diverse, including centromeric band, telomere band and intermediate band. Multiple C-bands were found in some chromosomes, for example, all types of C-bands were found in m 2 and st 4. The level of the heterochromatin was %±0.034%. We confirmed once again that P. pingi was a tetraploid fish. Its chromosomes were plastic to some extent based on the karyotype and C-bands, indicating that P. pingi might be adaptable to specific habitats in different regions. Key words Percocypris pingi; Karyotype; C-band; Polyploidization 1 Corresponding author: YANG Shiyong, yangshiyong@sicau.edu.cn

28 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 养殖裸盖鱼 (Anoplopoma fimbria) 疥疮病 * 病原菌的分离与鉴定 王晓冉 1,2 陈四清 2,3 莫照兰 2,3 李贵阳 2,3 刘长琳 2,3 王有廷 4 李 杰 2,31 黄 倢 2,3 (1. 中国海洋大学海洋生命学院青岛 ;2. 农业部海水养殖病害防治重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛 ;3. 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室青岛 ;4. 烟台海益苗业有限公司烟台 ) 摘要裸盖鱼 (Anoplopoma fimbria) 是一种名贵的冷水经济鱼类, 已在我国北方地区开展小规模的工厂化繁育和养成 目前, 我国关于裸盖鱼的病害研究仍是空白 本研究对山东烟台一养殖场自然发生疥疮病的裸盖鱼进行了病原分析, 从发病鱼体内分离得到形态一致的优势菌株, 命名为 AF-1, 并对其进行了致病性检测 菌种鉴定及药物敏感性研究 人工感染实验证明,AF-1 对裸盖鱼有致病性, 呈现症状与自然发病状态一致 ; 结合形态观察 革兰氏染色 生理生化特征 16S rrna 和 gyrb 基因序列进化树分析, 将 AF-1 鉴定为杀鲑气单胞菌 (Aeromonas salmonicida); 药物敏感性实验结果显示,AF-1 对青霉素 阿莫西林 头孢噻吩等 13 种抗生素具有耐药性, 对氟苯尼考 氟甲喹等 16 种抗生素敏感 综上所述, 本研究首次报道了我国养殖裸盖鱼感染杀鲑气单胞菌病例, 为裸盖鱼养殖过程中的疾病防控和疫苗开发提供了参考 关键词裸盖鱼 ; 疥疮病 ; 杀鲑气单胞菌中图分类号 S943 文献标识码 A 文章编号 (2017) 裸盖鱼 (Anoplopoma fimbria) 隶属于辐鳍鱼纲 (Actinopterygii) 鲉形目(Scorpaeniformes) 黑鲉科 (Anoplopomatidae) 裸盖鱼属(Anoplopoma), 分布于北太平洋沿岸, 包括自墨西哥北部至白令海的北美洲沿海和自勘察加半岛至日本东北部的亚洲沿海地区 裸盖鱼属于偏杂食的肉食性鱼类 ( 刘春胜等, 2015), 年均增重 2000 g 左右, 最适生长温度为 10 13, 即使在夏季高温季节, 裸盖鱼增重速度仍与适温条件下的半滑 舌鳎 (Cynoglossus semilaevis) 和大菱鲆 (Scophthalmus maximus) 相同 ( 陈昭廷等, 2015) 裸盖鱼肌肉富含多种营养物质, 如不饱和脂肪酸 ( 刘长琳等, 2015), 具有极高的养殖价值 裸盖鱼早期仅在加拿大地区有小规模的工厂化养殖 (Hannah et al, 2013), 作为一种适合于黄海冷水团养殖的名贵鱼种,2013 年裸盖鱼被引入我国, 并在山东烟台试养成功 2015 年, 裸盖鱼国内养殖和 * 国家自然科学基金 ( ) 中国水产科学研究院黄海水产研究所基本科研业务费( , ) 山东省自主创新及成果转化专项(2014ZZCX06205) 和青岛海洋科学与技术国家实验室鳌山科技创新计划 (2015ASKJ02) 共同资助 [This project was supported by the National Natural Sciences Foundation of China ( ), Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, YSFRI, CAFS( , ), the Special Independent Innovation and Achievement Transformation of Shandong Province (2014ZZCX06205) and the Scientific and Technological Innovation Projects financially supported by Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology (2015ASKJ02)]. 王晓冉, @qq.com 1 通讯作者 : 李杰, 助理研究员, lijie@ysfri.ac.cn 收稿日期 : , 收修改稿日期 :

29 26 渔业科学进展第 38 卷 繁育技术获得突破, 并在山东烟台地区开展工厂化繁殖和养成, 但目前国内和国际上裸盖鱼养殖病害的研究报道相对匮乏, 早期从海捕野生裸盖鱼个体中分别检测到杀鲑气单胞菌 (Aeromonas salmonicida) 和鲑肾杆菌 (Renibacterium salmoninarum) 感染的病例 (Evelyn, 1971; Bell et al, 1990);Kent 等 (1998) 对大西洋鲑 (Salmo salar) 网箱附近野生裸盖鱼调查发现, 养殖大西洋鲑的微孢子虫 (Loma spp.) 等病原具有侵染裸盖鱼的能力 关于养殖裸盖鱼, 目前只有加拿大不列颠哥伦比亚大学的评估报告对病害情况进行了简短的总结 (Sumaila et al, 2005) 2015 年 11 月, 烟台一养殖场繁育养殖的裸盖鱼出现疥疮病症状, 自组织中分离得到一株优势菌, 并进行了人工感染实验 生理生化鉴定 抗生素敏感检测及 16S rrna 和 gyrb 基因序列分析, 确定了病原菌的致病性 分类地位和耐药性, 为我国人工繁育和养成裸盖鱼的细菌病防治提供了参考 1 材料与方法 1.1 病鱼来源发病裸盖鱼采集自山东烟台某一个养殖场, 本地繁育和养成,8 月龄, 鱼体重 g, 工厂化流水养殖, 养殖水温约为 病原菌分离从发病裸盖鱼的溃烂部位 脓肿部位 肝脏 脾脏和肾脏取样, 划线 TSA 和 2216e 平板培养基,20 培养 h, 将获得的优势菌落进行纯化培养, 分离纯化后的菌落采用 20% 的甘油保存于 80 冰箱备用 1.3 病原菌的人工感染通过肌肉注射方式对裸盖鱼进行人工感染 将分离菌株接种于 TSB 液体培养基,20 摇床培养 36 h 离心收集菌体, 用生理盐水重悬细菌, 调节细菌浓度至 OD 600 nm =0.5, 此时细菌浓度约为 CFU/ml 用生理盐水将菌液稀释至 CFU/ml 选择 400 g 左右裸盖鱼, 通过背部肌肉注射方式进行感染, 每尾鱼注射 0.2 ml CFU/ml 菌液, 共注射 6 尾 ; 对照组注射等体积的灭菌生理盐水 每天正常饲喂 换水, 记录发病和死亡情况, 对死亡的鱼及时解剖, 并对病原进行分离 1.4 病原菌的生理生化特征和药物敏感性分析采用革兰氏染色法对细菌进行染色镜检 ; 采用微生物鉴定系统 API-ID32E 生理生化检测试剂盒 ( 梅里埃 公司, 法国 ), 参照产品使用说明书进行生理生化特征测定 ; 采用药敏检测试剂盒 ATB-VET( 梅里埃公司, 法国 ), 对菌株进行药物敏感性检测 ; 选择氟苯尼考药敏纸片 ( 杭州微生物试剂有限公司 ) 测定菌株对氟苯尼考的敏感性 1.5 病原菌 16S rrna 和 gyrb 基因序列测定利用 16S rrna 通用引物 27 F(5 -AGAGTTTG- ATCCTGGCTCAG-3, 对应大肠杆菌 8 27 bp) 和 1492 R(5 -RGGTTACCTTGTTACGACTT-3, 对应大肠杆菌 bp),pcr 扩增 AF-1 16S rrna 序列 ; 按照已有文献报道的条件, 扩增菌株的 gyrb 基因 (Küpfer et al, 2006) 将扩增得到的 PCR 产物送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序, 获得的序列信息在 GenBank 中用 Blast( 进行同源性比较, 利用 MEGA 5.05 软件, 采用邻位相连法 (Neighbor-Joining) 构建系统进化树 (Bootstrap=1000) 2 结果 2.1 病鱼症状 病原分离及人工感染发病裸盖鱼体表有少量出血点和溃烂, 腹鳍出血, 嘴角溃烂, 严重者体表有脓肿 ; 病鱼肝脏 肠壁充血 ( 图 1) 从病鱼的溃烂部位 疥疮 肝脏 脾脏和肾脏都得到菌落形态一致的优势菌, 细菌在 TSA 平板上生长呈浅黄色不透明圆形菌落, 在 2216e 琼脂平板上生长呈针尖状菌落 其中, 脾脏 肾脏和疥疮部位含菌量较高 所有分离到菌株的菌落形态一致,16S rrna 序列测定结果相似度大于 99%, 确定为同一菌株, 命名为 AF-1 人工感染结果显示, 注射感染菌株 AF-1 的裸盖鱼 28 d 内全部死亡, 出现症状与自然发病一致, 前 21 d 死亡 5 尾, 主要表现为鱼鳍出血, 体表有溃烂和出血点,22 28 d 死亡 1 尾, 在注射部位出现脓肿 ; 死亡裸盖鱼解剖可见肝脏和肠壁充血 从人工感染发病的裸盖鱼体内重新分离到菌株, 其菌落形态 生理生化特征和 16S rrna 序列与 AF-1 一致, 证明该菌株为此次裸盖鱼疥疮病的病原菌 2.2 病原菌生理生化特征和药物敏感性革兰氏染色后光学显微镜观察显示, 所有菌株均呈革兰氏阴性短杆菌 ; 采用 API ID32E 系统鉴定菌株 AF-1, 反应结果见表 1 ATB 系统数据库鉴定结果显示, 菌株 AF-1 属于气单胞菌属, 评语为 非常好的鉴定在属水平 ;ATB-VET 药物敏感性检测结果见表 2,AF-1 对青霉素 阿莫西林 头孢噻吩等 13 种抗

30 第5期 27 王晓冉等: 养殖裸盖鱼(Anoplopoma fimbria)疥疮病病原菌的分离与鉴定 Fig.1 图 1 发病裸盖鱼症状 The clinical symptoms of diseased sablefish A 腹部和腹鳍出血 B 体表溃烂 C 肝脏充血 D 尾部脓肿 E 脓肿内部溃烂 F 嘴角溃烂 A: Subcutaneous hemorrhage in the abdomen and the fin; B: Ulcer on the body; C: Liver congestion; D: Abscess in the tail; E: Ulcer inside of abscess; F: Ulcer in the mouth Tab.1 表 1 AF-1 API ID32E 生理生化特征 Biochemical reactions of AF-1 strain by API ID32E 项目 Items 脂酶 Lipase N-乙酰葡萄糖胺 N-acetylglucosamine D-麦芽糖 D-maltose D-葡萄糖 D-glucose 蔗糖 Sucrose D-半乳糖酸盐 D-galactonate 尿素水解 Urea hydrolysis 精氨酸双水解酶 Arginine dihydrolase 肌醇 Inositol α-麦芽糖 α-maltose D-纤维二糖 D-cellobiose β-半乳糖苷酶 β-galactosidase L-天冬氨酸芳胺酶 L-aspartic arylaminase D-海藻糖 D-trehalose α-葡萄糖苷酶 α-glucosidase L-阿拉伯糖 L-arabinose 结果 Results 项目 Items 结果 Results 鸟氨酸脱羧酶 Ornithine decarboxylase 吲哚 Indole D-甘露醇 D-mannitol 酚红 Phenol red 5-酮基葡萄糖酸盐 5-keto-gluconate L-阿拉伯醇 L-arabitol 赖氨酸脱羧酶 Lysine decarboxylase β-葡萄糖苷酶 β-glucosidase 丙二酸盐 Malonate D-山梨醇 D-sorbitol β-葡萄糖醛酸酶 β-glucuronidase 侧金盏花醇 Adonitol L-鼠李糖 L-rhamnose α-半乳糖苷酶 α-galactose D-阿拉伯醇 D-arabitol 古老糖 Palatinose + 注 + 表示阳性 表示阴性 Note: +. Positive reaction;. Negative reaction

31 28 渔业科学进展第 38 卷 表 2 AF-1 的药敏检测结果 Tab.2 Antibiotics sensitivity of AF-1 抗生素 Antibiotics 敏感性 Sensitivity 抗生素 Antibiotics 敏感性 Sensitivity 青霉素 Penicillin R 红霉素 Erythromycin R 阿莫西林 Amoxicillin R 林可霉素 Lincomycin R 复方阿莫西林 Amoxicillin clavulanic acid R 磺胺甲恶唑 Sulfamethoxazole R 本唑西林 Oxacillin R 泰洛星 Tylosin R 头孢噻吩 Cefalotin R 多粘霉素 Ecolistin S 头孢哌酮 Cefoperazone S 复方新诺明 Cotrimoxazole S 链霉素 Streptomycin R 普纳霉素 Pristinamycin R 大观霉素 Spectinomycin S 氟甲喹 Fumequine S 卡那霉素 Kanamycin S 奥索利酸 Oxolinic acid S 庆大霉素 Gentamicin S 伊氟沙星 Enrofloxacin S 安普霉素 Apramycin S 呋喃妥因 Nitrofurantoin S 氯霉素 Chloromycetin S 夫西地酸 Fusidic acid R 四环素 Tetracycline S 利福平 Rrifampicin S 多四环素 Doxycycline S 甲硝唑 Metronidazole R 注 :S 表示敏感,R 表示不敏感 Note: S. Sensitive; R. Resistant 生素均具有耐药性, 对氟甲喹等 15 种药物敏感 ; 氟苯尼考药敏纸片测定结果显示, 纸片抑菌圈大于 9 cm,af-1 对氟苯尼考高度敏感, 进一步指导养殖场采用氟苯尼考拌料投喂的方式进行治疗, 对疾病起到了有效控制 2.3 系统发育学分析利用 PCR 方法扩增裸盖鱼病原菌 AF-1 的 16S rrna 和 gyrb 基因, 得到 16S rrna(1430 bp) 和 gyrb (1042 bp) 的基因序列, 在 GenBank 的序列登录号分 别为 KU 和 KU 测序结果经过 Blast 比对分析显示, 菌株 AF-1 基因序列在 GenBank 中同源性最高的几株菌为杀鲑气单胞菌 从 NCBI 数据库中选择多株气单胞菌属标准菌株的 16S rrna 和 gyrb 基因序列, 利用 Mega 5.05 软件构建系统进化树 16S rrna 进化树结果显示,AF-1 与杀鲑气单胞菌和鱼蛭气单胞菌 (Aeromonas piscicola) 聚为一簇 ( 图 2);gyrB 进化树结果显示,AF-1 与杀鲑气单胞菌的亲缘关系更高 ( 图 3), 综合生理生化和系统发育进化树结果, 引起此次裸盖鱼疥疮病病原菌 AF-1 应为杀鲑气单胞菌 Fig.2 图 2 基于 16S rrna 序列构建的系统发育进化树 Phylogenetic tree constructed by neighbor joining method based on sequences of 16S rrna

32 第 5 期王晓冉等 : 养殖裸盖鱼 (Anoplopoma fimbria) 疥疮病病原菌的分离与鉴定 29 Fig.3 图 3 基于 gyrb 序列构建的系统发育进化树 Phylogenetic tree constructed by neighbor joining method based on sequences of gyrb 3 讨论本研究从患疥疮病的养殖裸盖鱼中分离得到一株优势菌 AF-1, 人工感染实验表明, 菌株 AF-1 可以感染正常裸盖鱼并引起体表出血 溃烂和脓肿等症状, 与自然条件下发病症状一致 从人工感染患病裸盖鱼组织中重新分离到的细菌生理生化特征和 16S rrna 基因序列与 AF-1 完全一致, 证明 AF-1 菌株为此次裸盖鱼疥疮病的病原菌 为鉴定病原菌 AF-1 的种类, 本研究利用 API ID32E 试剂条对裸盖鱼病原菌进行生理生化鉴定, 鉴定结果显示 AF-1 属于气单胞菌属 进一步选择了病原菌的 2 个管家基因 (16S rrna 和 gyrb) 进行序列分析 16S rrna 基因在细菌进化中保守性高, 在细菌分类鉴定和系统发育分析中应用广泛 ( 陈文新, 1998), 但由于鱼蛭气单胞菌 (A.piscicola) 与杀鲑气单胞菌相似度较高, 通过 16S rrna 无法完全区分 (Beaz-Hidalgo et al, 2009), 利用 gyrb 基因区分气单胞菌属的近缘种已有报道 (Küpfer et al, 2007), 因此, 本研究同时选择了 gyrb 基因用于进化树分析, 分析结果显示, 菌株 AF-1 与杀鲑气单胞菌聚为一簇, 属于杀鲑气单胞菌 杀鲑气单胞菌分为 5 个亚种, 包括杀鲑亚种 杀日本鲑亚种 无色亚种 史氏亚种和溶果胶亚种 (Holt et al, 1994; Pavan et al, 2000; Nash et al, 2006) 本研究分离得到的菌株 AF-1 尚无法确定所属亚种, 下一步研究将选取更多的管家基因进行多位点序列分型 (Multilocus sequence typing) 研究, 以确定 AF-1 所属亚种 杀鲑气单胞菌是养殖鱼类的主要致病菌, 可以引 起鱼类皮肤脓肿 溃烂等疥疮病症状 (McCarthy et al, 1977), 在我国多种养殖鱼类中均有杀鲑气单胞菌感染的报道 ( 李绍戊等, 2015; 王海娟等, 2015; 史秀杰等, 2007; 张晓君等, 2005) 近年来, 在山东地区的养殖大菱鲆 大西洋鲑等冷水性鱼类中先后发现杀鲑气单胞菌感染的病例 ( 吕俊超等, 2009; 衣萌萌等, 2015), 本实验室也曾在烟台的发病大菱鲆中分离到杀鲑气单胞菌, 这表明在我国的冷水性海水鱼养殖过程中, 杀鲑气单胞菌是不可忽视的一类重要病原 裸盖鱼属于冷水性养殖鱼类, 加拿大裸盖鱼养殖评估报告指出, 杀鲑气单胞菌可能是裸盖鱼养殖过程中的一个重要病原 (Sumaila et al, 2005) 本研究首次报道了国内养殖裸盖鱼感染杀鲑气单胞菌的病例, 并通过药物敏感性分析研究防治方法, 采用氟苯尼考进行治疗并取得较好效果, 为我国养殖裸盖鱼病害防治提供了技术措施 在今后的研究中, 将针对裸盖鱼的杀鲑气单胞菌病原进行疫苗开发, 为裸盖鱼的绿色健康养殖提供保障 参考文献 Beaz-Hidalgo R, Alperi A, Figueras MJ, et al. Aeromonas piscicola sp. nov., isolated from diseased fish. Systematic and Applied Microbiology, 2009, 32(7): Bell GR, Hoffmann RW, Brown LL. Pathology of experimental infections of the sablefish, Anoplopoma fimbria (Pallas), with Renibacterium salmoninarum, the agent of bacterial kidney disease in salmonids. Journal of Fish Diseases, 1990, 13(5):

33 30 渔业科学进展第 38 卷 Chen WX. Bacterial phylogeny. Acta Microbiologica Sinica, 1998, 38(3): [ 陈文新. 细菌系统发育. 微生物学报, 1998, 38(3): ] Chen ZT, Chen SQ, Wang YT, et al. Growth characteristics of sablefish Anoplopoma fimbria in industrially farming. Fishery Modernization, 2015, 42(3): [ 陈昭廷, 陈四清, 王有廷, 等. 温度对裸盖鱼工厂化养殖的影响. 渔业现代化, 2015, 42(3): 12 16] Evelyn TPT. An aberrant strain of the bacterial fish pathogen Aeromonas salmonicida isolated from a marine host, the sablefish (Anoplopoma fimbria), and from two species of cultured Pacific salmon. Journal of the Fisheries Board of Canada, 1971, 28(10): Hannah L, Pearce CM, Cross SF. Growth and survival of California sea cucumbers (Parastichopus californicus) cultivated with sablefish (Anoplopoma fimbria) at an integrated multitrophic aquaculture site. Aquaculture, 2013, (3): Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, et al. Bergey s manual of determinative bacteriology. Ninth Edition, 1994, Kent ML, Traxler GS, Kieser D, et al. Survey of salmonid pathogens in ocean-caught fishes in British Columbia, Canada. Journal of Aquatic Animal Health, 1998, 10(2): Küpfer M, Kuhnert P, Korczak BM, et al. Genetic relationships of Aeromonas strains inferred from 16S rrna, gyrb and rpob gene sequences. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2006, 56(12): Liu CL, Chen SQ, Wang YT, et al. The analysis and evaluation of the nutritive composition of the muscles of sablefish (Anoplopoma fimbria). Progress in Fishery Sciences, 2015, 36(2): [ 刘长琳, 陈四清, 王有廷, 等. 裸盖鱼 (Anoplopoma fimbria) 肌肉的营养成分分析及评价. 渔业科学进展, 2015, 36(2): ] Liu CS, Chen SQ, Wang YT, et al. Measurement of morphometric characters in 1 2-year-old sablefish, Anoplopoma fimbria. Fishery Modernization, 2015, 42(2): [ 刘春胜, 陈四清, 王有廷, 等. 1 2 龄裸盖鱼形态特征及其相关参数分析. 渔业现代化, 2015, 42(2): 23 27] Li SW, Wang D, Lian HM, et al. Isolation, identification and pathogenicity of Aeromonas salmonicida subsp. achromogenes from Atlantic salmon (Salmo salar). Acta Hydrobiologica Sinica, 2015, 39(1): [ 李绍戊, 王荻, 连浩淼, 等. 大西洋鲑杀鲑气单胞菌无色亚种的分离鉴定和致病性研究. 水生生物学报, 2015, 39(1): ] Lü JC, Zhang XH, Wang Y, et al. Isolation and identification of bacterial pathogen: Aeromonas salmonicida subsp. achromogenes in cultured turbot and histopathological study. Periodical of Ocean University of China (Natural Science Edition), 2009, 39(1): [ 吕俊超, 张晓华, 王燕, 等. 养殖大菱鲆病原菌 杀鲑气单胞菌无色亚种的分离鉴定和组织病理学研究. 中国海洋大学学报 ( 自然科学版 ), 2009, 39(1): 91 95] McCarthy DH, Skinner FA, Shewan JM. Some ecological aspects of the bacterial fish pathogen-aeromonas salmonicida, Aquatic microbiology. Academic Press, 1977, Nash JHE, Findlay WA, Luebbert CC, et al. Comparative genomics profiling of clinical isolates of Aeromonas salmonicida using DNA microarrays. BMC Genomics, 2006, 7(1): 43 Pavan ME, Abbott SL, Zorzopulos J, et al. Aeromonas salmonicida subsp. pectinolytica subsp. nov., a new pectinasepositive subspecies isolated from a heavily polluted river. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2000, 50(3): Shi XJ, Liu H, Gao LY, et al. Isolation and identification of causative agents of sick Arctic charr (Salvelinusal pinus). Journal of Huazhong Agricultural University, 2007, 26(2): [ 史秀杰, 刘荭, 高隆英, 等. 患病北极红点鲑的病原分离与鉴定. 华中农业大学学报, 2007, 26(2): ] Sumaila R, Volpe J, Liu Y. Ecological and economic impact assessment of Sablefish aquaculture in British Columbia. Fisheries Centre Research Reports, University of British Columbia, 2005, 13(3): 33 Wang HJ, Wang L. Identification and antibiotic resistance analysis of Aeromonas salmonicida isolated from Cyprinus carpio. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2015, 42(1): [ 王海娟, 王利. 鲤鱼杀鲑气单胞菌的分离鉴定及耐药性分析. 中国畜牧兽医, 2015, 42(1): ] Yi MM, Sun GX, Du YS, et al. The impacts of Aeromonas salmonicida on swimming behavior and numbers of blood cells of Atlantic salmon (Salmo salar L.). Journal of Fishery Sciences of China, 2015, 22(1): [ 衣萌萌, 孙国祥, 杜以帅, 等. 杀鲑气单胞菌对大西洋鲑游泳行为和血细胞数量的影响. 中国水产科学, 2015, 22(1): ] Zhang XJ, Fang H, Chen CZ, et al. Study on characterization of Aeromonas salmonicida subsp. flounderacida subsp. nov. from diseased stone flounder (Kareius bicoloratus). Oceanologia et Limnologia Sinica, 2005, 36(1): [ 张晓君, 房海, 陈翠珍, 等. 石鲽 (Kareius bicoloratus L.) 源杀鲑气单胞菌杀鲽亚种生物学性状的研究. 海洋与湖沼, 2005, 36(1): 51 60] ( 编辑冯小花 )

34 第 5 期王晓冉等 : 养殖裸盖鱼 (Anoplopoma fimbria) 疥疮病病原菌的分离与鉴定 31 Isolation and Identification of Aeromonas salmonicida Associated with Furunculosis in Cultured Sablefish (Anoplopoma fimbria) WANG Xiaoran 1,2, CHEN Siqing 2,3, MO Zhaolan 2,3, LI Guiyang 2,3, LIU Changlin 2,3, WANG Youting 4, LI Jie 2,31, HUANG Jie 2,3 (1. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao ; 2. Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao ; 3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao ; 4. Yantai Haiyi Seeds Co., Ltd, Yantai ) Abstract Sablefish (Anoplopoma fimbria), also known as black cod, is a sleek, black-skinned and valuable cold water benthic fish species that lives in the north Pacific Ocean. They possess high content of unsaturated fatty acids. Sablefish have been cultured in British Columbia of Canada, and in recent years, they were introduced into the aquaculture industry in Shandong Province in north China. In this study, we reported the observation of furunculosis found in cultured sablefish in China. AF-1, a strain of bacterial pathogen was isolated from the diseased sablefish. Sablefish infected with this bacterium showed typical symptoms of furunculosis such as subcutaneous hemorrhage in the abdomen and the fin, abscess, ulcer and liver congestion. AF-1 was confirmed to be the pathogen of sablefish furunculosis through the artificial injection experiment, in which the injected fish showed the same symptoms. A series of methods including biochemical and biophysical tests and phylogenetic analysis of 16S rrna and gyrb genes were used to identify the pathogen. The API ID32E results showed that AF-1 belonged to Aeromonas sp. The 16S rrna and gyrb genes were amplified and sequenced, and the submission numbers were KU and KU Phylogenetic analysis of gene sequences showed that AF-1 was Aeromonas salmonicida. The chemotherapeutant sensitivity test showed that AF-1 was resistant to 13 antibiotics such as penicillin, amoxicillin and cephalothin, but was sensitive to another 16 antibiotics such as fumequine and florfenicol. According to the antibiotics sensitivity test result, florfenicol was added into diets to control furunculosis in sablefish. Our study indicated that A. salmonicida could infect cultured sablefish in our country, and provided information on the disease control in cultured sablefish. Key words Sablefish (Anoplopoma fimbria); Furunculosis; Aeromonas salmonicida 1 Corresponding author: LI Jie, lijie@ysfri.ac.cn

35 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 美洲黑石斑鱼 (Centropristis striata) * 突眼症 的病原菌分离鉴定 陈建国 1,2 陈超张廷廷 1,21 1,2 李炎璐刘莉 2 1,2 孙曙光孙涛 1,2 4 邵彦翔 (1. 上海海洋大学水产与生命学院上海 ;2. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛 ; 3. 大连海洋大学大连 ;4. 烟台开发区天源水产有限公司烟台 ) 3 摘要养殖中患有 突眼症 的美洲黑石斑鱼 (Centropristis striata) 的症状表现为眼球白浊 充血 异常增生 从眼球病灶部位分离纯化得到 1 株优势菌, 在 TCBS 培养基上生长迅速, 菌落中部隆起, 黄色, 有黏性, 杆状菌, 端生单鞭毛, 属于革兰氏阴性菌, 定名为 CJG01 人工感染实验证实, 其对美洲黑石斑鱼有较强的致病性, 可引起幼鱼眼球突出 脱落, 肌肉溃烂, 骨胳外露 解剖感染组的幼鱼发现, 患病幼鱼的肝脏 肾脏红肿, 脾脏肿大, 肠道内有淡黄色液体 其半致死浓度 LD 50 为 CFU/ml API 20NE 快速鉴定及相关生理生化实验结果显示, 菌株 CJG01 的生长温度为 28 37, 最适温度为 28, 在含盐量为 0 5% 之间的 TSB 培养基可生长, 对弧菌抑制剂 O/129 敏感, 氧化酶反应阳性, 鸟氨酸脱羧酶反应阳性,V-P 反应阴性, 可同化甘露醇 麦芽糖 苹果酸, 不能同化葡萄糖 阿拉伯糖 甘露糖 癸酸 已二酸 柠檬酸 苯乙酸等, 菌株 CJG01 的生理生化特性与哈维氏弧菌 (Vibrio harveyi) 一致 对病原菌的 16S rdna 序列对比分析及系统进化树分析显示, 菌株 CJG01 与哈维氏弧菌序列同源性最高, 达 99% 药敏实验证实, 该菌株对氨苄西林 头孢氨苄 头孢拉定 诺氟沙星 青霉素 多粘菌素 B 阿奇霉素等药物不敏感, 对头孢唑林 恩诺沙星 链霉素 红霉素 克拉霉素等药物中度敏感, 对抗生素头孢哌酮 头孢曲松 头孢他啶 氧氟沙星 洛美沙星 氟罗沙星 环丙沙星 氯霉素 新生霉素 新霉素 庆大霉素 卡那霉素 呋喃唑酮 利福平 四环素 米诺环素等种药物敏感 关键词美洲黑石斑鱼 ; 突眼症 ; 分离鉴定 ; 哈维氏弧菌中图分类号 S 文献标识码 A 文章编号 (2017) 美洲黑石斑鱼 (Centropristis striata) 属科 (Serranidae) 石斑鱼亚科(Serraninae), 又名条纹锯 黑锯, 通称黑石斑, 有翡翠斑 珍珠斑 天星斑 宝石斑等多种美名, 是美国东部沿海重要的商业捕捞对象 游钓鱼种和观赏鱼类, 曾是我国北方工厂化和 南方网箱重要的养殖品种之一 ( 王波等, 2003) 随着我国石斑鱼产业逐渐进入规模化养殖阶段, 石斑鱼的各种病害也随着养殖规模的扩大呈现迅速上升的势头, 经常造成大面积死亡, 给养殖业主带来巨大经济损失, 严重制约了石斑鱼养殖业的发展 我国已报道 * 国际合作项目 (2012FDA30360) 和东盟项目 中国 - 东盟海水养殖技术联合研究与推广中心 共同资助 [This work was supported by International Cooperation Project (2012FDA30360) and the Association of South-East Asian Nations (ASEAN) Project: China-ASEAN Mariculture Technology Joint Research and Extension Center]. 陈建国, ysfrichenjianguo@126.com 1 通讯作者 : 陈超, 研究员, ysfrichenchao@126.com 收稿日期 : , 收修改稿日期 :

36 第 5 期陈建国等 : 美洲黑石斑鱼 (Centropristis striata) 突眼症 的病原菌分离鉴定 33 的养殖石斑鱼致病性细菌有创伤弧菌 (Vibrio vulnificus) 溶藻弧菌(V. alginolyticus) 河流弧菌 (V. fluvialis) 哈维氏弧菌(V. harveyi) 产气单胞杆菌 (Aeromonas sp.) 鲨鱼弧菌(V. cardhariae) 假单胞菌 (Pseudomonas spp.) 不动杆菌(Acinetobacter spp.) 等 ( 刘秀珍等, 1994; 朱传华等, 2000; 鄢庆枇等, 2001; 覃映雪等, 2004; 吴定虎等, 1989) 2015 年 6 月, 烟台天源水产有限公司养殖的一批 2 龄美洲黑石斑鱼, 患有 突眼病 症 本研究对其 突眼症 的病灶部位 肝脏 脾脏 肾脏等组织器官取样, 通过生理生化及分子生物学技术手段鉴定, 揭示了诱发美洲黑石斑鱼 突眼症 的病原体, 为其健康养殖及综合防治提供理论支撑 1 材料与方法 1.1 实验动物 患病美洲黑石斑鱼 2015 年 8 月 10 日, 选取 5 尾患病的体重为 (250±10) g 体长为(22±2) cm 的 2 龄美洲黑石斑鱼个体, 暂养于烟台天源水产养殖有限公司 健康美洲黑石斑鱼感染实验选用体重为 (8.65±1.15) cm 体长为(11.365±4.415) g 的健康美洲黑石斑鱼幼鱼, 共计 420 尾 1.2 病原菌的分离和纯化取患 突眼症 的濒死美洲黑石斑鱼, 在无菌条件下, 用 75% 酒精棉对鱼体消毒后, 取出眼球 肝脏 脾脏 肾脏等器官组织, 用 1.5% 的无菌生理盐水冲洗后剪碎 取剪碎的组织, 在无菌 TSA 培养基和 TCBS 培养基上分别划线分离, 在 28 条件下, 培养 24 h 从眼球 肝脏 脾脏 肾脏等器官组织中, 分别分离得到形态特征一致的 4 株优势菌 经鉴定, 它们属同一种 ( 定名为 CJG01), 连续纯化培养 3 代 挑取纯化后的单菌落于 TSB 液体培养基扩增, 在 28 条件下, 培养 10 h 按照菌液 80% 甘油 =8 2 的比例, 将扩增后的菌液保存于灭菌后的 80% 甘油中, 置于 80 超低温冰箱保种备用 1.3 致病菌株的电镜观察先用 PBS 冲洗菌株, 再用 3% 戊二醛固定 10 min, 碳网沾取后晾干 5 min,1% 磷钨酸染色 3 min, 自然状态晾 15 min, 用日本 JEOL 电子公司 JEM-1200EX 透射电镜观察 ( 范文辉等, 2005) 对患有 突眼症 美洲黑石斑鱼个体的眼球 脾脏 肝脏 肾脏等器官组织 样品, 采用透射电镜和扫描电镜结合检查病毒颗粒 ( 陈超等, 2010) 1.4 人工感染实验 将致病菌株用 1.5% 无菌生理盐水制成 CFU/ml 菌悬液 ( 采用酶标仪和平板稀释计数法结合计算 ),10 倍浓度系列稀释后备用 设 6 个浓度组 (A1 A2 A3 A4 A5 和 A6), 每个浓度下, 设 3 个平行组 (A1.1 A1.2 A1.3; A2.1 A2.2 A2.3; A3.1 A3.2 A3.3; A4.1 A4.2 A4.3; A5.1 A5.2 A5.3; A6.1 A6.2 A6.3), 每平行组 20 尾幼鱼, 共计 360 尾 空白对照设 3 个平行组 (B1 B2 和 B3), 每组 20 尾幼鱼, 共计 60 尾 有效水体 19 L 的泡沫箱, 每天换水 1/2, 充气暂养 7 d 后开始实验 养殖环境 : 水温 26 33, 盐度 26 32, 溶氧 mg/l,ph 值 实验组采用肌肉注射攻毒, 注射 0.1 ml 相应浓度的菌液 ; 对照组肌肉注射 0.1 ml 的 1.5% 无菌生理盐水, 观察并记录幼鱼发病症状及每日死亡尾数, 统计 3 个平行组幼鱼的平均死亡数 取濒死美洲黑石斑鱼幼鱼的眼球 肝脏 脾脏 肌肉等器官组织, 再次分离纯化, 方法同上 将再次分离纯化的优势菌株制成高浓度 ( CFU/ml), 采用肌肉注射法注射对照组, 最后将第 2 次分离的优势菌株与原菌株一起进行细菌鉴定 ( 范文辉等, 2005) 采用寇氏法计算菌株的半致死浓度 LD 50 ( 邹玉霞等, 2004): lgld 50 =X k d(p i 0.5) 式中,X k 为最大对数值,d 为相邻两组对数值差, P i 为死亡率,i 为分组号 1.5 生理生化鉴定 采用 API-20NE 和 API-20NE 自动鉴定系统进行鉴定 并结合生理生化测试盒及相关生理生化鉴定管 ( 青岛海博生物技术有限公司 ) 补充鉴定 ( 吕俊超等, 2009) 1.6 细菌 16S rdna 序列测定 PCR 模板 DNA 的制备用灭菌牙签挑取单菌落悬浮于 50 μl 无菌去离子水中,100 水浴 5 min, r/min 离心 20 min, 取 1 μl 上清液作为 PCR 反应所用模板 DNA( 范文辉等, 2005) PCR 扩增与测序采用扩增 16S rdna 序列通用引物, 正向引物 27F:5 -AGAGTTTGATCCTGG- CCTGGCTCAG-3, 反向引物 1492R:5 -TACGGCTA- CCTTGTTACGACTT-3 PCR 反应条件 :94 预变性 10 min;94 变性 40 s,55 复性 30 s,72 延伸 90 s, 35 个循环 ; 最后 72 温育 7 10 min PCR 产物由上

37 34 渔 业 科 海桑尼生物科技有限公司纯化 测序 根据测序结果 在 GenBank 中使用 BLAST( gov/blast)进行同源性比较 在网站( net/vibrio.html)选取与哈维氏弧菌同源性较高的 10 株 代表菌株的 16S rdna 序列 采用 MEGA5.05 软件构 建系统发育树(Tamura et al, 2011) 1.7 学 进 展 第 38 卷 观察未发现寄生虫 ph 光照 盐度 温度 氨氮 亚硝酸盐等环境因子指标均符合美洲黑石斑鱼的生 理生态条件 2.1 病原菌株的形态特征 CJG01 菌落在 TCBS 平板上呈黄色 边缘光滑 有黏性 革兰氏阴性菌 菌株经电镜负染后观察 菌 药物敏感实验 株 呈 短 杆 状 端 生 单 鞭 毛 菌 株 CJG01 大 小 约 将培养 24 h 的细菌制成浓度为 CFU/ml 菌悬液(陈超等, 2010) 取 50 μl 涂布于 TSA 培养基平 板中(平板直径为 90 mm 培养基厚度为 4 mm) 用 无菌镊子将抗菌素纸片(杭州微生物试剂有限公司)贴 于平板中央 每个平板 1 片 28 恒温培养 24 h 结果判读 记录纸片周围抑菌圈直径 根据美国 ( ) ( ) μm 鞭毛长约 μm(图 1) 2.2 人工感染实验结果 菌株 CJG01 感染美洲黑石斑鱼幼鱼 1 2 d 高浓 度感染组的幼鱼大量死亡 低浓度感染组下的幼鱼游 泳能力 摄食能力下降 肌肉注射部位红肿 鳞片脱 临床实验室标准化协会 CLSI (Clinical and Laboratory 落 感染 3 5 d 幼鱼肌肉注射部位溃烂 眼球增生 Standards Institute)标准 报告细菌对该抗生素是敏感 感染 6 7 d 肌肉腐烂 眼球脱落 幼鱼死亡(图 2) (Susceptible, S) 耐药(Resistant, R) 中介(Intermediate, 取濒死幼鱼病灶部位显微镜镜检 发现有大量运 I) (陈佳玉等, 2010) 2 动细菌(表 1) 解剖观察发现 患病幼鱼的肝脏 肾脏 红肿 脾脏肿大 肠道内有淡黄色液体 从患病美洲 结果与分析 黑石斑鱼幼鱼的病灶部位处 再次分离得到的优势菌 患病的美洲黑石斑鱼表现为眼球充血 肿大等症 株 其形态和生理生化反应与菌株 CJG01 一致 将其 状 病鱼游动 摄食能力下降 最终眼球脱落 患病 制成浓度为 CFU/ml 的菌悬液 感染对照组的 鱼死亡 经统计分析 美洲黑石斑鱼的 突眼症 死亡 美洲黑石斑鱼幼鱼 结果幼鱼全部死亡 优势菌株 率高达 90% 用电镜扫描眼球 肝脏 脾脏 肾脏 CJG01 诱发了美洲黑石斑鱼 突眼症 肌肉注射的菌 等器官组织部位 未发现病毒颗粒 在光学显微镜下 株 CJG01 的半致死浓度 LD50 为 CFU/ml Fig.1 图 1 CJG01 的菌落和菌体形态 Colonies and cell morphology of the strain CJG01 A. 菌株 CJG01 在 TCBS 培养基上形成边缘光滑整齐的黄色菌落 B. 菌株 CJG01 的电镜照片 (bar=1 μm) A. CJG01 in TCBS medium, bright yellow colonies; B. Electron microscope photograph of CJG01 (bar=1 μm)

38 第5期 35 陈建国等: 美洲黑石斑鱼(Centropristis striata) 突眼症 的病原菌分离鉴定 Fig.2 图 2 感染菌株 CJG01 后的幼鱼发病症状 Symptoms of the C. sriata juvenile infected with CJG01 A. 脱鳞 B. 皮肤溃烂 C. 眼球突出 D. 眼球脱落 幼鱼死亡 A. Desquamation; B. Skin eruptions; C. Exophthalmos; D. Eyeball fell off, the fry died 表 1 CJG01 对美洲黑石斑鱼幼鱼人工感染实验结果 Tab.1 Results of healthy C. sriata juvenile infected with CJG01 注射浓度 日死亡数 尾数 剂量 Injection Death for each day(ind.) concentration Amount Dosage(ml) 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d (CFU/ml) 分组 Group 死亡统计 Death statistics (ind.) 死亡率 Death rate(%) 实验组 A1 Treatment A A A B 1.5%NaCl A4 A5 对照组 Control 2.3 生理生化鉴定结果 菌株 CJG01 生理生化特性为革兰氏阴性 对弧 菌抑制剂 O/129 敏感 生长温度为 最适温 度为 28 在含盐量为 0 5%的 TSB 培养基可生长 氧化酶反应阳性 鸟氨酸脱羧酶反应阳性 V-P 反应 阴性 可同化甘露醇 麦芽糖 苹果酸 不能同化葡 萄糖 阿拉伯糖 甘露糖 癸酸 已二酸 柠檬酸 苯乙酸等 其他理化性质见表 2 参考 伯杰氏细菌 鉴定手册 (第九版) 一般细菌常用鉴定方法 以及 相关文献(Cano-Gomez et al, 2009; 毛芝娟等, 2002) 半致死率 LD50 (CFU/ml) 等资料 证实菌株 CJG01 与哈维氏弧菌的各项生理 生化特性一致 2.4 菌株 CJG01 的 16S rdna 序列分析 菌株 CJG01 的 16S rdna 序列长度为 1424 bp (图 3) BLAST 同源比对结果显示 其与哈维氏弧菌 的同源性高达 99% 从 NCBI 核酸数据库中 选取 10 株水产动物致病菌株的 16S rdna 基因序列进行系 统发育树分析 并采用 MEGA5.05 软件构建发育树 (图 4) 可以看出 该菌株于哈维氏弧菌的亲缘关系 最为接近 可认定菌株 CJG01 为哈维氏弧菌

39 36 渔业科学进展第 38 卷 表 2 菌株 CJG01 生理生化特征 Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of CJG01 项目 Items 菌株 CJG01 Strain CJG01 项目 Items 菌株 CJG01 Strain CJG01 革兰氏阴性 Gram negative 葡萄糖同化 Glucose assimilation 运动性 Motility + 阿拉伯糖 Arabinose O/129 (10 μg/piece) S 甘露糖 Mannose O/129 (150 μg/piece) S 甘露醇 Mannitol + 4 生长 Growth at 4 N- 乙酰 - 葡萄糖胺 N-Acetylglucosamine 15 生长 Growth at 15 麦芽糖 Maltose + 28 生长 Growth at 28 + 葡萄糖酸盐 Gluconate + 37 生长 Growth at 37 + 癸酸 Capric acid 42 生长 Growth at 42 已二酸 Adipate 0 NaCl 生长 Grow at 0 NaCl + 苹果酸 Malic acid + 4% NaCl 生长 Grow at 4% NaCl + 柠檬酸 Citric acid 5% NaCl 生长 Grow at 5% NaCl + 苯乙酸 Phenyl acetic acid 6% NaCl 生长 Grow at 6% NaCl 氧化酶 Oxidase + KNO 3 + 鸟氨酸脱羧酶 Ornithine decarboxylase + 色氨酸 Tryptophan + V-P 反应 Voges-Proskauer reaction 葡萄糖酸化 Glucose oxidation + 赖氨酸脱羧酶 Lysine decarboxylase + 精氨酸 Arginine 丙二酸 Malonate 脲素 Urea + 蔗糖 Sucrose + 七叶灵 Esculin 海藻糖 Trehalose + 明胶 Gelatin 纤维二糖 D-cellobiose + 对硝基 -β-d 甲基半乳糖 p-nitrophenyl-β-dgalactopyranoside : 阴性 ;+: 阳性 ;S: 敏感 : Negative; +: Positive; S: Susceptible + L- 天门冬素芳胺酶 L-Aspartic acid arylamidase 2.5 药物敏感实验结果 菌株 CJG01 对 28 种药物的敏感性结果显示 ( 表 3), 该菌株对氨苄西林 头孢氨苄 头孢拉定 诺氟沙星 青霉素 多粘菌素 B 阿奇霉素等药物不敏感, 对头孢唑林 恩诺沙星 链霉素 红霉素 克拉霉素等药物中度敏感, 对头孢哌酮 头孢曲松 头孢他啶 氧氟沙星 洛美沙星 氟罗沙星 环丙沙星 氯霉素 新生霉素 新霉素 庆大霉素 卡那霉素 呋喃唑酮 利福平 四环素 米诺环素等药物敏感 3 讨论 图 3 菌株 CJG01 的 16S rdna PCR 产物琼脂糖电泳 Fig.3 Agarose electrophoresis of 16S rdna amplified products of CJG01 1. DNA marker;2. 阴性对照 ;3. 鳗弧菌阳性对照 ; 4. 16S rdna 产物 1. DNA marker; 2. Negative control; 3. Vibrio anguillarum positive control; 4. 16S rdna product 弧菌是海洋环境中最常见的细菌群之一, 广泛分布于河口近岸 海区 淡水和生物体中 ( 何苹萍等, 2013), 其致病性受宿主的生理状态及水质环境条件等综合因素的影响较大, 是一类条件致病菌 ( 郑天伦等, 2002) 在养殖过程中, 因过量投饵和养殖鱼类的排泄物引起底质极端恶化, 使水体中的氨氮 硫化氢

40 第 5 期陈建国等 : 美洲黑石斑鱼 (Centropristis striata) 突眼症 的病原菌分离鉴定 37 药物 Drugs 图 4 基于菌株 CJG01 的 16S rdna 序列构建的系统发育树 Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rdna sequence of CJG01 药片浓度 Concentration of drug(μg/g) 表 3 菌株 CJG01 对抗菌药物的敏感性 Tab.3 The sensitivity of CJG01 to antimicrobial agents 抑菌圈直径 Diameters of microbiostatic circle (mm) 敏感性 Sensitivity 药物 Drugs 药片浓度 Concentration of drug(μg/g) 抑菌圈直径 Diameters of microbiostatic circle (mm) 敏感性 Sensitivity 氨苄西林 Ampicillin 10 0 R 新生霉素 Novobiocin S 头孢氨苄 Cephalexin 30 9 R 新霉素 Neomycin S 头孢唑林 Cefamezin I 链霉素 Streptomycin I 头孢拉定 Cefradine R 青霉素 Penicillin 10 0 R 头孢哌酮 Cefoperazone S 红霉素 Erythromycin I 头孢曲松 Ceftriaxone S 庆大霉素 Gentamicin S 头孢他啶 Cefoperazone S 卡那霉素 Kanamycin S 氧氟沙星 Ofloxacin 洛美沙星 Ciprofloxacin 恩诺沙星 Enrofloxacin 氟罗沙星 Fleroxacin 5 17 S S 5 19 I 5 29 S 克拉霉素 Clarithromycin 阿奇霉素 Azithromycin 多粘菌素 B Polymyxin B 呋喃唑酮 Furazolidone I R R S 诺氟沙星 Norfloxacin 10 7 R 利福平 Rifampicin 5 24 S 环丙沙星 Ciprofloxacin S 四环素 Tetracycline S 氯霉素 Chloroamphenicol S 米诺环素 Minocycline S S: 敏感 ;R: 耐药 ;I: 中介 S: Susceptible; R: Resistant; I: Intermediate 含量显著升高, 养殖水体溶氧显著下降, 在恶劣的气候条件下, 如夏季闷热无风或突降暴雨的天气, 盐度和 ph 值急剧变化 ; 宿主受到病毒 真菌 寄生虫等的感染和侵害, 宿主机能下降, 病原弧菌大量侵入宿主, 弧菌疾病的暴发 ( 胡超群等, 2010; 金珊等, 2005; 杨少丽等, 2005) 海水鱼类弧菌疾病流行温度为 ( 赵桂林等, 2014) 范围 本研究证实, 环境温度低于 15 时, 哈维氏弧菌的增殖得到抑制, 当温 度达到 时, 菌落迅速扩增, 在含有 0 5% NaCl 的 TSB 培养基能够生长 本研究的菌株 CJG01 经过电镜负染, 观察到菌株 CJG01 呈短杆状, 端生单鞭毛 ; 革兰氏染色为阴性, 在 TCBS 培养基上为黄色, 边缘透明, 中间隆起, 有黏性 ; 对弧菌抑制剂 O/129 敏感, 氧化酶反应阳性 采用 API-20NE 鉴定系统以及相关生理生化鉴定管对分离的菌株 CJG01 进行生理生化特征比较分析, 得

41 38 渔业科学进展第 38 卷 出其生理生化特性与哈维氏弧菌一致 ( 陈献稿等, 2004; 林克冰等, 1999) 为进一步确认菌株 CJG01 的分类学地位, 采用 BLAST 比对其 16S rdna 序列, 证实菌株与哈维氏弧菌的同源性高达 99%, 确认菌株 CJG01 为哈维氏弧菌 最新 16S rdna 系统发育学分析比较细菌核糖体 DNA 基因片段的同源性, 实现对细菌的分类学鉴定, 理论上具有很好的可靠性, 但截止到 1996 年, 只测定了 3500 余种细菌的完整 16S rdna 序列, 给鉴定结果的准确性带来很大的影响, 如果没有生理生化鉴定结果作为佐证, 可能无法得出准确的结论 因此, 在进行生物物种鉴定时采用多种方法, 取长补短, 相互补充, 保证鉴定结果的客观性和科学性 ( 陈晓燕等, 2003; 范文辉等, 2005) 本次致病菌的感染实验证实了哈维氏弧菌是引发美洲黑石斑鱼突眼病的条件致病菌之一 养殖过程中弧菌病害时有发生, 且流行于多个国家和地区, 是许多养殖鱼类的病原菌 (Harikrishnan et al, 2010; 黄志坚等, 2002; 金珊等, 2005; 林克冰等, 2014; 罗鸣等, 2013) 研究表明, 哈维氏弧菌通过分泌溶血素 蛋白酶及脂多糖来破坏宿主组织 ( 王海阳等, 2014) 本研究证实, 哈维氏弧菌侵染肌肉组织后, 染病部位出现脱鳞 肌肉溃烂, 严重的可见骨骼外露 ; 伴随烂尾 突眼等症状 解剖鱼的内脏, 可在肝脏 肾脏 脾脏等组织中分离出致病菌 解剖发现, 肝脏 脾脏 肾脏充血严重, 小肠内有黄色液体流出 有研究证实, 哈维氏弧菌可导致鱼的病变组织, 如头肾 脾 胸腺 肝 粘膜淋巴组织和肠的上皮细胞出现不同程度的变性及坏死, 细胞超微病变观察发现, 这些组织的线粒体出现空泡化 ( 任红梅等, 2011) 肾小管上皮细胞变性 坏死 ; 颗粒细胞的细胞核核膜部分溶解 ; 脾窦和脾索分界不明显 ; 脾颗粒细胞核核膜溶解, 胸腺中有较多空泡 ; 肝细胞胞浆内脂滴积累多 ; 肠绒毛萎缩, 肠上皮细胞胞质多数线粒体 内质网等相互聚集固缩, 粘膜上皮细胞坏死 脱落 ( 徐晓津等, 2009) 等现象 本人工感染实验中, 采用肌肉注射攻毒美洲黑石斑鱼幼鱼, 出现了较高的死亡率, 半致死浓度 LD 50 = CFU/ml 证实了哈维氏弧菌是毒性很强的致病菌, 具有很强的致病性 哈维氏弧菌引起石斑鱼突眼病的病原体的研究报道较少, 国内外主要是对其生理生化特性以及病理做了研究, 对于其致病因子, 致病机理等需要今后做进一步的研究 参考文献 Cano-Gomez A, Bourne DG, Hall MR, et al. Molecular identification, typing and tracking of Vibrio harveyi in aquaculture systems: Current methods and future prospects. Aquaculture, (1 2): 1 10 Chen C, Cheng B, Wang YG, et al. Isolation and identification of a pathogenic bacterium from Epinephelus septemfasciatus with exophthalmic disease. Progress in Fishery Sciences, 2010, 31(1): [ 陈超, 程波, 王印庚, 等. 七带石斑鱼繁殖群体 突眼 症病原菌的分离与鉴定. 渔业科学进展, 2010, 31(1): 25 32] Chen JY, Liang Y. Clinical test series (microbiology test booklet). Hangzhou: Zhejiang University Press, 2010, [ 陈佳玉, 梁勇. 临床检验系列教程 ( 微生物学检验分册 ). 杭州 : 浙江大学出版社, 2010, 35 36] Chen XG, Wu SQ, Shi CB, et al. Isolation and identification of pathogenetic Vibrio harveyi from estuary cod Epinephelus coioides. Journal of Fishery Sciences of China, 2004, 11(4): [ 陈献稿, 吴淑勤, 石存斌, 等. 斜带石斑鱼病原菌 ( 哈维氏弧菌 ) 的分离与鉴定. 中国水产科学, 2004, 11(4): ] Chen XY, Hu CQ, Chen C. Characteristics of pathogenic bacteria of vibriosis in caged Malabar grouper, Epinephelus malabaricus. Marine Sciences, 2003, 27(6): [ 陈晓燕, 胡超群, 陈偿. 人工养殖点带石斑鱼弧菌病病原菌的分离及鉴定. 海洋科学, 2003, 27(6): 68 71] Fan WH, Huang J, Wang XH, et al. Identification and phylogenetic study of pathogenic bacteria causing ulcer disease of cultured Turbot (Scophthalmus maximus). Acta Microbiologica Sinica, 2005, 45(5): [ 范文辉, 黄倢, 王秀华, 等. 养殖大菱鲆溃疡症病原菌的分离鉴定及系统发育分析. 微生物学报, 2005, 45(5): ] Harikrishnan R, Balasundaram C, Heo MS. Molecular studies, disease status and prophylactic measures in grouper aquaculture: Economic importance, diseases and immunology. Aquaculture, 2010, 30(9): 1 14 He PP, Zhao YZ, Chen XL, et al. Isolation and identification of Vibrio in cultured Litopenaeus vannamei. Jiangsu Agricultural Sciences, 2013, 41(6): [ 何苹萍, 赵永贞, 陈秀荔, 等. 凡纳滨对虾及养殖水体中弧菌的分离鉴定. 江苏农业科学, 2013, 41(6): ] Hu CQ, Tao BH. Penaeid shrimp vibriosis and immune prevention: A review. Tropic Oceanology, 2010, 19(3): [ 胡超群, 陶保华. 综述 : 对虾弧菌病及其免疫预防的研究进展. 热带海洋, 2010, 19(3): 84 92] Huang ZJ, He JG. Isolation, identification and pathogenicity of the bacterial pathogen in Epinephlus fario. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni, 2002, 41(5): [ 黄志坚, 何建国. 鲑点石斑鱼细菌病原的分离鉴定和致病性. 中山大学学报 ( 自然版 ), 2002, 41(5): 64 67] Jin S, Wang GL, Zhao QS, et al. Epidemiology of vibriosis in large yellow croaker Pseudosciaena crocea (Richardson) in marine cage culture. Fisheries Science, 2005, 24(1): [ 金珊, 王国良, 赵青松, 等. 海水网箱养殖大黄鱼弧菌病的流行病学研究. 水产科学, 2005, 24(1): 17 19] Lin KB, Wu JS, Huang ZB, et al. Isolation and identification of a

42 第 5 期陈建国等 : 美洲黑石斑鱼 (Centropristis striata) 突眼症 的病原菌分离鉴定 39 bacterial pathogen from Epinephelus coioides. Journal of Fujian Fisheries, 2014, 36(6): [ 林克冰, 吴建绍, 黄兆斌. 一株斜带石斑鱼 (Epinephelus coioides) 病原菌的分离与鉴定. 福建水产, 2014, 36(6): ] Lin KB, Zhou C, Liu JF, et al. Studies on the pathogenic bacteria of Pseudosciaena crocea in marine cage culture. Marine Sciences, 1999(4): [ 林克冰, 周宸, 刘家富, 等. 海水网箱养殖大黄鱼病原菌研究, 海洋科学, 1999(4): 58 62] Liu XZ, Zou XL, Mo XY, et al. A study on the pathogen of vibriosis isolated from diseased Epinephelus sp. in cage mariculture. Tropic Oceanology, 1994, 13(1): [ 刘秀珍, 邹晓理, 莫小燕, 等. 海水网箱养殖石斑鱼病原菌研究. 热带海洋, 1994, 13(1): 81 86] Luo M, Chen FX, Liu LL, et al. Progress in disease research of grouper aquaculture in China. Fisheries Science, 2013, 32(9): [ 罗鸣, 陈傅晓, 刘龙龙, 等. 我国石斑鱼养殖疾病的研究进展. 水产科学, 2013, 32(9): ] Lv JC, Zhang XH, Wang Y, et al. Isolation and identification of bacterial pathogen: Aeromonas salmonicida subsp. achromogenes in cultured turbot and histopathological study. Periodical of Ocean University of China (Natural Science), 2009, 39(1): [ 吕俊超, 张晓华, 王燕, 等. 养殖大菱鲆病原菌 : 杀鲑气单胞菌无色亚种的分离鉴定和组织病理学研究. 中国海洋大学学报 ( 自然科学版 ), 2009, 39(1): 91 95] Mao ZJ, Liu GY, Chen CF. Isolation and identification of pathogenic bacteria causing ulcerosis in large yellow croaker (Pseudosciaena crocea). Journal of Anhui Agricultural University, 2002, 29(2): [ 毛芝娟, 刘国勇, 陈昌福. 大黄鱼溃疡病致病菌的初步分离与鉴定. 安徽农业大学学报, 2002, 29(2): ] Qin YX, Chi XC, Su YQ, et al. The pathogeny of ulcer disease in Epinephlus awoara. Journal of Fisheries of China, 2004, 28(3): [ 覃映雪, 池信才, 苏永全, 等. 网箱养殖青石斑鱼的溃疡病病原. 水产学报, 2004, 28(3): ] Ren HM, He Z, Yang DY, et al. Pathological study on rice field eel artificial infected by Aeromonas sobria. Journal of Hydroecology, 2011, 32(1): [ 任红梅, 何智, 杨德英, 等. 黄鳝人工感染温和气单胞菌的组织病理学研究. 水生态学杂志, 2011, 32(1): ] Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28(10): Wang B, Zhu MY, Mao XH. The new variety-centropristis striata for artificial culture. Hebei Fisheries, 2003(5): [ 王波, 朱明远, 毛兴华. 养殖新品种 美洲黑石斑鱼. 河北渔业, 2003(5): 26 27] Wang HY, Huang YC, Ding Y, et al. Construction and protection evaluation of DNA vaccine of Vibrio harveyi GST genes on orange-spotted grouper (Epinephelus coioides). Journal of Guangdong Ocean University, 2014, 34(4): [ 王海阳, 黄郁葱, 丁燏, 等. 哈维氏弧菌 GST 核酸疫苗制备及其对斜带石斑鱼的免疫保护作用. 广东海洋大学学报, 2014, 34(4): Wu DH. The preliminary research for the prevention and cure of diseases in Epinephelus akaara. Journal of Fujian Fisheries, 1989(3): [ 吴定虎. 赤点石斑鱼的病害及其防治的初步研究. 福建水产, 1989(3): 59 64] Xu XJ, Xu B, Wang Jun, et al. Effect of V. harveyi on the main organs of P. crocea (Electronic microscope section). Journal of Xiamen University (Natural Science), 2009, 48(2): [ 徐晓津, 徐斌, 王军, 等. 哈维氏弧菌人工感染大黄鱼的组织病理学研究. 厦门大学学报 ( 自然科学版 ), 2009, 48(2): ] Yan QP, Su YQ, Wang J, et al. Studies on vibriosis (Vibrio fluvialis) in cultured Epinephelus awoara. Marine Sciences, 2001, 25(10): [ 鄢庆枇, 苏永全, 王军, 等. 网箱养殖青石斑鱼河流弧菌病研究. 海洋科学, 2001, 25(10): 17 19] Yang SL, Wang YG, Dong SG. Progress of research on vibriosis in marine cultured fish. Marine Fisheries Research, 2005, 26(4): [ 杨少丽, 王印庚, 董树刚. 海水养殖鱼类弧菌病的研究进展. 海洋水产研究, 2005, 26(4): 75 82] Zheng TL, Wang GL, Jin S. Prevention and cure of vibriosis in aquatic animals: A review. Journal of Oceanography in Taiwan Strait, 2002, 21(3): [ 郑天伦, 王国良, 金珊. 海水养殖动物弧菌病防治的研究进展. 台湾海峡, 2002, 21(3): ] Zhu CH, He JG, Huang ZJ. Identification and pathogenicity of pathogen of Epinephalus fario and E. awoara ulceration disease. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni, 2000, 39(3)(Suppl): [ 朱传华, 何建国, 黄志坚. 网箱养殖石斑鱼暴发性溃疡病病原菌分离鉴定及致病性研究. 中山大学学报, 2000, 39(3)( 增刊 ): ] Zou YX, Zhang PJ, Mo ZL, et al. Isolation and identification of the pathogenic bacteria from Scophthalmus maximus. High Technology Letters, 2004(4): [ 邹玉霞, 张培军, 莫照兰, 等. 大菱鲆出血症病原菌的分离和鉴定. 高技术通讯, 2004(4): 89 93] ( 编辑冯小花 )

43 40 渔业科学进展第 38 卷 Isolation and Classification of Exophthalmic Disease-Inducing Pathogenic Bacterium from Centropristis striata CHEN Jianguo 1,2, CHEN Chao 1,21, LI Yanlu 1,2, SUN Shuguang 1,2, SHAO Yanxiang 3, ZHANG Tingting 1,2, LIU Li 1,2, SUN Tao 4 (1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai ; 2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture; Qingdao Key Laboratory for Marine Fish Breeding and Biotechnology, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao ; 3. Dalian Ocean University, Dalian ; 4. Yantai Tianyuan Fisheries Corporation, Yantai ) Abstract A strain of bacterial pathogen was isolated from eyeballs of cultured Centropristis striata with the symptoms such as white chaotic, hyperaemia and paraplasm in the eyeballs. The strain grew quickly in the TCBS culture medium, and the colonies were protruding, yellow, and tackiness. The strain named CJG01 was Gram-negative, bacillus and monotricha. The intramuscular injection experiment revealed that CJG01 was virulent to C. striata with LD 50 value of CFU/ml. CJG01 could cause symptoms including larval exophthalmos, eyeball fall off, muscle ulceration, and fishbone exposure. Anatomical observation showed liver inflammation, splenic organ enlargement, kidney inflammation and yellow liquid in the intestine. The results of API 20NE rapid identification and related physiological and biochemical experiments showed that the growth temperature for CJG01 was 28 37, and the optimum temperature was 28. CJG01 could grow in TSB culture medium with 0 5% salinity. It was sensitive to vibrio inhibitors O/129, was oxidase and ornithine decarboxylase positive, and was V-P negative. CJG01 could assimilate mannitol, maltose and malic acid, but not glucose, arabinose, mannose, decanoic acid, acetic acid, citric acid, benzene, etc. The strain shared similarities with Vibrio harveyi in biochemical and biophysical properties. Analysis of the 16S rdna sequence and the phylogenetic tree suggested that CJG01 was highly similar to V. harveyi. Based on the results above, CJG01 was identified as V. harveyi. The chemotherapyeutant sensitivity test showed that CJG01 was insensitive to ampicillin, cephalosporins ammonia benzyl, cephalosporins, norfloxacin, penicillin, azithromycin, polymyxin B, etc. It was moderately sensitive to cefazolin, streptomycin, erythromycin, clarithromycin, etc. Novobiocin, neomycin, cefoperazone, ceftriaxone, gentamicin, cefoperazone, kanamycin, ofloxacin, ciprofloxacin, fleroxacin, furazolidone, rifampicin, ciprofloxacin, tetracycline, chloroamphenicol and minocycline could effectively inhibit the growth of CJG01. Key words Centropristis striata; Exophthalmos; Separation and identification; Vibrio harveyi 1 Corresponding author: CHEN Chao, ysfrichenchao@126.com

44 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 金乌贼 (Sepia esculenta) 早期发育阶段 * 内壳形态学指标的主成分分析 李 达 1,2 刘长琳 2 李 昂 2 杜腾飞 1,2 柳淑芳 2,31 庄志猛 2,4 (1. 上海海洋大学水产与生命学院上海 ;2. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛 ;3. 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室青岛 ;4. 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋生物学与生物技术功能实验室青岛 ) 摘要为揭示金乌贼 (Sepia esculenta) 早期发育阶段内壳生长发育规律和形态学特征, 本研究采集其红珠与黑珠期 心跳期 出膜期 初孵化幼体 5 日龄 10 日龄 6 个时期的金乌贼, 分别测量其胴腹长 (DML) 胴宽(MB) 体重(BW) 壳长(CL) 壳宽(CB), 壳重 (CW) 生长纹数(LN) 7 项指标, 进行内壳形态学的主成分分析 结果显示, 红珠与黑珠期 出膜期和 10 日龄时期各生长指标间均呈显著性正相关, 心跳期 初孵化幼体期和 5 日龄时期部分生长指标间相关性不显著 主成分分析显示, 红珠与黑珠期 心跳期的第 1 主成分为质量因子 ( 体重和壳重 ), 出膜期 初孵化幼体 5 日龄 10 日龄等 4 个时期的第 1 主成分为长度因子 ( 胴腹长和壳长 ), 这表明金乌贼不同时期内壳形态学各性状的生长速率存在一定差异, 出膜前 ( 红珠与黑珠期和心跳期 ) 质量因子的增长优于长度因子的增长, 而出膜后 ( 出膜期至 10 日龄时期 ) 长度因子的增长优于质量因子的增长 关键词金乌贼 ; 生长性状 ; 内壳 ; 主成分分析中图分类号 S954.4 文献标识码 A 文章编号 (2017) 金乌贼 (Sepia esculenta) 属于头足纲 (Cephalopoda) 乌贼目 (Sepioidea) 乌贼科(Sepiidea)( 陈新军等, 2009), 广泛分布于中国沿海 日本列岛以及菲律宾群岛海域 ( 董正之, 1991) 金乌贼具有生命周期短 生长速度快 营养价值高等特点, 为我国北方沿海经济价值较大的头足类, 曾是我国重要的海洋渔业捕捞对象之一 ( 董正之, 1991) 但自 20 世纪 80 年代以来, 由于过度捕捞和海洋环境的破坏等多种原因, 其资源量明显衰退, 产量急剧下降, 目前, 金乌贼在许多海域已经绝迹 ( 郝振林等, 2007; 唐启升等, 1990) 因此, 进一步探索金乌贼生物学特征, 对更好地保护金乌贼野生资源和提高增养殖效果尤为重要 金乌贼的内壳又称海螵蛸, 既是身体唯一的支撑结构, 也是乌贼垂直运动时所依赖的浮力结构 (Bandel et al, 1979) 海螵蛸因其具有较高的药用价值, 得到了广泛研究, 但报道多集中于药学方面 ( 刘永刚等, 2005; 张健英等, 1993; 赵中杰等, 1990), 而头足类内壳发生和生长发育过程及其机理探讨方面的研究几乎空白 为了更好地了解海螵蛸的形态与功能, 推测海螵蛸的形成过程以及形成机理, 本研究以早期不同发育 * 十二五 农村领域国家科技计划课题 (2012BAD18B03) 农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室开放课题 (2014K01) 和基本科研业务费专项 ( ) 共同资助 [This work was supported by the National Scientific and Technological Projects in Rural Areas in 12th Five-Year (2012BAD18B03), Key Laboratory of Exploitation and Utilization of Ocean Resources in the East China Sea, MOA (2014K01) and Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund ( )]. 李达, meiniandali@126.com 1 通讯作者 : 柳淑芳, 研究员, liusf@ysfri.ac.cn 收稿日期 : , 收修改稿日期 :

45 42 渔业科学进展第 38 卷 阶段的金乌贼为研究对象, 采集相关生长性状指标数据, 并采用主成分分析法, 以揭示金乌贼早期发育阶段内壳生长发育规律和形态学特征, 为金乌贼幼苗的选育及养殖提供参考依据 1 材料与方法 1.1 实验材料将受精卵在面积为 25 m 2 池深为 1 m 的培育池中孵化 池中均匀设置 12 个气石, 保证孵化过程中进行不间断地微量充气, 使水中溶氧量 6 mg/l 光照维持在 lx 孵化用经过二级砂滤的自然海水, 培育水温为 20 25, 盐度为 29 30,pH , 并定期更换海水 出膜后幼体的培育条件与孵化条件 相同 每天 09:00 和 18:00 投饵 2 次, 投喂的饵料和金乌贼幼体的数量比例为 日龄幼体投喂卤虫无节幼体和活体糠虾,5 10 日龄投喂活体糠虾 实验期间, 从培育池中分 6 个时期随机取样, 分别获得样品红珠与黑珠期 30 尾 心跳期 29 尾 出膜期 30 尾 初孵化幼体 26 尾 5 日龄 30 尾 10 日龄 30 尾, 共 175 尾 1.2 生物学指标测定用游标卡尺测定金乌贼的胴腹长 (DML) 胴宽 (MB) 后, 用精密电子天平 (Sartorius) 测定体重 (BW), 将其解剖, 取出内壳, 测定骨板壳长 (CL) 壳宽 (CB), 在解剖镜下测定生长纹数 (LN), 最后称其壳重 (CW) ( 表 1 图 1) 表 1 金乌贼早期发育阶段部分测量参数 Tab.1 Morphometric measurements of S. esculenta at the early developmental stages 参数 Parameters 测量范围 Measuring range 壳长 Cuttlebone length(cl) 壳宽 Cuttlebone breadth(cb) 生长纹数 Lamella number(ln) 胴腹长 Dorsol mantle length(dml) 胴宽 Mantle breadth(mb) 内壳中线最前端至最后端的长度 Length from the front end to the end of cuttlebone 内壳的最大宽度 Maximum width of cuttlebone 生长纹的数目 Number of growth layers 自胴部腹面中线最前端至最后端, 骨针不包括在内 Length from the bottom of the ventral midline to the front of the final end, spicule is not included 胴部腹面的最大宽度 Maximum width of the dorsol mantle 对标准化指标进行主成分分析, 具体操作步骤和所得结果的分析方法参照王国梁等 (2005) 为了有效保留原始数据所含的信息量, 提取主成分时, 通常使累计贡献率大于 85%, 这样保证结果基本涵盖金乌贼早期发育阶段原始形态生长性状的全部遗传信息 2 结果 图 1 金乌贼壳测量参数 Fig.1 Scheme of morphometric measurements of the cuttlebone 1.3 数据处理及分析方法 统计软件用 SPSS 19.0 Sigma plot 12.5 Excel 等软件进行数据处理 分析方法由于原始数据单位度量不同, 不能在同一水平上进行比较, 因此, 在分析之前, 通常需要通过 z-score( 标准差 ) 标准化处理数据来消除量纲和数量级的影响 标准化函数为 : x * =(x µ)/σ 式中,x * 为标准化后的数据,x 为原始数据,µ 为样本数据的均值,σ 为样本数据的标准差 标准化后共得到 6 组标准化指标, 用 SPSS 金乌贼早期各生长性状的测量结果 本研究共测量金乌贼早期发育阶段红珠与黑珠期 心跳期 出膜期 初孵化幼体 5 日龄 10 日龄等 6 个时期的壳长 (CL) 壳宽 (CB) 壳重 (CW) 生长纹数 (LN) 胴腹长 (DML) 胴宽 (MB) 体重 (BW) 等 7 个生长性状的数据, 详见表 2 从表 2 可以看出, 红珠与黑珠期 心跳期 出膜期 初孵化幼体期各性状的变化范围较大,5 日龄期 10 日龄期的变化范围较小 在本培育条件下, 从红珠与黑珠期到初孵化幼体耗时 16 d, 据此可以推断, 出膜前的 1 个生长纹形成需要 2.43 d, 而出膜后的生长纹数日增长为 4.95 d, 生长纹数的增长速率呈现先快后慢的特点 2.2 金乌贼内壳不同生长时期各生长性状间的相关性 根据所测形态特征数据, 利用相关系数法获得的

46 第 5 期李达等 : 金乌贼 (Sepia esculenta) 早期发育阶段内壳形态学指标的主成分分析 43

47 44 渔业科学进展第 38 卷 相关系数矩阵如表 3 从表 3 可以看出, 红珠与黑珠期 出膜期和 10 日龄期各生物性状间均呈极显著性正相关 (P<0.01); 心跳期, 除胴腹长与部分性状 胴宽与壳重间相关性不显著 (P>0.05) 外, 其他性状间呈显著性正相关 (P<0.05); 初孵化幼体期, 除胴宽与部分性状相关性不显著外 (P>0.05), 其他性状间呈极显著性正相关 (P<0.01);5 日龄时期, 除胴腹长与部分性状 胴宽与部分性状间相关性不显著 (P>0.05) 外, 其他性状间呈显著性正相关 (P<0.05) 2.3 金乌贼内壳生长性状的主成分分析本研究在金乌贼早期发育阶段的 6 个时期选取的主成分特征值及贡献率见表 4, 成分矩阵见表 5 初孵化幼体期和 5 日龄时期分别提取 4 个主成分, 其他时期提取 3 个主成分,6 个时期入选的主成分略有差别 红珠与黑珠期第 1 主成分贡献率为 %, 贡献率较大的为体重 壳长和壳重特征向量, 且体重与壳长 壳重间呈显著正相关, 可将其称为质量因子 ; 第 2 主成分的贡献率为 9.547%, 贡献率较大的为胴宽和壳宽特征向量, 可以称为宽度因子, 其中, 壳宽特征向量为负值, 说明这段时期胴宽越宽, 则壳宽越窄 ; 第 3 主成分的贡献率为 7.946%, 贡献率较大的为生长纹数生长向量, 可以称为层数因子, 且其特征值为负, 说明此时期金乌贼幼体增长速度越快, 骨板形成速度越慢 前 3 个主成分的累计贡献率为 % 心跳期, 第 1 主成分的贡献率为 %, 贡献较大的为胴宽 体重 壳长 壳宽和生长纹数 5 个特征向量, 可以称之为质量 层数因子, 其中, 生长纹数特征向量最大, 说明这个时期金乌贼幼体内壳骨板快速形成, 伴随着骨板的形成, 壳长和壳宽也开始快速增长 ; 第 2 主成分的贡献率为 %, 贡献率较大的为胴腹长特征向量 ( 长度因子 ); 第 3 主成分的贡献率为 %, 贡献率较大的为胴宽特征向量 ( 宽度因子 ), 且其特征值为负, 这个时期胴宽的增长速度缓慢 前 3 个主成分的累计贡献率为 % 出膜期, 第 1 主成分的贡献率为 %, 贡献率较大的为胴宽 壳长 壳宽和生长纹数, 可以称之为长度因子, 与心跳期相比, 第 1 主成分仍有壳长 壳宽和生长纹数, 但其特征值所占比重已有所下降, 说明出膜期内壳形成速度较心跳期有所减慢 ; 第 2 主成分的贡献率为 9.361%, 贡献率较大的为胴腹长和体重特征向量, 可以称之为长度因子, 这个时期胴腹长仍在缓慢增长, 而体重也在缓慢增长, 但增长速度 较心跳期有所下降 ; 第 3 主成分的贡献率为 5.889%, 贡献率较大为壳重特征向量, 可以称之为质量因子 前 3 个主成分的累计贡献率为 % 初孵化幼体期, 第 1 主成分的贡献率为 %, 贡献率较大的为体重 壳长特征向量, 可以称之为长度因子, 孵化后的金乌贼幼体的胴腹长和壳长都快速增长, 而且伴随着胴腹长和壳长的快速增长, 体重和壳重也快速增长 ; 第 2 主成分的贡献率为 %, 贡献率较大的为胴宽和壳重特征向量, 可以称之为宽度因子, 说明这个时期胴宽仍处于明显的增长趋势 ; 第 3 主成分的贡献率为 8.988%, 贡献率较大的为胴腹长和壳宽特征向量, 可以称之为宽度因子, 这个时期壳宽还在增长, 但增长速度减慢 ; 第 4 主成分的贡献率为 5.830%, 贡献率较大的为生长纹数特征向量, 可以称之为层数因子 前 4 个主成分的累计贡献率为 % 5 日龄时期, 第 1 主成分的贡献率为 %, 贡献率较大的为体重 壳长和壳宽特征向量, 可以称之为长度因子, 这个时期体重和壳长仍然快速增长 ; 第 2 主成分的贡献率为 %, 贡献率较大的为胴腹长特征向量, 可以称之为长度因子, 这个时期胴腹长仍处于明显的增长趋势, 但较初孵化幼体时期已有所减慢 ; 第 3 主成分的贡献率为 %, 贡献率较大的为胴宽和纹数特征向量, 可以称之为宽度因子, 其中, 胴宽特征向量值为负, 而生长纹数特征向量为正, 说明生长纹数越大, 胴宽越小 ; 第 4 主成分的贡献率为 8.932%, 贡献率较大的为壳宽和壳重特征向量, 可以称之为宽度因子 前 4 个主成分的累计贡献率为 % 10 日龄时期, 第 1 主成分的贡献率为 %, 贡献率较大的为胴腹长和壳长特征向量, 可以称之为长度因子, 其中, 体重和胴宽的特征值也较大, 说明随着胴腹长和胴宽的增长, 体重也快速增长 ; 第 2 主成分的贡献率为 %, 贡献率较大的为纹数特征向量, 可以称之为层数因子 ; 第 3 主成分的贡献率为 7.506%, 贡献率较大的为胴宽 壳宽和壳重特征向量, 可以称之为宽度因子, 其中, 胴宽的特征值为负, 而壳宽的特征值为正, 说明胴宽越大的金乌贼幼体, 其个体壳宽越小 前 3 个主成分的累计贡献率为 % 3 讨论人工养殖是补充金乌贼资源的有效方法, 但金乌贼幼体生长生物学知识的缺乏使得目前人工培育幼体的成活率较低, 而研究金乌贼内壳的形态学发育对

48 第 5 期李达等 : 金乌贼 (Sepia esculenta) 早期发育阶段内壳形态学指标的主成分分析 45 Tab.3 时期 Stages 红珠与黑珠期 Red-bead and black-beads stage 心跳期 Heartbeating stage 出膜期 Hatching stage 初孵化幼体 Newlyhatched larvae 5 日龄 5-day-old 10 日龄 10-day-old 表 3 金乌贼早期发育阶段不同时期内壳与各生长性状的相关系数 The phenotype correlation coefficient among the traits of S. esculenta at early different developmental stages 项目 Items 胴腹长 Dorsol mantle length 1 胴腹长 Dorsol mantle length 胴宽 Mantle breadth 体重 Body weight 壳长 Cuttlebone length 壳宽 Cuttlebone breadth 胴宽 Mantle breadth ** 1 体重 Body weight ** ** 1 壳长 Cuttlebone length ** ** ** 1 壳宽 Cuttlebone breadth ** * ** ** 1 壳重 Cuttlebone weight ** ** ** ** ** 1 壳重 Cuttlebone weight 纹数 Lamella number 纹数 Lamella number ** ** ** ** ** ** 1 胴腹长 Dorsol mantle length 1 胴宽 Mantle breadth 体重 Body weight ** ** 1 壳长 Cuttlebone length ** ** 1 壳宽 Cuttlebone breadth ** ** ** 1 壳重 Cuttlebone weight * ** ** 1 纹数 Lamella number * ** ** ** ** * 1 胴腹长 Dorsol mantle length 1 胴宽 Mantle breadth ** 1. 体重 Body weight ** ** 1 壳长 Cuttlebone length ** ** ** 1 壳宽 Cuttlebone breadth ** ** ** ** 1 壳重 Cuttlebone weight ** ** ** ** ** 1 纹数 Lamella number ** ** ** ** ** ** 1 胴腹长 Dorsol mantle length 1 胴宽 Mantle breadth * 1 体重 Body weight ** 壳长 Cuttlebone length ** ** 1 壳宽 Cuttlebone breadth ** * ** ** 1 壳重 Cuttlebone weight ** ** ** ** 1 纹数 Lamella number ** ** ** ** ** 1 胴腹长 Dorsol mantle length 1 胴宽 Mantle breadth 体重 Body weight * ** 1. 壳长 Cuttlebone length ** ** 1 壳宽 Cuttlebone breadth ** ** ** 1 壳重 Cuttlebone weight * ** ** 1 纹数 Lamella number ** ** * * 1 胴腹长 Dorsol mantle length 1 胴宽 Mantle breadth ** 1 体重 Body weight ** ** 1 壳长 Cuttlebone length ** ** ** 1 壳宽 Cuttlebone breadth ** ** ** ** 1 壳重 Cuttlebone weight ** ** ** ** ** 1 纹数 Lamella number ** ** * ** * ** 1 * 表示显著 (P<0.05), ** 表示极显著 (P<0.01) * showed significant difference (P<0.05), * * showed extremely significant difference (P<0.01)

49 46 渔业科学进展第 38 卷 时期 Stages Tab.4 表 4 金乌贼早期发育阶段不同时期生长性状的特征值和累计贡献率 Eigenvector and cumulative contribution rate of S. esculenta at early different developmental stages 成份初始特征值 Initial Eigenvalue Components 特征值 Eigenvalue 贡献率 Contribution 累计贡献率 Cumulative contribution rate (%) 红珠与黑珠期 Red-bead and black-beads stage 心跳期 Heart-beating stage 出膜期 Hatching stage 初孵化幼体期 Newly-hatched larvae 5 日龄 5-day-old 10 日龄 10-day-old 表 5 金乌贼早期发育阶段不同时期入选成分的特征向量 Tab.5 Principal eigenvector of S. esculenta at early different developmental stages 特征向量 Principal eigenvector 时期 Stages 成分 Components 胴腹长 Dorsol mantle length 红珠与黑珠期 Red-bead and black-beads stage 心跳期 Heart-beating stage 出膜期 Hatching stage 初孵化幼体期 Newly-hatched larvae 5 日龄 5-day-old 10 日龄 10-day-old 胴宽 Mantle breadth 体重 Body weight 壳长 Cuttlebone length 壳宽 Cuttlebone breadth 壳重 Cuttlebone weight 纹数 Lamella number 成分 1 Component 成分 2 Component 成分 3 Component 成分 1 Component 成分 2 Component 成分 3 Component 成分 1 Component 成分 2 Component 成分 3 Component 成分 1 Component 成分 2 Component 成分 3 Component 成分 4 Component 成分 1 Component 成分 2 Component 成分 3 Component 成分 4 Component 成分 1 Component 成分 2 Component 成分 3 Component

50 第 5 期李达等 : 金乌贼 (Sepia esculenta) 早期发育阶段内壳形态学指标的主成分分析 47 时期 Stages Tab.6 红珠与黑珠期 Red-bead and black-beads stage 心跳期 Heart-beating stage 表 6 金乌贼早期发育阶段不同时期的主成分 Principal components of traits of S. esculenta at early different developmental stages 第 1 主成分 First principal component 质量因子 Quality factor 质量 层数因子 Quality-layer factor 第 2 主成分 Second principal component 宽度因子 Width factor 长度因子 Length factor 第 3 主成分 Third principal component 层数因子 Layer factor 宽度因子 Width factor 第 4 主成分 Fourth principal component 出膜期 Hatching stage 长度因子 Length factor 长度因子 Length factor 质量因子 Quality factor 初孵化幼体 Newly-hatched larvae 长度因子 Length factor 宽度因子 Width factor 宽度因子 Width factor 层数因子 Layer factor 5 日龄 5-day-old 长度因子 Length factor 长度因子 Length factor 宽度因子 Width factor 宽度因子 Width factor 10 日龄 10-day-old 长度因子 Length factor 层数因子 Layer factor 宽度因子 Width factor 提高幼体成活率具有重要参考价值 本研究发现, 在金乌贼发育早期的 6 个不同时期, 内壳形态学各性状的生长速率存在一定差异, 出膜前 ( 红珠与黑珠期和心跳期 ) 质量因子的增长优于长度因子的增长, 而出膜后 ( 出膜期至 10 日龄时期 ) 长度因子的增长优于质量因子的增长, 但其中代表内壳发育的壳长都是最重要的参数 对于其他指标, 本研究采用了主成分分析法, 该方法是将原来众多具有一定相关性的指标, 重新组合成一组新的互相无关的综合指标来代替原来指标的一种多元分析方法 ( 余锦华等, 2005) 它可以反映多个实测指标的主要信息, 在进行分析与评价指标变量时, 能够切断相关的干扰, 找出主导因素, 从而做出更为准确的估计与评价 ( 蔺宏凯等, 2010) 目前, 在水产动物中, 主成分分析法主要用于研究群体系统分类 ( 刘晓慧等, 2015; 孙诗萌等, 2015; 郑汉丰等, 2005), 而对头足类生长性状的主成分分析鲜见报道, 国内仅见凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) ( 何铜等, 2009) 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) ( 王燕飞等, 2014) 翘嘴鲌(Siniperca chuatsi) ( 窦亚琪等, 2014) 高体革 (Scortum barcoo) ( 于飞等, 2009) 等的相关研究 本研究是首次尝试用主成分分析法分析金乌贼的内壳形态学特征 按照主成分分析中关于累计贡献率和特征向量的生物学含义, 累计贡献率为各复合性状相对于所有复合性状对于遗传方差的贡献的百分率 ; 特征向量表示对复合性状贡献的大小, 其绝对值反映了各性状对该主成分作用的大小和性质 ( 耿社民等, 1997) 体尺性状与体重性状均属于数量性状, 是环境和遗传因素共同作用的结果, 是动物遗传选育重要的表型性状与体型外貌的量化指标 ( 蔺宏凯等, 2010) 本研究由不同时期生长性状 的相关分析可知, 红珠与黑珠期 出膜期和 10 日龄期各生物性状间均呈显著性正相关, 心跳期 初孵化幼体期和 5 日龄时期部分性状间相关性不显著 相关分析虽然可以了解各生长阶段不同性状参数的相互关系, 但无法消除性状间彼此相关而造成的信息重叠, 为此, 进行主成分分析, 将复杂的数据综合成几个简单的综合性状 ( 侯建君等, 2006) 本研究不同时期主成分分析结果见表 6, 从表 6 可以看出, 金乌贼早期发育阶段不同时期主成分有所不同, 同一主成分在不同时期所占的比重也不同 第 1 主成分在前 2 个时期为质量因子, 后 4 个时期为长度因子 ; 第 2 主成分主要为长度因子和宽度因子 ; 第 3 主成分大部分为宽度因子 ; 第 4 主成分只有 2 个时期存在, 分别为层数因子和宽度因子 同时主成分分析结果表明, 大部分时期只要抓住前 3 个主成分, 就能抓住 7 个生长指标 85% 以上的信息, 红珠与黑珠期和心跳期质量的增长优于形态特征的增长, 而从出膜期至 10 日龄时期形态特征的增长优于质量的增长 分析原因可能是, 幼体出膜后为了躲避天敌和主动摄食, 将能量主要用于运动器官和摄食器官的形成, 这种现象被称为异速生长, 并且在其他物种中已经得到证实 ( 单秀娟等, 2009; 马境等, 2007) 在所有时期中, 第 1 主成分所占的贡献率均在总的贡献率的 50% 以上, 说明它是金乌贼早期个体形态性状变异的主要来源, 由于生物体各性状间存在遗传相关, 一个性状的改变会导致另一个性状的选择反应, 因此, 在选育工作中可根据第 1 主成分为主进行选择, 也就是在出膜前 ( 红珠与黑珠期 心跳期 ) 以体重为重要的形态性状选择指标, 出膜后 ( 出膜期 初孵化幼体期 5 日龄期和 10 日龄期 ) 则以内壳壳长和胴腹长为重要的选择指标, 依此可提高金乌贼的选育效率

51 48 渔业科学进展第 38 卷 参考文献 Bandel K, Boletzky S. A comparative study of the structure, development and morphological relationships of chambered cephalopod shells. Veliger, 1979, 21(3): Chen XJ, Liu BL, Wang YG. The world of cephalopods. Beijing: China Ocean Press, 2009 [ 陈新军, 刘必林, 王尧耕. 世界头足类. 北京 : 海洋出版社, 2009] Dong ZZ. The world ocean economy cephalopod biology. Jinan: Shandong Science and Technology Press, 1991 [ 董正之. 世界大洋经济头足类生物学. 济南 : 山东科技学技术出版社, 1991] Dou YQ, Liang XF, Yi TL, et al. Principal component and discriminant analyses of traits of Siniperca chuatsi at different ages. Journal of Fishery Sciences of China, 2014, 21(6): [ 窦亚琪, 梁旭方, 易提林, 等. 翘嘴鳜不同月龄性状的主成分与判别分析. 中国水产科学, 2014, 21(6): ] Geng SM, Chang H, Qin GQ, et al. Principal component analysis and classification of body characteristics in the part cattle population of Asia. Journal of Yellow Cattle Science, 1997(4): [ 耿社民, 常洪, 秦国庆, 等. 亚洲 49 个牛群体体尺性状的多元统计分析. 黄牛杂志, 1997(4): 17 20] Hao ZL, Zhang XM, Zhang PD. Biological characteristics and multiplication techniques of Sepia esculenta. Chinese Journal of Ecology, 2007, 26(4): [ 郝振林, 张秀梅, 张沛东. 金乌贼的生物学特性及增殖技术. 生态学杂志, 2007, 26(4): ] He T, Lin XL, Yang CM, et al. Principal component and discriminant analyses of traits of Litopenaeus vannamei at different ages. Acta Ecologica Sinica, 2009(4): [ 何铜, 刘小林, 杨长明, 等. 凡纳滨对虾各月龄性状的主成分与判别分析. 生态学报, 2009(4): ] Hou JJ, Shi ZX, Li BM. Principal component analysis of Landrace s physical characteristics. Journal of China Agricultural University, 2006, 11(3): [ 侯建君, 施正香, 李保明. 不同生长阶段长白猪体型特征的主成分分析. 中国农业大学学报, 2006, 11(3): 56 60] Lin HK, Zhang Y, Zhou ZY. The principal component analysis of Xinjiang brown cattle body measurement trait. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2010, 37(8): [ 蔺宏凯, 张杨, 周振勇. 新疆褐牛体尺性状指标与体重的主成分分析. 中国畜牧兽医, 2010, 37(8): ] Liu XH, Song N, Liu HY, et al. Preliminary analysis on morphological characteristics of 5 Collichthys lucidus geographical populations. Transaction of Oceanology and Limnology, 2015(2): [ 刘晓慧, 宋娜, 刘鸿雁, 等. 棘头梅童鱼 5 个地理群体的形态学初步分析. 海洋湖沼通报, 2015(2): 59 67] Liu YG, Zhao FH, He JL. Study of cuttlebone. Lishizhen Medicine and Chinese Medicine, 2005, 16(1): [ 刘永刚, 赵富花, 何进来. 海螵蛸的研究概况. 时珍国医国药, 2005, 16(1): 72 73] Ma J, Zhang LZ, Zhuang P, et al. Development and ailometric growth patterns of larval Acipenser schrenckii. Chinese Journal of Applied Ecology, 2007, 18(12): [ 马境, 章龙珍, 庄平, 等. 施氏鲟仔鱼发育及异速生长模型. 应用生态学报, 2007, 18(12): ] Shan XJ, Dou SZ. Growth and development of juvenile (Miichthys miiuy), juvenile and its ecological significance. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2009, 40(6): [ 单秀娟, 窦硕增. 鱼 (Miichthys miiuy) 仔 稚鱼发育生长方式及其生态学意义. 海洋与湖沼, 2009, 40(6): ] Sun SM, An BS, Cai MC, et al. Analysis of morphological variation of different populations of fat greenling Hexagrammos otakii. Chinese Journal of Fisheries, 2015(4): 6 11 [ 孙诗萌, 安百胜, 蔡明城, 等. 大泷六线鱼不同群体的形态差异分析. 水产学杂志, 2015(4): 6 11] Tang QS, Ye HZ. Development and protection of fishery resources in Shandong offshore. Beijing: Agriculture Press, 1990: 212 [ 唐启升, 叶懋中. 山东近海渔业资源开发与保护. 北京 : 农业出版社, 1990: 212] Wang GL, He XQ. Statistical analysis of multivariable economic data. Shaanxi Science and Technology Press, 1993 [ 王国梁, 何晓群. 多变量经济数据统计分析. 陕西科学技术出版社, 1993] Wang YF, Wang CL, Mu CK, et al. Principal component analysis of morphometric traits of Portunus trituberculats at different month ages. Ecologic Science, 2014, 33(3): [ 王燕飞, 王春琳, 母昌考, 等. 三疣梭子蟹不同月龄形态性状的主成分分析. 生态科学, 2014, 33(3): ] Yu F, Chen BY, Gao H, et al. Principal component analysis of growth traits of Scortum barcoo at different growth stages. Journal of Huaihai Institute of Technology (Natural Sciences Edition), 2009, 18(4): [ 于飞, 陈百尧, 高焕, 等. 高体革不同生长阶段生长性状的主成分分析. 淮海工学院学报 ( 自然科学版 ), 2009, 18(4): 69 72] Yu JH, Yang WQ. Multivariate statistical analysis and application. Guangzhou: Zhongshan University Press, 2005 [ 余锦华, 杨维权. 多元统计分析与应用. 广州 : 中山大学出版社, 2005] Zhang JY, Li WB. Study of cuttlebone demineralization and remineralization and microstructure. Medical Journal of Shenyang, 1993(4): [ 张健英, 李文波. 海螵蛸的脱矿 再矿化及显微构造的研究. 沈阳医药学报, 1993(4): ] Zhao ZJ, Jiang PF, Li A. Determination of calcium carbonate, trace elements and amino acids in cuttlebone. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 1990, 15(1): [ 赵中杰, 江佩芬, 李昂. 海螵蛸中碳酸钙 微量元素和氨基酸的测定. 中国中药杂志, 1990, 15(1): 41 43] Zheng HF, Zhang GF, Li JL, et al. Morphology difference analysis of juvenile among Hyriopsis cumingii, Hyriopsis schlegeli and their hybrids. Journal of Shanghai Fisheries University, 2005, 14(3): [ 郑汉丰, 张根芳, 李家乐, 等. 三角帆蚌 池蝶蚌及其杂交 F 1 代早期形态差异分析. 上海水产大学学报, 2005, 14(3): ] ( 编辑冯小花 )

52 第 5 期李达等 : 金乌贼 (Sepia esculenta) 早期发育阶段内壳形态学指标的主成分分析 49 Principal Component Analysis of the Morphometric Traits of the Cuttlebone of Sepia esculenta at Early Developmental Stages LI Da 1,2, LIU Changlin 2, LI Ang 2, DU Tengfei 1,2, LIU Shufang 2,31, ZHUANG Zhimeng 2,4 (1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai ; 2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao ; 3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao ; 4. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao ) Abstract To characterize the traits of the cuttlebone of Sepia esculenta at the early developmental stages, we collected data at different stages including the red-bead and black-bead stage, the heart-beating stage, the hatching stage, the newly-hatched larvae stage, the 5-day-old stage and the 10-day-old stage. The principal component analysis was performed to evaluate seven growth traits including the dorsal mantle length, the mantle breadth, the body weight, the cuttlebone length, the cuttlebone breadth, the cuttlebone weight and the lamella number. The results showed that there were significant correlations between any two traits at the red-bead and black-bead stage, the hatching stage and the 10-day-old stage. However, some traits showed no correlation at the heart-beating stage, the newly-hatched larvae stage and the 5-day-old stage. The first principal component was the weight factor at the first two stages, and it became the length factor at other four stages. The second principal component was the length factor and width factor. The third principal component was mostly the width factor. At only two stages there was the fourth principal component that was the lamella factor and the width factor. The growth rate of these traits varied at different stages. From the red-bead and black-bead stage to the heart-beating stage, the morphometric traits outgrew the body weight, and this pattern was reversed from the hatching stage to the 10-day-old stage. Key words Sepia esculenta; Growth traits; Cuttlebone; Principal component analysis 1 Corresponding author: LIU Shufang, liusf@ysfri.ac.cn

53 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 黄斑篮子鱼 (Siganus oramin) 对北方养殖 * 网箱网衣附着藻类的生物清除作用 吕旭宁房景辉 1,2 2 蒋增杰高振锟 2,31 1,2 方建光 1 姜娓娓 2,3 邹健 1,2 郭晓亮 (1. 上海海洋大学水产与生命学院上海 ; 2. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛 ; 3. 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室青岛 ) 2 摘要高温季节网衣附着藻类的大量附着是北方网箱养殖产业面临的主要问题之一, 生物清除策略是解决这一问题的有效手段 本研究利用黄斑篮子鱼 (Siganus oramin) 作为网衣附着藻类生物清除的工具种, 于 2015 年 6 11 月, 采用室内实验和现场观测相结合的方法, 系统研究了桑沟湾楮岛海域网箱养殖区不同水层网衣附着藻类生物量的月际变化 黄斑篮子鱼对优势藻类的摄食能力及对网衣藻类的清除效果 结果显示, 同一月份不同深度附着藻类生物量的日均增长量有一定差异, 且不同水层在 8 月 7 日 9 月 14 日时间段内的藻类附着日均增长量均显著高于其他月份 (P<0.01), 各个月份海头红 (Plocamium telfairiae) 均为该区域的优势种类 构建了适温条件下黄斑篮子鱼对海头红的碳收支方程 :100 摄入碳 =11.69 生长碳 粪便碳 排泄碳 代谢碳 初始体重为 (1.44±0.61) g 的黄斑篮子鱼经过 152 d 的养殖, 平均体重达到 (45.38±4.22) g, 日均增重 0.26 g 海区网箱内有无黄斑篮子鱼的对比实验显示, 其对不同月份网衣附着藻类的清除率在 80.28% 90.15% 之间 研究表明, 黄斑篮子鱼对网衣附着藻类有较高的清除效率, 可以作为清除网衣附着生物的工具种 关键词网衣 ; 附着藻类 ; 海头红 ; 黄斑篮子鱼 ; 碳收支中图分类号 S965.3 文献标识码 A 文章编号 (2017) 在北方网箱养殖过程中, 高温季节网衣附着藻类的大量着生一直是困扰广大从业者的主要问题之一 大量的附着藻类导致网箱的自身重量增大, 对海水的阻力变大, 自身浮力变小, 致使网绳的负重增加, 缩短了网具的使用寿命, 夏季生物量高峰时期会造成网具的网眼堵塞, 影响水体的内外交换 ( 王建军等, 1996), 严重时甚至会阻碍养殖对象的生长, 甚至导 致死亡 (Cronin et al, 1999) 在我国北方主要通过曝晒法进行清除附着藻类, 但该过程费时费力, 对网具也会造成不同程度的机械损伤 因此, 寻求一种合理的附着藻类防除方法对北方网箱养殖业具有积极意义 黄斑篮子鱼 (Siganus oramin), 亦称长鳍篮子鱼, 广泛分布于太平洋西部和印度洋以及我国的东海南部和南海 ( 马强等, 2006) 黄斑篮子鱼主要栖息于水体 * 公益性行业 ( 农业 ) 科研专项 ( ) 青岛海洋科学与技术国家实验室鳌山科技创新计划项目(2016ASKJ02) 和国家贝类产业技术体系 (CARS-47) 共同资助 [This work was funded by Special Fund for Agro-Scientific Research in the Public Interest ( ), the Scientific and Technological Innovation Project financially supported by Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology (2016ASKJ02) and Modern Agro-Industry Technology Research System (CARS-47)]. 吕旭宁, m @163.com 1 通讯作者 : 蒋增杰, 副研究员, jiangzj@ysfri.ac.cn 收稿日期 : , 收修改稿日期 :

54 第 5 期吕旭宁等 : 黄斑篮子鱼 (Siganus oramin) 对北方养殖网箱网衣附着藻类的生物清除作用 51 中下层, 活动能力较强, 喜结群, 易受惊, 具有争抢食物的习性, 喜摄食网衣上附着的藻类, 可清洁网衣 ( 陆忠康, 1996) 针对北方海水网箱养殖藻类附着盛期主要集中在夏 秋季节, 本研究以桑沟湾楮岛海域为研究区域, 选择黄斑篮子鱼作为底播刺参苗种网箱中间培育期 (4 11 月 ) 网衣附着藻类的生物清除工具种, 探讨了适温条件下黄斑篮子鱼对附着藻类优势种海头红 (Plocamium telfairiae) 的摄食能力, 旨在为北方海水网箱养殖过程中附着藻类的清除提供一种新的思路 1 材料与方法 1.1 实验地点与材料实验地点选在山东省荣成市桑沟湾楮岛海域, 此处为荣成网箱养殖的密集区域, 主要品种为许氏平 (Sebastes schlegelii) 大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)( 养殖时段为 5 月初至 10 月中旬 ) 及保苗期的刺参 (Stichopus japonicus)( 养殖时段为 5 月中旬至 10 月底 ), 养殖期间日均水温范围为 15 24, 盐度为 30.9±1.1,pH 为 8.1±0.7, 溶氧大于 6.0 mg/l 渔排为木制框架, 网箱规格为 3.0 m 3.0 m 3.0 m, 单层聚乙烯网衣, 网目规格为 1.0 cm 实验用黄斑篮子鱼从福建近海捕获, 苗种于 2015 年 6 月 12 日运到实验海区网箱中暂养, 苗种平均体长为 (39.0±6.5) mm, 平均体重为 (1.4±0.6) g, 共放养 4000 尾 1.2 实验内容及方法 网箱附着藻类群落变化用聚丙烯材料制藻类附着框 ( 长 宽为 45.0 cm 45.0 cm, 附着框上网衣网目为 6.5), 研究 6 11 月网箱养殖区附着藻类的数量和优势种 附着框于 6 月 15 日投放, 于 7 月 16 日 8 月 7 日 9 月 15 日 10 月 15 日和 11 月 14 日分别回收, 并更换新的附着框, 这 5 个月包含了北方网衣藻类 少量附着 大量附着 少量附着 的全过程 附着框挂在养殖黄斑篮子鱼的渔排上, 实验设置 3 个平行, 每个平行包括自上而下的 3 个附着框, 深度分为 0.5 m 1.4 m 和 2.3 m 底部挂有 1.0 kg 的配重 回收的附着框带回实验室后, 进行附着藻类的种类鉴定 ( 非藻类生物单独取下, 烘干处理 ), 鉴定完成后, 将网衣剪下, 放入干净的托盘中,65 条件下烘干 48 h, 将烘干后的网衣进行称重 ( 精确到 0.1 g), 记为 W 1, 将网衣上的藻类清除干净后, 再次称量网衣的重量, 记为 W 2,W 1 W 2 即为附着藻类的干重 自然状态下, 网箱区不同月份网衣附着藻类生物量, 用附着框上藻类的日均增长量 ( 文章中涉及的藻类重量均为干重 ) 来 估算 实验有关参数计算依据公式 : 日均增重量 (g)=(w 2 W 1 )/t 式中,W 1 和 W 2 分别为实验开始和结束时的藻类干重 (g),t 为实验持续时间 (h) 适温条件下黄斑篮子鱼对海头红的摄食能力和碳收支在 8 月 17 日, 进行了 23 条件下黄斑篮子鱼对网衣附着藻类优势种海头红的碳收支实验, 实验用鱼的全长为 (79.5±7.5) mm 本实验共设 3 个平行, 实验开始前每个平行选取 4 条活力较强 体色正常 大小均匀的黄斑篮子鱼转移至 49.0 cm 23.5 cm 29.0 cm( 长 宽 高 ) 的玻璃缸流水槽中, 水量保持在距底部 24.0 cm 处, 暂养驯化 7 d 后开始实验 ( 驯化期间投喂海头红 ) 沿岸的自然海水经砂滤后作为实验用水, 实验水温为 (23.0±0.5), 以冷水机 (HXLS 1000, 大连 ) 控制, 盐度为 30.9±1.1, 溶氧量保持在 6.0 mg/l 以上 实验开始的同时, 每组平行取出 1 条鱼进行呼吸 排泄的相关实验, 剩余 3 条进行摄食实验 实验持续 24 h, 上午 06:00 开始, 根据预实验的实验结果, 一次性投喂过量的海头红, 为了防止粪便在水中溶失, 分别在 1 h 6 h 14 h 24 h 用虹吸法吸取粪便, 将收集的粪便与残饵烘干 称重 干燥后的残饵与粪便, 经过研磨 过筛 酸化 干燥后, 各称取一定质量 ( mg) 包膜, 样品中的碳含量用元素分析仪 (Vario EL cube; Elementar, 德国 ) 进行分析 得出的数据用于计算摄入总碳和粪便总碳, 代 谢碳 ( 碳代谢率 ) 和排泄碳 ( 碳排泄率 ) 用耗氧率和排氨率的数据转换得出 耗氧率和排氨率的测定 : 设置 3 个平行 3 个空白对照组, 所用容器为可容纳 5.8 L 海水的白色聚乙烯实验瓶, 每个瓶中放 1 条鱼 实验用鱼放入实验瓶后, 流水暂养 2 h 后, 用保鲜膜密封, 开始实验 实验过程中 23 水浴, 实验持续 2 h, 实验结束后, 虹吸法取水样进行耗氧率和排氨率的测定 溶解氧 (DO) 的测定采用 (Winkler) 碘量法, 根据实验前后溶解氧的浓度变化计算单位干重耗氧率 [OR, mg/(g h)]: OR=[(DO 0 DO t ) V]/(W t) 式中,DO 0 和 DO t 分别为实验开始和结束时实验水中溶解氧含量 (mg/l),v 为实验用水的体积 (L),W 为实验鱼体干重 (g),t 为实验持续时间 (h) 氨氮 (NH 4 -N) 采用次溴酸钠氧化法测定, 根据实验前后氨氮浓度变化计算单位干重排氨率 [NR, μmol/(g h)]: NR=[(N t N 0 ) V]/(W t) 式中,N 0 和 N t 分别为实验开始和结束时实验水

55 52 渔业科学进展第 38 卷 中氨氮浓度 (μmol/l),v 为实验用水的体积 (L),W 为实验鱼体干重 (g),t 为实验持续时间 (h) 黄斑篮子鱼在 23 下的碳收支中 : IR=W 1 /(W 2 t),c c =IR C 1 % FR=W 3 /(W 2 t),f c =FR C 2 % U c =(12/28) NR R c =RQ (12/32) OR G c =C c F c U c R c 式中,IR 为摄食率,FR 为排粪率,NR 为排氨率,OR 为耗氧率 [ 单位均为 mg/(g h)];c c 为摄入碳, F c 为粪便碳,U c 为排泄碳,R c 为代谢碳,G c 为生长碳 [ 单位均为 mg/(g h)];rq 为呼吸熵, 本研究采用经验常数 0.85( 毛兴华等, 1997) W 1 为实验时间内摄食海头红干重,W 2 为实验鱼体干重,W 3 为实验时间内排出粪便干重 ( 单位均为 g); t 为实验持续时间 (h);c 1 为海头红中含碳量,C 2 为粪便中含碳量 黄斑篮子鱼在 6 11 月的生长情况及其对网衣清除效果的对比黄斑篮子鱼自 6 月 12 日放入网箱后, 投喂海头红等野生藻类暂养, 在 6 月 15 日随机捞取 400 条放入已长有杂藻的网箱 ( 规格为 3.0 m 3.0 m 3.0 m) 内, 设置 3 个平行, 用未放养黄斑篮子鱼的相同规格网箱作为对照, 隔 30 d 左右测量水温 溶氧 盐度 ph, 随机取黄斑篮子鱼 10 条, 测量其体长 全长 体宽和体重, 体长 全长 体宽均精确到 0.1 mm, 体重精确到 0.1 g 每个实验和对照网箱 均随机设 5 个采样点, 跟踪不同季节篮子鱼对附着藻类的清除率, 采样点面积为 20.0 cm 2, 且位于相同位置 实验有关参数计算公式 : 日均增长量 (mm)=(l 2 L 1 )/t 日均增重量 (g)=(w 2 W 1 )/t 式中,L 1 和 L 2 分别为实验开始和结束时鱼体体长,W 1 和 W 2 分别为实验开始和结束时鱼体湿重 (g), t 为实验持续时间 (h) 数据统计与处理数据处理采用 Excel 2007, 统计分析采用 SPSS 19.0, 对所得数据进行单因素方差分析 (One-way ANOVA) 和 Duncan 多重比较, 以 P<0.05 作为差异显著水平 2 结果 月网衣附着藻类生物量的月际变化规律及优势种类 6 11 月网衣附着藻类生物量的月际变化见图 1 结果显示, 相同月份 不同深度的藻类附着量存在差异 7 月 16 日 8 月 6 日, 下层附着框上附着的藻类重量显著低于上层和中层 (P<0.01), 上层和中层差异不显著 (P>0.05);8 月 7 日 9 月 14 日, 上层与中层及下层差异显著 (P<0.01), 中层及下层无差异 (P>0.05); 9 月 15 日 10 月 14 日, 下层与上层及中层差异显著 (P<0.01), 上层和中层无差异 (P>0.05);10 月 15 日 Fig.1 图 1 不同深度附着藻类日均增长量的月际变化 Monthly variation of average daily weight gain of fouling macroalgae in different depth 由于 6 月 15 日 7 月 15 日实验海域有台风经过, 仅存上层一个附着框, 因此, 这段时间的上 中 下藻类附着量均用此附着框的数据代替 不同字母表示差异显著 (P<0.05) Due to the typhoon in the test sea area during 15th June to 15th July, only one frame in the upper layer remained, as the result, the data of this frame were applied to other different layer frames. Different letters indicated significant differences (P<0.05)

56 第 5 期吕旭宁等 : 黄斑篮子鱼 (Siganus oramin) 对北方养殖网箱网衣附着藻类的生物清除作用 月 14 日三层均差异不显著 (P>0.05) 相同深度 不同月份的附着藻类日均增长量差异显著,8 月 7 日 9 月 14 日时间段内, 各层的藻类日均增长量都显著高于其他月份 从附着藻类的日均附着量来看, 其生长受水温影响显著 (P<0.05) 各个月份网衣附着生物的种类统计结果见表 1 结果显示, 实验期间的每个月均有海头红, 而玻璃海鞘仅在 8 月出现, 且海头红的干重占比始终在 90% 以上, 是网衣附着藻类的优势种 2.2 适温条件下黄斑篮子鱼对海头红的摄食能力及碳收支 23 条件下, 黄斑篮子鱼对海头红的摄食能力见表 2 结果显示, 摄食率可达 (10.91±0.69) mg/(g h), 从碳收支结果来看, 以海头红为食物来源的黄斑篮子 鱼每天摄入的碳为 (2.31±0.15) mg/(g h), 其中, 约有 71.43% 用于代谢,11.69% 用于生长 由图 2 得出的碳收支方程 100 摄入碳 =11.69 生长碳 粪便碳 排泄碳 代谢碳 中可以看出 : 摄入碳的大部分以代谢碳的形式输出, 排泄碳的占比最小, 生长碳的比重略大于粪便碳 2.3 黄斑篮子鱼在 6 11 月的生长情况及对网衣清除效果的对比从 6 月中旬 11 月中旬黄斑篮子鱼生长过程来看 ( 图 3), 其生长受水温影响明显, 在取样阶段平均水温约 24 时, 日均增长量达到最高, 为 0.91 mm/d 当平均水温降到 17 时, 日均增长量和日均增重量均出现最低值, 分别为 0.08 mm/d 和 0.03 g/d, 水温较高的 8 月 7 日 10 月 14 日时间段内生长较快 Tab.1 种类 Species 表 月桑沟湾楮岛海域网衣附着生物的种类 Species of biofouling in cage culture area of Chudao, Sanggou Bay from June to November 6 月 15 日 7 月 15 日 7 月 16 日 8 月 6 日 实验时段 Experimental period 8 月 7 日 9 月 14 日 9 月 15 日 10 月 14 日 10 月 15 日 11 月 14 日 海头红 P. telfairiae 玻璃海鞘 Ciona intestinalis / / + / / 注 : + 表示出现, / 表示没有出现 + 越多表示数量越大 Note: + represented presence; / represented absence. The more +, the larger number Tab.2 摄食率 IR [mg/(g h)] 表 2 23 条件下黄斑篮子鱼对海头红的摄食及代谢生理 (n=3) Data of feeding and metabolic physiology of S. oramin and its feeding of P. telfairiae at 23 (n=3) 摄食碳 C c [mgc/(g h)] 排粪率 FR [mg/(g h)] 粪便碳 F c [mgc/(g h)] 耗氧率 OR [mg/(g h)] 呼吸碳 Rc [mgc/(g h)] 排氨率 NR [mg/(g h)] 排泄碳 Uc [mgc/(g h)] 10.91± ± ± ± ± ± ± ±0.01 图 2 23 黄斑篮子鱼摄食海头红的碳收支 Fig.2 Carbon budget of S. oramin feeding with P. telfairiae at 23 黄斑篮子鱼对附着藻类生长的控制作用非常明显 ( 图 4), 实验期间, 清除率在 80.28% 90.15% 之间, 在附着藻类生物量最多的 8 月, 清除率达到 81.25% 图 3 黄斑篮子鱼在不同月份的日均增长 / 重量 Fig.3 Average daily length/weight gain of S. oramin during the experimental period

57 54 渔业科学进展第 38 卷 图 4 不同月份篮子鱼对附着藻类的清除率 Fig.4 Removal rate of fouling macroalage by S. oramin in different month 3 讨论 目前, 附着生物的防除主要通过物理措施 化学手段及生物学方法 ( 刘姗姗等, 2006) 相对于生物学方法, 物理措施与化学手段存在多种弊端, 如物理措施费时费力, 且容易造成网具不同程度的磨损, 影响使用寿命 (Holm et al, 2003; 阎斌伦等, 2005); 化学手段中的有毒物质对海洋生物的生长发育有不同程度的负面影响等 (Evans, 1999; 陈纪国, 2016) 而生物防治方法对环境友好, 清除附着生物时不会对海洋环境和生态造成不良的影响 与桑沟湾其他区域的附着生物相比, 桑沟湾南部楮岛海域的附着生物具有非常明显的特点 : 首先, 附着生物的多样性低, 实验期间的大型附着生物种类只有 2 种, 而桑沟湾北部的寻山贝藻养殖区,2007 年 5 月 2008 年 4 月鉴定出的大型附着生物达 23 种 ( 齐占会等, 2010); 其次, 优势种的组成简单, 以红藻门的海头红为主, 各月份的生物量均占到总生物量的 90% 以上, 该藻藻体扁平, 丛生, 基部有匍匐枝, 向上生出扁平直立的羽状分枝, 分枝上有齿状小枝, 形态特征符合篮子鱼的摄食特点 本研究黄斑篮子鱼对海头红的摄食结果显示, 黄斑篮子鱼对海头红的摄食速度较快, 且摄食海头红能够满足黄斑篮子鱼正常的生理生长需要 Pillans 等 (2004) 发现, 褐篮子鱼 (Siganus fuscescens) 对不同藻类摄食选择性的结果也显示, 褐篮子鱼对红藻门的刺枝鱼栖苔 (Acanthophora spicifera) 和帚状江蓠 (Gracilaria edulis) 的摄食能力显著高于对褐藻门网地藻 (Dictyota dichotoma) 匍扇藻 (Lobophora variegata) 和绿藻门银白钙扇藻 (Udotea argentea) 的摄食, 对 2 种红藻的同化效率分别达到 54.16% 和 39.51% 这些特点为实施篮子鱼生物清除提供了良好的自然条件 碳收支是研究生物体内能量循环的有效手段, 通过碳收支方程, 可以进一步了解黄斑篮子鱼摄食海头红的能量分配策略 由于涉及篮子鱼的碳收支方面的研究较少, 选择了梭鱼 (Sphyraenus) 和真鲷 (Pagrosomus major) 2 种海水鱼与其进行对比,2 种鱼自由摄食状态下的碳收支分别为 :100 摄入碳 =9.29 生长碳 粪便碳 非粪便流失碳 ( 排泄碳 + 代谢碳 )( 康斌等, 2007),100 摄入碳 =13.99 生长碳 粪便碳 排泄碳 代谢碳 ( 李军等, 1998) 对比 23 下黄斑篮子鱼对海头红的碳收支方程 100 摄入碳 =11.69 生长碳 粪便碳 排泄碳 代谢碳, 可以看出本研究结果与上述研究相似, 因为碳收支与能量收支类似, 只是用碳作为计量单位, 因此, 可以推测黄斑篮子鱼的能量分配为 : 大部分的能量用于维持其代谢需求, 较多的能量伴随着代谢产物排出体外, 从而导致用于生长的能量较低 相比饲料喂养的黄斑篮子鱼日均增重 0.27 g ( 冯广朋等, 2008), 摄食附着藻类的篮子鱼, 日均增重仍达到了 0.26 g, 这说明只摄食藻类的能量摄入足以满足其自身的正常生长 国内外很多关于篮子鱼的研究集中在食性 生长 繁殖 分子生物学等方面 (Hoque et al, 1999; Pillans et al, 2004; 沈卓坤等, 2003; 陈傅晓等, 2006), 把黄斑篮子鱼应用于网衣清洁的深入研究并不多见 实验发现, 黄斑篮子鱼对网衣上附着藻类的平均清除率达 80% 以上, 充分利用其对网衣上藻类的清除作用, 就可以在相同的养殖时间内, 做到少换或者不换网衣 因此, 选择黄斑篮子鱼与合适物种混养, 既能有效抑制藻类的附着, 降低人力成本, 还可以为养殖户带来额外的收入, 具有显著的生态和经济效益 参考文献 Chen FX, Feng QY. Cage culture technique of Siganus oramin. Fishery Modernization, 2006, 33(5): [ 陈傅晓, 冯全英. 莹斑篮子鱼网箱养殖技术. 渔业现代化, 2006, 33(5): 19 20] Chen JG. Construction proposal of anti-fouling coatings in nuclear power plants. Overall Corrosion Control, 2016, 30(1): [ 陈纪国. 核电站防海生物涂料施工建议. 全面腐蚀控制, 2016, 30(1): 83 86] Cronin ER, Cheshire AC, Clarke SM, et al. An investigation into the composition, biomass and oxygen budget of the fouling community on a tuna aquaculture farm. Biofouling, 1999, 13(4): Evans SM. TBT or not TBT: That is the question. Biofouling, 1999, 14(2): Feng GP, Zhang LZ, Zhuang P, et al. Feeding habit and growth

58 第 5 期吕旭宁等 : 黄斑篮子鱼 (Siganus oramin) 对北方养殖网箱网衣附着藻类的生物清除作用 55 characteristics of Siganus canaliculatus cultured in sea net cage. Marine Fisheries, 2008, 30(1): [ 冯广朋, 章龙珍, 庄平, 等. 海水网箱养殖长鳍篮子鱼的摄食与生长特性. 海洋渔业, 2008, 30(1): 37 42] Holm ER, Haslbeck EG, Horinek AA. Evaluation of brushes for removal of fouling from fouling-release surfaces, using a hydraulic cleaning device. Biofouling, 2003, 19(5): Hoque MM, Takemuar A, Matsuyama M, et al. Lunar spawning in Siganus canaliculatus. Journal of Fish Biology, 1999, 55(6): Kang B, Xian WW, Wu YF. Carbon budget of redlip mullet (Liza haematocheila T. &S.) under different feeding rates. Periodical of Ocean University of China (Natural Science Edition, 2007, 37(2): [ 康斌, 线薇微, 武云飞. 不同摄食水平条件下鮻的碳收支研究. 中国海洋大学学报 ( 自然科学版 ), 2007, 37(2): ] Li J, Xu CA, Xu SH, et al. Study on energy budget, nitrogen and carbon budget in young red sea bream. Marine Sciences, 1998, 22(2): [ 李军, 徐长安, 徐世宏, 等. 真鲷能量收支和氮与碳收支的初步研究. 海洋科学, 1998, 22(2): 46 48] Liu SS, Yan T. Present situation and development prospects of prevention of marine biofouling. Journal of Marine Sciences, 2006, 24(4): [ 刘姗姗, 严涛. 海洋污损生物防除的现状及展望. 海洋学研究, 2006, 24(4): 53 60] Lu ZK. The status and prospect for rabbitfish farming. Modern Fisheries Information, 1996, 11(3): [ 陆忠康. 篮子鱼 (Rabbitfish farming) 养殖现状及其发展前景. 现代渔业信息, 1996, 11(3): 20 23] Mao XH, Hao YW, Yang XL. Carbon metabolism and energy metabolism of Argopecten irradians and Chlamys ferrari. Acta Oceanologica Sinica, 1997, 19(4): [ 毛兴华, 郝亚威, 杨小龙. 海湾扇贝和栉孔扇贝的碳代谢及能量代谢. 海洋学报, 1997, 19(4): ] Ma Q, Liu J. Introduction and prospect of the systematic study of Siganidae in China. South China Fisheries Science, 2006, 2(4): [ 马强, 刘静. 篮子鱼科的系统研究概况及我国篮子鱼科的研究展望. 南方水产, 2006, 2(4): 68 74] Pillans RD, Franklin CE, Tebbetts IR. Food choice in Siganus fuscescens: Influence of macrophyte nutrient content and availability. Journal of Fish Biology, 2004, 64(2): Qi ZH, Fang JG, Zhang JH, et al. Seasonal succession of fouling communities in the poly-culture area of scallop Chlamys farreri and kelp Laminaria japonica in Sanggou Bay. Progress in Fishery Sciences, 2010, 31(4): [ 齐占会, 方建光, 张继红, 等. 桑沟湾贝藻养殖区附着生物群落季节演替研究. 渔业科学进展, 2010, 31(4): 72 77] Shen ZK, Chen S. Co-culture technique of tiger shrimp and rabbitfish in the pond. Journal of Aquaculture, 2003, 24(6): [ 沈卓坤, 陈赛. 篮子鱼与斑节对虾的池塘混养技术. 水产养殖, 2003, 24(6): 12 13] Wang JJ, Huang ZG, Li CY, et al. Investigation of cage farms biofouling in Xiamen port. Acta Oceanologica Sinica, 1996, 18(5): [ 王建军, 黄宗国, 李传燕, 等. 厦门港网箱养殖场污损生物的研究. 海洋学报, 1996, 18(5): ] Yan BL, Hu XL, Qiao JY. Culture technology of anti-wave cage in deep sea. China Fisheries, 2005(6): [ 阎斌伦, 胡希亮, 乔进友. 深海抗风浪网箱养殖技术. 中国水产, 2005(6): 60 62] Yan T, Yan WX, Dong Y, et al. Investigation of biofouling in offshore areas east of Hainan Island. Oceanologia et Limnologia Sinica, 1998, 29(4): [ 严涛, 严文侠, 董钰, 等. 海南岛东部海域生物污损的研究. 海洋与湖沼, 1998, 29(4): ] ( 编辑冯小花 )

59 56 渔业科学进展第 38 卷 Biological Control of Macroalgae Fouled on the Net of Marine Cage Using Siganus oramin in Northern China LÜ Xuning 1,2, JIANG Zengjie 2,31, FANG Jianguang 2,3, ZOU Jian 2, FANG Jinghui 2, GAO Zhenkun 1,2, JIANG Weiwei 1, GUO Xiaoliang 1,2 (1. College of Fishers and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai ; 2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao ; 3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao ) Abstract Accumulation of macroalgae fouled on the net of marine cage during hot seasons is one of the major problems of the cage culture in Northern China. Biological clearance is an effective way to solve this problem. In this study, Siganus oramin was used as the potential cleaner fish to control the fouling macroalgae. From June to November in 2015, a series of laboratory experiments and field observations were carried out in the cage culture area around Chudao in the Sanggou Bay. We investigated the monthly variation of the biomass and diversity of fouling macroalgae in different layers, the feeding activity of S. oramin on the dominant specie of fouling macroalgae, and the cleaning effect of S. oramin on the fouling macroalgae. The results showed that in the same month, the growth rates of fouling macroalgae varied according to their layers; from 7th August to 14th September, the growth rate of fouling macroalgae was significantly higher than in other months in different layers (P<0.01). Plocamium telfairiae was the dominant species in this area. A carbon budget equation for the S. oramin feeding on Plocamium telfairiae (100C=11.69G+10.82F+6.06U+71.43R) was constructed under the appropriate seawater temperature. The initial average wet weight of S. oramin was (1.44±0.61) g and it reached (45.38±4.22) g after a 152-day cultural period; the growth rate was 0.26 g/d. The removal rate for fouling macroalgae varied between 80.28% and 90.15% in the cage culture area. These results suggested that the removal of fouling macroalgae was more efficient using this method and thus it could be used to control the fouling macroalgae on the net of marine cages. Key words Net; Fouling macroalgae; Plocamium telfairiae; Siganus oramin; Carbon budget 1 Corresponding author: JIANG Zengjie, jiangzj@ysfri.ac.cn

60 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 不同水泥类型混凝土人工鱼礁的 * 生物附着效果 李真真 1,2 公丕海 2 关长涛 2 李 娇 21 王腾腾 1,2 (1. 上海海洋大学海洋科学研究院上海 ; 2. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛 ) 摘要为研究不同水泥类型混凝土人工鱼礁对生物附着效果的影响, 本研究在青岛薛家岛海域进行礁体挂板实验, 水泥类型包括复合硅酸盐水泥 (P.C) 矿渣硅酸盐水泥(P.S) 火山灰质硅酸盐水泥 (P.P) 粉煤灰硅酸盐水泥(P.F) 和铝酸盐水泥 (CA),2015 年 9 月完成海上挂板 结果显示,2015 年 11 月第 1 次取样, 不同材质人工鱼礁上的附着生物量从大到小依次为 P.P P.S CA P.F 和 P.C, 生物量分别为 和 g/m 2 ; 生物种类分别为 P.S 上 7 种,P.F P.P 和 CA 上各 5 种,P.C 上 3 种 2016 年 3 月,CA P.P P.F P.C 和 P.S 上的生物量分别为 和 g/m 2 ; 生物种类由多到少为 P.F CA P.S P.P P.C, 种类分别为 年 11 月,Pielou 均匀度指数 J 为 CA>P.P>P.F>P.C>P.S;2016 年 3 月为 P.S>P.F>P.P>CA>P.C 2015 年 11 月, 附着生物 Shannon-Wiener 多样性指数 (H ) 为 CA>P.P> P.F>P.C>P.S;2016 年 3 月依次为 P.S>P.F>P.P>CA>P.C 研究表明,5 种混凝土鱼礁中, 铝酸盐水泥 (CA) 及粉煤灰硅酸盐水泥 (P.F) 人工鱼礁生物附着效果好, 复合硅酸盐水泥 (P.C) 生物附着效果较差 关键词 水泥类型 ; 混凝土人工鱼礁 ; 附着生物 中图分类号 X835 文献标识码 A 文章编号 (2017) 人工鱼礁是将人工构造物有目的地投放于海底, 用来改善海域生态环境 保护和增殖渔业资源的人工设施 (Howe, 2003; Manoudis et al, 2005) 一般来说, 人工鱼礁的投放会改变礁体周围几百米海域的水环境状况 (Wilding et al, 2002), 它不仅会影响营养盐的循环及传输 (Alongi et al, 2008; 林军等, 2006), 也会使沉积物发生生物化学变化 (Falcao et al, 2007), 同时为海洋生物提供良好的栖息环境 (Henderson et al, 2014) 附着生物是人工鱼礁集鱼 诱鱼的主要生物环境因子, 又是礁区渔业对象的主要饵料生物, 可以作为海洋生物的饵料场 栖息地及庇护所 ( 刘同渝, 2003; 李娇等, 2016) 附着生物的种类 组成及数量变化直接影响着人工鱼礁区的生态效应 ( 周艳波等, 2010), 可作为人工鱼礁效果评估的重要衡量指标 不同材料的人工鱼礁, 其生物附着种类和数量不同 (Huang et al, 2006; 陈勇等, 2012; Kress et al, 2002; 刘秀民等, 2007; 张伟等, 2010) 人工鱼礁建造材料包括混凝土 木材 钢板 塑料 石块 轮胎以及废弃的轮船 火车等 混凝土由于其结构稳定, 是应用最广泛的人工鱼礁材料之一 (Walker et al, 2002; Baine, 2001) Falace 等 (2002) 对悉尼港的混凝土人工鱼礁进行生态效果评估, 结果表明, 礁体上生物附着效果良好 * 中央级公益性科研院所基本科研业务费 ( ) 和公益性行业 ( 农业 ) 科研专项 ( ) 共同资助 [This work was supported by Central Research Institutes of Basic Research and Public Service Special Operations( ), and Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest( )]. 李真真, lzzcau2011@sina.com 1 通讯作者 : 李娇, lijiao@ysfri.ac.cn 收稿日期 : , 收修改稿日期 :

61 58 渔业科学进展第 38 卷 而且底栖生物的丰度有所增加 目前, 虽然对混凝土的利用及研究较多, 但关于不同水泥类型的混凝土人工鱼礁差异的研究相对较少 不同类型的水泥成本相差较大, 且成分及组成各异 铝酸盐水泥的主要成分为铝酸一钙及其他铝酸盐以及少量的硅酸二钙等 硅酸盐水泥的主要成分为硅酸三钙 硅酸二钙 铝酸三钙 铁铝酸四钙等 本研究针对复合硅酸盐水泥 (P.C) 矿渣硅酸盐水泥 (P.S) 火山灰质硅酸盐水泥(P.P) 粉煤灰硅酸盐水泥 (P.F) 和铝酸盐水泥 (CA) 5 种类型水泥制作的人工鱼礁的生物附着效果进行了实验研究, 分析了 5 种人工鱼礁生态效益及经济效益的差别, 以期为混凝土人工鱼礁水泥类型的选择提供理论依据 1 材料与方法 1.1 样板制作 5 种水泥类型包括复合硅酸盐水泥 (P.C) 矿渣硅酸盐水泥 (P.S) 火山灰质硅酸盐水泥(P.P) 粉煤灰硅酸盐水泥 (P.F) 和铝酸盐水泥 (CA), 每种类型的人工鱼礁制作 10 个 ( 表 1) 尺寸均为 20 cm 20 cm 2 cm( 图 1) 表 1 鱼礁模型尺寸及数量 Tab.1 Size and quantity of artificial reef models 编号 Serial No. 材料 Material 水泥类型 Cement concrete 代号 Code 尺寸 Size(cm) 组数 Groups 1 混凝土 Concrete 复合硅酸盐水泥 Composite Portland cement P.C 混凝土 Concrete 矿渣硅酸盐水泥 Slag Portland cement P.S 混凝土 Concrete 火山灰质硅酸盐水泥 Pozzolan Portland cement P.P 混凝土 Concrete 粉煤灰硅酸盐水泥 Fly-ash Portland cement P.F 混凝土 Concrete 铝酸盐水泥 Aluminate cement CA 图 1 人工鱼礁挂板 Fig.1 Artificial reefs exposed to the marine environment 1.2 挂样时间及海域 2015 年 9 月在山东省青岛市薛家岛海域投放 1.3 挂样及取样方法将 5 种人工鱼礁挂板悬挂在网箱的缆绳上, 均沉降到海面以下 50 cm 处, 减少不同光照对人工鱼礁的影响 2015 年 11 月和 2016 年 3 月, 分别进行 1 次取样 每次采样 每种材料的鱼礁各取 3 个样, 采样面积为 10 cm 10 cm 取得的样品用玻璃瓶装, 加入 5% 的福尔马林溶液固定, 带回实验室分析鉴定 1.4 数据分析附着生物量按照如下公式计算 : P m/ s 式中,P 为附着生物量 (g/m 2 ),m 为附着生物干 重质量 (g),s 为取样面积 (m 2 ) 附着生物群落多样性分析采用 Shannon-Wiener 多样性指数 ( H ) 和 Pielou 均匀度指数 ( J ) 计算公式如下 : s P H Pi log2 i i 1 J H /log s 2 式中,S 为采集样品的种类总数,P i 为第 i 种的个体数与样品中的总个体数的比值 (N i /N) 优势种由优势度指数 (Y) 确定,Y>0.02 为优势种 计算公式如下 : Y Ni N f / i 式中, f i 为第 i 种出现的个体数,N 为采集样品中的所有种类总个体数,N i 为第 i 种出现的频率 利用软件 Primer 5 计算不同礁体上附着生物群落的多样性参数 采用 SPSS 17.0 软件进行统计学分析, 单因子方差分析 (One-way ANOVA) 检验组内差异, P<0.05 为差异显著,P<0.01 为差异极显著 2 结果 2.1 礁体附着生物种类及生物量 2 次取样附着生物生长状况如图 2 图 3 所示, 前后 2 次效果差异显著, 且不同材质人工鱼礁上附着

62 第5期 李真真等: 不同水泥类型混凝土人工鱼礁的生物附着效果 Fig.2 Fig.3 59 图 年 11 月附着生物生长状况 The growth status of fouling organisms in November, 2015 图 年 3 月附着生物生长状况 The growth status of fouling organisms in March, 2016 生物量有显著差异 附着生物大多数属于温带黄渤海 常见物种(表 2) 2 次取样生物种类总数量差异较大 第 1 次取样生物种类数为 13 种 其中 红藻门 2 种 绿藻门 2 种 褐藻门 2 种 节肢动物门 4 种及环节动 物门 3 种 第 2 次生物种类数为 27 种 其中 红藻 门 4 种 绿藻门 3 种 褐藻门 2 种 节肢动物门 6 种 环节动物门 8 种及软体动物门 腔肠动物门 纽形动 物门 扁形动物门各 1 种 从不同水泥类型上看(表 3) 2015 年 11 月 P.S 上 生物种类为 7 种 P.F P.P CA 上为 5 种 P.C 上为 3 种 2016 年 3 月生物种类由多到少为 P.F CA P.S P.P P.C 种类分别为 年

63 60 渔业科学进展第 38 卷 Tab.2 表 2 不同材料人工鱼礁附着生物种类 Different kinds of material adhesion on artificial reefs 人工鱼礁材料 Material of artificial reef 种类 Species 木块 Wood P.F P.S CA P.C P.P 带形蜈蚣藻 Grateloupia turuturu 仙菜 Ceramium sp 紫菜 Porphyra sp 海头红 Plocamium telfairiae + + 缘管浒苔 Enteromorpha linza + 孔石莼 Ulva pertusa 刚毛藻 Cladophora sp 幅叶藻 Petalonia fascialidingba + + 萱藻 Scytosiphon lomentarius + 麦秆虫 Caprella sp 钩虾 Gammarus sp 藻钩虾 Amphithoe japonica 青纵沟纽虫 Lineus fuscovirids Takakura + + 东方小藤壶 Chthamalus challenger 多室草苔虫 Bugula neritina + + 双管阔沙蚕 Platynereis bicanaliculata + + 多齿围沙蚕 Perinereis nuntia + + 中华内卷齿蚕 Aglaophamus sinens 异足索沙蚕 Lumbricomeries heteropoda + 吻蛰虫 Artacama proboscidea 岩虫 Marphysa sanguinea + 扁模裂虫 Typosyllis fasciata + + 千岛模裂虫 Typosyllis adamantens kurilensi 哈鳞虫 Harmothoe sp. + 小肌蛤 Muculusnanus 微点舌片海牛 Armina (Linguella) babai + 黑额近四眼纽虫 Quasitetrastemma nigrifrons 平角涡虫 Planocera riticulata + 注 : 1 为第 1 次取样, 2 为第 2 次取样 Note: 1 : The first sampling, 2 : The second sampling Tab.3 人工鱼礁材料 Material of artificial reef 表 3 不同材质人工鱼礁的附着生物种类总数及生物量 The species and biomass of the fouling organisms on different artificial reefs 附着生物种类 Species of fouling organisms 附着生物量 Biomass of fouling organisms (g/m 2 ) P.F P.S P.P P.C CA

64 第 5 期李真真等 : 不同水泥类型混凝土人工鱼礁的生物附着效果 月, 不同材料人工鱼礁上附着生物量从大到小依次为 P.P P.S CA P.F P.C, 生物量分别为 g/m 年 3 月, 各实验组附着生物量均有明显增加,CA 组附着生物总量最多, 为 g/m 2 ; 其次分别为 P.P P.F P.C P.S, 生物量分别为 g/m 2 2 次取样中, 生物量最高为 CA 组, 其次为 P.P 及 P.F 两组 2.2 群落结构变化结果显示 ( 图 4),2015 年 11 月,Pielou 均匀度指数分别为 CA>P.P>P.F>P.C>P.S, 依次为 , 其中,P.P 与 P.F 差异不显著 (P>0.05), 其余各组均有显著差异 (P<0.05) 2016 年 3 月, 分别为 P.S>P.F>P.P>CA>P.C,Pielou 均匀度指数依次为 , 其中,P.F P.P 两组差异不显著 (P>0.05) CA P.C 两组均匀度指数下降, 其余各组均上升 第 1 次取样 Shannon-Wiener 多样性指数由高到低依次为 CA>P.P>P.F>P.C>P.S, 分别为 , 各组均存在显著差异 (P<0.05) 第 2 次取样依次为 P.S>P.F>P.P> CA>P.C, Shannon-Wiener 多样性指数依次 , 其中 P.S P.F 两组差异不显著 (P>0.05), 其余各组均存在显著差异 (P<0.05) 2 次取样 Shannon-Wiener 多样性指数平均值最高为 P.P 组, 其次为 CA 及 P.F 组, 最低为 P.C 组 Fig.4 图 4 人工鱼礁上附着生物 Shannon-Wiener 多样性指数和 Pielou 均匀度指数 Shannon-Wiener biodiversity index and Pielou evenness index of fouling organisms on artificial reefs 2.3 附着生物优势种及优势度 2015 年 11 月,CA P.S 两组分别有 6 个优势种, P.P 组有 5 个,P.F 组有 4 个,P.C 组有 3 个 东方小藤壶 (Chthamalus challenger) 在 P.C 组占绝对优势, 优势度为 0.48 钩虾(Gammarus sp.) 在 P.F P.P P.S CA 四组中占绝对优势, 优势度分别为 年 3 月,P.F 及 P.P 两组优势种分别为 9 个,CA 及 P.S 两组分别有 8 个优势种,P.C 组有 5 个 孔石莼 (Ulva lactuca L.) 在各组中均占绝对优势, 小肌蛤为 5 种共有的优势种 3 讨论附着生物生长受温度 盐度 光照 潮汐 海浪 这些环境因子的影响 (Su et al, 2009; 唐贵明, ) ; 陈翔峰等, 2011),2 次采样时间间隔为 4 个月, 附着生物的生物量 种类 群落结构及优势种都存在差异 2015 年 11 月, 由于水温较低 投放时间短, 附着生物量和种类总数均较少 2016 年 3 月, 附着平均生物量和生物种类增加, 约为第 1 次的 2 倍左右, 生物种类数由第 1 次的 13 种增加到第 2 次的 27 种 优势种也发生了变化,5 种不同水泥类型的混凝土礁体优势种由钩虾和东方小藤壶均变为孔石莼 Shannon-Wiener 多样性指数和 Pielou 均匀度指数是 2 种表征群落稳定性的指标 一般来说, 一个群落的多样性指数和均匀度指数越高, 则预示着该群落所属的生态系统越稳定和成熟 ( 孙军等, 2004) Shannon-Wiener 多样性指数 ( H ) 也有所升高, 第 1 次取样平均为 1.73, 第 2 次平 1) Tang GM. Study on biodiversity of macrobenthos in the rocky intertidal zone of Qingdao. Master s Thesis of Ocean University of China, 2008, [ 唐贵明. 青岛岩相潮间带大型底栖生物生物多样性调查研究. 中国海洋大学硕士研究生学位论文, 2008, 30 36]

65 62 渔业科学进展第 38 卷 均为 2.51 Pielou 均匀度指数 (J) 两次取样变化较小, 各组平均值由 0.31 变为 0.32 生物群落更加成熟和稳定 钢筋混凝土人工鱼礁对海洋生物的诱集效果明显高于油井类 舰船类等人工鱼礁 ( 江艳娥等, 2013) 张伟等 (2010) 对大亚湾杨梅坑人工鱼礁区的混凝土鱼礁和铁制鱼礁上的附着生物进行了调查, 发现混凝土礁体比铁制礁体上附着生物生物量高, 说明混凝土人工鱼礁具有较好的生物附着效果 本研究中,5 种不同水泥类型的人工鱼礁中,P.F CA 两组生物附着种类最多,CA P.P P.F 三组生物量较多,P.F P.S P.P 三组生物群落较为稳定, 而 P.C 组生物种类及生物量最少,Shannon-Wiener 多样性指数和 Pielou 均匀度指数均最低 由此可知, 铝酸盐水泥 (CA) 及粉煤灰硅酸盐水泥 (P.F) 制成的人工鱼礁生物附着效果好 最常用的复合硅酸盐水泥 (P.C) 人工鱼礁生物附着效果相对较差 从成本上看, 铝酸盐水泥 (CA) 的成本约为普通水泥的 2 4 倍, 主要用于紧急军事工程 修桥 筑路以及抢修 ( 堵漏 ) 等工程中, 作为人工鱼礁材料的性价比不高 火山灰质硅酸盐水泥 (P.P) 目前使用比较少, 生物附着效果不突出, 也不建议使用 最为常用的复合硅酸盐水泥 (P.C) 成本比粉煤灰硅酸盐水泥 (P.F) 及矿渣硅酸盐水泥 (P.S) 高, 其生物附着总量最少, 生态效益相对较差 而粉煤灰硅酸盐水泥 (P.F) 不仅成本低, 而且生物附着效果较好, 经济效益和生态效益均占优势 Kress 等 (2002) 研究发现, 在含 40% 60% 粉煤灰的礁体上, 藻类附着效果要显著好于纯混凝土和纯粉煤灰礁体 粉煤灰和碱渣制作的人工鱼礁具有较高抗压强度 无污染 造价低及结构稳固等优点 ( 刘秀民等, 2014; 覃维祖, 2006) 综上所述, 粉煤灰硅酸盐水泥制作的人工鱼礁不仅可以利用工业残余矿渣, 减少工业废渣对环境污染的压力, 同时可以作为人工鱼礁材料, 生物附着效果较好, 具有较高的生态效益 参考文献 Alongi DM, Trott LA, Pfitzner J. Biogeochemistry of inter-reef sediments on the northern and central Great Barrier Reef. Coral Reefs, 2008, 27(2): Baine M. Artificial reefs: A review of their design, application, management and performance. Ocean and Coastal Management, 2001, 44(3): Chen XF, Hou J, Mu ZJ, et al. Study on the adhesion and variety of marine fouling organisms. Development and Application of Materials, 2011, 26(1): [ 陈翔峰, 侯健, 穆振军, 等. 海洋污损生物变化及附着规律研究. 材料开发与应 用, 2011, 26(1): 24 28] Chen Y, Tian Tao, Zhao ZY, et al. The feasibility of congealing stone materials used as artificial reef the species composition and biomass of organisms attached to the tested modules. Journal of Dalian Ocean University, 2012, 27(4): [ 陈勇, 田涛, 赵子仪, 等. 凝石胶凝材料作为人工鱼礁材料的可行性研究 Ⅱ. 大连海洋大学学报, 2012, 27(4): ] Falace A, Bressan G. Evaluation of the influence of inclination of substrate panels on seasonal changes in a macrophytobenthic community. ICES Journal of Marine Science, 2002, 59(5): Falcao M, Santos MN, Vicente M, et al. Biogeochemical processes and nutrient cycling within an artificial reef off Southern Portugal. Marine Environmental Research, 2007, 63(5): Henderson MJ, Fabrizio MC, Lucy JA. Movement patterns of summer flounder near an artificial reef: Effects of fish size and environmental cues. Fisheries Research, 2014, 153(5): 1 8 Howe JC. Artificial reef evaluation with application to natural marine habitats: William Seaman Jr. (Ed. ); CRC Press, New York, NY, Fisheries Research, 2003, 63(2): Huang ZR, Liang XY, Zeng J. Preliminary study on effects of accrete organisms of artificial reef material. South China Fisheries Science, 2006, 2(1): [ 黄梓荣, 梁小芸, 曾嘉. 人工鱼礁材料生物附着效果的初步研究. 南方水产, 2006, 2(1): 34 38] Jiang YE, Chen PM, Lin ZJ, et al. Comparison of effectiveness of various artificial reef materials for fish attraction. Journal of Applied Oceanography, 2013, 32(3): [ 江艳娥, 陈丕茂, 林昭进, 等. 不同材料人工鱼礁生物诱集效果的比较. 应用海洋学学报, 2013, 32(3): ] Kress N, Tom M, Spanier E. The use of coal fly ash in concrete for marine artificial reefs in the southeastern Mediterranean: compressive strength, sessile biota, and chemical composition. ICES Journal of Marine Science, 2002, 59(5): Li J, Gong PH, Guan CT, et al. Carbon sequestration of additives of artificial reefs and its effect on carbon fixation of Ostrea Plicatula. Progress in Fishery Sciences, 2016, 37(6): [,,,. (Ostrea plicatula)., 2016, 37(6): ] Lin J, Zhang SY. Research advances on physical stability and ecological effects of artificial reef. Marine Fishery, 2006, 28(3): [ 林军, 章守宇. 人工鱼礁物理稳定性及其生态效应的研究进展. 海洋渔业, 2006, 28(3): ] Liu TY. Bait effect of artificial reefs. Jiangxi Fishery Sciences and Technology, 2003(4): [ 刘同渝. 人工鱼礁的饵料效应 ( 一 ). 江西水产科技, 2003(4): 37 38] Liu XM, Zhang HH, Luo MW. Research on building of artificial fish-reef by using fly ash and alkaline dregs. Journal of Building Materials, 2007, 10(5): [ 刘秀民, 张怀慧, 罗迈威. 利用粉煤灰和碱渣制作人工鱼礁的研究. 建筑

66 第 5 期李真真等 : 不同水泥类型混凝土人工鱼礁的生物附着效果 63 材料学报, 2007, 10(5): ] Manoudis, Antoniadou C, Dounas C, et al. Successional stages of experimental artificial reefs deployed in Vistonikos Gulf (North Aegean Sea, Greece): Preliminary results. Belgian Journal of Zoology, 2005, 135(2): Su ZX, Xiao H, Huang LM. Effect of fouling in Daya Bay Scallop chlamysnobilis (reeve) cultivation: Food competition and nutrient release. Marine Science Bulletin, 2009, 11(2): Sun J, Liu DY. The application of diversity indices in marine phytoplankton studies. Acta Oceanologica Sinica, 2004, 26(1): [ 孙军, 刘东艳. 多样性指数在海洋浮游植物研究中的应用. 海洋学报, 2004, 26(1): 62 75] Tan WZ. The application of fly ash in concrete. Fly Ash Comprehensive Utilization, 2006, 14(2): 1 7 [ 覃维祖. 粉煤灰在混凝土中的应用技术. 粉煤灰综合利用, 2006, 14(2): 1 7] Walker BK, Henderson B, Spieler RE. Fish assemblages associated with artificial reefs of concrete aggregates or quarry stone offshore Miami Beach, Florida. Aquatic Living Resources, 2002, 15(2): Wilding TA, Sayer MDJ. Evaluating artificial reef performance: Approaches to pre- and post-deployment research. ICES Journal of Marine Science, 2002, 59(5): Zhang W, Li CH, Jia XP, et al. Ecological characteristics of fouling organisms on concrete and steel of in Daya Bay. Marine Environmental Science, 2010, 29(4): [ 张伟, 李纯厚, 贾晓平, 等. 大亚湾混凝土鱼礁和铁制鱼礁附着生物生态特征. 海洋环境科学, 2010, 29(4): ] Zhou YB, Cai WG, Chen HG, et al. The mechanism and research progress on fish attraction technique for artificial reef. Marine Fishery, 2010, 32(2): [ 周艳波, 蔡文贵, 陈海刚, 等. 人工鱼礁生态诱集技术的机理及研究进展. 海洋渔业, 2010, 32(2): ] ( 编辑冯小花 ) Study on the Organisms Attachment of Artificial Reefs Constructed with Five Different Cements LI Zhenzhen 1,2, GONG Pihai 2, GUAN Changtao 2, LI Jiao 21, WANG Tengteng 1,2 (1. College of Marine Science, Shanghai Ocean University, Shanghai ; 2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Qingdao Key Laboratory for Marine Fish Breeding and Biotechnology, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao ) Abstract In order to study organism attachment on artificial reefs made of different cements, we hanged the artificial reefs constructed with five different cements including Composite Portland cement (P.C), slag Portland cement (P.S), pozzolana Portland cement (P.P), fly ash Portland cement (P.F) and aluminate cement (CA). The artificial reefs were exposed to the marine environment near the Xuejia Island in September In November 2015, we collected the first water samples to analyze different reef materials on organism attachment. We found that the biomass of fouling organisms on different artificial reefs followed the order P.P > P.S > CA > P.F > P.C, and the values were g/m 2, g/m 2, g/m 2, g/m 2 and g/m 2 respectively. The number of organism species on P.S was 7, and it was 5 on P.F, P.P and CA. We collected the second samples in March 2016 and found that CA still had the largest biomass that was g/m 2, followed by P.P, P.F, P.C and P.S on which the biomass was g/m 2, g/m 2, g/m 2 and g/m 2 respectively. The number of species on P.F, CA, P.S, P.P and P.C was 17, 15, 12, 11 and 8. In the first sampling, the Pielou evenness index (J) followed the order CA > P.P > P.F > P.C > P.S; in the second sampling, the order was P.S > P.F > P.P > CA > P.C. In the first sampling, the Shannon-Wiener diversity index (H ) of fouling organisms followed the order CA > P.P > P.F > P.C > P.S; in the second sampling, the order was P.S > P.F > P.P > CA > P.C. Our study showed that the aluminate cement and fly ash cement artificial reefs were most suitable for organism attachment, whereas the composite Portland cement had poor biological adhesion capability. Key words Different types of cement; Concrete artificial reef; Attaching organisms 1 Corresponding author: LI Jiao, lijiao@ysfri.ac.cn

67 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) * 工厂化养殖系统微藻的群落特征分析 沈明明 1,2 李 健 1,31 王清印 1,3 葛红星 2 刘 萍 1,3 常志强 1,3 (1. 上海海洋大学水产与生命学院上海 ; 2. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛 ; 3. 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室青岛 ) 摘要 2015 年 6 9 月期间, 对青岛市宝荣水产科技有限公司凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 工厂化养殖车间的 6 个实验池进行采样调查, 分析了水体中微藻的种类组成 丰度 多样性和优势种演替特征, 并结合养殖情况进行了讨论 共检出微藻 5 门 28 属 49 种 ( 其中优势种 14 种 ), 丰度范围为 cell/l, 生物量范围为 mg/l, 多样性指数范围为 多样性指数低于 0.9 时, 生态系统稳定性差, 对虾易发病 不同养殖阶段微藻优势种种类不同, 前期主要是绿藻门 (Chlorophyta) 硅藻门(Bacillarionphyta) 和部分甲藻门 (Pyrrophyta) 的种类, 中 后期以蓝藻门 (Cyanophyta) 的微囊藻 (Microcystis sp.) 和颤藻 (Oscillatoria sp.) 为主 对虾养殖密度显著影响微藻优势种演替,300 ind/m 2 养殖密度 (A1 池 ) 藻相稳定且以绿藻和硅藻为优势种, 对虾生长良好 ; ind/m 2 养殖密度 (B1 C1 和 C2 池 ) 颤藻在中 后期演替成为绝对优势种, 对虾易发病死亡 本研究为优化对虾工厂化养殖环境 指导养殖生产提供参考 关键词凡纳滨对虾 ; 工厂化养殖 ; 微藻 ; 群落特征中图分类号 Q178.1 文献标识码 A 文章编号 (2017) 对虾池塘养殖一直是我国主要的传统生产模式, 但该模式存在养殖水域污染严重 易出现流行病 受气候制约以及单位面积产出较低等问题, 而对虾工厂化养殖模式对环境污染较轻, 能有效防止对虾暴发性流行病, 产量高且能有效保证对虾的食品安全 ( 孟庆武等, 2008) 近几年, 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 工厂化养殖模式在山东青岛 日照等地区迅速发展起来 工厂化养殖模式尽管切断了与外界病源的联系, 对养殖用水进行了更规范 更科学的管理, 但病害仍 时有发生, 这可能跟水体中浮游藻类群落演替有着一定的关系 ( 陈剑锋等, 2006) 微藻是虾池生态系的重要组成部分, 尤其是数量和生物量都占统治地位的优势种, 在一定程度上代表着微藻的群落特征, 其变动会给对虾的生长带来一定的影响 深入研究虾池微藻的群落特征, 不仅对阐明虾池人工生态系的结构 功能有重要理论意义, 而且对控制适宜的浮游植物种群和数量, 维持对虾稳定产出也有重要的实践意义 (Attayde et al, 1999) 我国对虾工厂化养殖发展的时 * 国家虾产业技术体系 (CARS-47) 泰山产业领军人才项目(LNJY ) 和青岛海洋科学与技术国家实验室鳌山科技创新计划项目 (2015ASKJ02) 共同资助 [This work was supported by Modern Agro-industry Technology Research System (CARS-47), the Program of Shandong Leading Talent (LNJY ) and Science and Technology Innovation Project of Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology (2015ASKJ02)]. 沈明明, damingziaa@163.com 1 通讯作者 : 李健, 研究员, lijian@ysfri.ac.cn 收稿日期 : , 收修改稿日期 : Li YQ. Analysis on farming system of super-intensive and effect of main factors on growth, immunity and nutrient budgets in shrimp. Doctoral Dissertation of Ocean University of China, 2006, [ 李玉全. 工厂化养殖系统分析及主要养殖因子对对虾生长 免疫及氮磷收支的影响. 中国海洋大学博士研究生学位论文, 2006, 40 68]

68 第 5 期沈明明等 : 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 工厂化养殖系统微藻的群落特征分析 65 间还较短, 目前的研究报道多集中于养殖效益 理化因子 管理技术等方面 ( 李玉全, ) ; 谢立民等, 2003; 刘娇等, 2008; 刘海英, ) ; 管崇武等, 2010), 关于凡纳滨对虾工厂化养殖系统中微藻的群落特征还未见系统的研究报告, 微藻群落演替规律及其与养殖环境因子之间的关系也不明确 本文研究了凡纳滨对虾工厂化养殖系统的微藻群落特征, 系统地分析了微藻种类组成 丰度 多样性和优势种演替特征, 并结合养殖情况进行了讨论, 以期为优化对虾工厂化养殖环境 指导养殖生产提供参考 1 材料与方法 1.1 采样地点本实验于 2015 年 6 9 月在青岛市宝荣水产科技有限公司进行 对虾工厂化养殖车间顶部覆盖塑料薄膜用于保温, 内设 60 个面积为 2.67 m 2 的近六边形水泥池, 池底铺设 回 形纳米气孔管道进行供气, 具备独立的给排水系统, 养殖用水为经砂滤 消毒以及充分曝气的地下海水 选取 6 个条件基本相同的水泥池用于本实验, 实验用凡纳滨对虾购自广东恒兴育苗场, 虾苗经 20 d 暂养后, 体重达 (0.036±0.006) g, 于 6 月 10 日放至养殖池, 编号为 A1 A2 B1 B2 C1 C2, 其中,A1 池和 A2 池对虾放养密度为 300 ind/m 2, B1 和 B2 池为 400 ind/m 2,C1 和 C2 为 500 ind/m 2 参照彭聪聪等 (2011) 划分对虾养殖阶段的方法, 根据对虾的生长情况并兼顾采样周期, 将对虾养殖周期分为 3 个阶段 :6 月 13 日 7 月 11 日为前期,7 月 12 日 8 月 8 日为中期,8 月 9 日 9 月 6 日为后期 1.2 样品采集与处理 2015 年 6 月 13 日 9 月 6 日, 共计 84 d, 每隔 14 d 从各池采水样 2 L, 取 1 L 倒入聚乙烯塑料瓶, 加入 5% 鲁哥氏液 (Lugol s solution) 固定, 静置 24 h 后, 将水样浓缩至 20 ml, 显微镜下检查微藻 另外 1 L 水样装瓶带回实验室, 低温保存, 用于测定氨氮等化学因子 依照 中国海藻志 ( 郭玉洁等, 2003) 水生生物学 ( 赵文等, 2005) 等对微藻进行定性鉴定 用血球计数板进行定量检测, 取 0.1 ml 浓缩水样于计数框内在显微镜下计数, 假定浮游植物细胞为随机分布, 计数误差在 ±10% 内 每天使用 YSI556 型多参数水质仪 (YSI, 美国 ) 监测实验池水体的温度 (T) 溶解氧(DO) 盐度(S) 和 ph 值等常规水质参数 水样中氨氮 (NH + 4 -N) 亚硝酸盐 (NO 2 -N) 硝酸盐(NO 3 -N) 磷酸盐(PO 3 4 -P) 总氮 (TN) 和总磷 (TP) 等浓度均按照 海洋调查规范 (GB/T ) 进行测定 1.3 数据处理 微藻密度 D (cell/l)=200 P n N 0 /N 1 式中,P n 为计数框计数的浮游植物个数,N 0 为计数框总格数,N 1 为计数过的方格数 生物量 (mg/l) 计算参照蔡林婷等 (2013) 的方法 : B=D R 式中,B 为微藻生物量,R 小型藻 = mg; R 中型藻 = mg;r 大型藻 = mg 浮游植物多样性指数采用 Shannon-Wiener 物种多样性指数 (H ): H Pi log s i 1 式中均采用物种数量作为指标, 其中,P i =n i /N, n i 为物种 i 的个体数,N 为群落样本的总个体数, 即 P i 为物种 i 占总个体数的比例,S 为群落物种数 参照张才学等 (2007) 划分微藻丰度的方法, 微藻 P i < 0.01, 为稀有种 ;0.01 P i 0.1, 为常见种 ; P i 0.1, 为优势种 2 结果与分析 2.1 环境理化因子变化状况和养殖情况 养殖期间, 不同养殖时期各实验池的 ph 氨氮等环境理化因子的变化情况见表 1 ph 范围为 , 后期降幅较大 总氨氮为 mg/l, 中期升幅较大 亚硝氮为 mg/l, 养殖前期处于较低水平, 中期迅速上升, 后期稳定在较高水平 硝酸氮为 mg/l, 随着养殖进行, 浓度上升较快 无机磷为 mg/l 总氮为 mg/l, 总磷为 mg/l 各养殖池对虾存活率和产量等生长性能如表 2 所示 养殖第 26 天 (7 月 9 日 ) 第 40 天 (7 月 23 日 ), 出现连续阴雨天气, 此阶段 B1 池和 C2 池对虾前 7 d 死亡率超过 40%, 随后一直都有对虾死亡 养殖至 70 d 以后, B1 池和 C1 池对虾出现 偷死 症状, 直至养殖结束, 都有对虾陆续死亡 2 P i 1 Liu HY. Water quality characteristic of industrial shrimp farming and effects of higher dissolved oxygen on its farming. Master s Thesis of Ocean University of China, 2006, [ 刘海英. 对虾工厂化养殖水质特征及高溶解氧对养殖的影响. 中国海洋大学硕士研究生学位论文, 2006, 26 52]

69 66 渔业科学进展第 38 卷 池号 Pond No. A1 A2 B1 B2 C1 C2 养殖阶段 Culture period Tab.1 表 1 虾池主要理化因子的变化情况 Changes of main physical-chemical factors in shrimp ponds ph 氨氮 NH 4 + -N (mg/l) 硝酸氮 NO 3 -N (mg/l) 磷酸盐 PO 4 3 -P (mg/l) 总氮 TN (mg/l) 总磷 TP (mg/l) 前期 Early 8.24± ± ± ± ± ±0.24 中期 Mid 8.22± ± ± ± ± ±0.45 后期 Late 7.84± ± ± ± ± ±1.01 前期 Early 8.20± ± ± ± ± ±0.21 中期 Mid 8.14± ± ± ± ± ±0.64 后期 Late 7.82± ± ± ± ± ±0.93 前期 Early 7.98± ± ± ± ± ±0.32 中期 Mid 7.88± ± ± ± ± ±0.65 后期 Late 8.18± ± ± ± ± ±0.97 前期 Early 8.22± ± ± ± ± ±0.23 中期 Mid 8.15± ± ± ± ± ±0.34 后期 Late 7.90± ± ± ± ± ±1.08 前期 Early 8.34± ± ± ± ± ±0.35 中期 Mid 8.32± ± ± ± ± ±0.86 后期 Late 7.75± ± ± ± ± ±1.38 前期 Early 8.02± ± ± ± ± ±0.42 中期 Mid 7.98± ± ± ± ± ±0.58 后期 Late 7.86± ± ± ± ± ± 微藻种类组成对虾工厂化养殖实验池中的微藻种类和丰富度如表 3 所示 6 个实验池中共鉴定出微藻 5 门 28 属 49 种, 其中绿藻门 8 属 10 种, 占总种类数的 20.4%; 硅藻门 9 属 19 种, 占 38.8%; 蓝藻门 6 属 13 种, 占 26.5%; 甲藻门 4 属 6 种, 占 12.2%; 隐藻门 1 属 1 种, 占 2% 绿藻 蓝藻和硅藻多为优势种和常见种, 甲藻有 2 种优势种, 隐藻有 1 种优势种, 其余为常见种和稀有种 2.3 微藻的数量和多样性变化 不同养殖时期对虾实验池中微藻的密度 生物量 表 2 对虾生长性能 Tab.2 The growth performance of shrimp Pond No. A1 A2 B1 B2 C1 C2 Survival rate (%) Yield (kg/m 2 ) 表 3 虾池微藻种类和丰富度 Tab.3 Species and abundance of microalgae in shrimp ponds 种类 Species 丰富度 Abundance 种类 Species 丰富度 Abundance 绿藻门 Chlorophyta 旋链角毛藻 C.curvisetus ++ 扁藻属 Platymonas sp. 假弯角毛藻 C.pseudocurvisetus ++ 亚心型扁藻 P.subcordiformis ++ 盒形藻属 Biddulphia sp. 空球藻属 Eudorina sp. 中华盒形藻 B.sinensis + 空球藻 E.elegans + 长耳盒形藻 B.aurita + 小球藻属 Chlorella sp. 双尾藻属 Ditylum sp. 小球藻 C.vulgaris +++ 布氏双尾藻 D.brightwellii + 蛋白核小球藻 C.pyrenoidesa +++ 太阳双尾藻 D.sol + 椭圆小球藻 C.ellipsoidea ++ 舟形藻属 Navicula sp. 凯氏小球藻 C.kessleri ++ 隐头舟形藻 N.cryptocephala + 杂球藻属 Pleodorina sp. 膜状舟形藻 N.membranacea + 杂球藻 P.californica + 蓝藻门 Cyanophyta

70 第 5 期沈明明等 : 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 工厂化养殖系统微藻的群落特征分析 67 续表 3 种类 Species 丰富度 Abundance 种类 Species 丰富度 Abundance 月牙藻属 Selenastrum sp. 色球藻属 Chroococcus sp. 纤细月牙藻 S.gracile + 小形色球藻 Ch.minor + 微绿球藻属 Nannochloris sp. 微小色球藻 Ch.minutus ++ 眼状微绿球藻 N.oculata +++ 微囊藻属 Microcystis sp. 卵囊藻属 Oocystis sp. 具缘微囊藻 M.marginata + 波吉卵囊藻 O.borgei + 不定微囊藻 M.incerta +++ 小形卵囊藻 O.parva + 坚实微囊藻 M.firma ++ 单生卵囊藻 O.solitavia + 隐杆藻属 Aphanothece sp. 空星藻属 Coelastrum sp. 温声隐杆藻 Ap.caldariorum + 空星藻 C.sphaericum ++ 栖石隐杆藻 Ap.saxicola + 小孢空星藻 C.microporum + 颤藻属 Oscillatoria sp. 硬毛藻属 Chaetomorpha sp. 威利颤藻 O.willei +++ 线形硬毛藻 C.linum + 弱细颤藻 O.tenuis +++ 粗硬毛藻 C.crassa + 盐泽颤藻 O.saline + 杜氏藻属 Dunaliella sp. + 绿色颤藻 O.chlorina ++ 盐生杜氏藻 D.salina + 阿氏颤藻 O.agardhii + 巴尔杜氏藻 D.bardawil + 螺旋藻属 Spirulina sp. 硅藻门 Bacillarionphyta 大螺旋藻 S.major ++ 直链藻属 Melosira sp. 席藻属 Phormidium sp. 具槽直链藻 M.sulcata +++ 窝形席藻 P.foveolarum ++ 变异直链藻 M.varians ++ 束毛藻属 Trichodesmium sp. 圆筛藻属 Coscinodiscus 细发束毛藻 T.thiebautii + 线形圆筛藻 C.lineatus +++ 甲藻门 Pyrrophyta 格氏圆筛藻 C.granil + 原甲藻属 Prorocentrum sp. 辐射圆筛藻 C.radiatus + 海洋原甲藻 P.micans + 小环藻属 Cyclotella sp. 微小原甲藻 P.minimum +++ 扭曲小环藻 C.comta +++ 裸甲藻属 Gymnodinium sp. 条纹小环藻 C.striata + 蓝色裸甲藻 G.coeruleum + 海链藻属 Thalassiosira sp. 链状裸甲藻 G.catenatum + 诺氏海链藻 T.nordenskioldi +++ 多甲藻属 Peridinium sp. 细弱海链藻 T.subtilis ++ 扁多甲藻 P.depressum +++ 骨条藻属 Skeletonema sp. 角藻属 Ceratium sp. 中肋骨条藻 S.costatum 长角角藻 C.macroceros ++ 细柱藻属 Leptocylindrus sp. 棱角藻 C.fucus ++ 细柱藻 L.minimus 隐藻门 Cryptophyta 环毛藻属 Corethron sp. 隐藻属 Cryptomonas sp. 海洋环毛藻 C.pelagicum + 卵形隐藻 C.ovata +++ 角毛藻属 Chaetoceros sp. 蓝隐藻属 Chroomonas sp. 洛氏角毛藻 C.lorenzianus +++ 长形蓝隐藻 Ch.oblonga + 牟氏角毛藻 C.muelleri +++ 注 :+: 稀有种,++: 常见种,+++: 优势种 Notes: +: Rare species, ++: Common species, +++: Dominant species 和多样性指数如表 4 所示 整个养殖期间,6 个实验池的微藻密度为 cell/l, 生物量为 mg/l, 微藻密度和生物量均呈现出逐渐 升高的趋势 A1 和 A2 池对虾密度最低 (300 ind/m 2 ), 整个养殖过程中微藻的密度和生物量也处于较低水平, 而 C1 和 C2 池对虾密度最高 (500 ind/m 2 ), 养殖后期

71 68 渔业科学进展第 38 卷 池号 Pond No. A1 A2 B1 B2 C1 C2 表 4 Tab.4 养殖阶段 Culture period 不同养殖期虾池中微藻的总密度 总生物量以及多样性指数 Density, biomass and diversity index of microalgae in shrimp ponds 密度 Density (10 6 cell/l) 生物量 Biomass (mg/l) 多样性指数 H 前期 Early 2.31± ± ±0.24 中期 Mid 13.89± ± ±0.05 后期 Late 96.63± ± ±0.45 前期 Early 0.64± ± ±0.07 中期 Mid 4.32± ± ±0.18 后期 Late 12.65± ± ±0.26 前期 Early 2.16± ± ±0.39 中期 Mid ± ± ±0.00 后期 Late ± ± ±0.29 前期 Early 1.89± ± ±0.28 中期 Mid 28.64± ± ±1.22 后期 Late 86.86± ± ±0.42 前期 Early 3.41± ± ±0.35 中期 Mid ± ± ±0.62 后期 Late ± ± ±0.13 前期 Early 2.75± ± ±0.36 中期 Mid ± ± ±0.05 后期 Late ± ± ±0.06 微藻密度和生物量都达到较高水平, 明显高于低密度池, 主要类群为颤藻, 生物量占比达到 80% 以上 养殖期间, 各实验池微藻多样性指数范围为 低密度 (A1 和 A2 间 ) 以及中密度 (B1 和 B2 间 ) 实验池微藻的多样性指数变化呈现一定的差异性, 而 2 个高密度 (C1 和 C2 间 ) 实验池微藻多样性指数变化趋势一致, 均表现为随养殖时间增加一直下降 2.4 虾池微藻优势种的组成及演替情况不同养殖时期各虾池微藻优势种演替情况如图 1 所示, 优势种及对应编号参见表 5 低密度养殖实验池 A1 优势种有 6 种, 养殖前期, 小球藻一直处于优势地位, 此外, 还有扭曲小环藻 (C.comta) 扁多甲藻(P.depressum) 和卵形隐藻 (C.ovata), 优势种优势度都在 0.15 以下, 养殖至第 42 天, 蓝藻门的威利颤藻 (Oscillatoria willei) 演替成为优势种, 随后颤藻优势度减少, 小球藻重新成为优势种并保持至养殖末期 A2 池优势种有 6 种, 整个养殖阶段微藻密度明显低于其他池, 前 中期优势种主要为硅藻门的线形圆筛藻 (C.lineatus) 和牟氏角毛藻 (C.muelleri), 第 14 天, 扁多甲藻和牟氏角毛藻共同成为优势种, 后期蓝藻门的弱细颤藻 (O.tenuis) 长期占据优势地位 中密度养殖实验池 B1 优势种有 6 种, 前期以牟 氏角毛藻为主要优势种,14 d 以后, 不定微囊藻 (M.incerta) 迅速演替成为优势种, 一直持续到 50 d 以后, 优势种演替为威利颤藻和弱细颤藻, 微小原甲藻 (P.minimum) 在养殖 70 d 左右成为优势种, 只持续 5 d, 威利颤藻在养殖末期优势度达到 0.48, 成为绝对优势种 B2 池优势种有 5 种, 前 中期优势种主要是绿藻门的小球藻和硅藻门的扭曲小环藻和洛氏角毛藻 (C.lorenzianus), 后期小球藻成为绝对优势种, 优势度高达 0.32 高密度养殖实验池 C1 优势种有 5 种, 前期优势种为小球藻 扭曲小环藻和洛氏角毛藻, 第 28 天左右, 蓝藻门的弱细颤藻和威利颤藻逐渐演替成为优势种并在养殖后期成为绝对优势种, 颤藻优势度高达 0.82 C2 池优势种有 7 种, 养殖前 14 d 内, 优势种为蛋白核小球藻 (C.pyrenoidesa) 诺氏海链藻 (T.nordenskioldi) 和牟氏角毛藻, 随后不定微囊藻迅速演替为绝对优势种 ; 第 28 天, 优势种变为硅藻门的角毛藻和弱细颤藻, 第 38 天, 颤藻取代角毛藻成为绝对优势种 3 讨论本研究中, 各实验池中微藻的数量变化均呈前期较低 中期快速升高 后期达到最高的趋势 青岛地

72 第 5 期沈明明等 : 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 工厂化养殖系统微藻的群落特征分析 69 表 5 微藻优势种及相应编号 Tab.5 Microalgae dominant species and their corresponding codes 编号 No. 微藻种类 Species 拉丁名 Latin names 编号 No. 微藻种类 Species 拉丁名 Latin names P1 小球藻 Chlorella vulgaris P8 牟氏角毛藻 Chaetoceros muelleri P2 蛋白核小球藻 Chlorella pyrenoidesa P9 不定微囊藻 Microcystis incerta P3 眼状微绿球藻 Nannochloris oculata P10 威利颤藻 Oscillatoria willei P4 线形圆筛藻 Coscinodiscus lineatus P11 弱细颤藻 Oscillatoria tenuis P5 扭曲小环藻 Cyclotella comta P12 微小原甲藻 Prorocentrum minimum P6 诺氏海链藻 Thalassiosira norden P13 扁多甲藻 Peridinium depressum P7 洛氏角毛藻 Chaetoceros lorenzianus P14 卵形隐藻 Crypto monas ovata Fig.1 图 1 虾池微藻优势种演替动态 Dynamic succession of microalgae species in shrimp ponds P1 P14 代表微藻优势种种类的编号, 种类及对应编号见表 5 P1 P14 in this diagram represented corresponding codes for dominant species, and microalgae species, and their corresponding codes were shown in Tab.5

73 70 渔业科学进展第 38 卷 区凡纳滨对虾工厂化养殖用水多来源于地下海水经砂滤后使用, 进入养殖池前还要通过滤网过滤, 经过多层过滤的水体中的微藻含量较少, 因此, 养殖前期密度偏低 养殖中 后期, 水温逐渐升高, 随着对虾的快速生长和投饵量的增加, 大量未被摄食的残料 对虾排泄物等营养盐也在养殖池中累积, 刺激了微藻的大量繁殖 ( 刘孝竹等, 2011; 彭聪聪等, 2011) C1 池在最后一次采样时, 颤藻生物量达到 165 mg/l, 占微藻总生物量的 78%,C2 池颤藻生物量也达到 119 mg/l, 占 63%, 水中可见颤藻丝状群体结块贴壁生长, 对虾大量发病死亡 据曹平等 (2011) 报道, 当颤藻浓度达到 12.5 mg/l 时, 对虾成活率明显下降 虽然颤藻也能吸收氨氮 亚硝氮等有害物质, 但高密度的颤藻极易引发 倒藻, 导致大量羟胺 硫化物等有毒物质释放, 造成对虾应激死亡 (Cremen et al, 2007) 因此, 在养殖后期, 应该注意对颤藻等不良微藻进行繁殖评估和有效控制 A2 池微藻生物量明显低于其他养殖池, 对虾虽未发病, 但生长缓慢, 终产量明显低于相同放养密度的 A1 池, 分析原因可能是低密度的藻相结构造成了微藻对养殖系统调节能力的低下, 水质多变不稳定, 给对虾生长带来了不利影响 多样性指数可用于定量反映浮游植物的异质性与稳定性, 该指数越大, 微藻群落信息含量越大, 抗干扰能力越强, 稳定性越高 ( 孙耀等, 1998) 中 高密度对虾实验池微藻多样性指数呈现先升高后降低的趋势, 可能是由于养殖前期水体经多层过滤, 池中微藻种类和数量都极少, 相应地多样性指数偏低, 随着养殖的进行, 生态系统逐步完善, 稳定性增强, 多样性指数也相应增加 ; 到了养殖后期, 由于蓝藻类的颤藻暴发性生长成为优势种, 微藻群落演替向单一方向发展, 表现为多样性指数迅速降低 ( 彭聪聪等, 2011) B1 池中后期 C1 和 C2 池后期, 多样性指数多低于 0.9, 水质不同程度恶化, 对虾表现出病症和死亡现象, 其他虾池除几次低于 0.9, 其余多在 0.9 以上, 对虾生长良好 这与郭皓等 (1996) 报道的结论相似 因此, 在养殖过程中, 当微藻多样性指数低于 0.9 时, 应加强管理, 预防对虾发病 优势种可代表一个群落的生态特征 ( 黄翔鹄等, 2002) 本研究中, 对虾工厂化养殖的中后期, 颤藻优势种占到总量的 58% 90%, 表明微藻总量的变动是由较为单一的优势种控制的 张才学等 (2007) 调查发现, 湛江地区对虾工厂化养殖池后期, 微藻优势种主要是小球藻和小环藻等耐污种类 李玉全等 (2006) 在青岛小麦岛进行的研究发现, 对虾工厂化养殖池中的微藻群落以硅藻为主 本研究中, 前期优势种主要 以绿藻和硅藻的一些种类为主, 中后期蓝藻的微囊藻和颤藻多演替成为优势种, 与以上二者的研究结果有较大差异 可能原因是后期水体的高营养水平是颤藻等蓝藻大量暴发的原因, 蓝藻的大量繁殖抑制了绿藻和硅藻等的生长 ( 彭聪聪等, 2010) 对虾工厂化养殖模式是在小水体中进行的高密度商业化养殖方式, 在养殖过程中受到投饵 换水 增氧 消毒等多种人工因子调控 ( 孟庆武等, 2008), 不同养殖地区 不同养殖工艺 养殖用水的处理方式等都有可能造成微藻优势种差异 ( 吴斌等, 2008; 李雪松等, 2006) 本研究发现, 养殖密度对微藻群落的演替也有较大影响, 较低养殖密度的 A1 池 (300 ind/m 2 ), 大部分时间都以小球藻占优势地位, 藻相良好, 而 B1 池 (400 ind/m 2 ) 和 C1 C2 池 (500 ind/m 2 ) 在养殖后期, 藻相被颤藻控制 卢静等 (2000) 报道, 低密度 (70 ind/m 2 ) 养殖围隔, 微藻以硅藻种类的舟形藻 (Navicule) 和小环藻为主, 中高养殖密度 ( ind/m 2 ) 虾池, 裸甲藻属 (Gymnodinium) 蓝球藻属(Chroococcus) 等种类占优势 李玉全等 (2013) 报道, 对虾养殖密度显著影响工厂化养殖系统氮磷的输出, 随着养殖密度的增加, 投饵量以及对虾的代谢物 排泄物都高于低养殖密度, 使得高密度虾池的营养水平高于低密度虾池, 水中不同的营养水平可能造成微藻演替差异 以上表明, 过高的养殖密度可能是导致养殖后期蓝藻等不良微藻演替成为优势种的原因之一 参考文献 Attayde JL, Hansson LA. Effects of nutrient recycling by zooplankton and fish on phytoplankton communities. Oecologia, 1999, 121(1): Cai LT, Chen C, Wang YN, et al. Dynamic change of the phytoplankton in the breeding ponds of Penaeus vannamei. Journal of Ningbo University (Natural Science and Engineering Edition), 2013, 26(2): 7 11 [ 蔡林婷, 陈晨, 王一农, 等. 凡纳滨对虾设施化养殖塘中浮游植物的动态变化. 宁波大学学报 ( 理工版 ), 2013, 26(2): 7 11] Cao P, Huang XH, Li CL, et al. Effects of Oscillatoria sp. on growth and immune activities of Litopeuaeus vauuamei. Fishery Modernization, 2011(5): [ 曹平, 黄翔鹄, 李长玲, 等. 颤藻对凡纳滨对虾生长和免疫相关酶活力的影响. 渔业现代化, 2011(5): 25 30] Chen JF, Lai YH, Tong WP. Fluctuation of ph values in water of industrialized cultivation of white leg shrimp Litopenaeus vannamei. Fisheries Science, 2006, 25(9): [ 陈剑锋,

74 第 5 期沈明明等 : 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 工厂化养殖系统微藻的群落特征分析 71 赖廷和, 童万平. 凡纳滨对虾工厂化养殖水体 ph 值的变化特征. 水产科学, 2006, 25(9): ] Cremen MC, Martinez-Goss MR, Corre VL, et al. Phytoplankton bloom in commercial shrimp ponds using green-water technology. Journal of Applied Phycology, 2007, 19(6): Guan CW, Liu H, Zhang YL. Experimental study on breeding Litopenaeus vannamei in recirculating aquaculture system. Fishery Modernization, 2010, 38(4): [ 管崇武, 刘晃, 张宇雷. 凡纳滨对虾工厂化循环水养殖试验研究. 渔业现代化, 2010, 38(4): 21 25] Guo H, Yu ZG. The characterisitics of phytoplankton community in prawn pond and the relationships with shrimp disease. Marine Science, 1996(1): [ 郭皓, 于占国. 虾池浮游植物群落特征及其与虾病的关系. 海洋科学, 1996(1): 39 45] Guo YJ. Chinese algae. Beijing: Science Press, 2003 [ 郭玉洁. 中国海藻志. 北京 : 科学出版社, 2003] Huang XH, Wang QH. A study on dominant phytoplankton species in high-level prawn ponds and its formation cause. Journal of Tropical Oceanography, 2002(4): [ 黄翔鹄, 王庆恒. 对虾高位池优势浮游植物种群与成因研究. 热带海洋学报, 2002(4): 36 44] Li XS, Liang JR, Chen CP, et al. Species diversity of phytoplanktons in shrimp aquaculture areas in the Quanzhou Bay Fujian Province. Journal of Xiamen University (Natural Science), 2006(S1): [ 李雪松, 梁君荣, 陈长平, 等. 泉州湾虾池浮游植物种类多样性研究. 厦门大学学报 ( 自然科学版 ), 2006(S1): ] Li YQ, Li J, Wang QY, et al. Analysis on structure and benefit of super-intensive and semi-intensive shrimp farming systems. Marine Fisheries Research, 2006, 27(5): [ 李玉全, 李健, 王清印, 等. 对虾工厂化养殖与池塘养殖系统结构与效益比较分析. 海洋水产研究, 2006, 27(5): 85 90] Li YQ, Wang RJ, Jiang LX. Effects of density-stress on water quality and growth of Marsupenaeus japonicas. Marine Fisheries Research, 2013, 37(10): [ 李玉全, 王仁杰, 姜令绪. 密度胁迫对日本囊对虾生长和水环境的影响. 海洋科学, 2013, 37(10): 53 57] Liu J, Qu KM, Liu HY, et al. Studies on features of water environment in industrialized shrimp culture system. Marine Fisheries Research, 2008, 29(6): 1 8 [ 刘娇, 曲克明, 刘海英, 等. 对虾工厂化养殖水环境基本特征研究. 海洋水产研究, 2008, 29(6): 1 8] Liu XZ, Cao YC, Li ZJ, et al. Study on microalgae community structure and its relationship with environment factors in the shrimp ponds during the later phases of culture period. Progress in Fishery Sciences, 2011, 32(3): [ 刘孝竹, 曹煜成, 李卓佳, 等. 高位虾池养殖后期浮游微藻群落结构特征. 渔业科学进展, 2011, 32(3): 84 91] Lu J, Li DS, Dong SL. The impact of stocking density on plankton community in shrimp pond. Journal of Fisheries of China, 2000, 24(3): [ 卢静, 李德尚, 董双林. 对虾池的放养密度对浮游生物群落的影响. 水产学报, 2000, 24(3): ] Meng QW, Wang S, Zhao YJ, et al. The characteristics, development trend and prospects of prawn's industrial aquaculture in China. Ocean Development and Management, 2008, 25(3): [ 孟庆武, 王圣, 赵玉洁, 等. 我国对虾工厂化养殖的特点 发展趋势及前景. 海洋开发与管理, 2008, 25(3): ] Peng CC, Li ZJ, Cao YC, et al. Change of dominant species of planktonic microalgae in Litopenaeus vannamei s semiintensive culture ponds and its impact on the culture environment. Marine Environmental Science, 2011, 30(2): [ 彭聪聪, 李卓佳, 曹煜成, 等. 凡纳滨对虾半集约化养殖池塘微藻优势种变动规律及其对养殖环境的影响. 海洋环境科学, 2011, 30(2): ] Sun Y, Li F, Li J, et al. Phytoplankton community characteristics and the interrelationship with nutrient salts in shrimp ponds. Marine Fisheries Research, 1998, 19(2): [ 孙耀, 李锋, 李健, 等. 虾塘水体中浮游植物群落特征及其与营养状况的关系. 海洋水产研究, 1998, 19(2): 45 51] Wu B, Liao SM. Primary report of species composition of microalgae in the culture ponds of shrimp Litopenaeus vannamei in Beihai, Guangxi. Guangxi Sciences, 2008, 15(4): [ 吴斌, 廖思明. 广西北海凡纳滨对虾养殖池塘中微型藻类组成调查. 广西科学, 2008, 15(4): ] Xie LM, Lin XT, Xu ZN, et al. Phytoplankton communities and physical and chemical factors in different types of shrimp ponds. Ecologic Science, 2003, 22(1): [ 谢立民, 林小涛, 许忠能, 等. 不同类型虾池的理化因子及浮游植物群落的调查. 生态科学, 2003, 22(1): 34 37] Zhang CX, Lao Z, Liu YL, et al. Change of phytoplankton and physicochemical factors in ponds of shrimp Peuaeus vauuamei with different cultural patterns during late period. Journal of Guangdong Ocean University, 2007, 27(4): [ 张才学, 劳赞, 刘玉莲, 等. 凡纳滨对虾常见养殖模式下养殖后期浮游植物及理化因子的变化. 广东海洋大学学报, 2007, 27(4): 38 44] Zhao W. Hydrobiology. Beijing: China Agriculture Press, 2005 [ 赵文. 水生生物学. 北京 : 中国农业出版社, 2005] ( 编辑冯小花 )

75 72 渔业科学进展第 38 卷 Analysis of the Microalgae Community in Industrial Aquaculture Ponds of Pacific White Shrimp (Litopenaeus vannamei) SHEN Mingming 1,2, LI Jian 1,31, WANG Qingyin 1,3, GE Hongxing 2, LIU Ping 1,3, CHANG Zhiqiang 1,3 (1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai ; 2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao ; 3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao ) Abstract The microalga community in 6 industrial aquaculture ponds of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) was analyzed at Baorong Aquatic Science and Technology Limited Corporation in Qingdao from June to September in The composition of species, abundance, biodiversity and characteristics of dominant species succession were investigated and discussed based on the situation of shrimp culture. A total of 49 species of microalgae were identified that belonged to 28 genera and 5 phylums (including 14 dominant species). The population density of microalgae was cell/l, the biomass was mg/l, and the biodiversity index was The stability of the ecosystem was weak and the shrimps were prone to outbreaks of diseases when the biodiversity index was below 0.9. The dominant species in the early stage of cultivation were green algae, diatoms and some species of dinoflagellates. Microcystis incerta and Oscillatoria willei belonging to Cyanophyta gradually became the dominant species in the middle to late stages. The culture density of shrimp had significant effects on the succession of microalga dominant species. The shrimp grew well in a stable community of microalgae where the culture density was 300 ind/m 2 (pond A1) and the dominant species were mainly green algae and diatoms. The harmful Oscillatorias tended to become the dominant species in the middle to late stages as the culture density was ind/m 2 (in pond B1, C1 and C2), which easily led to the outbreak of shrimp diseases. Our study provided important information on the tuning of the environment of industrial aquaculture ponds. Key words Litopenaeus vannamei; Industrial aquaculture; Microalgae species; Community characters 1 Corresponding author: LI Jian, lijian@ysfri.ac.cn

76 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 循环水养殖塘 * 挂膜式生物滤器内微生物的多样性 1 张健龙江顾德平 4 3 1,21 敏王城峰童晓岚金 胡伟国于忠利戴习林 (1. 上海海洋大学水产与生命学院上海 ;2. 上海市水域环境生态上海高校工程研究中心上海 ; 3. 陶氏化学 ( 中国 ) 投资有限公司上海 ;4. 上海市奉贤区水产技术推广站上海 ) 3 婧 3 摘要为了解凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 养殖过程中挂膜式生物滤器内不同位置间微生物群落结构多样性的差异, 采集已运行 46 d 的挂膜式生物滤器内挂膜上部外侧和内侧 下部内侧和外侧及收集盘 5 个不同位置的微生物, 采用分子生物学手段, 通过 16S rrna 基因高通量测序法对生物滤器内微生物进行多样性分析, 并对不同位置间功能性微生物进行对比 结果显示, 在门水平上,5 个不同位置共鉴定出 10 个主要类群, 其中, 变形菌门 (Proteobacteria) 所占丰度比例较大, 为主要优势类群, 硝化螺旋菌门 (Nitrospirae) 在挂膜内外两侧检出比例均较高 ( 平均 4.3%), 收集盘内则较低 (0.33%), 存在显著性差异 共鉴定出 41 种优势属, 其中地杆菌属 (Pedobacter) 为绝对优势种属, 短小盒菌属 (Parvularcula) 为次优势属, 二者丰度比例均在 10% 以上, 硝化螺旋菌属 (Nitrospira) 为第三优势属, 挂膜不同位置丰度比例 ( 平均 4.31%) 显著高于收集盘内比例 (0.28%) 挂膜上氨氧化细菌 (AOB) 平均丰度比例为 1.70%, 硝化细菌 (NOB) 平均比例为 6.99%, 是系统中主要去除氨氮和亚硝酸氮的微生物 生物滤器各部位微生物物种多样性丰富, 微生态系统稳定, 可有效维持循环水系统的水质 生物滤器硝化作用主要在上部进行, 下部净化能力较弱, 收集盘内基本没有硝化能力 生产中应合理配置挂膜数量, 科学设计挂膜长度以提高生物滤器的净化效率 关键词凡纳滨对虾 ; 循环水养殖 ; 生物滤器 ; 生物膜 ; 微生物多样性 ; 纳米纤维膜中图分类号 Q938.8 文献标识码 A 文章编号 (2017) 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 又称南美白对虾, 是我国对虾养殖的主要品种之一 ( 黄永春等, 2010) 随着凡纳滨对虾集约化养殖的迅速发展, 养殖水质恶化及对虾种质退化等问题给对虾养殖带来的风险不断加大 氨氮和亚硝酸氮是诱发对虾暴发疾病的主要因素, 也是造成生态环境污染的主要因子之一 ( 王年斌等, 2004) 目前, 改善对虾水质的生态养殖模式主要有混养 ( 梁志辉等, 2007) 种植浮床植物( 戴习林等, 2012) 以及循环水养殖 (Zhang et al, 2011) 等 其中, 以生物滤器为核心处理单位的循环水养殖主要利用滤料表面形成的生物膜去除水体中氨氮和亚硝酸氮, 是改善水质最为有效的方法之一 ( 黄滨等, 2016) 生物膜由微生物附着于不同载体而形成, 其形成方式主要有两 * 上海市虾类产业技术体系建设项目 [ 沪农科产字 (2014) 第 5 号 ] 上海市教委重点学科建设项目(J50701) 和上海市高校知识服务平台项目 (ZF1206) 共同资助 [This work was supported by the Shanghai Shrimp Industry Technology System Program (Hunongkechanzi ), the Key Discipline Project of Shanghai Municipal Education Commission (J50701), the Project of Shanghai Universities Knowledge Service Platform (ZF1206)]. 张健龙, m @163.com 1 通讯作者 : 江敏, 教授, mjiang@shou.edu.cn 收稿日期 : , 收修改稿日期 :

77 74 渔业科学进展第 38 卷 种, 一是根据用途采用已筛选出具有特殊功能的微生物进行挂膜培养, 二是利用养殖水体中土著微生物自然挂膜 后者因其操作简单 成本较低而被广泛应用 生物膜中微生物种类的组成和优势功能菌的比例, 对于研究生物膜功能机理及对有害污染物的降解转化具有重要意义, 而且对构建不同条件下循环水养殖系统具有指导意义 许多学者对于循环水养殖系统中生物膜上微生物多样性进行了报道 Schreier 等 (2010) 研究了循环水养殖系统中生物滤膜上的微生物多样性 ;Wold 等 (2014) 研究了鳕鱼 (Gadus morhua) 海水循环水养殖系统生物膜微生物多样性 ; 姚延丹等 (2011) 对复合池塘循环水养殖系统内微生物群落结构进行了分析 ; 李秋芬等 (2011) 通过 PCR-DGGE 法分析了循环水养殖系统生物滤池细菌群落的结构变化 ; 张海耿等 (2011) 研究了循环水养殖系统生物载体上微生物群落多样性变化 然而, 多数研究仅对生物滤器内某一特定部位或进行混合取样, 而生物滤器不同部位由于水流 溶解氧 有机物负荷等的不同, 有可能存在较大差异, 但这方面的研究尚未见报道 本研究通过 16S rrna 基因高通量测序法, 检测分析凡纳滨对虾养殖过程中挂膜式生物滤器内 ( 以下简称生物滤器 ) 的微生物多样性, 并对滤器内不同部位间微生物多样性进行对比分析, 以期为深入了解生物滤器的作用机理及对挂膜式生物滤器的构建和改进提供理论依据 1 材料与方法 1.1 实验塘基本情况实验于 2015 年 4 月 1 日 6 月 10 日在上海奉贤区 某养殖基地进行, 凡纳滨对虾为大棚土塘养殖 养殖池水深为 1.4 m, 养殖水面约 0.43 hm 2, 配有 4 台叶轮式增氧机 ( 每天开启 14 h), 另配备 20 个全天开启的自沉式底部微孔曝气盘, 投放苗种约 50 万尾 斑点叉尾鮰 (Ietalurus punetaus)20 尾, 配备外置挂膜式生物滤器以实现循环水养殖 ( 图 1) 养殖过程中未添加新水和换水, 早晚各投喂饲料 1 次, 养殖结束后收获成虾体长和体重分别为 (9.81± 0.17) cm/ 尾和 (5.43±0.25) g/ 尾 实验期间, 实验塘水温和 ph 变化范围分别为 和 , 主要营养盐指标总氮 总磷和高锰酸盐指数变化范围分别为 mg/l mg/l 和 mg/l 生物滤器为 1.4 m 1.4 m 2 m 的钢骨架结构, 底部设 0.2 m 高的收集盘, 滤器内部挂 52 根 1 m 1.8 m 的塑料骨架, 每个骨架上搭 1 层 1 m 3.6 m 纳米纤维膜, 自然披挂于骨架的左右两侧 通过水泵 ( 功率为 1.8 kw) 将养殖池塘水抽至滤膜系统顶部, 经顶部布水管均匀分布到各层纳米纤维材料的表面, 汇入收集盘后经出水口排入养殖塘 生物滤器 4 月 25 日开启, 至养殖生产结束时关闭 1.2 样品采集与处理 样品采集养殖结束后, 关闭生物滤器, 打开装置外壳, 按图 1 所示采集不同部位微生物样品 上部采样位置距挂膜顶层 20 cm, 下部采样位置距挂膜底部 20 cm, 上下部均采集挂膜外侧和内侧微生物, 另采集收集盘内沉积物, 采集样品均保存于 10 ml 灭菌离心管内, 80 冷藏待处理 各部位样品编号 : 上部膜内侧 (SN), 上部膜外侧 (SW), 下部膜内侧 (XN), 下部膜外侧 (XW), 收集盘内沉积物 (D) Fig.1 图 1 凡纳滨对虾循环水养殖挂膜式生物滤器水处理系统模式 Technology flow chart of the recirculating aquaculture system for L. vannamei

78 第 5 期张健龙等 : 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 循环水养殖塘挂膜式生物滤器内微生物的多样性 样品 DNA 提取无菌条件下称取 0.2 g 样本, 放入 5 ml 灭菌塑料离心管中, 加入 1 ml SLX-Mlus Buffer 缓冲液和 100 μl DS Buffer 缓冲液,70 孵育 10 min, 室温 3000 r/min 离心 3 min, 吸取 800 μl 上清液至 2 ml 离心管中 加入 270 μl P2 Buffer, 涡旋混匀, 冰上孵育 5 min, r/min 离心 5 min, 转移上清液至 1.5 ml 离心管中, 加入 0.7 倍体积的异丙醇, 混匀, 20 下放置 1 h, 然后 r/min 离心 5 min 采用试剂盒(E.Z.N.A.Soil DNA Kit) 提取该微生物基因组 DNA, 分别用 Qubit 2.0 和琼脂糖凝胶检测 DNA 浓度 S rrna 基因的 PCR 扩增 PCR 扩增采用环境微生物 16S rrna 通用引物 : 上游引物 341F5 (5 -CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-3 ) 和下游引物 805R3 (3 -GACTGGAGTTCCTTGGCA CCCGAGAATTCCA-5 ), 用于 PCR 扩增的 16S rdna 片段由上海生物工程技术服务有限公司合成 扩增反应体系为 50 μl:10 PCR 缓冲液 5 μl, 上下游引物各 0.5 μl (50 μmol/l),0.5 μl dntp (10 mmol/l),0.5 μl Taq DNA 聚合酶 (5 U/μl), 模板 10 ng, 加双蒸水定容至 50 μl 反应程序 :94 预变性 3 min;94 变性 30 s,45 退火 20 s,65 延伸 30 s,5 个循环 ;94 变性 20 s, 55 退火 20 s,72 延伸 30 s, 共 20 个循环 ;72 延伸 5 min PCR 结束后, 用 1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测结果, 并在目的条带处用 SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒割胶回收 S rrna 基因测序 16S rrna 基因测序交由上海生物工程技术服务有限公司完成, 将所测基因序列通过 Blast ( blast.cgi) 在 GenBank 中进行相似序列搜索, 根据最相似序列确定其系统发育地位 1.3 数据分析 将多条序列按其序列间的距离进行聚类, 然后以序列之间的相似性作为域值 (0.97) 分成操作分类单元 OTU 根据 OTU 数目进行 Alpha 多样性指数计算, 指数包括香农指数 (Shannon Index) ACE 指数 Chao1 指数 Coverage 和 Simpson 等 Chao1 指数和 ACE 指数均由 Chao 等 (2002) 提出, 用来估计群落中含有的 OTU 数目, 是生态学中估计物种总数的常用指数 Coverage 是指各样品文库的覆盖率, 其数值越高, 样本中序列没有被测出的概率越低, 该指数实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况 (Li et al, 2015) Alpha 多样分析采用 mothur (Schloss et al, 2011), 相关网址 :http: / 常规数据处理及作图使用 Excel 软件统计分析 ; 非参数检验 方差分析 (One-way ANOVA) 及 NMDS 作图采用 SPSS 19.0 进行 ; 样本距离 heatmap 图所用软件为 R 语言程序包 pheatmap 2 结果 2.1 微生物物种组成对生物滤器内 5 个不同部位微生物进行测序分析 在门水平共鉴定出 10 个主要类群 ( 图 2-a), 包括变形菌门 (Proteobacteria) 拟杆菌门(Bacteroidetes) 厚壁菌门 (Firmicutes) 硝化螺旋菌门(Nitrospirae) 浮霉菌门 (Planctomycetes) 衣原体门(Chlamydiae) 芽单胞菌门 (Gemmatimonadetes) 绿弯菌门(Chloroflexi) 疣微菌门 (Verrucomicrobia) 和蓝藻门 (Cyanobacteria) 变形菌门 拟杆菌门和厚壁菌门在不同部位均为主要优势门类, 其中, 变形菌门为绝对优势门类 挂膜上所检测出硝化螺旋菌门比例 ( 平均为 4.33%) 显著高于收集盘内比例 (0.33%), 非参数检验表明, 存在极显著性差异 (P<0.01); 上部膜内 (5.53%) 上部膜外 (4.36%) 和下部膜内 (4.41%) 三者之间无显著性差异, 但比例均高于下部膜外 (3.03%), 非参数检验表明, 存在显著性差异 (P<0.05) 收集盘内浮霉菌门和疣微菌门所占比例均高于其在挂膜上的比例 其他门类相对比例较小, 不同部位间差异不显著 在属水平上, 5 个不同部位共鉴定出 743 种微生物, 种类数由多至少依次为 D>SN>SW>XN>XW( 图 2-b) 2.2 优势种与功能分类将生物滤器 5 个不同部位中均存在且丰度比例大于 0.1% 的微生物种类 ( 属水平 ) 定为优势属, 共鉴定出 41 个优势属 ( 表 1) 地杆菌属(Pedobacter) 为绝对优势, 丰度比例均在 10% 以上 ; 短小盒菌属 (Parvularcula) 为次优势属, 在 SN SW 和 XN 部位丰度比例在 10% 以上,SW 和 D 中比例较小 ; 第三优势属为硝化螺旋菌属 (Nitrospira), 各挂膜不同部位含量均较高 ( 平均值为 4.31%), 收集盘内较低 (0.28%) 根据微生物种属的功能, 可将系统内优势种属分为 4 类 第 1 类是可直接参与硝化或反硝化作用的硝化类群 (Orso et al, 1994; Yin et al, 2009; Purkhold et al, 2000), 共 10 种, 包括亚硝化单胞菌 (Nitrosomonas) 芽殖小小梨形菌属 (Blastopirellula) 及亚硝化球菌属 (Nitrosococcus) 3 种氨氧化菌 (AOB), 以及硝化螺旋菌属 (Nitrospira) 黄色单胞菌科(Silanimonas) 固氮弧菌属 (Azoarcus) 土微菌属(Pedomicrobium) 副球

79 76 渔业科学进展第 38 卷 2 Fig.2 Dominant bacterial community of the biological filter a b a: Phylum level, b: Genus level 菌属 (Paracoccus) 埃希氏- 志贺菌属 (Escherichia- Shigella) 和红螺菌科 (Defluviicoccus) 7 种硝化菌 (NOB); 第 2 类是可利用有机物参与氮代谢循环的类群 ( 冯丽娟等, 2011; 唐美珍等, 2014; 马溪曼等, 2015), 共 8 种, 包括假单胞菌属 (Pseudomonas) 金色单胞菌属 (Chryseolinea) 小红卵菌属(Rhodovulum) 小梨形菌属 (Pirellula) 维斯氏菌属(Weissella) 生丝微菌属 (Hyphomicrobium) 线状微球菌属(Filomicrobium) 和脱硫叶菌属 (Desulfobulbus); 第 3 类主要为具有抵抗重金属及降解芳香类有机污染物的类群 ( 袁军等, 2008; Arun et al, 2009), 共 3 种, 分别为短小盒菌属 (Parvularcula) 赤杆菌科(Altererythrobacter) 和新鞘氨醇杆菌属 (Novosphingobium); 第 4 类为其他污水处理 系统或生物膜反应器中常见种属 (Zhou et al, 2012), 如地杆菌属 (Pedobacter) 玫瑰变色菌(Roseovarius) 等 2.3 α 多样性分析通过高通量测序技术, 根据 barcode 标签对序列进行拆分, 对所测序列进行冗余处理, 获得相似度 97% 以上的序列, 并将其聚类为用于分析的 OTU 单元 由于样品间存在一定的差异以及测序技术本身的缺陷, 每个样品所测出的有效序列数存在差异 ( 表 2) 下部膜外 OTU 数目最少, 非参数检验表明, 其与其他部位间存在显著性差异 (P<0.05) ACE 指数及 Chao1 指数受 OTU 数目影响也出现类似结果, 下部膜外多样性指数明显低于其他部位 (P<0.05) 5 个不同部位

80 第 5 期张健龙等 : 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 循环水养殖塘挂膜式生物滤器内微生物的多样性 77 表 1 不同部位微生物优势属丰度比例 (%) Tab.1 Relative abundance of dominant microbial genus in different positions (%) 属类 Genus SN XN SW XW D 地杆菌属 Pedobacter 短小盒菌属 Parvularcula 硝化螺旋菌属 Nitrospira 玫瑰变色菌 Roseovarius 瘤胃球菌属 Ruminococcus 假单胞菌 Pseudomonas 鞘氨醇杆菌属 Sphingobacterium 黄色单胞菌科 Silanimonas Hymenobacter 赤杆菌科 Altererythrobacter 金色单胞菌属 Chryseolinea 新衣原体属 Neochlamydia 黄杆菌属 Flavobacterium Aquicella 芽孢杆菌属 Bacillus 浮霉状菌属 Planctomyces 亚硝化单细胞菌 Nitrosomonas 小红卵菌属 Rhodovulum 芽殖小小梨形菌属 Blastopirellula 堆囊菌属 Sorangium 新鞘氨醇杆菌属 Novosphingobium 黄曲霉属 Chthoniobacter 小梨形菌属 Pirellula Ornatilinea 维斯氏菌属 Weissella 固氮螺菌属 Azospira 固氮弧菌属 Azoarcus 土微菌属 Pedomicrobium 副球菌属 Paracoccus 木洞菌属 Woodsholea 亚硝化球菌属 Nitrosococcus 明串珠菌属 Leuconostoc 埃希氏 - 志贺菌属 Escherichia-Shigella 生丝微菌属 Hyphomicrobium 线状微球菌属 Filomicrobium 军团菌属 Legionella 红螺菌科 Defluviicoccus Q 热力克次体 Coxiella Phycisphaera 伪枝藻科 Brasilonema 脱硫叶菌属 Desulfobulbus

81 78 渔业科学进展第 38 卷 表 2 不同部位微生物多样性指数 Tab.2 The diversity index for bacterial community in different samples 位置 Position OTU num Coverage ACE_index Chao1_index Shannon_index Simpson SN XN SW XW D 之间 Shannon 指数和 Simpson 值无显著性差异, 根据生物多样性阈值的分级评价标准 ( 蔡立哲等, 2002) 可知, Shannon 指数均在处于 V 级, 微生物物种多样性丰富 2.4 组间相似性分析 根据 5 个不同部位间所测序列的相似程度及相对丰度, 对各样品进行相似性聚类热图分析 ( 图 3), 并根据属水平差异进行非多维尺度分析 (NMDS), 二者分析结果较为类似 相似性聚类热图分析中, 颜色深浅用于判断样品两两之间的相似程度, 颜色越红越相近, 越蓝则相差越大 由聚类结果可知, 上部膜内 (SN) 下部膜内(XN) 以及上部膜外 (SW) 可以聚为一支, 下部膜外 (XW) 与收集盘内 (D) 微生物可以聚为一支 相似性分析显示, 不同样品间微生物组成存在极显著差异 (P<0.01) 由图 3 可知,SN 与 XN 组间微生物相似性最高,SN 与 SW 之间的相似性次之,XN 与 D 内微生物相似性最低 NMDS 的分析结果见图 4, 其压力系数 stress=0.1, 排序结果较好, 分析结果与聚类分析结果较为类似 图 3 不同部位间相似性聚类热图 Fig.3 Heatmap and cluster analysis of microorganism communities in five sampling positions 3 讨论 3.1 主要门类组成 变形菌门作为自然界最为丰富的一个门类, 在众多环境中均为绝对优势种 本研究中, 变形菌门为绝对优势门类, 平均比例为 40%, 挂膜各部位间不存在 图 4 不同部位间 NMDS 分析 Fig.4 NMDS of microorganism communities in five sampling positions on genus level 显著性差异, 但均显著高于收集盘中的 33.18%, 这与多数研究结果较为类似 张海耿等 (2011) 对循环水养殖系统中生物膜载体上微生物种类组成进行研究发现, 变形菌门比例为 51.52%, 并认为 β 变形菌是废水处理系统中除氮的主要类群 ; 郑林雪等 (2015) 对缺氧 / 好氧膜生物反应器中好氧池和厌氧池中微生物多样性研究发现, 变形菌门在好氧池和厌氧池中的比例分别为 37.04% 和 27.91%, 并认为溶解氧的差异是变形菌门比例不同的主要原因 本研究中, 变形菌门比例较高, 高比例变形菌门对于系统脱氮具有重要作用 ( 张海耿等, 2011), 溶氧和有机物含量的不同是不同部位间变形菌门比例产生差异的主要原因 ( 郑林雪等, 2015) 系统内水流从生物滤器顶部进入 分散并流过挂膜表面, 与膜上微生物接触后, 水中有机物被分解, 过剩的营养物质被迅速去除, 溶解氧含量迅速降低, 水流汇入收集盘时, 溶解氧和有机物含量已与进入系统时存在较大差异, 因此, 收集盘内变形菌门比例较小 硝化螺旋菌是参与氮代谢循环的重要微生物, 也是生物系统内部将亚硝酸氮和氨氮氧化的重要微生物, 是主要目的功能菌, 其比例的多少直接影响生物膜系统对于亚硝酸氮和氨氮的去除能力 研究表明, 在自然环境中硝化螺旋菌门为劣势种类, 在水体及土

82 第 5 期张健龙等 : 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 循环水养殖塘挂膜式生物滤器内微生物的多样性 79 壤中含量均不高 (Gibbons et al, 2015), 在养殖水体中硝化螺旋菌门的比例也较小 ( 李敬源等, 2012), 在不同废水处理系统中硝化螺旋菌门比例存在一定差异 张楠等 (2015) 用 A/O 生物膜法强化处理石化废水中微生物群落多样性表明, 硝化螺旋菌门比例低于 1%, 氨氮去除率可达 93% 96% 左右, 去除率较高 ; 曾薇等 (2015) 研究污水处理系统中硝化螺旋菌菌群结构变化时发现,4 种不同工艺污水处理系统中硝化螺旋菌门比例在 1% 7% 之间, 氨氮去除率可达 70% 以上, 可以看出硝化螺旋菌门比例在较低情况下即可达到很好的除氨氮效果 本研究中, 硝化螺旋菌门所占比例较高 ( 挂膜上平均比例为 4.33%), 挂膜各部位与收集盘内存在极显著差异 (P<0.01), 较高的硝化螺旋菌门比例是本实验能有效去除氨氮和亚硝酸氮的原因 不同部位间硝化螺旋菌门的差异与多种原因有关, 众多研究表明, 硝化细菌对于不同工艺及环境非常敏感, 受各种因素, 例如溶解氧 温度 水力停留时间及各种水体中抑制剂等因素影响较大 (Geets et al, 2006; Blackbume et al, 2008; Bollmann et al, 2011) 本研究中, 生物滤器为挂膜式, 相邻膜之间存在空隙, 透氧能力较好, 这符合硝化螺旋菌门好氧生长的习性 ; 其次, 水流经生物滤器顶部流经膜表面时溶解氧和有机物较为丰富, 利于微生物的大量繁殖 ; 再者, 由于收集盘内水体溶解氧和有机物含量降低, 且没有太多微生物附着点, 不利于微生物的繁殖和积累, 因而, 收集盘内硝化螺旋菌门明显少于其他部位 3.2 主要优势种的变化所测样品中共鉴定出 41 种优势属, 其中, 以地杆菌属和短小盒菌属为主要优势属, 丰度比例均在 10% 以上, 二者均为生物滤器内常见微生物种类, 其中, 短小盒菌属具极强的高温抗逆性, 而且有一定抗重金属的能力, 有望成为在恶劣环境下进行生态修复的重要种群 (Arun et al, 2009) 本研究中, 硝化螺旋菌属为第三优势属, 相对丰度比例较高, 是硝化作用的主要类群 ( 张海耿等, 2011) AOB 及 NOB 是影响生物滤器去除氨氮和亚硝酸氮的主要微生物类群, 曾薇等 (2015) 研究发现, 处理系统内的 AOB 丰度比例 0.3% NOB 达 5.26% 时, 即可达到很好的氨氮除去效果, 并认为 AOB 的含量决定了系统硝化的效果 张楠等 (2015) 研究发现,AOB 含量为 0.16% NOB 含量为 1.12% 时, 系统的总氮去除效率可达到 21% 本研究中, 微生物优势属中共鉴定出 3 种 AOB 微生物, 挂膜上丰度加和比例为 1.35% 1.87%;7 种 NOB 微生物在挂膜上丰度加和比例为 5.76% 8.52%,AOB 和 NOB 丰度比例较高, 较高的 AOB 和 NOB 含量是本实验具有较好的除氨氮和亚硝酸氮效果的主要原因 本研究中, 还发现一定比例的可同步进行硝化反硝化作用的微生物包括土微菌属 副球菌属和红螺菌科 ( 杨航等, 2008; 孙雪等, 2014), 硝化反硝化微生物的存在大大缩短了生物滤器除氮时间, 提高了除氮效率 ( 黎乾等, 2011) 3.3 多样性分析 下部膜外 OTU 数目显著低于其他部位, 其他部位间不存在显著性差异, 即在同样称取 0.2 g 样品中, 下部膜外所含有效微生物量较其他部位少 由于挂膜方式为双层挂膜, 每两层之间由一塑料支架支撑, 多层塑料支架紧密排列, 膜内侧由塑料支架分开, 而膜外侧则与相邻膜紧密接触 挂膜上部由于水体的冲击力较大, 外膜间并未产生粘黏性接触, 而随着水体的冲击力减小, 下部膜外产生黏贴 大面积外膜黏贴导致膜表面溶解氧降低和水流受阻, 同时也导致微生物附着面积减少, 因此, 下部膜外有效微生物含量较其他部位少 ACE 指数及 Chao1 指数受 OTU 数目影响也出现类似结果 5 个不同部位间 Shannon 指数不存在显著性差异, 指数值均处于 V 级, 微生物物种多样性丰富, 表明生物滤器内微生态系统稳定, 对水中营养盐的变化能起到很好的缓冲作用 4 结论 本研究中, 挂膜上 AOB 细菌比例和 NOB 细菌比例较高, 生物滤器具有较好的去除氨氮和亚硝酸氮的效果 生物滤器内生物多样性较高, 对稳定滤器的水处理效果具有重要作用 综合不同部位间功能微生物比例的差异可知, 收集盘基本不具有硝化能力, 因此, 需定时清理收集盘内沉积物, 以免消耗水体中大量溶解氧而产生厌氧反硝化现象 生物滤器挂膜下部外侧有效微生物含量较低, 对水体氨氮和亚硝酸氮的去除能力较弱, 硝化和反硝化作用主要在生物滤器上部进行 设计挂膜式生物滤器时, 应合理配置挂膜数量, 科学设计挂膜长度以提高生物滤器的净化效率 参考文献 Arun AB, Chen WM, Lai WA, et al. Parvularcula lutaonensis sp. nov., a moderately thermotolerant marine bacterium isolated from a coastal hot spring. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2009, 59(5): Blackburne R, Yuan ZG, Keller J. Partial nitrification to nitrite using low dissolved oxygen concentration as the main

83 80 渔业科学进展第 38 卷 selection factor. Biodegradation, 2008, 19(2): Bollmann A, French E, Laanbroek HJ. Chapter three-isolation, cultivation, and characterization of ammonia-oxidizing bacteria and archaea adapted to low ammonium concentrations. Methods in Enzymology, 2011, 486: Cai LZ, Ma L, Gao Y, et al. Analysis on assessing criterion for polluted situation using species diversity index of marine macrofauna. Journal of Xiamen University (Natural Science), 2002, 41(5): [ 蔡立哲, 马立, 高阳, 等. 海洋底栖动物多样性指数污染程度评价标准的分析. 厦门大学学报 ( 自然科学版 ), 2002, 41(5): ] Chao A, Bunge J. Estimating the number of species in a stochastic abundance model. Biometrics, 2002, 58(3): Dai XL, Guo Y, Qian HR, et al. The purification effect of three vegetables and different cultivation on aquaculture water from shrimp pond. Journal of Shanghai Ocean University, 2012, 21(5): [ 戴习林, 郭印, 钱辉仁, 等. 3 种蔬菜及浮植方式对虾池水体的净化效果. 上海海洋大学学报, 2012, 21(5): ] Feng LJ, Zhu L, Xu J, et al. Enhanced denitrification in the biofilm process remedying polluted water source via stepfeeding. Acta Scientiae Circumstantiae, 2011, 31(12): [ 冯丽娟, 朱亮, 徐京, 等. 分段配水强化受污染水源水生物膜修复工艺脱氮性能研究. 环境科学学报, 2011, 31(12): ] Geets J, Boon N, Verstraete W. Strategies of aerobic ammoniaoxidizing bacteria for coping with nutrient and oxygen fluctuations. FEMS Microbiology Ecology, 2006, 58(1): 1 13 Gibbons SM, Gilbert JA. Microbial diversity Exploration of natural ecosystems and microbiomes. Current Opinion in Genetics & Development, 2015, 35: Huang B, Ma T, Liu BL, et al. Effects of ozone concentration on the activity of biofilm and its effectiveness of purification in recirculating aquaculture systems. Progress in Fishery Sciences, 2016, 37(3): [ 黄滨, 马腾, 刘宝良, 等. 不同浓度臭氧对循环水养殖系统生物膜活性及其净化效能的影响. 渔业科学进展, 2016, 37(3): ] Huang YC, Ai HS, Yin ZX, et al. Studies on WSSV resistant and immune characteristics of the 4th generation selective breeding families for resistance to the white spot syndrome virus(wssv) of Litopenaeus vannamei. Journal of Fisheries of China, 2010, 34(10): [ 黄永春, 艾华水, 殷志新, 等. 第四代凡纳滨对虾抗 WSSV 选育家系的抗病及免疫特性研究. 水产学报, 2010, 34(10): ] Li JY, Lin WT, Luo JF, et al. Community structure of microbes involved in nitrification and denitrification in typical shrimp-farming water. Acta Microbiologica Sinica, 2012, 52(4): [ 李敬源, 林炜铁, 罗剑飞, 等. 典型对虾 养殖水体中参与硝化与反硝化过程的微生物群落结构. 微生物学报, 2012, 52(4): ] Li Q, Wu SW, Wu WX, et al. Effect of injected leachate C/N ratio on the denitrification of a bioreactor filled with landfilled refuse. Environmental Science, 2011, 32(11): [ 黎乾, 吴松维, 吴伟祥, 等. 回灌渗滤液 C/N 对填埋垃圾生物反应器反硝化特性的影响. 环境科学, 2011, 32(11): ] Li QF, Fu XJ, Zhang Y, et al. PCR-DGGE analysis of bacterial communities in bio-filters of re-circulating mariculture system. Journal of Fisheries of China. 2011, 35(4): [ 李秋芬, 傅雪军, 张艳, 等. 循环水养殖系统生物滤池细菌群落的 PCR-DGGE 分析. 水产学报, 2011, 35(4): ] Li Y, Chen L, Wen H. Changes in the composition and diversity of bacterial communities 13 years after soil reclamation of abandoned mine land in eastern China. Ecological Research, 2015, 30(2): Liang ZH, Wang ZC, Yang JL, et al. Polyculture of crab Scyllaserrata megalops with white leg shrimp Litopenaeus vannamei in ponds. Fisheries Science, 2007, 26(11): [ 梁志辉, 王志成, 杨家林, 等. 锯缘青蟹大眼幼体与凡纳滨对虾混养试验. 水产科学, 2007, 26(11): ] Ma XM, Lu YY, Xie ZQ, et al. Effects of microorganisms related to carbon and nitrogen metabolisms on microbial structure in solid waste composting. Environmental Engineering, 2015, 33(12): [ 马溪曼, 陆彦宇, 谢志全, 等. 添加碳氮代谢相关微生物对堆肥过程中菌群结构的影响. 环境工程, 2015, 33(12): 95 99] Orso S, Gouy M, Navarro E, et al. Molecular phylogenetic analysis of Nitrobacter spp. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 1994, 44(1): Purkhold U, Pommerening-Röser A, Juretschko S, et al. Phylogeny of all recognized species of ammonia oxidizers based on comparative 16S rrna and amoa sequence analysis: Implications for molecular diversity surveys. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(12): Schloss PD, Gevers D, Westcott SL. Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rrna-based studies. PLoS One, 2011, 6(12): e27310 Schreier HJ, Mirzoyan N, Saito K. Microbial diversity of biological filters in recirculating aquaculture systems. Current Opinion in Biotechnology, 2010, 21(3): Sun X, Zhu WJ, Wang L, et al. Review on the main microorganisms and their metabolic mechanisms in enhanced biological phosphorus removal (EBPR) systems. Chinese Journal of Applied Ecology, 2014, 25(3): [ 孙雪, 朱为静, 王亮,

84 第 5 期张健龙等 : 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 循环水养殖塘挂膜式生物滤器内微生物的多样性 81 等. 强化生物除磷系统主要微生物及其代谢机理研究进展. 应用生态学报, 2014, 25(3): ] Tang MZ, Yao SM, Zhang FF, et al. Pollutants removal by Pseudomonas flava WD-3 and Monod model simulation in constructed wetland. Acta Scientiae Circumstantiae, 2014, 34(12): [ 唐美珍, 姚淑敏, 张凤凤, 等. Pseudomonas flava WD-3 对人工湿地污染物的去除及 Monod 模型模拟. 环境科学学报, 2014, 34(12): ] Wang NB, Han JB, Zhou ZC, et al. Environmental factors in shrimp culture ponds related with diseases outbreaks. Fisheries Science, 2004, 23(12): 5 8 [ 王年斌, 韩家波, 周遵春, 等. 虾池水环境因子与虾病爆发的相关性分析. 水产科学, 2004, 23(12): 5 8] Wold PA, Holan AB, Øie G, et al. Effects of membrane filtration on bacterial number and microbial diversity in marine recirculating aquaculture system (RAS) for Atlantic cod (Gadus morhua L.) production. Aquaculture, 2014, (Suppl): Yang H, Huang J, Liu B. Advances in research of heterotrophic nitrification Aerobic denitrification strain Paracoccus pantotrophus ATCC Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2008, 14(4): [ 杨航, 黄钧, 刘博. 异养硝化 好氧反硝化菌 Paracoccus pantotrophus ATCC 的研究进展. 应用与环境生物学报, 2008, 14(4): ] Yao YD, Li G, Tao L, et al. Analysis of microbial community structure in an integrated pond recirculating aquaculture system. Journal of Fishery Sciences of China, 2011, 18(2): [ 姚延丹, 李谷, 陶玲, 等. 复合池塘循环水养殖系统微生物群落结构分析. 中国水产科学, 2011, 18(2): ] Yin J, Xu WF. Ammonia biofiltration and community analysis of ammonia-oxidizing bacteria in biofilters. Bioresource Technology, 2009, 100(17): Yuan J, Lai QL, Zheng TL, et al. Polycyclic aromatic hydrocarbondegrading bacterium Novosphingobium sp. H25 isolated from deep sea and its degrading genes. Acta Microbiologica Sinica, 2008, 48(9): [ 袁军, 赖其良, 郑天凌, 等. 深海多环芳烃降解菌新鞘氨醇杆菌 H25 的降解特性及降解基因. 微生物学报, 2008, 48(9): ] Zeng W, Zhang LM, Wang AQ, et al. Community structures and population dynamics of nitrifying bacteria in activated sludges of wastewater treatment plants. China Environmental Science, 2015, 35(11): [ 曾薇, 张丽敏, 王安其, 等. 污水处理系统中硝化菌的菌群结构和动态变化. 中国环境科学, 2015, 35(11): ] Zhang HG, Ma SS, Li QF, et al. Analysis of the changes of microbial community structure on bio-carrier of recirculating aquaculture systems(ras). Environmental Science, 2011, 32(1): [ 张海耿, 马绍赛, 李秋芬, 等. 循环水养殖系统 (RAS) 生物载体上微生物群落结构变化分析. 环境科学, 2011, 32(1): ] Zhang N, Chu LB, Ding PY, et al. Enhanced treatment of petrochemical wastewater by using A/O biofilm reactor and analysis of biofilm community. China Environmental Science, 2015, 35(1): [ 张楠, 初里冰, 丁鹏元, 等. A/O 生物膜法强化处理石化废水及生物膜种群结构研究. 中国环境科学, 2015, 35(1): 80 86] Zhang SY, Li G, Wu HB, et al. An integrated recirculating aquaculture system (RAS) for land-based fish farming: The effects on water quality and fish production. Aquaculture Engineering, 2011, 45(3): Zheng LX, Li J, Ren JZ, et al. Analysis of bacterial community composition by 16S rdna clone library sampling from anoxic-aerobic membrane bioreactor process. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2015, 9(5): [ 郑林雪, 李军, 任金柱, 等. 16S rdna 克隆文库解析 AO-MBR 系统中细菌种群多样性. 环境工程学报, 2015, 9(5): ] Zhou ZC, Jiang F, Wang SF, et al. Pedobacter arcticus sp. nov., a facultative psychrophile isolated from Arctic soil, and emended descriptions of the genus Pedobacter, Pedobacter heparinus, Pedobacter daechungensis, Pedobacter terricola, Pedobacter glucosidilyticus and Pedobacter lentus. International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology, 2012, 62(8): ( 编辑冯小花 )

85 82 渔业科学进展第 38 卷 Microbial Diversity in Bio-Filter of the Recirculating Aquaculture System for Litopenaeus vannamei ZHANG Jianlong 1, JIANG Min 1,21, WANG Chengfeng 3, TONG Xiaolan 3, JIN Jing 3, GU Deping 4, HU Weiguo 4, YU Zhongli 4, DAI Xilin 1 (1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai ; 2. Research and Engineering Center on Aquatic Environment Ecosystem, Shanghai ; 3. Dow Chemical (China) Investment Company Limited, Shanghai ; 4. Fengxian Fisheries Technology Extension Station, Shanghai ) Abstract In order to study the biodiversity of microbial community structure and explore the water quality purification mechanism of bio-filter in the recirculating aquaculture system for Litopenaeus vannamei, microorganism samples were collected from 5 different positions which were the outer and inner surfaces of the upper part of nano-membrane, the outer and inner surfaces of the lower part of the nano-membrane, and the collecting tray. Microbial diversity, functional microorganisms and purifying capacity among different samples were analyzed according to molecular biological methods and 16S rrna gene pyro sequencing. The results showed that 10 phyla were identified in 5 different positions, in which Proteobacteria was the dominant group. Nitrospirae was detected in the nano-membrane (4.3%), while with low abundance in the collecting tray (0.33%). Ammonia oxidizing bacteria and nitrite oxidizing bacteria in nano-membrane were the primary microorganisms to remove nitrogen and the proportions were 1.70% and 6.99%, respectively. There were 41 dominant species identified in total. Among which, Pedobacter was absolutely dominant, Parvularcula was the second dominant species, and both abundance ratios were above 10%. Nitrospira was the third dominant species, whose average abundance on membrane (4.31%) was significantly higher than that in the collecting tray (0.28%). Rich biodiversity of microorganism and stable microorganism ecosystem in the biological filter had a crucial role in buffering water quality. The analysis of effective biomass indicated that nitrification happened mostly in the upper part of the biological filter, and the nitrification effect was weakened in the lower part, while almost disappeared in the collecting tray. Therefore, in order to improve efficiency of nitrification, the hanging membrane density and length should be scientifically designed and rationally distributed. Key words Litopenaeus vannamei; Recirculating aquaculture; Bio-filter; Biofilm; Microbial diversity; Nano-Membrane 1 Corresponding author: JIANG Min, mjiang@shou.edu.cn

86 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 循环水养殖欧洲鲈鱼 (Dicentrarchus labrax) * 重金属污染状况与富集分布特征 万慧珊 1,2 程 波 21 宋晓红 3 李 乐 2 宋 怿 2 (1. 上海海洋大学水产与生命学院上海 ;2. 中国水产科学研究院质量与标准研究中心北京 ; 3. 岛津企业管理 ( 中国 ) 有限公司北京 ) 摘要为了解并评估天津市某循环水养殖企业的养殖产品重金属安全性和分布规律, 本研究采用电感耦合等离子体发射光谱法 (ICP 法 ) 和原子荧光法 (AFS 法 ), 对该封闭循环水养殖系统中欧洲鲈鱼 (Dicentrarchus labrax) 幼鱼 养殖中期和成鱼 3 个阶段的鱼体肌肉 肝脏和鳃中 8 种重金属 (As Cd Cr Cu Ni Pb Zn 和 Hg) 含量进行测定 结果显示, 从生长阶段来看, 随养殖过程推进, 各重金属在欧洲鲈鱼体内分布特征不同, 肌肉中 As 含量随时间增加而增加, 最大值为 1.93 mg/kg, Cu 和 Hg 则相反, 最大值分别为 和 mg/kg; 肝脏中 As Cd 和 Cu 含量均随时间增加, 最大值分别为 和 mg/kg; 鳃中 As 含量随时间增加而增加, 最大值为 mg/kg, Cr Cu Zn 和 Hg 含量呈先降后升的趋势, 最大值分别为 和 mg/kg 从组织分布特征来看,As 含量为肌肉 > 肝脏 > 鳃,Cd Cu 和 Zn 含量均为肝脏 > 鳃 > 肌肉,Hg 含量为肌肉 > 鳃 > 肝脏,Cr 含量为鳃 > 肝脏 > 肌肉 可食部分, 即肌肉中各重金属含量均符合食品安全国家标准 (GB ), 参考鱼体重金属残留污染程度分级, 该系统中的欧洲鲈鱼均属于未污染 水体样本, 除养殖中期进水中 Pb 和 Cd 超标, 其余重金属含量均符合我国渔业水质标准 (GB ) 表明该养殖系统中重金属污染在安全范围内 关键词 循环水养殖 ; 欧洲鲈鱼 ; 重金属 ; 污染 ; 组织分布 ; 富集规律 中图分类号 X835 文献标识码 A 文章编号 (2017) 水产养殖作为 为人类提供优质蛋白质 的农业产业, 其需求量逐年上升 据测算, 到 2030 年, 中国对水产品的需求量将再增加 2000 万 t ( 任爱景等, 2012) 循环水养殖模式(RAS) 被认为是能够解决当前自然资源日益匮乏与人类需求矛盾不断增加的有效 途径之一 通过系统中各单元操作的处理, 可实现水资源的循环利用, 也加强了对水体污染物的管理和营养素的再利用 ( 柳瑶等, 2015; 于冬冬, ) ; 朱建新等, 2014; 黄滨等, 2016) 同时, 循环水养殖系统的封闭模式, 方便通过控制水温为养殖对象的生长繁殖提 * 国家自然科学基金项目 ( ) 公益性行业( 农业 ) 科研专项 ( ) 现代农业产业技术体系建设专项 (CARS-49) 和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目 (2016C009) 共同资助 [This work was supported by the National Natural Science Foundation of China ( ), the Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest ( ), Modern Agricultural Industry Technology System (CARS-49), and the Special Fund of Chinese Central Government for Basic Scientific Research Operations in Commonweal Research Institutes (2016C009)]. 万慧珊, hs-wan@foxmail.com 1 通讯作者 : 程波, 副研究员, chengbocafs@163.com 收稿日期 : , 收修改稿日期 : Yu DD. The research of fine particles removal techniques in the seawater recirculating aquaculture system. Master s Thesis of Shanghai Ocean University, 2014, [ 于冬冬. 海水循环水养殖系统中微细颗粒去除技术的研究. 上海海洋大学硕士研究生学位论文, 2014, 12 16]

87 84 渔业科学进展第 38 卷 供相对稳定的水环境 循环水养殖模式虽然有上述诸多优点, 但因其封闭循环的特征, 若养殖用水受到污染, 且源水处理环节不能及时有效发挥作用, 一旦危害物质随水源进入养殖系统, 将难以排出系统, 因而, 在循环水养殖系统中, 水处理工艺等环节的高效运行, 将直接关系到系统中水产品质量安全的保障 此外, 养殖过程中投入大量饲料等物质, 饲料中微量重金属等危害物质易在系统中累积, 危害物质的富集是否会对养殖产品造成质量安全问题是该模式面临的新挑战 Martins 等 (2010) 研究了循环水养殖系统中 3 种不同水循环速率条件 (30 70 和 1500 L/kg feed d) 对养殖尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus) 体内的重金属含量的影响, 发现循环水中重金属含量随换水率的减少而增加, 表明水的循环使用会导致重金属累积 目前, 我国循环水养殖大多采用近海海水和地下水作为养殖水源, 并充分利用地热资源, 降低运行能耗成本 近年来, 随着我国工农业的快速发展, 大量污染物违规排放入海或入地, 养殖用水的安全性受到威胁 目前, 有关循环水养殖模式的研究, 大多集中在养殖系统水处理工艺流程的设计优化 生物滤器载体填料的筛选 系统病害的防控等方面 ( 刘鹰, 2011; 刘鹰等, 2012), 有关该模式养殖产品的安全性问题少有研究 天津市是我国应用工厂化循环水养殖设备与工艺集成力度最大的地区, 本研究以天津地区某大型欧洲鲈鱼 (Dicentrarchus labrax) 循环水养殖系统为研究对象, 在养殖周期的不同时间段采集养殖样品, 进行重金属含量与分布特征分析, 以期评估该养殖产品的安全性, 并获得该循环水养殖系统中重金属在欧洲鲈鱼体内的富集与分布特征, 为封闭循环水养殖模式的优化设计和推广应用提供理论参考 1 材料与方法 1.1 实验设计 研究对象及采样该养殖企业地处天津市滨海新区杨家白镇, 养殖用水为周边盐场卤水与地下井水, 卤水经过沉淀池沉 淀后, 与地下深井淡水勾兑, 调节盐度至 30 左右, 作为养殖系统使用水体 该企业 1 套封闭循环水养殖系统包括 1 套水处理系统和 8 个圆形水泥池, 单个水泥池直径为 6 m, 水深为 1 m, 欧洲鲈鱼养殖密度约为 30 kg/m 3, 养殖废水经过机械过滤器物理过滤 生物滤池生物降解 调温增氧后, 泵送回养殖池循环利用, 日换水率为 50% 本研究选定 1 套养殖系统中的 1 个养殖池为研究对象 ( 单个池子养殖成鱼约 1600 尾 ), 采集该养殖场欧洲鲈鱼生长的 3 个主要阶段的样品 : 幼鱼 ( 养殖 3 个月, 养殖周期为 2015 年 2 5 月 ) 中期( 养殖 6 个月, 养殖周期为 2015 年 2 8 月 ) 和成鱼 ( 养殖 10 个月, 养殖周期为 2015 年 2 12 月 ),3 个阶段每次分别随机采集 6 尾鱼 欧洲鲈鱼各生长阶段鱼体规格见表 1 欧洲鲈鱼幼鱼 养殖中期和成鱼分别取其肌肉 肝脏 鳃进行重金属含量测定 分别采集勾兑使用混合源水 养殖池中水和生物滤器处理出水 3 种水体并进行重金属含量测定 1.2 试剂与仪器 仪器 EG35A Plus 电热板 ( 莱伯泰科有限公司, 中国 ); 全谱型 ICPE-9820 电感耦合等离子发射光谱仪 ( 岛津, 日本 );AFS-830 型原子荧光分光光度计 ( 北京吉天仪器有限公司 ) 标准品与试剂重金属标准溶液购于国家有色金属及电子材料分析测试中心 生物成分分析标准物质购于中国地质科学院地球物理地球化学勘查研究所 试剂 : 硝酸 高氯酸均为分析纯, 购于国药集团化学试剂有限公司 1.3 样品处理水样 : 将获取的进水 池中水和生物滤器出水各水样分别用 0.45 μm 混线滤膜抽滤, 加入 1 ml 65% HNO 3, 置于 20 冰箱保存待测 生物样 : 将捕捞的欧洲鲈鱼样品放入装有冰袋的保温箱中, 尽快送回实验室, 将欧鲈洗净后用陶瓷解剖刀分别取肌肉 肝 鳃组织, 用分散机匀浆后置于 20 条件下贮存备用 生长阶段 Growth stages 表 1 不同养殖阶段欧洲鲈鱼规格 Tab.1 Specifications of D. labrax at three growth stages 样品数体长 BL(cm) 体重 BWH(g) Sample number 范围 Range Mean±SD 范围 Range Mean±SD 幼鱼 Juvenile ± ±1.3 中期 Mid-term ± ±47.5 成鱼 Adult ± ±82.9

88 第 5 期万慧珊等 : 循环水养殖欧洲鲈鱼 (Dicentrarchus labrax) 重金属污染状况与富集分布特征 85 每次分别称取 1.5 g 左右样品放入 50 ml 锥形瓶中, 加入 12.0 ml 65.0% HNO 3 以及 3.00 ml 70.0% HClO 4, 加盖静置过夜 ; 将静置过夜后的溶液放入电热板上消解至澄清透明, 若出现黑色或棕色物质则需再向锥形瓶中加入 65.0% HNO 3 和 70% HClO 4 混合酸, 继续消解, 直至溶液近干并冒出白烟, 溶液呈透明或略带黄色, 冷却后用去离子水少量多次洗入容量瓶并定容至 25.0 ml, 同时作试剂空白, 备用待测 1.4 金属测定称取生物样品进行消解, 随后由电感耦合等离子体发射光谱仪测定 As Cd Cr Cu Ni Pb Zn, 测定方法遵照 食品中铅 砷 铁 钙 锌 铝 钠 镁 硼 锰 铜 钡 钛 锶 锡 镉 铬 钒含量的测定 (DB53T ), 原子荧光法测定 Hg, 测定方法遵照 食品安全国家标准食品中总汞及有机汞的测定 (GB ) 测定过程中制作标准曲线, 根据标准曲线计算得出样本中重金属含量 每份样品测定 3 个平行样, 结果均以湿重计 所测各元素加标回收率为 85% 120%, 样品标准偏差小于 5.00% 1.5 评价方法利用单因子污染指数法, 根据我国食品安全国家标准 - 食品中污染限量 (GB ) (2012), 对本实验中欧洲鲈鱼肌肉中重金属污染状况进行评估 参考鱼体重金属残留污染程度分级, 其中, 污染指数 <0.1 为未污染 ; 为微污染 ; 为轻污染 ; 为中污染 ; 为重污染 ;>1.0 为严重污染 ( 石俊艳等, 1994) 1.6 数据处理及分析欧洲鲈鱼各组织器官重金属在不同生长阶段数据分析采用 Excel 2010 和 SPSS 21.0, 配对 T 检验进行差异分析, 用于判断重金属在欧洲鲈鱼幼鱼 中期和成鱼各生长阶段含量差异, 以及成鱼阶段肌肉 肝脏 和鳃中重金属分布差异,P<0.05 水平表明差异显著 2 结果与分析 2.1 欧洲鲈鱼体内与养殖水体中重金属总体污染状况表 2 为欧洲鲈鱼各组织中重金属检出率和超标率 在所检测的 54 个样本中,Cd 和 Cu 存在超标, 超标率分别为 33.3% 和 22.2%, 其中, 超标样品只存在于肝脏样品中, 肌肉和鳃样本中各元素均未超标 该养殖场欧洲鲈鱼体内重金属含量总体情况良好, 在所检测的肌肉 肝脏和鳃样品中, 肌肉样品重金属检测结果均符合我国食品安全国家标准 - 食品中污染限量 (GB ) (2012) 各阶段养殖进水 池中水和出水中重金属含量范围和限量标准如表 3 所示, 水样中重金属含量水平总体情况良好, 除养殖中期进水中 Pb 和 Cd 出现超标, 其余重金属元素检测结果均符合我国渔业水质标准 (GB ) (1989) 图 1 为本研究中欧洲鲈鱼各生长阶段肌肉中重金属污染指数 结果显示, 各生长阶段重金属污染指数有所不同, 其中, 养殖幼鱼污染指数最高, 为 , 养殖中期和养殖成鱼污染指数分别为 和 , 各生长阶段欧洲鲈鱼均属于未污染 表明该养殖系统中重金属污染在安全范围内, 鱼体属于安全的食用范围, 但仍然需要对系统进行监测管理和维护, 以确保该系统长期安全有效运行 2.2 不同生长阶段欧洲鲈鱼重金属含量变化特征不同生长阶段欧洲鲈鱼肌肉中重金属含量变化特征如图 2 所示 随着养殖过程的进行,As 含量水平逐渐增加, 且相互之间存在显著差异 (P<0.05), 在幼鱼和成鱼阶段, 其含量分别为 1.05 mg/kg, 在养殖阶段, 其含量为 1.93 mg/kg Hg 含量水平逐渐降低, 且相互之间存在显著差异 (P<0.05), 在幼鱼和成鱼阶段, 其含量分别为 mg/kg, 均低于国家食品安全限量标准 (0.5 mg/kg) Cu 与 Hg 含量变化趋 表 2 欧洲鲈鱼各组织中重金属检出率和超标率 (%) Tab.2 The detection rate and the over limit rate of heavy metal in three tissues of D. labrax (%) 项目 Items 金属元素 Metal elements As Cd Cr Cu Ni Pb Zn Hg 肌肉检出率 Detection rate in muscle 肝脏检出率 Detection rate in liver 鳃检出率 Detection rate in gill 超标率 Over standard ratio

89 86 渔业科学进展第 38 卷 Tab.3 表 3 各生长阶段养殖水中重金属含量范围和限量标准 (mg/l) Concentration and limit standards of heavy metals in water at three growth stages (mg/l) 养殖阶段金属元素 Metal elements Growth stages As Cd Cr Cu Ni Pb Zn Hg/10 3 幼鱼 进水 Inflow nd nd nd nd nd nd Juvenile 池中水 Culture nd nd nd nd nd nd 出水 Outflow nd nd nd nd nd nd 中期 进水 Inflow nd nd nd nd Mid-term 池中水 Culture water nd nd nd nd 出水 Outflow nd nd nd nd nd nd 成鱼 进水 Inflow nd nd nd nd nd nd Adult 池中水 Culture water nd nd nd nd nd nd 出水 Outflow nd nd nd nd nd nd 限量标准 Limit standards 注 :nd 为未检出 Note: nd: No detection 图 1 不同生长阶段欧洲鲈鱼重金属污染指数 Fig.1 Heavy metals pollution index of D. labrax at three growth stages 有增长的趋势, 且相互之间存在显著差异 (P<0.05), 在幼鱼阶段其含量达到最大值 (8.98 mg/kg), 养殖中期呈现最小值 (4.59 mg/kg) Cr 和 Pb 在各生长阶段均未检出 不同生长阶段欧洲鲈鱼肝脏中重金属含量变化见图 3 As 和 Cu 含量水平随养殖时间的增加而逐渐增加, 且均在成鱼阶段达到最大值, 分别为 mg/kg 其中,As 含量在幼鱼和养殖中期之间差异显著 (P<0.05), 养殖中期和成鱼间差异不显著 (P>0.05) Cu 在生长 3 个阶段浓度值均存在显著差异 (P<0.05) Cd Cr 和 Zn 含量水平均在养殖中期时达到最大值, 分别为 和 50.8 mg/kg Cr 和 Zn 在生长 3 个阶段含量均存在显著差异 (P<0.05) Cd 含量仅在幼鱼和养殖中期存在显著差异 (P<0.05) Hg 在欧鲈 3 个生长阶段肝脏组织中均未检出 图 2 欧洲鲈鱼不同生长阶段肌肉中重金属含量变化 Fig.2 The variation of heavy metal contents in the muscle of D. labrax at three growth stages 势一致, 含量水平为幼鱼 > 养殖中期 > 成鱼, 但各阶段差异不显著 (P>0.05) Zn 含量水平呈先下降后微 Fig.3 图 3 欧洲鲈鱼 3 个不同生长阶段肝脏中重金属含量变化 The variation of eavy metal contents in the liver of D. labrax at three growth stages

90 第 5 期万慧珊等 : 循环水养殖欧洲鲈鱼 (Dicentrarchus labrax) 重金属污染状况与富集分布特征 87 不同生长阶段欧洲鲈鱼鳃中重金属含量变化见图 4 随着养殖过程的进行,As 含量水平逐渐增加, 在幼鱼和成鱼阶段, 含量分别为 mg/kg, 其中,As 仅在幼鱼和养殖中期存在显著差异 (P<0.05) Cu 和 Zn 含量均在幼鱼阶段含量最高, 分别为 mg/kg, 养殖中期含量水平最低, 分别为 mg/kg, 其中,Cu 和 Zn 各阶段之间差异显著 (P<0.05) Cr 和 Hg 在养殖成鱼阶段含量水平达到最大值, 分别为 mg/kg, 在养殖中期达到最小值, 分别为 mg/kg, 其中,Cr 各阶段相互之间存在显著差异 (P<0.05),Hg 各阶段相互之间无显著差异 (P>0.05) Pb 在各生长阶段均未检出 图 5 欧洲鲈鱼成鱼体内重金属的组织分布特征 Fig.5 Distribution of heavy metals in different tissues of adult D. labrax 同组标有不同字母者表示组间差异显著 (P<0.05) Different superscripts represented significant difference within groups (P<0.05) 3 讨论 3.1 欧洲鲈鱼及养殖水体中重金属污染状况与影响因素 Fig.4 图 4 欧洲鲈鱼 3 个不同生长阶段鳃中重金属含量变化 The variation of heavy metal contents in the gill of D. labrax at three growth stages 2.3 欧洲鲈鱼养殖成鱼体内重金属的组织分布特征 欧洲鲈鱼成鱼阶段不同组织中重金属含量分布见图 5 As 在欧鲈体内的组织分布为肌肉 > 肝脏 > 鳃, 含量最大值为 1.93 mg/kg, 且相互之间存在显著差异 (P<0.05) Cd Cu Zn 的组织分布为肝脏 > 鳃 > 肌肉, 含量水平最大值分别为 mg/kg, 且各元素的组织分布特征差异显著 (P<0.05) Cr 在欧洲鲈鱼体内的累积浓度为鳃 > 肝脏 > 肌肉, 含量水平最大值为 mg/kg, 且相互之间存在显著差异 (P<0.05) Ni 含量水平在各组织间无显著差异 (P>0.05) Pb 只在肌肉中检出, 含量为 mg/kg; Hg 在肝脏中未检出, 在肌肉中含量水平为最大值 (0.005 mg/kg), 肌肉组织和鳃中 Hg 分布呈显著差异 (P<0.05) 本研究中, 养殖欧洲鲈鱼 3 个阶段 3 种组织中均不同程度检测出 As Hg Cd Cr 等重金属元素, 且对肌肉等可食部分按照食品安全国家标准 食品中污染物限量 (GB ) 重金属限量标准值进行评价 结果显示, 该养殖系统中欧洲鲈鱼肌肉中重金属含量未出现超标现象 此外, 养殖欧洲鲈鱼肝脏中 Cd 和 Cu 含量较高, 分别为 mg/kg, 但一般情况下, 消费者仅食用鱼体肌肉部分, 肝脏和鳃作为内脏的一部分, 在前处理时已被丢弃, 因此, 从食用角度考虑, 肝脏中富集的重金属不会对该养殖系统中欧洲鲈鱼食品安全造成较大威胁 对于水生动物而言, 生存环境中存在的各种重金属元素, 无论是否和它们生命代谢有关, 都会在动物体内通过呼吸 摄食等不同途径在组织中积累 (Rainbow, 2007) Lacerda 等 (2006) 发现池塘中 Cu 主要来源于养殖用水, 其次是投入的饲料 肥料和化学药品等 对于循环水养殖系统, 当水源受重金属一定程度污染时, 养殖用水是系统中重金属的主要来源, 并因系统封闭循环的特征, 在养殖动物体内产生较强的富集 (Cheng et al, 2014) 本研究中, 养殖企业的养殖用水为近海盐场卤水和地下井水勾兑而成, 对其勾兑混合用水进行检测, 水体中重金属 Cu Pb Zn 和 Hg 等均有检出, 且养殖中期所用混合源水中 Pb 和 Cd 含量水平超出

91 88 渔业科学进展第 38 卷 渔业水质标准 (GB ) 的限量值 有研究表明, 封闭循环水养殖系统中, 换水率是影响系统水体重金属含量的因素之一, 随系统换水率降低, 水体重金属含量呈现上升趋势 但研究同时表明, 在对系统中罗非鱼 大菱鲆 (Psetta maxima) 等鱼体重金属进行检测时, 发现换水率的变化未成为影响鱼体重金属分布的主要因素 (Calvi et al, 2006; Deviller et al, 2005; Bussel et al, 2014; Martins et al, 2011) 但养殖鱼体重金属分布特征还会因养殖品种不同而有所不同 ( 陆维亚等, 2016), 本实验所测样本为欧洲鲈鱼, 与上述研究中研究对象有所不同, 研究结果也有所差异 本研究中, 该养殖企业循环水系统水体中 As Cr 和 Ni 均未检出, 且实际生产换水率高达 50.0%, 然而, 在检测的肌肉样品中,As 含量处于较高水平 同时, 在所检测水体中出现超标的 Pb 在欧洲鲈鱼体内并未检出, 而 Cd 在水体中出现超标的现象, 同时在欧洲鲈鱼肝脏中含量水平较高, 这说明在该循环水养殖系统中, 水源与欧洲鲈鱼体内重金属累积有关但并不是唯一因素 有研究表明,As 暴露会对人体皮肤造成损害, 严重时会引起皮肤癌 肺癌等,Cd 通过呼吸和饮食进入人体, 富集在体内的 Cd 对人体的内脏 骨骼以及生殖器官具有较强的损伤, 长期 Cd 暴露易患肺癌 骨痛病及神经衰弱等,Pb 对人体多个系统和器官组织具有毒性效应, 可引起神经系统紊乱 免疫力下降 血铅中毒 ( 陈保卫等, 2009; 杜丽娜等, 2013; 韩艳春等, 2009) 因此, 加强控制源水中重金属含量水平, 提高循环水养殖系统运行效率, 切实保障水产品质量安全对循环水养殖系统的良性发展至关重要 对于养殖动物而言, 重金属离子分为营养类和非营养类,Cu 和 Zn 等营养元素比 As Hg 等非营养元素更易被机体吸收, 且不同重金属之间存在协同和竞争作用, 某些金属元素会共用一个离子通道, 当环境中多种离子相互作用时, 其在生物体内的富集会产生竞争效应, 影响吸收 ( 王明华等, 2005) 被测的 8 种重金属元素中, 除 Cd Cu 外,Zn 富集能力相对较高, 但 Pb 在欧洲鲈鱼体内基本无富集, 说明欧洲鲈鱼对某些重金属元素的富集具有选择性 循环水养殖系统中重金属的污染富集, 还与养殖系统的水处理工艺流程 系统的运行管理 养殖品种和投入品质量等诸多因素相关, 如何减少危害物质的富集以及是否对养殖产品造成质量安全问题还需要更多深入的 研究探索 3.2 欧洲鲈鱼不同生长阶段重金属分布规律本研究循环水养殖系统中, 养殖水体再利用率可达 50%, 水中未被去除的重金属离子伴随着欧洲鲈鱼的生长发育在鱼体内不断累积, 且不同元素在欧洲鲈鱼不同生长阶段分布规律有所不同 郭建林 (2007) 1) 研究表明,Zn 作为鱼类生长的必需元素, 是鱼体内某些酶的组分或活化剂, 同时具有促进鱼类蛋白质代谢 骨骼发育等功能 闫海鱼等 (2008) 研究认为, 鱼体在体长迅速增加的阶段其体内重金属富集速率也加快, 随着体重的快速增加, 重金属在体内被稀释, 浓度呈现下降趋势, 该结论与本研究结果一致 对于有害重金属元素, 生物体在环境中重金属暴露胁迫刺激下, 可以诱导产生金属硫蛋白 (Metallothionein, MT), 通过 MT 与重金属的结合, 将重金属排除体外, 呈现体内重金属释放的现象 ( 吴坚, 1991; Roesijadi, 1994; 蔡立哲等, 1999; 陈海刚等, 2008) 本研究中, 随着养殖过程的进行,Cr Cd 和 Hg 含量均出现降低, 可能与此生理代谢过程有关, 但各元素在 3 个生长阶段之间含量并无显著差异 (P>0.05) Cd 含量在养殖中期进水和池中水中均高于成鱼阶段, 这与成鱼阶段肝脏中 Cd 含量出现降低的情况一致 可能由于 Cd 未能及时随循环系统排出, 滞留在养殖池中造成鱼体中 Cd 累积 Hg 在养殖中期水体中含量较高, 该结果与欧洲鲈鱼肌肉中 Hg 含量分布规律一致 在循环水养殖系统中, 水体中重金属含量的本底值以及去除率可能会影响该系统中欧洲鲈鱼对重金属的分布规律, 具体还有待深入研究 3.3 欧洲鲈鱼养殖成鱼不同组织重金属分布规律对于水生生物来说, 重金属的吸收途径主要有三种 ( 王明华等, 2005): 一是通过表皮和鳃直接从周围水环境中摄入, 二是从食物链中通过摄食 ( 包括饵料和颗粒物等 ) 富集, 三是通过以上两种方法共同作用形成重金属积累 本研究中, 重金属在欧洲鲈鱼各组织器官中存在显著差异 (P<0.05), 其中, 肝脏对重金属呈现出高含量水平,Cd 在肝脏中含量水平为鳃的 21.2 倍 ;Cu 在肝脏中含量水平分别是肌肉和鳃的 和 倍 ; 肝脏中 Fe 含量水平分别是肌肉和鳃的 36.0 和 2.6 倍, 肝脏中 Zn 含量水平是肌肉的 Guo JL. Effects of Fe, Cu, Mn, Zn on growth, physiological function, content of trace elements in organs of Carassius auratus Gibelio. Master s Thesis of Soochow University, 2007, [ 郭建林. Fe Cu Mn Zn 对异育银鲫生长 生理机能及器官微量元素含量的影响. 苏州大学硕士研究生学位论文, 2007, 19 24]

92 第 5 期万慧珊等 : 循环水养殖欧洲鲈鱼 (Dicentrarchus labrax) 重金属污染状况与富集分布特征 89 倍, 是鳃的 2.9 倍 饵料中重金属累积会影响暴露在该环境下的鱼类重金属吸附情况 (Wang et al, a b) 针对饵料对该循环水养殖系统中欧洲鲈鱼体内重金属累积的影响, 还有待进一步探究 Hook 等 (2001) 研究表明, 一般情况下, 通过水相吸收的重金属离子会留在表皮组织或外骨骼中, 存在于鱼体内脏等软组织中的重金属多是由鱼体摄食吸收而来 本研究中, 幼鱼阶段水体中 Cu 和 Zn 含量相对较高, 暴露在这一环境中的幼鱼易受其影响, 造成皮肤和鳃中 Cu 和 Zn 的富集, 该结果与上述结论一致 此外, 当重金属离子进入体内后, 由肝脏进行解毒, 一部分重金属在此被降解, 还有一小部分随排泄物排出体外, 当鱼体内脏重金属浓度过高时, 会发生重金属向肌肉扩散的现象 (Sanders et al, 1998) 本研究所发现的 As 在鲈鱼不同组织中分布规律与鲫鱼 (Carassius auratus) 和菲律宾蛤仔 (Ruditapes philippinarum) 基本一致 ( 罗国钧, 2000; 姜会超等, 2014) 有研究表明, 鱼体对重金属的累积作用受生活环境和重金属种类等因素的影响 ( 曾乐意, 2012) 1) 本研究中, 欧洲鲈鱼暴露在含有重金属的水体中造成体内重金属累积, 但不同重金属元素在鱼体内分布情况不同,Cd Cu 主要分布在肝脏中, 而 As Hg 主要分布在肌肉中 对于 Cu 而言, 仅在养殖初期水体中检出, 但在欧洲鲈鱼各阶段肌肉 肝脏和鳃中均有检出, 其中, 肝脏组织中 Cu 含量出现较高值 该结果与 Cinier(1999) 的研究结果一致 4 结论 As Cd Cr Cu Ni Pb Zn 和 Hg 共 8 种重金属在该封闭循环水养殖系统欧洲鲈鱼肌肉 肝脏和鳃中部分或全部有检出, 其中, 肌肉中各元素含量均在食品安全国家标准 食品中污染物限量 (GB ) 范围以内, 水体样本除养殖中期进水中 Pb 和 Cd 出现超标, 其余重金属检测结果均在我国渔业水质标准 (GB ) 限量标准内, 重金属污染指数结果显示, 各生长阶段欧洲鲈鱼均属于未污染 除 Ni 外, 其余 7 种重金属在欧洲鲈鱼体内存在显著组织分布特征 :As 含量水平为肌肉 > 肝脏 > 鳃, Cd Cu 和 Zn 含量水平为肝脏 > 鳃 > 肌肉,Hg 含量水平为肌肉 > 鳃 > 肝脏,Cr 含量水平为鳃 > 肝脏 > 肌肉 随着养殖过程推进, 不同重金属元素在欧洲鲈鱼 体内不同组织富集规律不同, 对于肌肉组织, 总 As 含量随时间增加而增加, 而 Cu 和 Hg 则相反 ; 在肝脏中 As Cd 和 Cu 含量均随时间增加而增加, 但在鳃中,As 含量随时间增加而增加, 而 Cr Cu Zn 和 Hg 含量呈现先下降后上升的趋势 参考文献 Bussel CGJ, Schroeder JP, Mahlmann L, et al. Aquatic accumulation of dietary metals (Fe, Zn, Cu, Co, Mn) in recirculating aquaculture systems (RAS) changes body composition but not performance and health of juvenile turbot (Psetta maxima). Aquacultural Engineering, 2014, 61(4): Cai LZ, Hong HS, Hong LY. Accumulation of zinc and lead in Ruditapes philippinarum and its tolerance. Acta Scientiae Circumstantiae, 1999, 19(3): [ 蔡立哲, 洪华生, 洪丽玉. 菲律宾蛤仔对锌 铅的积累特征. 环境科学学报, 1999, 19(3): ] Calvi AM, Allinson G, Jones P, et al. Trace metal concentrations in wild and cultured Australian short-finned eel (Anguilla australis Richardson). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2006, 77(4): Chen BW, Naramandura H, Lu ML, et al. Metabolism, toxicity, and biomonitoring of arsenic species. Progress in Chemistry, 2009, 21(2 3): [ 陈保卫, 那仁满都拉, 吕美玲, 等. 砷的代谢机制 毒性和生物监测. 化学进展, 2009, 21(2 3): ] Chen HG, Jia XP, Lin Q, et al. Accumulation and release characteristics of heavy metals in Crassostrea rivalaris under mixed exposure. Chinese Journal of Applied Ecology, 2008, 19(4): [ 陈海刚, 贾晓平, 林钦, 等. 混合暴露条件下近江牡蛎对重金属的积累与释放特征. 应用生态学报, 2008, 19(4): ] Cheng B, Liu Y, Yang HS, et al. Effect of copper on the growth of shrimps Litopenaeus vannamei: Water parameters and copper budget in a recirculating system. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 2014, 32(5): Cinier CDC, Petit-Ramel M, Faure R, et al. Kinetics of cadmium accumulation and elimination in carp Cyprinus carpio, tissues. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology, 1999, 122(3): Deviller G, Palluel O, Aliaume C, et al. Impact assessment of various rearing systems on fish health using multibiomarker response and metal accumulation. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2005, 61(1): Zeng LY. The contents of heavy metals in several fish species from upstream of the Yangtze River and ecophysiological effects of the dietary lead (Pb) on Spinibarbus sinensis. Master s Thesis of Southwest University, 2012:14 17 [ 曾乐意. 长江上 游几种鱼类重金属含量及饲料铅对中华倒刺鲃的生理生态学影响. 西南大学硕士研究生学位论文, 2012:14 17]

93 90 渔业科学进展第 38 卷 Du LN, Yu RZ, Wang HY, et al. Pollution and toxicity of cadmium: A review of recent studies. Journal of Environment and Health, 2013, 30(2): [ 杜丽娜, 余若祯, 王海燕, 等. 重金属镉污染及其毒性研究进展. 环境与健康杂志, 2013, 30(2): ] Han YC, Sinayil A. Progress in clinical and experimental researches of children lead poisoning. Journal of Environment and Health, 2009, 26(8): [ 韩艳春, 阿依吐伦 斯马义. 儿童铅毒性临床和实验研究进展. 环境与健康杂志, 2009, 26(8): ] Hook SE, Fisher NS. Reproductive toxicity of metals in calanoid copepods. Marine Biology, 2001, 138(138): Huang B, Ma T, Liu BL, et al. Effects of ozone concentration on the activity of biofilm and its effectiveness of purification in recirculating aquaculture systems. Progress in Fishery Sciences, 2016, 37(3): [ 黄滨, 马腾, 刘宝良, 等. 不同浓度臭氧对循环水养殖系统生物膜活性及其净化效能的影响. 渔业科学进展, 2016, 37(3): ] Jiang HC, Liu AY, Song XK, et al. The characteristics of heavy metal accumulation and release in Ruditapes philippinarum tissues and organs during the exposure of mixed heavy metals. Process in Fishery Sciences, 2014, 35(3): [ 姜会超, 刘爱英, 宋秀凯, 等. 混合暴露条件下菲律宾蛤仔不同组织对几种重金属的富集与释放特征. 渔业科学进展, 2014, 35(3): 82 90] Lacerda LD, Santos JA, Madrid RM. Copper emission factors from intensive shrimp aquaculture. Marine Pollution Bulletin, 2006, 52(12): Liu Y, Liu BL. Opportunities and challenges for marine industrialized aquaculture in China. Fishery Modernization, 2012, 39(6): 1 4, 9 [ 刘鹰, 刘宝良. 我国海水工业化养殖面临的机遇和挑战. 渔业现代化, 2012, 39(6): 1 4, 9] Liu Y, Song XF, Lei JL, et al. Biofiltration of cyclo-bio fluidized sand bed in recirculating aquaculture system. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering, 2015, 31(3): [ 柳瑶, 宋协法, 雷霁霖, 等. 循环水养殖旋转式生物流化床生物过滤功能. 农业工程学报, 2015, 31(3): ] Liu Y. Research progress on marine industrial recirculating aquaculture technology. Journal of Agricultural Science and Technology, 2011, 13(5): [ 刘鹰. 海水工业化循环水养殖技术研究进展. 中国农业科技导报, 2011, 13(5): 50 53] Lu WY, Li J, Xue MM, et al. Accumulation and migration regularity of heavy metals in plankton and Aristichthys nobilis. Food and Machinery, 2016, 32(3): [ 陆维亚, 李节, 薛敏敏, 等. 重金属在浮游生物与鳙鱼中的蓄积和迁移规律. 食品与机械, 2016, 32(3): ] Luo GJ. Research into the distributive and accumulative rules about heavy metals in the Crucian Carp s body. Journal of Yuzhou University, 2000, 17(1): [ 罗国钧. 鲫鱼体内重金属的分布和积累规律研究. 渝州大学学报 ( 自然科学版 ), 2000, 17(1): 56 61] Martins CIM, Eding EH, Verreth JAJ. The effect of recirculating aquaculture systems on the concentrations of heavy metals in culture water and tissues of Nile tilapia Oreochromis niloticus. Food Chemistry, 2011, 126(3): Martins CIM, Eding EH, Verdegem MCJ, et al. New developments in recirculating aquaculture systems in Europe: A perspective on environmental sustainability. Aquacultural Engineering, 2010, 43(3): Ministry of Health of PRC. National food safety standard-maximum levels of contaminants in foods (GB ). Beijing: China Standards Press, 2012 [ 中华人民共和国卫生部. 食品安全国家标准 - 食品中污染限量 (GB ). 北京 : 中国标准出版社, 2012] National Environmental Protection Agency. GB Water quality standard for fisheries. Beijing: China Standards Press, 1989 [ 国家环境保护局. GB 渔业水质标准. 北京 : 中国标准出版社, 1989] Rainbow PS. Trace metal bioaccumulation: Models, metabolic availability and toxicity. Environment International, 2007, 33(4): Ren AJ, Yang ZY, Dai YJ, et al. Research on aquatic product demand forecasting in China. Journal of Shanghai Ocean University, 2012, 21(1): [ 任爱景, 杨正勇, 戴亚娟, 等. 我国水产品需求预测研究. 上海海洋大学学报, 2012, 21(1): ] Roesijadi G. Behavior of metallothionein-bound metals in a natural population of an estuarine Mollusca. Marine Environmental Research, 1994, 38(4): Sanders JG, Riedel GF. Metal metabolism in aquatic environments. London: Chapman and Hall, 1998: Shi JY, Yu WJ, Liu Z, et al. Investigation on residual pollutant of fishes in Yalu River. Freshwater Fisheries, 1994, 24(3): 8 10 [ 石俊艳, 于伟君, 刘中, 等. 鸭绿江等河流鱼体残毒调查报告. 淡水渔业, 1994, 24(3): 8 10] Wang MH, Wang GZ, Li SJ. Assimilation and metabolism of heavy metals in marine crustacean. Fujian Journal of Agricultural sciences, 2005, 20(B12): [ 王明华, 王桂忠, 李少菁. 重金属在海洋甲壳动物中的吸收和代谢. 福建农业学报, 2005, 20(B12): 51 56] Wang WX, Dei RCH, Xu Y. Responses of Zn assimilation by coastal plankton to macronutrients. Limnology and Oceanography, 2001a, 46(6): Wang WX, Dei RCH. Biological uptake and assimilation of iron by marine plankton: Influences of macronutrients. Marine Chemistry, 2001b, 74(2/3): Wang WX, Lee BG, Reinfelder JR, et al. Assimilation and regeneration of trace elements by marine copepods. Limnology and Oceanography, 1996, 41(1): Wu J. Biochemical effects of trace elements to marine organism. Marine Environmental Science, 1991, 10(2): [ 吴坚. 微量金属对海洋生物的生物化学效应. 海洋环境科学, 1991, 10(2): 58 64]

94 第 5 期万慧珊等 : 循环水养殖欧洲鲈鱼 (Dicentrarchus labrax) 重金属污染状况与富集分布特征 91 Yan HY, Feng XB, Liu T, et al. Present situation of fish mercury pollution in heavily mercury-contaminated Baihua reservoir in Guizhou. Chinese Journal of Ecology, 2008, 27(8): [ 闫海鱼, 冯新斌, 刘霆, 等. 贵州百花湖鱼体汞污染现状. 生态学杂志, 2008, 27(8): ] Zhu JX, Liu H, Xu Y, et al. Dual-culture techniques for the rapid start-up of recirculating aquaculture system. Process in Fishery Sciences, 2014, 35(4): [ 朱建新, 刘慧, 徐勇, 等. 循环水养殖系统生物滤器负荷挂膜技术. 渔业科学进展, 2014, 35(4): ] ( 编辑冯小花 ) Contamination and Accumulation of Heavy Metals in Dicentrarchus labrax Cultured in Recirculating Aquatic Systems WAN Huishan 1,2, CHENG Bo 21, SONG Xiaohong 3, LI Le 2, SONG Yi 2 (1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai ; 2. Quality and Standard Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Beijing ; 3. Shimadzu (China) Co., Ltd., Beijing ) Abstract Aquaculture provides human beings with steady sources of high-quality proteins and has been an ever-growing industry thanks to the recirculating aquatic system (RAS). RAS allows aquaculture to be less dependent on natural resources. However, RAS is prone to the accumulation of hazardous substances such as flocculation, non-ionic ammonia and heavy metals, so the safety of produces raised in RAS needs to be carefully evaluated. In this study, we analyzed the safety and the distribution of eight heavy metals in Dicentrarchus labrax cultured in a closed RAS in Tianjin. The contents of arsenic, cadmium, chromium, copper, nickel, lead and zinc were measured with Inductively Coupled Plasma (ICP), and the level of mercury was measured with Atomic Fluorescence (AFS) during the three growth stages including juvenile, mid-term and adult. It was found that the distribution of heavy metals varied at different growth stages. In the muscle, the content of arsenic increased over time with the maximum value of 1.93 mg/kg. The contents of copper and mercury changed in an opposite pattern and the maximum values were mg/kg and mg/kg respectively. In the liver, the contents of arsenic, cadmium and copper increased over time with the maximum value of 1.47 mg/kg, 1.09 mg/kg and mg/kg respectively. In the gill, the content of arsenic increased over time with the maximum value of mg/kg. The contents of chromium, copper, arsenic and mercury first rose and then dropped, and the maximum values were mg/kg, 45.8 mg/kg, 19.2 mg/kg and mg/kg respectively. The distribution of arsenic in different tissues followed the order of muscle>liver>gill; the distribution of cadmium, copper and zinc followed the order of liver>gill>muscle; mercury followed the order of muscle>liver>gill; and chromium followed the order of gill>liver>muscle. In general, the contents of all elements in the muscle complied with the national food safety standard (GB ). All the samples were unpolluted according to the grading of heavy metal residues in fishes. Contents of all heavy metal elements were under the limits of the water quality standard for fisheries (GB ) except for Pb and Cd. In conclusion, the heavy metal contents in the tested RAS were in a safe range. Key words Recirculating aquatic systems (RAS); Dicentrarchus labrax; Heavy metals; Contamination; Distribution; Enrichment 1 Corresponding author: CHENG Bo, chengbocafs@163.com

95 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 光照对不同规格番红砗磲 (Tridacna crocea) * 氧 氨氮及活性磷酸盐代谢的影响 1 刘小霞李乐郑兴顾志峰 1 刘春胜 ( 海南大学海洋学院热带生物资源教育部重点实验室海口 ) 摘要在水温 下, 采用室内实验生态学方法, 研究了 5000 lx 光照强度和黑暗对壳长为 (63.53±1.22) mm (S 组 ) (75.87±1.50) mm (M 组 ) 和 (92.75±3.02) mm (L 组 ) 番红砗磲 (Tridacna crocea) 氧 氨氮及活性磷酸盐代谢的影响 结果显示, 光照条件下, 番红砗磲释放氧气, 吸收氨氮和活性磷酸盐 黑暗条件下, 番红砗磲代谢状况与其他双壳贝类类似 番红砗磲个体代谢率与规格密切相关 : 光照条件下个体越大, 产氧率 对氨氮和活性磷酸盐吸收率越高 ; 黑暗条件下, 个体越大, 耗氧率 对氨氮和活性磷酸盐释放率亦越高 光照条件下, 番红砗磲软体部单位干重代谢率与其个体规格呈负相关, 个体越大, 单位干重的产氧率 氨氮和活性磷酸盐的吸收率越小 实验首次量化了不同光照条件下番红砗磲对氧 氨氮及活性磷酸盐的吸收和排泄状况, 结果可为研究番红砗磲在珊瑚礁生态系统中的作用提供依据, 对砗磲人工养殖也具有一定的参考 关键词番红砗磲 ; 光照 ; 规格 ; 代谢中图分类号 S966 文献标识码 A 文章编号 (2017) 番红砗磲 (Tridacna crocea) 隶属于软体动物门 (Mollusca) 双壳纲(Bivalvia) 帘蛤目(Veneroida) 砗磲科 (Tridacnidae) 砗磲属(Tridacna), 分布于从西太平洋到印度洋非洲东海岸的热带海域, 在我国主要分布在南海热带海域 ( 罗伟, 1991) 砗磲个体巨大, 向上直立生长于珊瑚礁中, 是珊瑚礁生态系统的重要生物 砗磲肉味道鲜美 营养丰富, 具有一定的药用价值 ( 陈国英等, 2008), 是一种名贵的经济贝类 (Green et al, 1999; Han et al, 2008), 其贝壳作为 佛教七宝 之首, 具有极高的收藏价值 此外, 番红砗磲的外套膜鲜艳, 也是水族市场的新宠 砗磲区别于其他双壳贝类的最主要特征是具有鲜艳的外套膜和共生虫黄藻 (Symbiodinium sp.) 系统 砗磲生长所需营养来源于外套膜管状系统内共生虫 黄藻的光合作用和鳃的滤食性摄食两部分, 前者所占营养比例随砗磲生长而增加 如壳长为 1.7 cm 的大砗磲 (T. gigas) 光合作用所占营养比例为 35%, 壳长为 13.7 cm 时则增至 66% 以上 (Klumpp et al, 1992; Norton et al, 1992) 虫黄藻不仅赋予砗磲鲜艳的颜色, 更重要的是为砗磲生长提供营养 砗磲外套膜色素细胞内部聚集的色素片晶可吸收波长为 400 nm 左右的蓝紫可见光, 以实现共生虫黄藻光合作用 (Griffiths et al, 1994) 相关研究表明, 虫黄藻可以吸收二氧化碳 活性磷酸盐 硝酸盐等, 将其转化为砗磲所需的有机营养 (Fitt, 1993; Klumpp et al, 1994) 国内外对砗磲研究主要针对砗磲的形态结构 生态习性 人工繁育 个体发育及环境相关性等 ( 罗伟, 1991; 何勇等, 2000; 李晓梅等, 2010; 晏宏等, 2011; * 国际科技合作专项 (2012DFG32200;2013DFA31780) 国家科技支撑计划(2012BAC18B04) 和海南省自然科学基金 (317029) 共同资助 [This work was supported by the International S&T Cooperation Program of China (2012DFG32200, and 2013DFA31780), National Science & Technology Pillar Program (2012BAC18B04), and the Natural Science Foundation of Hainan Province (317029)]. 刘小霞, @qq.com 1 通讯作者 : 顾志峰, 教授, hnugu@163.com; 刘春胜, 讲师, lcs5113@163.com 收稿日期 : , 收修改稿日期 :

96 第 5 期刘小霞等 : 光照对不同规格番红砗磲 (Tridacna crocea) 氧 氨氮及活性磷酸盐代谢的影响 93 邵达等, 2012; 李育培等, 2015) 在砗磲代谢研究方面, 仅 Klumpp 等 ( ) 开展了以总氮代谢为指标的大砗磲滤食性摄食和光合作用对生长的营养贡献比例变化的研究 本实验采用室内实验生态学方法研究了黑暗和光照条件下番红砗磲的氧 氨氮及活性磷酸盐生理代谢变化, 旨在量化番红砗磲对氧 氨氮及活性磷酸盐的吸收和排泄状况, 为我国砗磲资源的保护和开发提供参考 1 材料与方法 1.1 材料实验用番红砗磲 ( 图 1) 来自南海西沙赵述岛 实验前, 先将番红砗磲外壳洗净, 于水族缸中暂养 7 d 挑选大小不同 活力好 健康的个体, 测定其生物学性状 实验用海水为经沉淀 砂滤的新鲜天然海水,pH 为 , 盐度为 32 34, 水温为 方法实验采用静水系统, 在 15 L 的塑料圆桶中进行, 每个桶中放 6 L 抽滤海水, 用保鲜膜在水体表面封口, 膜中央开一小口, 插入一根长 40 cm 左右的塑料吸管 ( 直径为 1 cm), 用于采集水样 黑暗实验分成 4 组, 其中第 1 组为对照 ( 无番红砗磲 ), 其余 3 组按番红砗磲规格分成小规格组 (S 组 ) 中规格组 (M 组 ) 大规格组(L 组 ), 具体参数见表 1 实验组每组 9 个番红砗磲, 随机平均放置于 3 个塑料圆桶中 实验持续 6 h, 每 1 h 取水样 1 次 (75 ml), 测定溶解氧 氨氮 活性磷酸盐等, 所有水样均在 3 5 h 内测完 黑暗组实验桶采用黑色保鲜膜覆盖水体表面, 同时用黑色呢绒幕布遮盖, 以保证整个实验过程为无光环境 光照实验 : 待黑暗实验结束后, 番红砗磲放回水族缸中暂养 48 h 后, 进行光照实验 实验过程中, 所用光源为 LED 灯, 光照强度为 5000 lx, 采用白色透明保鲜膜覆盖水体表面 其他处理与黑暗实验相同 1.3 溶解氧 氨氮 活性磷酸盐的测定方法水质指标的检测依照 海洋监测规范 (GB ): 溶解氧采用 Winkler 碘量法测定, 氨氮采用次溴酸钠氧化法测定, 活性磷酸盐采用抗坏血酸还原磷钼蓝法测定 ph 盐度和温度采用 YSI-6600V2 型多参数水质监测仪测定 1.4 计算方法根据实验过程中桶内水中的溶解氧 氨氮和活性磷酸盐的质量浓度, 计算以下参数 : Tab.1 图 1 番红砗磲 Fig.1 Giant clam T. crocea A. 正面 ;B. 侧面 A. Front view; B. Lateral view 表 1 番红砗磲的生物学数据 Biological data of giant clam T. crocea 生物学特征 番红砗磲分组 T. crocea groups Biological characteristics 小规格 S 中规格 M 大规格 L 壳长 Shell length (mm) 63.53± ± ±3.02 壳宽 Shell width (mm) 45.23± ± ±5.57 壳高 Shell height (mm) 50.11± ± ±3.97 湿重 Wet body weight (g) 64.67± ± ±17.36 软体部干重 Soft tissue dry weight (g) 1.26± ± ±0.38

97 94 渔业科学进展第 38 卷 OR=[(A t A 0 ΔA) V]/(N t); OR =[(A t A 0 ΔA) V]/(W t); NR=[(B t B 0 ΔB) V]/(N t); NR =[(B t B 0 ΔB) V]/(W t); PR=[(C t C 0 ΔC) V]/(N t); PR =[(C t C 0 ΔC) V]/(W t) 式中,OR 为个体耗氧率 [mg/(ind h)];or 为软体部单位干重耗氧率 [mg/(dw h)];nr 为个体排氨率 [mg/(ind h)];nr 为软体部单位干重排氨率 [mg/(dw h)]; PR 为个体对活性磷酸盐的排出率 [mg/(ind h)];pr 为软体部单位干重对活性磷酸盐的排出率 [mg/(dw h)]; A 0 A t 为实验开始和实验持续时间为 t 时水体溶解氧含量 (mg/l);b 0 B t 为实验开始和实验持续时间为 t 时水体氨氮含量 (mg/l);c 0 C t 为实验开始和实验持续时间为 t 时水体活性磷酸盐含量 (mg/l);t 为实验持续时间 ;Δ 值为对照组中溶解氧 氨氮和活性磷酸盐的变化值 ;V 为桶中海水体积 (L);N 为番红砗磲的个数 (ind);w 为番红砗磲软体部干重 (g) 1.5 数据处理与分析所得数据为 3 个平行组数据的平均值 ± 标准差 (Mean±SD), 使用 Excel 和 SPSS 17.0 软件处理数据, 用单因素方差分析方法 (One-way ANOVA) 分析, 显著性水平为 结果与分析 2.1 溶氧变化黑暗条件下, 水中溶解氧的变化情况见图 2-A 与对照组相比, 各实验组溶解氧含量均呈下降趋势, 即该条件下番红砗磲消耗氧气 不同规格的番红砗磲个体对溶解氧的消耗率不同, 规格越大, 其耗氧率亦越高 (L 组 >M 组 >S 组 ) S 组 M 组 L 组番红砗磲个体的耗氧率分别为 (0.53±0.06) (0.70±0.03) (0.80±0.09) mg/(ind h) ( 图 3-A) 数据统计表明,S 组与其他 2 组均具有显著差异 (P<0.05),M 组与 L 组没有显著差异 光照条件下, 水中溶解氧的变化情况见图 2-B Fig.2 图 2 不同光照条件下溶解氧变化 The change in the level of dissolved oxygen under different illumination conditions A: 黑暗 ;B: 光照 A: Dark; B: Light Fig.3 图 3 不同光照条件下番红砗磲个体氧代谢率 The metabolic rate of oxygen of individual giant clam T. crocea under different illumination conditions A: 黑暗 ;B: 光照 A: Dark; B: Light

98 第 5 期刘小霞等 : 光照对不同规格番红砗磲 (Tridacna crocea) 氧 氨氮及活性磷酸盐代谢的影响 95 与对照组相比, 各实验组溶解氧均呈升高趋势, 即该条件下番红砗磲释放氧气 不同规格的番红砗磲个体产氧率不同, 规格越大产氧率越高 (L 组 >M 组 >S 组 ) S M L 组番红砗磲个体产氧率分别为 (1.57± 0.17) (1.97±0.22) (2.70±0.30) mg/(ind h) ( 图 3-B), 数据统计表明, 各组之间均有显著差异 (P<0.05) 2.2 氨氮变化在黑暗条件下, 水中氨氮的变化情况见图 4-A 相对于对照组, 各实验组海水中氨氮浓度均升高, 即各实验组中的番红砗磲均排氨, 但排氨的效果不同, 规格越大, 其排氨率亦越高 (L 组 >M 组 >S 组 ) S 组 M 组 L 组中番红砗磲个体排氨率分别为 (0.0145± ) (0.0161±0.0023) (0.0186±0.0027) mg/(ind h) ( 图 5-A) 数据统计分析表明,S 组与 M 组无显著差异,L 组与 S 和 M 组均有显著差异 (P<0.05) 在光照条件下, 各实验组水中的氨氮含量变化基本一致, 均呈现一定的波动 ( 图 4-B), 可能与番红砗磲内收缩运动的频率有关 同时, 番红砗磲的规格越大, 水中的氨氮含量也相对较高, 即番红砗磲规格越大, 其个体排氨率亦越高 (L 组 >M 组 >S 组 ) 数据统计分析表明, 光照和黑暗条件下, 番红砗磲 S 组与 M 组均无显著差异, 而与 L 组具有显著差异 (P<0.05) ( 图 5-B) 2.3 活性磷酸盐变化在黑暗条件下, 水中活性磷酸盐的变化如图 6-A 所示, 对照组和各实验组随实验时长均上下波动, 且变化基本一致 统计数据分析表明, 各组间活性磷酸盐的排出率无显著差异 ( 图 7-A) 在光照条件下, 水中活性磷酸盐的浓度变化见图 6-B 与对照组相比, 各实验组水中活性磷酸盐浓度降低, 即各实验组中的番红砗磲吸收活性磷酸盐, 但不同规格番红砗磲个体对活性磷酸盐的吸收率不同 : 规格越大, 对活性磷酸盐的吸收率越高 (L 组 >M 组 >S 组 ) S 组 M 组 L 组中番红砗磲个体对活性磷酸盐的吸收率分别为 (0.0039±0.0005) (0.0050±0.0006) (0.0066±0.0008) mg/(ind h), 各组之间均有显著差异 (P<0.05) ( 图 7-B) Fig.4 图 4 不同光照条件下氨氮浓度变化 The change in ammonia nitrogen concentration of giant clam T. crocea under different illumination conditions A: 黑暗 ;B: 光照 A: Dark; B: Light Fig.5 图 5 不同光照条件下番红砗磲个体氨氮代谢率 The metabolic rate of ammonia nitrogen of individual giant clam T. crocea under different illumination conditions A: 黑暗 ;B: 光照 A: Dark; B: Light

99 96 渔业科学进展第 38 卷 Fig.6 图 6 不同光照条件下活性活性磷酸盐变化 The changes in active phosphate concentration under different illumination conditions A: 黑暗 ;B: 光照 A: Dark; B: Light Fig.7 图 7 不同光照条件下番红砗磲个体活性磷酸盐代谢率 The metabolic rate of active phosphate of individual giant clam T. crocea under different illumination conditions A: 黑暗 ;B: 光照 A: Dark; B: Light 2.4 光照条件下番红砗磲共生虫黄藻的代谢光照条件下, 砗磲能量收支为砗磲与虫黄藻消耗氧并释放氨氮和活性磷酸盐的异养代谢, 与虫黄藻光合作用产生氧并吸收氨氮和活性磷酸盐的自养代谢的总和 基于上述条件, 同时假设黑暗与光照条件下番红砗磲与虫黄藻异养代谢相同, 作者得出光照条件下番红砗磲共生虫黄藻的产氧率 氨氮吸收率和活性磷酸盐吸收率分别为 : 产氧率 = 黑暗条件下番红砗磲耗氧率 + 光照条件下番红砗磲产氧率 ; 氨氮吸收率 = 黑暗条件下番红砗磲的排氨率 光照条件下番红砗磲的排氨率 ; 活性磷酸盐吸收率 = 黑暗条件下番红砗磲对活性磷酸盐的排出率 + 光照条件下番红砗磲对活性磷酸盐的吸收率 如图 8 所示, 光照条件下个体越大, 番红砗磲个体共生虫黄藻产氧率 氨氮和活性磷酸盐吸收率越高 Fig.8 图 8 光照条件下番红砗磲个体共生虫黄藻的代谢率 The metabolic rate of symbiotic zooxanthellae of individual giant clam T. crocea under illumination conditions

100 第 5 期刘小霞等 : 光照对不同规格番红砗磲 (Tridacna crocea) 氧 氨氮及活性磷酸盐代谢的影响 97 (L 组 >M 组 >S 组 ),S 组 M 组 L 组中番红砗磲个体共生虫黄藻产氧率分别为 (2.10±0.23) (2.67±0.30) (3.50±0.39) mg/(ind h), 各组之间都具有显著差异 (P<0.05) 而光照条件下, 番红砗磲个体共生虫黄藻对氨氮的吸收率差异不明显,S 组与 M 组无显著差异,L 组与其他 2 组均具有显著差异 (P<0.05) 番红 砗磲个体共生虫黄藻对活性磷酸盐的吸收率各组之间均具有显著差异 (P<0.05) 而光照条件下番红砗磲软体部单位干重的共生虫黄藻产氧率 对氨氮的吸收率 对活性磷酸盐的吸收率均是 S 组 >M 组 >L 组, 各组之间具有显著差异 (P<0.05) ( 图 9) Fig.9 图 9 光照条件下番红砗磲软体部单位干重共生虫黄藻的代谢率 The metabolic rate of symbiotic zooxanthellae per gram of dry weight of giant clam T. crocea under illumination conditions 3 讨论 3.1 光照对番红砗磲代谢的影响砗磲具共生虫黄藻系统 本研究发现, 在黑暗条件下, 即没有共生虫黄藻光合作用影响的情况下, 番红砗磲与其他双壳贝类相似, 消耗氧, 而在适宜光照条件下, 番红砗磲释放氧, 光照强度 5000 lx 时, 壳高为 和 mm 个体产氧率分别为 和 2.70 mg/(ind h) 其他的双壳贝类, 如壳高为 mm 和 mm 的企鹅珍珠贝 (Pteria penguin), 其耗氧率分别为 2.53 和 2.85 mg/(ind h) ( 栗志民等, 2009); 壳高为 mm 和 mm 的马氏珠母贝 (Pinctada martensi) 耗氧率分别为 0.90 和 3.05 mg/(ind h) ( 王海等, 2013) 同样光照条件下, 番红砗磲亦能吸收水体中活性磷酸盐, 且吸收率远大于黑暗条件下的排出率 光照条件下番红砗磲排氨率远小于黑暗条件, 说明相对于黑暗条件, 光照条件下番红砗磲可吸收氨氮 可见光照是影响砗磲代谢的重要因素 砗磲最独特的生物学性状是它的营养方式, 即通过其外套膜共生的虫黄藻, 利用海水中无机营养盐进行光合作用, 获得生长和呼吸所需营养 ; 砗磲水管系统和外套膜演化为一个巨大的 外套膜 组织并转向上方, 以利于共生虫黄藻光合作用 (Braley, 1992), 继而通过外套膜内结构精细的管道系统将光合作用的产物输送给 宿主 (Norton et al, 1992) 此外, 砗磲也可通过鳃的过滤获得营养, 但 Yonge(1975) 指出, 通过共生藻获得额外营养, 使砗磲贝超越了滤食的营养限制, 这也是砗磲能够生长巨大的原因 Mingoa 等 (1988) 的研究也揭示了大砗磲生长对于光照的依赖 Davies(1991) 进一步指出, 成年后砗磲大部分生长和呼吸所需要的营养由共生的虫黄藻提供 以放射性标志所做的碳平衡研究揭示, 虫黄藻光合作用固定的 90% 95% 碳传送给了宿主 (Davies, 1984) 3.2 规格对番红砗磲代谢的影响本研究发现, 在黑暗条件下, 番红砗磲个体的耗氧率 排氨率和对活性磷酸盐的排出率都随着规格的增大而升高, 这与虾夷马粪海胆 (Strongylocentrotus intermedius) 和长牡蛎 (Crassostrea gigas) 呼吸及排泄实验结果一致 ( 毕远溥等, 2000; 任黎华等, 2013), 与甲虫螺 (Cantharus cecillei)( 吴文广等, 2016) 的研究结果不一致 在光照条件下, 番红砗磲个体产氧率 排氨率和对活性磷酸盐的吸收率以及番红砗磲个体共生虫黄藻的产氧率 对氨氮的吸收率 对活性磷酸盐的吸收率也随规格的增大而升高, 说明单位个体的番红砗磲规格越大, 其虫黄藻总量也越多 有研究表明, 在一定范围内, 微藻的生物量越大, 对氨氮和活性磷酸盐的去除效果越好 ( 孙颖颖等, 2006; 边磊, ) ; 刘磊等, 2014) 但是, 光照条件下番红砗磲软体部单 1) Bian L. The removal and recycle of nitrogen and phosphorus nutrients and wastewater purification by microalgae. Master s Thesis of Zhejiang University, 2010, [ 边磊. 微藻对氮磷营养盐的脱除利用与废水净化. 浙江大学硕士研究生学位论文, 2010, 16 52]

101 98 渔业科学进展第 38 卷 位干重共生虫黄藻的产氧率 氨氮的吸收率和活性磷酸盐的吸收率却随着规格的增大而降低 这一现象可能是因为随着番红砗磲个体增大, 其软体部的干重虫黄藻数量减少的缘故 总之, 实验首次量化了光照和规格对番红砗磲氧 氨氮和活性磷酸盐代谢的影响 研究结果表明, 光照显著影响番红砗磲生理代谢 光照条件下, 番红砗磲释放氧气, 同时吸收氨氮和活性磷酸盐 其代谢率与规格密切相关, 即个体越大, 其产氧率 对氨氮和活性磷酸盐吸收率越高 因此, 在砗磲的养殖过程中, 需提供光照和营养盐, 以利于番红砗磲共生虫黄藻的光合作用 从生态学角度讲, 砗磲不但可直接吸收海水中营养盐, 同时为其他各种珊瑚鱼类 底栖生物等提供饵料和庇护所, 使砗磲具有极高的生态价值 (Neo et al, 2015) 参考文献 Bi YP, Jiang S, Liu HY, et al. Effect of temperature and body weight on oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of Strongylocentrotus intermedius. Fisheries Science, 2000, 19(4): 5 7 [ 毕远溥, 蒋双, 刘海映, 等. 水温 体重对虾夷马粪海胆耗氧量和排氨量的影响. 水产科学, 2000, 19(4): 5 7] Braley RD. The giant clam: hatchery and nursery culture manual. Australian Centre for International Agricultural Research, 1992(15): 144 Chen GY, Li JP, Li H. One of Buddhist s seven treasure Tridacna. Collection World, 2008(5): 126 [ 陈国英, 李江平, 李焕. 佛教七宝 之一 砗磲. 收藏界, 2008(5): 126] Davies PS. Effects of day light variation on energy budgets of shallow water corals. Marine Biology, 1991, 108(1): Davies PS. The role of zooxanthellae in the nutritional energy requirements of Pocillopora eydouxii. Coral Reefs, 1984, 2(4): Fitt WK. Nutrition of giant clams. Australian Centre for International Agricultural Research, 1993(47): Green A, Craig P. Population size and structure of giant clams at Rose Atoll, an important refuge in the Samoan Archipelago. Coral Reefs, 1999, 18(3): Griffiths DJ, Winsor H, Luongvan T. Iridophores in the mantle of giant clams. Australian Journal of Zoology, 1992, 40(3): Han L, Peter AT, Loke MC, et al. The defensive role of scutes in juvenile fluted giant clams (Tridacna squamosa). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2008, 359(1): He Y, Yang JD. The connection between Sr isotope in shell of modern Tridaecna and its living environment. Marine Geology and Quaternary Geology, 2000, 20(1): [ 何勇, 杨杰东. 现代砗磲壳体锶同位素与其生活环境的关系. 海洋地质与第四纪地质, 2000, 20(1): 35 38] Klumpp DW, Bayne BL, Hawkins AJS. Nutrition of the giant clam Tridacna gigas (L.) I. Contribution of filter feeding and photosynthates to respiration and growth. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 1992, 155(1): Klumpp DW, Griffiths CL. Contributions of phototrophic and heterotrophic nutrition to the metabolic and growth requirements of four species of giant clam (Tridacnidae). Marine Ecology Progress Series, 1994, 115: Liu L, Yang XW, Chen PY, et al. Efficiency of nitrogen and phosphorus removal from artificial wastewater by three kinds of microalgae. Guangdong Agricultural Sciences, 2014(11): [ 刘磊, 杨雪薇, 陈朋宇, 等. 3 种微藻对人工污水中氮磷去除效果的研究. 广东农业科学, 2014(11): ] Li YP, Li GY, Li JJ. Bottom sowing culturing Tridacna squamosa in the sea area of Xisha Islands. Scientific Fish Farming, 2015(9): [ 李育培, 李广毅, 李家积. 西沙群岛海域鳞砗磲底播养殖试验. 科学养鱼, 2015(9): 44 45] Li XM, Du Y, Lin CX. Research on relationship between body size and zooxanthellae number of Tridacna maxima. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2010(6): [ 李晓梅, 杜宇, 林炽贤. 长砗磲 (Tridacna maxima) 个体大小与虫黄藻数量的相关性研究. 安徽农业科学, 2010(6): Li ZM, Liu ZG, Xie L, et al. Oxygen consumption and ammonia-n excretion rates of Pteria penguin. Acta Oceanologica Sinica, 2009, 31(6): [ 栗志民, 刘志刚, 谢丽, 等. 企鹅珍珠贝耗氧率和排氨率的研究. 海洋学报, 2009, 31(6): ] Luo W. Larval growth of Tridacna crocea. Topic Oceanology, 1991(1): [ 罗伟. 番红砗磲幼虫的生长. 热带海洋, 1991(1): 73 79] Mingoa SSM. Photo adaptation in juvenile Tridacna gigas. Giant clams in Asia and the Pacific. ACIAR Monograph, 1988 (9): Neo ML, Eckman W, Vicentuan K, et al. The ecological significance of giant clams in coral reef ecosystems. Biological Conservation, 2015, 181: Norton JH, Shepherd MA, Long HM, et al. The zooxanthellae tubular system in the giant clam. The Biological Bulletin, 1992, 183(3): Ren LH, Zhang JH, Fang JG, et al. The diurnal of respiration, excretion and calcification in oyster Crassostrea gigas. Progress in Fishery Sciences, 2013(1): [ 任黎华, 张继红, 方建光, 等. 长牡蛎呼吸 排泄及钙化的日节律研究. 渔业科学进展, 2013(1): 75 81] Shao D, Yan H, Wang YH, et al. High resolution Sr/Ca profiles of three Tridacna specimens and their potential as sea surface temperature proxy. Journal of University of Science and Technology of China, 2012, 42 (1): 1 9 [ 邵达, 晏宏,

102 第 5 期刘小霞等 : 光照对不同规格番红砗磲 (Tridacna crocea) 氧 氨氮及活性磷酸盐代谢的影响 99 王玉宏, 等. 砗磲高分辨率 Sr/Ca 温度计 : 3 种物种的对比分析. 中国科学技术大学学报, 2012, 42 (1): 1 9] Sun YY, Wang CH. Study on relation between the growth rates of Isochrysis galbana and nutrient salt concentration. Marine Sciences, 2006, 30(1): [ 孙颖颖, 王长海. 球等鞭金藻的生长速率与培养液中营养盐的关系研究. 海洋科学, 2006, 30(1): 78 83] Wang H, Shi YH, Gu ZF. Relationship between weight and oxygen consumption rate of Pinctada fucata martensii. Journal of Qiongzhou University, 2013, 20(5): [ 王海, 石耀华, 顾志峰. 马氏珠母贝体重与耗氧率的关系. 琼州学院学报, 2013, 20(5): 73 79] Wu WG, Zhang JH, Gao ZK, et al. Effects of temperature and salinity on oxygen consumption and ammonia excretion rate of whelk Cantharus cecillei with different sizes. Progress in Fishery Sciences, 2016, 37(2): [ 吴文广, 张继红, 高振锟, 等. 温度和盐度对不同规格甲虫螺 (Cantharus cecillei) 耗氧率和排氨率的影响. 渔业科学进展, 2016, 37(2): ] Yan H, Shao D, Wang YH, et al. High resolution Sr/Ca profiles of Tridacna gigas from Xisha Islands of South China Sea and its potential application on sea surface temperature reconstruction. Journal of Earth Environment, 2011, 2(2): [ 晏宏, 邵达, 王玉宏, 等. 南海西沙大砗磲高分辨率 Sr/Ca 温度计及其意义. 地球环境学报, 2011, 2(2): ] Yonge CM. Giant clams. Scientific American, 1975, 232(4): ( 编辑冯小花 ) Effects of Illumination and Size on Metabolism of Oxygen Consumption, Ammonia and Active Phosphate Excretion in Giant Clam Tridacna crocea LIU Xiaoxia, LI Le, ZHENG Xing, GU Zhifeng 1, LIU Chunsheng 1 (Ocean College, Hainan University, Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education, Haikou ) Abstract The effects of illumination (5000 lx illumination and darkness) and size [shell length: (63.53±1.22) mm as small group, (75.87±1.50) mm as medium, and (92.75±3.02) mm as large ] on the metabolism of dissolved oxygen, ammonia nitrogen and active phosphate in the giant clam Tridacna crocea were studied under laboratory conditions at The results showed that under illumination, T. crocea released oxygen and absorbed ammonia nitrogen and active phosphate; the metabolism of T. crocea was similar to other bivalve mollusks in the dark. The metabolism rate of individual T. crocea was closely related to the size. Under illumination, the oxygen-production rate and the ammonia nitrogen/active phosphate absorption rate had a highly positive correlation with the size; in the dark, on the contrary, there was a negative correlation between the size and the oxygen production rate and the ammonia nitrogen/active phosphate absorption rate. Under illumination, the metabolic rate of symbiotic zooxanthellae (per gram of dry weight) of T. crocea was negatively correlated with the individual size. In this study, the metabolism of oxygen, ammonia nitrogen and active phosphate of T. crocea was quantitatively correlated with the size and light conditions for the first time. Our results provided basic information on the role of T. crocea in coral reef ecosystems and on the artificial breeding of giant clams. Key words Tridacna crocea; Illumination; Size; Metabolism 1 Corresponding author: GU Zhifeng, hnugu@163.com; LIU Chunsheng, lcs5113@163.com

103 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 复合益生菌制剂对大西洋鲑 (Salmo salar) 生长 * 消化酶和非特异性免疫指标的影响 1 刘淑兰陈张黎黎 1 1 娟李韩厚伟 1 1 杰刘孙国祥 2 豪王 1 胡佳平 2 纯 (1. 山东东方海洋科技股份有限公司烟台 ;2. 中国科学院海洋研究所青岛 ) 1 摘要选取体质健康 均重为 (180±28) g 的大西洋鲑 (Salmo salar) 420 尾, 随机分成 4 组 ( 对照组和 3 个不同菌剂水平的实验组 ), 每组 3 个重复, 每个重复 35 尾 对照组投喂基础饲料, 实验组分别投喂添加 1% 3% 和 5% 芽孢杆菌和酵母菌复合益生菌制剂 (BSCP) 的基础饲料 42 d 结果发现, 大西洋鲑投喂 1% 5% 的 BSCP 后生长性能得到明显改善, 增重率显著升高 (P<0.05), 饵料系数和死亡率显著降低 (P<0.05); 饲料蛋白质的表观消化率呈升高的趋势,5% 组蛋白质消化率具有显著性差异 (P<0.05), 但其脂肪表观消化率显著降低 (P<0.05); 实验组肠道和肝脏蛋白酶和脂肪酶活性有不同程度的升高, 但其中 5% 组肝脏脂肪酶活性显著降低 (P<0.05); 实验组肝脏免疫指标表现出不同程度的改善, 但其血清免疫指标无明显变化, 仅中高剂量组 SOD 活性显著降低 (P<0.05) 结果表明, BSCP 可以显著提高大西洋鲑的生长性能, 提高部分消化酶活性和蛋白质的消化率, 并在一定程度上促进大西洋鲑的非特异性免疫能力, 其饲料中适宜添加水平为 3% 关键词益生菌 ; 大西洋鲑 ; 生长 ; 消化酶 ; 非特异性免疫指标中图分类号 S963 文献标识码 A 文章编号 (2017) 大西洋鲑 (Salmo salar) 是一种营养价值较高的世界性养殖鱼类, 其肉质鲜美 富含必需脂肪酸和类胡萝卜素, 被公认为天然的绿色食品 由于野生资源有限, 目前市场上销售的大多数大西洋鲑来自人工养殖 而养殖过程中的人工管理操作和长期饱食投喂配合饲料对鱼体的生理功能造成不利影响, 导致其免疫力和生长速度降低 微生态制剂通过改善宿主肠道微生态平衡 提供营养物质 刺激免疫功能等作用, 可以提高养殖动物的生产性能 ( 张艳等, 2005), 是近年来促进养殖鱼类生长和健康类物质的研究热点之一 不同种类的益生菌对机体的作用机制不同, 复合添加通常能够达到作用互补或增强的效果 (Oelschlaeger, 2010; 赵剑闯等, 2010) 目前, 市场上已存在的微生态制剂多为两种或两种以上益生菌的复合制剂, 饲料 行业应用最为广泛的益生菌种类主要包括芽孢杆菌 (Bacillus) 乳酸菌以及酵母菌( 徐鹏等, 2012), 其中, 芽孢杆菌或乳酸菌的单一或复合添加剂是近年来国内外的研究热点, 而关于芽孢杆菌和酵母菌复合添加对鱼体影响的研究则较为少见 本文通过研究饲料中添加不同剂量芽孢杆菌和酵母菌复合发酵菌剂对大西洋鲑的生长性能 消化率 消化酶活性和非特异性免疫能力的影响, 探究复合益生菌制剂的促进效果及其在饲料中的适宜添加量, 为其在生产中应用提供依据 1 材料与方法 1.1 实验设计及材料 从 2014 年山东东方海洋科技股份有限公司培育 * 国家国际科技合作专项项目 鱼类全自动循环水养殖系统与技术的引进开发 (2014DFA31030) 资助 [This work was supported by the National Special Project for International Scientific and Technological Cooperation Introduction and Development of Fish Automatic Recirculating Aquaculture Systems and Technology (2014DFA31030)]. 刘淑兰, liujj @126.com 收稿日期 : , 收修改稿日期 :

104 第 5 期刘淑兰等 : 复合益生菌制剂对大西洋鲑 (Salmo salar) 生长 消化酶和非特异性免疫指标的影响 101 的降海后的大西洋鲑中, 选择 420 尾规格一致 体质健康 体重为 (180±28) g 的大西洋鲑, 随机分为 4 组, 分别为对照组和 3 个添加不同水平复合益生菌剂的实验组, 每组 3 个重复, 每个重复 35 尾, 置于 12 个独立的的室内循环水养殖系统 实验期为 42 d 鲑鳟鱼配合饲料购于北京汉业科技有限公司, 基础营养成分为水分 6.6% 粗蛋白 44.2% 粗脂肪 22.4% 灰分 10.6% 复合益生菌制剂 (Complex-probiotic-preparation, BSCP) 为解淀粉芽孢杆菌 CGMCC 菌株 (Bacillus amyloliquefaciens V4 CGMCC 10149) 和胶红酵母菌 CGMCC 1013 菌株 (Rhodotorula mucilaginosa CGMCC 1013) 的混合发酵液, 其中, 解淀粉芽孢杆菌为具有抗杀鲑气单胞菌的筛选菌株 两种益生菌均采用 LB 培养基分别发酵培养, 以 1 1 比例混合后测得混合发酵液中芽孢杆菌含量为 CFU/ml, 酵母菌含量为 CFU/ml, 菌液干物质含量约为 4.1%, 由中国科学院微生物研究所提供 BSCP 以体积 (ml)/ 饲料重 (g) 分别为 1% 3% 和 5% 的剂量喷洒到饲料中, 晾干 菌液和饲料储存于 4 冰箱备用 1.2 养殖管理大西洋鲑于小型室内封闭循环水系统养殖, 每个养殖池水体为 300 L, 初始养殖密度约为 21 kg/m 3 实验鱼暂养 14 d, 基本恢复正常后开始正式实验, 每天 08:00 和 15:00 饱食投喂 2 次, 投喂率为 1.0% 1.4%, 每次投饵后排污, 记录饲料残饵数 投喂量 死亡数和水温 每 5 d 测定一次氨氮和亚硝氮 养殖用水为恒温的地下岩层过滤海水, 水质优良 实验期间水温为 9 12, 溶解氧 >7 mg/l, 氨氮 <0.6 mg/l, 亚硝氮 <0.3 mg/l 1.3 样品采集及处理实验初始和结束时, 称重每池全部实验鱼 正式实验开始后, 每 7 d 收集每个养殖池粪便, 用于测定饲料表观消化率 投喂实验结束时, 每池随机取 3 尾大西洋鲑, 用 50 mg/l 的 MS-222 麻醉后尾静脉抽血, 血液置于肝素钠润湿的 2 ml 离心管中,4000 r/min 离心 15 min, 取上清液, 用于非特异性免疫指标的测定 抽血后鱼体解剖, 取肠道和肝脏, 去除脂肪组织, 于 80 冰箱保存 粗酶液制备 : 将上述组织解冻, 称重后加入 9 倍体积的 0.9% 无菌生理盐水, 组织匀浆机以 r/min 匀浆 2 min, 然后 3000 r/min 离心 10 min, 取上清液, 保存于 80, 用于测定消化酶和非特异性免疫指标 1.4 测定指标与方法 表观消化率采用 4 mol/l 盐酸不溶性灰分法进行测定 (Vandenberg et al, 2008) 组织总蛋白含量 消化酶活性和非特异性免疫指标均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定 蛋白酶活力测定采用福林 酚法, 淀粉酶活力测定采用碘 淀粉比色 法, 脂肪酶活力测定采用化学比浊法, 溶菌酶活力测定采用自身对照法, 酸性磷酸酶 (Acid phosphatase, ACP) 和碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase, AKP) 活性测定采用磷酸苯二钠比色法, 超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase, SOD) 活性测定采用黄嘌呤氧化酶法 ( 羟胺法 ) 生长性能指标及表观消化率相关计算公式如下 : 增重率 (%)=(W t W 0 )/W 特定生长率 (SGR, %)=(lnw t lnw 0 )/t 100 投喂率 (%)=W f /[(W 0 +W t )/2]/t 100 饲料系数 (FCR)=W f /(W t W 0 ) 死亡率 (%)=(N t N 0 )/N 干物质表观消化率 (%)=(1 A 1 /A 2 ) 100 蛋白质表观消化率 (%)=(1 A 1 P 2 /A 2 P 1 ) 100 脂肪表观消化率 (%)=(1 A 1 F 2 /A 2 F 1 ) 100 式中,t 为养殖天数,W 0 和 W t 分别为实验初和实验末鱼总体重 (g),w f 为饲料总投喂量 (g),n 0 和 N t 分别为实验初和实验末鱼体存池数,A 1 和 A 2 分别为饲料和粪便中盐酸不溶性灰分含量,P 1 和 P 2 分别为饲料和粪便中蛋白质含量,F 1 和 F 2 分别为饲料和粪便中脂肪含量 1.5 数据统计与分析 所有数据均以平均值 ± 标准误 (Mean±SE) 表示, 用 SPSS 13.0 软件进行单因素方差分析 (One-way ANOVA), 若存在显著差异, 则进行 Duncan 多重比较,P<0.05 为差异显著 2 结果 2.1 复合益生菌制剂对大西洋鲑生长性能的影响 BSCP 对大西洋鲑生长性能的影响见表 1 与对照组相比, 大西洋鲑投喂添加 1% 5% BSCP 的饲料 42 d 后, 增重率和 SGR 均分别升高约 21% 和 16%(P<0.05), 饲料系数和死亡率分别降低 15% 和 47% (P<0.05) 1% 组和 3% 组总摄食量和摄食率较对照组高 17% 和 13%(P>0.05),5% 组高于前三者, 且具有显著性差异 (P<0.05)

105 102 渔业科学进展第 38 卷 Tab.1 项目 Items 表 1 复合益生菌制剂对大西洋鲑生长性能的影响 Effects of the BSCP on the growth performance of Atlantic salmon (n=3, Mean±SE) 对照组 Control group 1% 组 1% group 3% 组 3% group 5% 组 5% group 初均重 Initial weight (g) ± ± ± ±2.20 末均重 Final weight (g) ±5.72 b ±6.37 a ±5.29 ab ±3.66 a 总摄食量 Total feed intake (kg) 3.69±0.10 b 4.37±0.17 ab 4.29±0.20 ab 4.46±0.06 a 摄食率 Feed intake rate (%) 1.13±0.03 b 1.27±0.04 ab 1.28±0.03 ab 1.32±0.02 b 增重率 Weight gain rate (%) 66.85±4.50 b 80.12±5.80 a 81.01±3.35 a 81.27±0.67 a 饲料系数 Feed coefficient 1.15±0.06 a 0.96±0.01 b 0.96±0.02 b 1.01±0.10 b 特定生长率 Specific growth rate (%/d) 1.22±0.06 b 1.40±0.13 a 1.41±0.04 a 1.42±0.10 a 死亡率 Mortality rate (%) 9.52±1.90 a 4.76±0.95 b 4.76±0.95 b 5.71±0.85 b 注 : 同行肩标不同小写字母者表示差异显著 (P<0.05) Note: In the same line, values with different superscripts were significantly different (P<0.05) 2.2 复合益生菌制剂对大西洋鲑饲料表观消化率的影响 BSCP 对大西洋鲑的饲料表观消化率的影响见表 2 与对照组相比, 大西洋鲑投喂 5% 的 BSCP 后, 蛋白质表观消化率升高 8%(P<0.05), 但其脂肪的表观消化率显著降低 0.4%(P<0.05), 而 1% 组和 3% 组与对照组无显著差异 (P>0.05) 投喂 BSCP 使鱼体饲料干物质的表观消化率呈现升高的趋势, 但各组间无显著差异 (P>0.05) 2.3 复合益生菌制剂对大西洋鲑消化酶活性的影响 BSCP 对大西洋鲑消化酶活性的影响见表 3 大西洋鲑投喂 BSCP 后, 肝脏蛋白酶活性均显著升高 (P<0.05), 肠道蛋白酶活性随添加量而升高,3% 组和 5% 组较对照组提高 31%(P<0.05) 肠道和肝脏脂肪酶活性随添加量的升高呈先升高后降低的趋势,3% 组 肠道和肝脏脂肪酶活性最高且显著高于对照组 47% 和 32%(P<0.05), 而 5% 组的肝脏脂肪酶活性却显著低于其他各组 (P<0.05) 复合益生菌对大西洋鲑肝脏和肠道中的淀粉酶活性无显著影响 (P>0.05) 2.4 复合益生菌制剂对大西洋鲑非特异性免疫指标的影响 BSCP 对大西洋鲑非特异性免疫指标的影响见表 4 投喂大西洋鲑 BSCP 42 d 后, 血清和肝脏 SOD 活性随添加量的升高呈先降后升的趋势,3% 组最低, 较对照组显著降低 (P<0.05) 5% 组肝脏 ACP 显著高于对照组和 1% 组 (P<0.05), 与 3% 组无显著差异 (P> 0.05) 随着复合益生菌剂量的增加, 肝脏溶菌酶和 AKP 的活性呈先升后降的趋势, 且 1% 和 3% 组溶菌酶活性显著升高 (P<0.05) BSCP 对大西洋鲑血清溶菌酶 ACP 和 AKP 的活性均无影响 (P>0.05) 表 2 复合益生菌制剂对大西洋鲑饲料表观消化率的影响 Tab.2 Effects of the BSCP on the apparent digestibility coefficient of Atlantic salmon (n=3; Mean±SE; %) 项目 Items 干物质 Dry-matter 蛋白质 Protein 脂肪 Lipid 对照组 Control group 69.33± ±0.98 b 98.10±0.31 a 1% 组 1% group 70.59± ±3.25 ab 97.83±0.20 ab 3% 组 3% group 71.01± ±2.70 ab 97.93±0.21 ab 5% 组 5%group 72.16± ±2.28 a 97.67±0.08 b Tab.3 肠道 Intestinal 肝脏 Liver 表 3 复合益生菌制剂对大西洋鲑消化酶活性的影响 Effects of the BSCP on the digestive enzyme activities of Atlantic salmon (n=3; Mean±SE; U/mg prot) 项目 Items 对照组 Control group 1% 组 1% group 3% 组 3% group 5% 组 5% group 淀粉酶 Amylase 0.31± ± ± ±0.08 脂肪酶 Lipase 42.30±2.86 b 54.13±7.79 ab 70.21±1.20 a 43.93±9.42 b 蛋白酶 Protease ±13.37 b ±12.22 b ±12.52 a ±9.25 a 淀粉酶 Amylase 0.42± ± ± ±0.14 脂肪酶 Lipase 30.94±4.13 b 35.56±3.07 ab 41.03±3.84 a 23.63±2.35 c 蛋白酶 Protease 20.25±4.26 b 32.55±3.50 a 33.12±5.93 a 36.07±5.45 a

106 第 5 期刘淑兰等 : 复合益生菌制剂对大西洋鲑 (Salmo salar) 生长 消化酶和非特异性免疫指标的影响 讨论不同种类的益生菌所具有的生理特性不同, 其在体内发挥的主要作用也有所差异 (Oelschlaeger, 2010) 芽孢杆菌具有稳定性好 抗逆性强 存活率高等特点 ( 李海兵等, 2008), 在极端环境下可以形成孢子 本研究中, 复合发酵菌液中的活性芽孢杆菌喷洒到饲料表面以后, 由于环境不适, 会以孢子形式进入鱼体消化道, 在肠道迅速萌发成营养型菌体 ( 周小辉等, 2009), 进而发挥其所具有的多种作用 酵母菌由于其结构的特殊性, 具有较好稳定性, 能耐受高酸环境, 进入肠道后可以合成多种营养素和消化酶 ( 李海兵等, 2008; 楚杰等, 2006), 且本身含有多种益生因子, 是良好的功能性营养型饲料添加剂, 芽孢杆菌和酵母菌复合投喂的效果明显优于单一菌种 3.1 益生菌对水产动物的促生长作用投喂益生菌可以促进养殖动物的生长性能已得到广泛证实 芽孢杆菌单独或配合多糖使用能够明显促进鲟鱼 (Acipenser baeri) ( 刘晓勇等, 2011; 高欣等, 2009) 鲫鱼(Carassius auratus)( 刘波等, 2006) 黄颡鱼 (Pelteobagrus fulvidraco)( 李丽鹃等, 2013) 和罗非鱼 (Oreochromis niloticus)( 付天玺等, 2008) 等多种鱼类的生长, 活性酵母菌或其干粉对重口裂腹鱼 (Schizothorax davidi)( 何敏等, 2008) 罗非鱼(Abu-Elala et al, 2013) 和中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis)( 陈昌福等, 2005) 等的生长也具有类似的促进作用 本研究中, 大西洋鲑投喂芽孢杆菌和酵母菌的复合发酵液后, 生长性能得到显著升高, 摄食率明显升高, 饵料系数降低, 与上述研究的结果相似 血清 Serum (U/ml) 肝脏 Liver (U/mg prot) Tab.4 表 4 复合益生菌制剂对大西洋鲑非特异性免疫指标的影响 Effects of the BSCP on the nonspecific immune indices of Atlantic salmon (n=3; Mean±SE) 项目 Items 对照组 Control group 1% 组 1% group 3% 组 3% group 5% 组 5% group 溶菌酶 Lysozyme 16.51± ± ± ±1.12 酸性磷酸酶 Acid phosphatase 5.63± ± ± ±0.40 碱性磷酸酶 Alkaline phosphatase 21.31± ± ± ±1.64 超氧化物歧化酶 Superoxide dismutase 85.12±5.86 a 78.84±6.97 ab 71.42±5.34 b 79.32±5.47 ab 溶菌酶 Lysozyme 14.72±1.82 b 20.54±1.18 a 20.48±3.47 a 17.47±1.43 ab 酸性磷酸酶 Acid phosphatase ±8.20 b ±15.67 b ±13.25 ab ±12.60 a 碱性磷酸酶 Alkaline phosphatase 27.85± ± ± ±4.35 超氧化物歧化酶 Superoxide dismutase 92.57±14.56 a 93.03±8.38 a 71.99±3.95 b 82.07±6.74 ab 3.2 复合益生菌对消化酶活性的影响益生菌的促生长机理包含多个方面, 其中一个非常重要的方面是其本身能够分泌多种消化酶, 并能够通过促进肠道中其他益生菌的繁殖间接促进消化酶的分泌, 增强营养物质的消化吸收 ( 李文华等, 2013; 李桂英等, 2013), 从而使大西洋鲑肠道中蛋白酶和脂肪酶的活性明显升高, 尤其是益生菌制剂添加水平达到 3% 以上的组 益生菌分泌的消化酶使鱼体对摄入饲料的消化吸收加快, 促进肠道食糜排空, 使大西洋鲑的摄食率提高 鱼体为了适应摄食量的增加对消化机能进行适应性改变, 促使肝脏中消化酶的合成水平适应性升高 (Stumpf et al, 2014), 因此, 投喂 BSCP 后大西洋鲑肝脏中的蛋白酶活性显著升高 这使其对肠道内蛋白质的消化吸收更加充分, 饲料干物质和蛋白质的表观消化率提高, 饲料系数降低 值得注意的是, 投喂 5% 水平 BSCP 的大西洋鲑 肝脏脂肪酶活性略有降低, 其对脂肪的消化率也显著降低, 这种现象可能是由于投喂的益生菌促进了肠道内乳酸杆菌的增殖 ( 刘波等, 2006) 在对哺乳动物的研究中, 发现乳酸菌具有降低脂肪吸收的作用, 其作用机理是乳酸菌能够抑制胰脂肪酶的活性 (Matsumura, 2010), 这可能在某种机理上影响了鱼体肝胰脏脂肪代谢相关酶的基因表达 (Qiao et al, 2015), 进而影响了肝脏脂肪酶的活性, 但具体的作用机理尚需进一步研究 这种现象表明, 对鱼体投喂不适剂量的益生菌可能对某些生理功能产生不利影响 3.3 复合益生菌制剂对非特异性免疫指标的影响芽孢杆菌和酵母菌含有的抗原类物质具有诱导刺激动物机体先天性免疫的作用, 能够增强机体的抗病菌感染能力 ( 刘宗英等, 2005; Selim et al, 2015) 本研究中投喂益生菌后大西洋鲑肝脏溶菌酶和 ACP 活性升高, 这表明肝脏中巨噬细胞的分泌和吞噬活

107 104 渔业科学进展第 38 卷 性增强 机体内 SOD 的活性变化与超氧阴离子自由基水平有关, 后者主要来源于吞噬细胞清除细菌时呼吸爆发产生 ( 邢宇坤等, 2004), 因此, 在正常生理条件下, SOD 的活性变化与侵染宿主的病原菌数量有一定的关系 本研究中, 投喂 3% 的复合益生菌制剂后大西洋鲑 SOD 活性显著降低, 这与 Tovar-Ramírez 等 (2010) 研究中饲喂黑鲈 (Dicentrarchus labrax) 活性酵母菌后 SOD 活性及其表达量降低的结果一致 其具体机理可能是益生菌具有抑制肠道有害菌的作用, 投喂芽孢杆菌和酵母菌提高了肠道内有益菌的数量 ( 刘波等, 2006; 何敏等, 2008), 使肠道中有害菌的数量及其侵染机会减小, 鱼体呼吸爆发的频率降低,SOD 活性伴随超氧阴离子水平的降低而降低 在对同一实验的菌群结构研究中发现, 大西洋鲑肠道中芽孢杆菌和乳酸菌的比例增加, 而弧菌的比例有所降低, 表明了以上论述的可能性 然而, 添加 5% 水平的复合益生菌制剂后 SOD 活性有所升高, 其原因可能是过量投喂益生菌扰乱了肠道微生态平衡 本研究与众多学者研究结果不同的是, 投喂益生菌后大西洋鲑血清中大部分非特异性免疫指标均无明显的变化, 推测可能与养殖环境和鱼体生理状态有关 血清免疫指标代表整个机体在某一条件下所处的免疫状态, 其在无应激状态下一般处于正常水平, 而在受到较严重的刺激后可表现出波动性的变化 本研究中, 大西洋鲑所处养殖条件较佳, 应激因子极少, 这可能是造成其血清免疫指标无明显差异的原因 而在后续的杀鲑气单胞菌攻毒实验 24 h 后, 血清各项非特异性免疫指标均有所上升, 与上述规律相符 4 结论综上所述, 饲料中添加芽孢杆菌和酵母菌的复合益生菌制剂可以提高大西洋鲑某些消化酶和肝脏非特异性免疫酶的活性, 进而可以显著促进大西洋鲑的生长, 提高饲料蛋白质的消化率, 但 5% 的添加水平不利于大西洋鲑对饲料脂肪的消化吸收 因此, 在本实验条件下, 复合益生菌制剂的适宜添加水平为 3% 参考文献 Abu-Elala N, Marzouk M, Moustafa M. Use of different Saccharomyces cerevisiae biotic forms as immune-modulator and growth promoter for Oreochromis niloticus challenged with some fish pathogens. International Journal of Veterinary Sciences and Medicine, 2013, 1(1): Chen CF, Yao J, Xiao ZM, et al. Effects of high active dry yeast on the growth and disease resistance of Chinese cashmere crab. Journal of Yangtze University (Natural Science Edition), 2005, 2(5): [ 陈昌福, 姚娟, 肖志猛, 等. 高活性干酵母对中华绒螯蟹生长和抗病力的影响. 长江大学学报 ( 自然科学版 ), 2005, 2(5): 24 26] Chu J, Wang FS, Zhang DW. Research progress of biological function and disease prevention of Saccharomyces boulardii. Chinese Journal of Pharmaceutical Biotechnology, 2006, 13(1): [ 楚杰, 王凤山, 张大伟. 布拉酵母菌的生物学作用及防治疾病应用研究进展. 药物生物技术, 2006, 13(1): 71 73] Fu TX, Xu GH, Wu YC, et al. Effects of Bacillus coagulans on digestive enzyme activities, digestibility and growth performance of hybrid tilapia (Oreochromis niloticus O. aureus). Freshwater Fisheries, 2008, 38(4): [ 付天玺, 许国焕, 吴月嫦, 等. 凝结芽孢杆菌对奥尼罗非鱼消化酶活性 消化率及生长性能的影响. 淡水渔业, 2008, 38(4): 30 35] Gao X, Gai LQ, Li MY, et al. Effects of Bacillus spp. on the growth performance and digestibility of juvenile Acipenser baeri. Journal of Hebei Normal University(Natural Science Edition), 2009, 33(3): [ 高欣, 盖力强, 李美英, 等. 芽孢杆菌对西伯利亚鲟幼鱼摄食生长和消化率的影响. 河北师范大学学报 ( 自然科学版 ), 2009, 33(3): ] He M, Wang KY, Zhang Y, et al. Effects of compound microbiological preparation on growth, activities of digestive enzymes, intestinal microflora of Schizothorax (Racoma) davidi (Sauvage) and water quality parameters. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2008, 20(5): [ 何敏, 汪开毓, 张宇, 等. 复合微生物制剂对重口裂腹鱼生长 消化酶活性 肠道菌群及水质指标的影响. 动物营养学报, 2008, 20(5): ] Li GY, Sun Y, Song XL, et al. Potential probiotics supplement may impact intestinal digestive enzyme and bacteria composition of Litopenaeus vannamei. Progress in Fishery Sciences, 2013, 34(4): [ 李桂英, 孙艳, 宋晓玲, 等. 饲料中添加潜在益生菌对凡纳滨对虾肠道消化酶活性和菌群组成的影响. 渔业科学进展, 2013, 34(4): 84 90] Li HB, Song XL, Li Y, et al. Progress on probiotic bacteria in aquaculture. Marine Fisheries Research, 2008, 29(5): [ 李海兵, 宋晓玲, 李赟, 等. 水产动物益生菌研究进展. 海洋水产研究, 2008, 29(5): 94 99] Li LJ, Gong Q, Quan KY, et al. Effects of dietary chitosan and probiotics on growth and non-specific immunity of Pelteobagrus fulvidraco. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2013, 41(34): [ 李丽鹃, 龚全, 权可艳, 等. 壳聚糖和益生菌对黄颡鱼生长性能及非特异性免疫机能的影. 安徽农业科学, 2013, 41(34): ] Li WH, Liu JH. The biological function and application in

108 第 5 期刘淑兰等 : 复合益生菌制剂对大西洋鲑 (Salmo salar) 生长 消化酶和非特异性免疫指标的影响 105 aquaculture of Bacillus. Feed and Husbandry: New Feed, 2013(12): [ 李文华, 刘建华. 饲用芽孢杆菌的生物学功能及其在水产养殖中的应用. 饲料与畜牧 : 新饲料, 2013(12): 11 14] Liu B, Xie J, Liu WB, et al. Effects of Bacillus licheniformis and xylooligosaccharides on digestive enzyme activities, growth and microflora in intestine in allogygenetic crucian carp. Journal of Dalian Fisheries University, 2006, 21(4): [ 刘波, 谢骏, 刘文斌, 等. 地衣芽孢杆菌与低聚木糖对异育银鲫消化酶活性 肠道菌群及生长的影响. 大连水产学院学报, 2006, 21(4): ] Liu XY, Zhang Y, Qi Y, et al. Effects of Bacillus subtilis on growth, digestive enzyme activity, and non-specific immunity in hybrid sturgeon (Acipenser baeri Acipenser schrenkii ) juveniles. Journal of Fishery Sciences of China, 2011, 18(6): [ 刘晓勇, 张颖, 齐茜, 等. 枯草芽孢杆菌对杂交鲟幼鱼生长性能 消化酶活性及非特异性免疫的影响. 中国水产科学, 2011, 18(6): ] Liu ZY, Yao J, Chen CF, et al. Effect of activity yeast cell on non-specific immune function and disease resistance in juvenile soft-shelled turtles (Pelodiscus sinensis) by oral administration. Journal of Huazhong Agricultural University, 2005, 24(2): [ 刘宗英, 姚鹃, 陈昌福, 等. 高活性干酵母对中华鳖非特异性免疫功能和抗病力的影响. 华中农业大学学报, 2005, 24(2): ] Matsumura A. Inhibitory effects of probiotics on pancreatic lipase. BIFIDUS Flores, Fructus et Semina, 2010, 24(4): Oelschlaeger TA. Mechanisms of probiotic actions A review. International Journal of Medical Microbiology, 2010, 300(1): Qiao Y, Sun J, Xia S, et al. Effects of different Lactobacillus reuteri on inflammatory and fat storage in high-fat dietinduced obesity mice model. Journal of Functional Foods, 2015, 14: Selim KM, Reda RM. Improvement of immunity and disease resistance in the Nile tilapia, Oreochromis niloticus, by dietary supplementation with Bacillus amyloliquefaciens. Fish & Shellfish Immunology, 2015, 44(2): Stumpf L, Tropea C, Greco LSL. Recovery growth of Cherax quadricarinatus juveniles fed on two high-protein diets: Effect of daily feeding following a cyclic feeding period on growth, biochemical composition and activity of digestive enzymes. Aquaculture, 2014, 433(1): Tovar-Ramírez D, Mazuraisa D, Gatesoupea JF, et al. Dietary probiotic live yeast modulates antioxidant enzyme activities and gene expression of sea bass (Dicentrarchus labrax) larvae. Aquaculture, 2010, 300(1 4): Vandenberg GW, Noüe JDL. Apparent digestibility comparison in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) assessed using three methods of feces collection and three digestibility markers. Aquaculture Nutrition, 2008, 7(4): Xing YK, Zhang W. Mechanisms of neutrophil respiratory burst and its inflammatory effects. Basic Medical Sciences and Clinics, 2004, 24(1): 1 6 [ 邢宇坤, 张伟. 中性粒细胞呼吸爆发的产生机制及其炎症效应. 基础医学与临床, 2004, 24(1): 1 6] Xu P, Dong XF, Tong JM. Microbial feed additives: Major functions and its research advances. Acta Zoonutrimenta Sinica, 2012, 24(8): [ 徐鹏, 董晓芳, 佟建明. 微生物饲料添加剂的主要功能及其研究进展. 动物营养学报, 2012, 24(8): ] Zhang Y, Li QF, Wang YG, et al. Research status and application of probiotics to mariculture. Marine Fisheries Research, 2005, 26(6): [ 张艳, 李秋芳, 王印庚, 等. 益生菌的研究现状及其在海水养殖中的应用. 海洋水产研究, 2005, 26(6): 83 87] Zhao JC, Zhou B. Comparison of the action mechanism between lactic acid bacteria and Bacillus. Feed and Husbandry: New Feed, 2010(10): [ 赵剑闯, 周勃. 乳酸菌与芽孢杆菌对机体作用机制的比较. 饲料与畜牧 : 新饲料, 2010(10): 39 41] Zhou XH, Li B. Study on the mechanism and application of Bacillus subtilis. Feed Research, 2009(10): [ 周小辉, 李彪. 枯草芽孢杆菌的机制及应用研究. 饲料研究, 2009(10): 26 28] ( 编辑冯小花 )

109 106 渔业科学进展第 38 卷 Effects of Complex-Probiotic-Preparation on the Growth, Digestive Enzymes and the Nonspecific Immune Indices of Atlantic Salmon (Salmo salar) LIU Shulan 11, JIANG Xin 1, SUN Guoxiang 2, ZHANG Lili 1, WANG Shunkui 1, WANG Chun 2 (1. Shandong Oriental Ocean Sci-Tech Co., Ltd, Yantai ; 2. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao ) Abstract The probiotic has various beneficial effects on fish such as improvements in nutrition, immunity and balance of intestinal micro-ecology. The combination of multiple probiotics is thought to be even more beneficial than single probiotic. Lactobacillus, Bacillus and yeast are the most widely used probiotic species in aquaculture. The effects of lactobacillus combined with bacillus have been extensively studied, whereas little is known about the combined effects of bacillus and yeast. In this study we investigated the effects of the compound preparation fermented by bacillus and yeast on the growth performance, digestive enzyme activities and the nonspecific immune indices of Atlantic salmon (Salmo salar). Four hundred and twenty Atlantic salmons with an average body weight of (180±28) g were randomly designated into 4 groups including one control group and three test groups. In each group there were 3 replicates of 35 fish. The control group was fed with the basal diet and test groups were fed with basal diet complemented with 1%, 3% or 5% complex-probiotic-preparation (BSCP) for 42 days. Compared to the control group, there was a higher weight gain and a lower feed conversion ratio and mortality (P<0.05) in the test groups. The digestibility of protein rose along with the increase of BSCP. In the 5% group, there was a difference in protein digestibility (P<0.05) and a reduction in lipid digestibility (P<0.05). BSCP up-regulated the digestive enzyme activities in varied degrees, except that it down-regulated the liver lipase activity in the 5% group (P<0.05). The liver immune indices were improved in test groups, however in the serum, BSCP induced little change except for the decrease of SOD activity in the 3% and 5% groups (P<0.05). The results indicated that the BSCP could improve the growth performance of Atlantic salmon, enhance the activities of some digestive enzymes and protein digestibility, and promote the nonspecific immunity to some extent. The optimal dietary level of BSCP was determined to be 3%. Key words Probiotic; Salmo salar; Growth; Digestive enzyme; Nonspecific immune indices 1 Corresponding author: LIU Shulan, liujj @126.com

110 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 脱脂磷虾粉对圆斑星鲽 (Verasper variegatus) 幼鱼生长 非特异性免疫力和血清生理 * 代谢指标的影响 郑建明 1,2 严俊丽赵捷杰 1,2 1,2 陈四清刘长琳 2 2 常青胡建成 21 2 王贞杰 (1. 上海海洋大学水产与生命学院上海 ;2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛 ) 1,2 摘要为研究脱脂磷虾粉替代鱼粉对圆斑星鲽 (Verasper variegatus) 幼鱼生长性能 非特异性免疫力和血清生理代谢指标的影响, 实验以鱼粉和脱脂磷虾粉为蛋白源, 鱼油为脂肪源, 分别以脱脂磷虾粉蛋白替代基础饲料中 0 10% 20% 30% 40% 50% 和 100% 的鱼粉蛋白制成 7 种等氮 等脂的饲料 ( 分别记为 R0 R10 R20 R30 R40 R50 R100), 投喂初始体重为 (60.11±0.13) g 体长为(14.12±0.25) cm 的圆斑星鲽幼鱼 8 周, 每组设 3 个重复, 每个重复 20 尾鱼 结果显示,R10 R50 组的特定生长率 (SGR) 存活率 (SR) 和饲料效率 (FER) 与 R0 组 ( 对照组 ) 没有显著性差异 (P>0.05), 但从 R30 组开始有下降的趋势 R10 R50 组的蛋白质效率 (PER) 和 R0 组无显著性差异 (P>0.05), 但 R100 组的 PER 显著低于 R0 组 (P<0.05) R10 R20 组血清中的酸性磷酸酶 (ACP) 显著高于 R0 组 (P<0.05),R30 组血清中酸性磷酸酶 (ACP) 和 R0 组没有显著性差异 (P>0.05) R30 R100 组血清中的碱性磷酸酶 (AKP) 显著高于 R0 组 (P<0.05) R10 组血清中超氧化物歧化酶 (SOD) 和 R0 组差异不显著 (P>0.05) R10 组肝脏中 ACP 显著高于 R0 组 (P<0.05), R40 R50 组和 R0 组没有显著性差异 (P>0.05) R30 R40 组肝脏中 AKP 和 R0 组差异不显著 (P>0.05) R10 R40 组肝脏中 SOD 和 R0 组没有显著性差异 (P>0.05) R10 R50 组血清的总蛋白 (TP) 显著高于 R0 组 (P<0.05) 各处理组和 R0 组血清中的谷草转氨酶 (GOT) 和谷丙转氨酶 (GPT) 没有显著性差异 (P>0.05) 综合来看,10% 30% 的脱脂磷虾粉替代组和对照组 R0 组对圆斑星鲽幼鱼的生长 饲料利用 免疫力及蛋白利用有相同的效果 关键词圆斑星鲽 ; 脱脂磷虾粉 ; 生长 ; 非特异性免疫力 ; 生理代谢中图分类号 S96 文献标识码 A 文章编号 (2017) 近年来, 全球鱼粉的产量难以满足日益增长的水产养殖业的需求, 因此, 寻求新型蛋白源成为目前饲料产业亟待解决的问题 南极磷虾是地球上已发现的生物量最大的单种生物之一, 其资源现存量据最新估计为 亿 t ( 常青等, 2013), 其氨基酸含量平衡, 富含不 饱和脂肪酸尤其是 EPA 和 DHA, 对大西洋鲑鱼 (Salmo salar) (Rungruangsaktorrissen, 2006; Hansen et al, 2010; Hansen et al, 2011; Olsen et al, 2006) 大西洋鳕 (Gadus * 农业部项目 南极海洋生物资源开发利用 中国水产科学研究院黄海水产研究所基本科研业务费( ) 和天津市农业科技成果转化与推广项目 ( ) 共同资助 [This work was supported by Ministry of Agriculture Project Antarctic Marine Biological Resources Development and Utilization, Special Scientific Research Funds for Non-Profit Institute, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences ( ), and Tianjin Agricultural Science and Technology Achievement Transformation and Extension Project ( )]. 郑建明, @qq.com 1 通讯作者 : 常青, 研究员, changqing@ysfri.ac.cn 收稿日期 : , 收修改稿日期 :

111 108 渔业科学进展第 38 卷 morhua)(karlsen et al, 2006; Tibbetts et al, 2011) 的生长及免疫有积极作用 圆斑星鲽 (Verasper variegatus) 俗称花斑宝, 主要分布在我国北部的黄海 渤海及日本九州岛附近 其外形美观 营养丰富, 是我国北方沿海人们喜爱的高档水产品之一, 具有较高的经济价值 ( 叶建生等, 2006) 脱脂磷虾粉是南极磷虾提取磷虾油后的副产品, 含有丰富的蛋白质, 可以作为潜在的蛋白源 为了充分利用南极磷虾资源, 本研究用脱脂磷虾粉替代鱼粉研究其对圆斑星鲽幼鱼生长 非特异性免疫力和血清生理代谢指标的影响, 以确定圆斑星鲽饲料中脱脂磷虾粉的适宜添加量 1 材料与方法 1.1 实验饲料鱼粉 脱脂磷虾粉为蛋白源, 鱼油为脂肪源, 高 筋粉为糖源, 制成等氮 (50%) 等脂(8%) 的颗粒饲料 分别以脱脂磷虾粉蛋白替代饲料中 0 10% 20% 30% 40% 50% 100% 的鱼粉蛋白, 配制 7 种等氮 等脂的饲料, 并记为 R0 R10 R20 R30 R40 R50 R100 实验饲料配方见表 1 对所有粉状原料经过粉碎机粉碎过 100 目筛, 按配方比例混合均匀, 把磷脂溶于鱼油后, 与其他粉状原料混合均匀, 加 30% 的水搅拌均匀, 最后用制粒机制成直径为 3 mm 的颗粒饲料, 鼓风烘干 h, 制好的颗粒饲料 20 下保存 1.2 饲养管理实验鱼取自山东烟台开发区天源水产有限公司 挑选健康无病 规格相近的圆斑星鲽幼鱼 420 尾, 初始体重为 (60.11±0.13) g, 体长为 (14.12±0.25) cm, 随机分到 21 个 330 L 的圆柱形塑料桶中, 每组设 3 个重复, 每桶 20 尾 实验开始前饲喂 R0 饲料暂养 7 d 养殖期间, 采用自然水温, 范围为 14 16, 盐度为 表 1 实验饲料配方和营养组成, % Tab.1 Formula and nutrient composition of the experimental diets(dry matter, %) 原料 Ingredients 饲料 / 脱脂磷虾粉蛋白替代鱼粉蛋白 Diet/Skimmed krill meal level R0 R10 R20 R30 R40 R50 R100 鱼粉 Fish meal 脱脂磷虾粉 Skimmed krill meal 高筋粉 High-gluten flour 鱼油 Fish oil 预混料 Premix 羧甲基纤维素 Carboxymethyl cellulose 微晶纤维素 Microcrystalline 磷脂 Phospholipid 胆碱 Choline 磷酸二氢钙 Ca(H 2 PO 4 ) 抗氧化剂 (TBHQ) 合计 Total 成分分析 Proximate composition 粗蛋白 Crude protein 粗脂肪 Crude lipid 灰分 Crude ash : 粗蛋白 65%, 粗脂肪 5% 2: 粗蛋白 77%, 粗脂肪 2% 3: 维生素 A IU/kg, 维生素 D IU/kg, 维生素 E 3000 mg/kg, 维生素 K mg/kg, 维生素 B mg/kg, 维生素 B mg/kg, 维生素 B mg/kg, 维生素 B mg/kg, D- 泛酸钙 2400 mg/kg, 烟酸胺 4500 mg/kg, 叶酸 185 mg/kg, D- 生物素 7.5 mg/kg, 肌醇 3000 mg/kg, 维生素 C mg/kg, 锌 1750 mg/kg, 锰 1050 mg/kg, 铜 410 mg/kg, 铁 1150 mg/kg, 钴 60 mg/kg, 碘 50 mg/kg, 硒 15 mg/kg 1: Crude protein 65%, Crude lipid 5% 2: Crude protein 77%, Crude lipid 2% 3: V A IU/kg, V D IU/kg, V E 3000 mg/kg, V K3 900 mg/kg, V B1 600 mg/kg, V B2 600 mg/kg, V B6 600 mg/kg, V B mg/kg, Calcium pantothenate 2400 mg/kg, Nicotinic acid amines 4500 mg/kg, Folic acid 185 mg/kg, Biotin 7.5 mg/kg, Inositol 3000 mg/kg, V C mg/kg, Zn 1750 mg/kg, Mn 1050 mg/kg, Cu 410 mg/kg, Fe 1150 mg/kg, Co 60 mg/kg, I 2 50 mg/kg, Se 15 mg/kg

112 第 5 期郑建明等 : 脱脂磷虾粉对圆斑星鲽 (Verasper variegatus) 幼鱼生长 非特异免疫力和血清生理代谢指标的影响 , 溶解氧为 5 6 mg/l, 流水养殖 实验从 2016 年 7 月 16 日持续至 9 月 12 日, 为期 8 周, 每天饱食投喂 1 次, 投喂 30 min 后使用虹吸管吸取残饵, 烘干称重, 每天记录摄食量 1.3 样品收集与分析实验结束后, 采样前使实验鱼饥饿 24 h, 并对每组鱼进行计数 称重 每桶随机取 3 尾鱼, 用 1% 的肝素钠浸润注射器后, 尾静脉取血, 血液低温放置 4 h, 4000 r/min 离心 10 min, 获得血清样品 分离的血清用于总蛋白 (Total protein, TP) 谷草转氨酶(Glutamic- oxaloacetic transaminase, GOT) 和谷丙转氨酶 (Glutamicpyruvic transaminase, GPT) 酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP) 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP) 和总超氧化物歧化酶 (Total superoxide dismutase, SOD) 活性的测定, 分离的肝脏用于 ACP AKP 和 SOD 的测定 饲料样品 105 烘干后采用凯氏定氮法测得粗蛋白含量 (VELP,UDK-142 automatic distillation unit, 意大利 ); 采用索氏抽提法 ( 石油醚为抽提液 ) 测得粗脂肪含量 (FOSS 脂肪测定仪 SOXTEC-2050, 瑞典 ); 将样品在马弗炉 (550 ) 中灼烧 6 h 测得灰分含量 血清中 TP GOT GPT ACP AKP 和 SOD 等酶活的测定均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒 特定生长率 (Specific growth rate, SGR, %/d)= (ln 实验末各组鱼平均体重 ln 实验初各组鱼平均体重 )/ 养殖天数 100 存活率 (Survival rate, SR, %)= 实验末鱼体个数 / 实验初鱼体个数 100 饲料效率 (Feed efficiency ratio, FER, %)= 总增重量 / 投饲总量 100 蛋白质效率 (Protein efficiency ratio, PER, %)= 总增重量 ( 投饲总量 饲料中粗蛋白含量 ) 数据统计实验数据采用 Excel 2010 和 SPSS 17.0 软件进行统计分析, 数据差异显著时采用 Duncan s 进行多重比较, 显著水平为 P<0.05, 数据以平均值 ± 标准误 (Mean±SE) 表示 2 结果 2.1 脱脂磷虾粉对圆斑星鲽幼鱼生长性能和饲料利用的影响脱脂磷虾粉对圆斑星鲽幼鱼生长性能和饲料应用的影响见表 2 由表 2 可以看出,R10 R50 组的 SGR SR 和 FER 呈现相同的趋势, 与 R0 组相比均无显著性差异 (P>0.05), 但显著高于 R100 组 (P<0.05) R10 R50 组的 PER 和 R0 组无显著性差异 (P>0.05), 但 R100 组的 PER 显著低于 R0 组 (P<0.05) 2.2 脱脂磷虾粉对圆斑星鲽幼鱼非特异性免疫力的影响脱脂磷虾粉对圆斑星鲽幼鱼非特异性免疫力的影响见表 3 从表 3 可以看出,R10 R20 组和 R100 组血清中的 ACP 显著高于 R0 组 (P<0.05) 除 R20 组和 R0 组没有差异外, 其他各组血清中的 AKP 均显著高于 R0 组 (P<0.05) 血清中的 SOD 与 ACP 和 AKP 相比, 呈相反的趋势,R10 组与对照组 R0 组没有显著性差异 (P>0.05), 其他各组均显著低于 R0 组 (P<0.05) 肝脏中 ACP 和 AKP 没有明显的趋势,R10 组的肝脏 ACP 显著高于 R0 组 (P<0.05),R30 组 R40 组和 R100 组肝脏中 AKP 与 R0 组差异不显著 (P>0.05),R50 组肝脏中 SOD 显著高于 R0 组 (P<0.05), 其他各组间没有显著性差异 (P>0.05) 表 2 脱脂磷虾粉对圆斑星鲽幼鱼生长性能和饲料利用的影响 Tab.2 Effects of dietary skimmed krill meal on the growth performance and feed utilization of juvenile spotted halibut 组别 Groups 特定生长率 SGR (%/d) 存活率 SR(%) 饲料效率 FER(%) 蛋白质效率 PER(%) R0 1.47±0.07 a 96.66±3.33 a 87.06±1.33 a 1.74±0.03 ab R ±0.17 a 98.33±1.66 a 84.60±9.34 a 1.59±0.09 b R ±0.08 a 98.33±1.66 a 88.33±1.01 a 1.76±0.02 ab R ±0.09 a 98.33±1.66 a 85.22±3.79 a 1.70±0.08 ab R ±0.14 a 95.00±5.00 a 75.36±14.26 a 1.81±0.08 a R ±0.15 a 98.33±1.66 a 78.43±10.71 a 1.76±0.03 ab R ±0.32 b 53.33±28.03 b 19.94±10.42 b 0.60±0.06 c 注 : 同列相同字母上标表示差异不显著 (P>0.05), 不同上标字母表示差异显著 (P<0.05), 下表同 Note: The same superscript within the same column indicated no significant difference (P>0.05), the different superscript letters indicated significant difference (P<0.05). The same as below

113 110 渔业科学进展第 38 卷 组别 Groups Tab.3 酸性磷酸酶 ACP ( 金氏单位 /100 ml) 表 3 脱脂磷虾粉对圆斑星鲽幼鱼非特异性免疫力的影响 Effects of dietary skimmed krill meal on non-specific immunity of juvenile spotted halibut 血清 Serum 肝脏 Liver 碱性磷酸酶 AKP ( 金氏单位 /100 ml) SOD (U/ml) 酸性磷酸酶 ACP ( 金氏单位 /g prot) 碱性磷酸酶 AKP ( 金氏单位 /g prot) SOD (U/mg prot) R0 1.90±0.46 e 0.41±0.09 d 11.19±0.15 a ±52.33 b 32.95±4.11 a 95.37±3.97 b R ±0.11 b 0.82±0.15 c 11.55±0.37 a ±30.85 a 22.89±2.04 cd 76.93±1.02 b R ±0.16 a 0.76±0.05 cd 9.22±0.20 b ±8.37 e 23.39±1.14 bcd 77.13±3.28 b R ±0.07 de 0.82±0.15 c 7.33±0.27 c ±3.12 de 28.62±1.18 abc 83.04±2.45 b R ±0.15 cd 1.72±0.19 b 10.12±0.23 b ±5.00 bcd 34.59±1.25 a 85.74±2.19 b R ±0.05 f 1.01±0.05 c 8.21±0.72 c ±16.83 bcd 20.84±1.68 d ±33.15 a R ±0.09 bc 5.75±0.07 a 7.20±0.06 c ±17.75 de 29.43±1.96 ab 86.28±0.77 b 2.3 脱脂磷虾粉对圆斑星鲽幼鱼血清生理代谢指标的影响 脱脂磷虾粉对圆斑星鲽幼鱼血清生理代谢指标的影响见表 4 由表 4 可以看出, 血清中 TP 呈先增大后减小的趋势,R10 R50 组血清 TP 均显著高于 R0 组 (P<0.05),R100 组与 R0 组血清 TP 没有显著性差异 (P>0.05) 血清中的 GPT 和 GOT 组间差异不显著 (P>0.05) 表 4 脱脂磷虾粉对圆斑星鲽幼鱼血清生理代谢指标的影响 Tab.4 Effects of dietary skimmed krill meal on serum physiological metabolism indices of juvenile spotted halibut 组别 Groups 总蛋白 TP(g/L) 谷丙转氨酶 GPT(U/L) 谷草转氨酶 GOT(U/L) R ±0.10 c 2.15± ±0.47 R ±0.53 a 3.13± ±0.45 R ±0.23 a 2.59± ±1.65 R ±1.05 b 2.07± ±0.70 R ±0.04 b 2.36± ±0.04 R ±0.30 b 1.55± ±1.26 R ±0.26 c 3.11± ± 讨论 3.1 脱脂磷虾粉对圆斑星鲽幼鱼生长和饲料利用的影响 本研究中, 脱脂磷虾粉替代 10% 30% 鱼粉蛋白的实验组, 其 SGR SR 和 FER 与对照组 R0 相比, 基本持平, 没有显著性差异 目前, 主要是关于全脂磷虾粉在水产动物中应用的报道 南极磷虾全虾粉替代 0 10% 20% 30% 的鱼粉制成 4 组饲料投喂大西洋鲑 12 周, 实验组与对照组的增重和饲料效率没 有显著性差异 (Julshamn et al, 2004) 添加 1% 5% 和 11% 的磷虾粉和 2.5% 的磷虾油组成的 4 组等氮 等能饲料, 投喂凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 72 d, 在清水和绿水环境其生长性能也无显著性差异 (Nunes et al, 2011) 南极磷虾蛋白替代饲料中的 0 20% 40% 60% 的鱼粉蛋白制成 4 组等氮 等能的饲料, 投喂大菱鲆 (Scophthalmus maximus) 56 d, 实验组与对照组的 SGR 没有显著性影响 ( 孔凡华等, 2012) 同时, 魏佳丽等 (2015) 发现, 在珍珠龙胆石斑鱼 (Epinephelus fuscoguttatus Epinephelus lanceolatu ) 基础饲料中用酶解南极磷虾粉替代 0 50% 的鱼粉,PER 无组间差异 以上研究表明, 部分全脂磷虾粉替代鱼粉不会对水产动物造成不利影响, 与本研究有相同的结果 Yoshitomi 等 (2012) 用全脂磷虾粉替代 0 15% 和 100% 的鱼粉饲养黄尾 (Seriola quinqueradiata),100% 全脂磷虾粉组黄尾的增重和 SGR 均显著下降 但 Tibbetts 等 (2011) 用 0 25% 50% 75% 和 100% 的磷虾粉替代鱼粉饲养大西洋鳕鱼和大西洋大比目鱼 (Hippoglossus hippoglossus) 发现,100% 替代组的增重和 SGR 都显著高于其他各组 而本研究中, 替代比例为 100% 的实验组, 其 SGR SR FER 和 PER 均显著低于对照组 R0 可能存在的原因: 一是南极磷虾粉经过脱脂处理, 使得脱脂磷虾粉干物质中几丁质所占比例升高, 影响圆斑星鲽对其的利用 ; 二是饲料中过多的纤维素影响圆斑星鲽的吸收利用 目前, 在饲料中添加超过 10% 的纤维素会降低鱼类和对虾的生长已见相关报道 (Hilton et al, 2011; Shiau et al, 1988; Dioundick et al, 1990) 3.2 脱脂磷虾粉对圆斑星鲽非特异性免疫力的影响 ACP 作为溶酶体的标志酶, 直接参与磷酸基团的转运和代谢 ( 牟海津等, 1999) AKP 不仅参与到磷酸基团的转移, 更参与到钙磷的代谢 ( 张洪渊等, 1996) 本研究中,R10 R50 添加组幼鱼血清中 AKP

114 第 5 期郑建明等 : 脱脂磷虾粉对圆斑星鲽 (Verasper variegatus) 幼鱼生长 非特异免疫力和血清生理代谢指标的影响 111 活性均高于对照组, 与严俊丽等 (2016) 的研究结果一致 这可能是脱脂磷虾粉含有少量虾青素的缘故, 而 R100 添加组的 AKP 活性异常升高, 有可能超出正常范围, 表明在圆斑星鲽饲料中添加少量的脱脂磷虾粉会对鱼体的免疫力产生一定的促进作用 孔凡华等 (2012) 研究发现, 用南极磷虾粉蛋白替代 0 60% 的鱼粉蛋白对大菱鲆血清中的 AKP 和 ACP 无显著影响 同时, 魏佳丽等 (2015) 发现, 在珍珠龙胆石斑鱼基础饲料中用酶解南极磷虾粉替代 0 50% 的鱼粉, 对鱼体血清中的 AKP 无显著性影响, 这与本研究的结果不同, 可能是与鱼的种类及生活的水环境有关 SOD 参与清除体内自由基的同时, 也与生物的免疫水平密切相关 ( 刘恒等, 1998) 本研究中,10% 40% 脱脂磷虾粉添加组幼鱼肝脏中 SOD 活性无显著差异, 而 100% 添加组鱼体 SOD 的活性降低, 同时,20% 100% 添加组血清中的 SOD 活性均显著低于对照组, 这与魏佳丽等 (2015) 的研究结果不同, 说明过高水平的脱脂磷虾粉会导致鱼体的免疫力下降 这可能是未脱脂的南极磷虾粉富含虾青素, 使鱼体抗氧化能力增强, 而脱脂磷虾粉虾青素等类胡萝卜素含量少的缘故 3.3 脱脂磷虾粉对圆斑星鲽血清生理代谢指标的影响血清的 TP 作为机体蛋白质代谢水平和氨基酸代谢水平的重要指标 ( 丁立云等, 2010), 血清中 TP 含量增多, 对机体蛋白质代谢 氮沉积具有一定的促进作用 (Kanjanapruthipong, 1998; Coma et al, 1995) 本研究中,R10 R50 组血清 TP 均高于 R0 组, 与严俊丽等 (2016) 的研究结果一致 说明合适比例脱脂磷虾粉的添加对鱼体蛋白质代谢有一定的促进作用 魏佳丽等 (2015) 用 10% 20% 30% 40% 和 50% 比例的酶解磷虾粉替代鱼粉饲养珍珠龙胆石斑鱼, 发现各组间 TP 无显著性差异, 与本研究不一致, 这可能与鱼的种类及生活习性有关 GOT 和 GPT 在蛋白质代谢中具有重要的中介作用, 正常情况下, 其二者主要存在于肝脏中, 血清中的含量很少, 只有当细胞受损或细胞坏死时,GOT 和 GPT 才会大量进入血液, 因此, 血液中的 GOT 和 GPT 的含量可反映出肝脏的损伤情况 (Nyblom et al, 2004) 在本研究中, 脱脂磷虾粉添加组血清中的 GPT 和 GOT 组间无差异, 与魏佳丽等 (2015) 和严俊丽等 (2016) 的研究结果一致 表明在圆斑星鲽饲料中添加适量的脱脂磷虾粉对蛋白利用有一定的促进作用, 且不会对圆斑星鲽的肝脏造成损伤 4 结论 该研究表明, 在圆斑星鲽配合饲料中添加合适比例的脱脂磷虾粉可以达到和鱼粉相同的生长效果 综合本研究脱脂磷虾粉对圆斑星鲽幼鱼生长 非特异性免疫力和血清生理代谢指标的影响的数据, 在该实验条件下, 脱脂磷虾粉在圆斑星鲽配合饲料中替代鱼粉蛋白合适的比例为 10% 30% 致谢 : 本实验受到了山东烟台开发区天源水产有限公司和济宁普生海云生物科技有限公司技术人员的帮助, 特在此致谢! 参考文献 Chang Q, Qin BY, Kong FH, et al. Application of Antarctic krill in aquatic feed. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2013, 25(2): [ 常青, 秦帮勇, 孔繁华, 等. 南极磷虾在水产饲料中的应用. 动物营养学报, 2013, 25(2): ] Coma J, Carrion D, Zimmerman DR. Use of plasma urea nitrogen as a rapid response criterion to determine the lysine requirement of pigs. Journal of Animal Science, 1995, 73(2): Ding LY, Zhang LM, Wang JY, et al. Effects of dietary protein level on growth performance, body composition and plasma biochemistry indices of juvenile starry flounder, Platichys stellatus. Journal of Fishery Science of China, 2010, 17(6): [ 丁立云, 张利民, 王际英, 等. 饲料蛋白水平对星斑川鲽幼鱼生长 体组成及血浆生化指标的影响. 中国水产科学, 2010, 17(6): ] Dioundick OB, Stom DI. Effects of dietary α-cellulose levels on the juvenile tilapia, Oreochromis mossambicus (Peters). Aquaculture, 1990, 91(3 4): Hansen JØ, Penn M, Øverland M, et al. High inclusion of partially deshelled and whole krill meals in diets for Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture, 2010, 310(1 2): Hansen JØ, Shearer KD, Øverland M, et al. Replacement of LT fish meal with a mixture of partially deshelled krill meal and pea protein concentrates in diets for Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture, 2011, 315(3 4): Hilton JW, Atkinson JL, Slinger SJ. Effect of increased dietary fiber on the growth of rainbow trout. Canadian Journal of Fisheries & Aquatic Sciences, 2011, 40(1): Julshamn K, Malde MK, Bjorvatn K, et al. Fluoride retention of Atlantic salmon (Salmo salar) fed krill meal. Aquaculture Nutrition, 2004, 10(1): 9 13 Kanjanapruthipong J. Supplementation of milk replacers containing soy protein with threonine, methionine, and lysine in the diets of calves. Journal of Dairy Science, 1998, 81(11):

115 112 渔业科学进展第 38 卷 Karlsen Ø, Suontama J, Olsen RE. Effect of Antarctic krill meal on quality of farmed Atlantic cod (Gadus morhua, L.). Aquaculture Research, 2006, 37(16): Kong FH, Liang MQ, Wu LX, et al. Effect of different level of Antarctic krill meal on growth, non-specific immunity and fluoride retention in diets of turbot Scophthalmus maximus. Progress in Fishery Sciences, 2012, 33(1): [ 孔凡华, 梁萌青, 吴立新, 等. 南极磷虾粉对大菱鲆生长 非特异性免疫及氟残留的影响. 渔业科学进展, 2012, 33(1): 54 60] Liu H, Li GY. The effect of immunopolysaccharide as a food additive on the penaeid shrimp, Penaeus vannamei. Oceanologia et Limnologia Sinica, 1998, 29(2): [ 刘恒, 李光友. 免疫多糖对养殖南美白对虾作用的研究. 海洋与湖沼, 1998, 29(2): ] Mu HJ, Jiang XL, Liu SQ, et al. Effects of immunopolysaccharide on the activities of acid phosphatase, alkaline phosphatase and superoxide dismutase in Chlamys farreri. Journal of Ocean University of Qingdao, 1999, 29(3): [ 牟海津, 江晓路, 刘树青, 等. 免疫多糖对栉孔扇贝酸性磷酸酶 碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性的影响. 青岛海洋大学学报, 1999, 29(3): ] Nunes AJP, Sá MVC, Sabry-Neto H. Growth performance of the white shrimp, Litopenaeus vannamei, fed on practical diets with increasing levels of the Antarctic krill meal, Euphausia superba, reared in clear- versus green- water culture tanks. Aquaculture Nutrition, 2011, 17(2): e511 e520 Nyblom H, Berggren U, Balldin J, et al. High AST/ALT ratio may indicate advanced alcoholic liver disease rather than heavy drinking. Alcohol & Alcoholism, 2004, 39(4): Olsen RE, Suontama J, Langmyhr E, et al. The replacement of fish meal with Antarctic krill, Euphausia superba, in diets for Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture Nutrition, 2006, 12(4): Rungruangsaktorrissen K. Digestive efficiency, growth and qualities of muscle and oocyte in Atlantic salmon (Salmo salar L) fed with diets with krill meal as an alternative protein source. Journal of Food Biochemistry, 2006, 31(4): Shiau SY, Yu HL, Hwa S, et al. The influence of carboxymethylcellulose on growth, digestion, gastric emptying time and body composition of tilapia. Aquaculture, 1988, 70(4): Tibbetts SM, Olsen RE, Lall SP. Effects of partial or total replacement of fish meal with freeze-dried krill (Euphausia superba) on growth and nutrient utilization of juvenile Atlantic cod (Gadus morhua) and Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus) fed the same practical diets. Aquaculture Nutrition, 2011, 17(3): Tibbetts SM, Olsen RE, Lall SP. Effects of partial or total replacement of fish meal with freeze-dried krill (Euphausia superba) on growth and nutrient utilization of juvenile Atlantic cod (Gadus morhua) and Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus) fed the same practical diets. Aquaculture Nutrition, 2011, 17(3): Wei JL, Wang JY, Song ZD, et al. Effects of the partial substitute for fish meal by hydrolyzed krill meal on growth performance, the body composition and the serum biochemical parameters of juvenile pearl gentian grouper. Progress in Fishery Sciences, 2016, 37(1): [ 魏佳丽, 王际英, 宋志东, 等. 酶解磷虾粉替代鱼粉对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼生长性能 体组成及血清生化的影响. 渔业科学进展, 2016, 37(1): ] Yan JL, Chen SQ, Chang Q, et al. Effects of Antarctic krill meal replacing fish meal on growth performance, serum and liver biochemical indices and serum non-specific immune indices of juvenile spotted halibut (Verasper variegatus). Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(11): [ 严俊丽, 陈四清, 常青, 等. 南极磷虾粉替代鱼粉对圆斑星鲽幼鱼生长性能 血清和肝脏生化指标及血清非特异性免疫指标的影响. 动物营养学报, 2016, 28(11): ] Ye JS, Wang XQ, Ma S, et al. Studies on biological and advances of Verasper variegates. Fisheries Economy Research, 2006(6): 5 7 [ 叶建生, 王兴强, 马甡, 等. 圆斑星鲽的生物学特性及其研究进展. 渔业经济研究, 2006(6): 5 7] Yoshitomi B, Nagano I. Effect of dietary fluoride derived from Antarctic krill (Euphausia superba) meal on growth of yellowtail (Seriola quinqueradiata). Chemosphere, 2012, 86(9): Zhang HY, Liu KW, Shi AJ, et al. Isolation, purification and some kinetic properties of alkaline phosphatase from the mantle of Anodonta woodlana (heude). Acta Hydrobiologica Sinica, 1996, 20(1): [ 张洪渊, 刘克武, 石安静, 等. 背角无齿蚌碱性磷酸酶的分离 纯化及其动力学研究. 水生生物学报, 1996, 20(1): 57 62] ( 编辑冯小花 )

116 第 5 期郑建明等 : 脱脂磷虾粉对圆斑星鲽 (Verasper variegatus) 幼鱼生长 非特异免疫力和血清生理代谢指标的影响 113 Effects of Dietary Skimmed Krill Meal on the Growth, Non-Specific Immunity and Serum Physiological Metabolism Indices of Juvenile Spotted Halibut (Verasper variegatus) ZHENG Jianming 1,2, YAN Junli 1,2, CHEN Siqing 2, CHANG Qing 21, WANG Zhenjie 1,2, ZHAO Jiejie 1,2, LIU Changlin 2, HU Jiancheng 2 (1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai ; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao ) Abstract An 8-week feeding trial was conducted to evaluate the effects of dietary skimmed krill meal (SKM) on the growth performance, serum biochemical parameters and non-specific immunity of juvenile spotted halibut (Verasper variegatus). The basal diet was formulated with fishmeal and SKM as the protein resource, and fish oil as the lipid resource. The control diet (R0) did not contain SKM, and 6 other diets were supplemented with SKM at 6.33% (R10, 10% replacement of the fishmeal protein. The same were as follows, 12.66%(R20), 18.99%(R30), 25.32%(R40), 31.66%(R50) and 63.31%(R100). These diets were then fed to seven groups of juvenile spotted halibut with initial weight of (60.11±0.13) g. Results showed that the specific growth rate, survival rate and feed efficiency of R10 R50 groups were not significantly different from those of R0 (P>0.05), but it displayed a decreasing trend from R30. The hepatosomatic index and viscerosomatic index of R10 R30 groups were not significantly different from those of R0 (P>0.05). The serum acid phosphatase in R10 and R20 was significantly higher than that in R0 (P<0.05). The serum acid phosphatase of R30 was not different from that of R0 (P>0.05). The serum alkaline phosphatase in R30 R100 groups was significantly higher than that in R0 (P<0.05). The serum SOD of R10 was not different from that of R0 (P>0.05). The liver acid phosphatase in R10 was significantly higher than that in R0 (P<0.05). The liver alkaline phosphatase of R30 and R40 was not significantly different from that of R0 (P>0.05). The liver SOD of R10 R40 groups was not significantly different from that of R0 (P>0.05). The serum total protein of R10 R50 groups was significantly higher than that of R0 (P<0.05). There was no difference in the viscerosomatic index and glutamate dehydrogenase among groups (P>0.05). The results above showed that 10% 30% of SKM replacement might have the same effects on the growth performance, feed efficiency ratio and non-specific immunity of juvenile spotted halibut. Key words Spotted flounder Verasper variegatus; Skimmed krill meal; Growth; Non-specific immunity; Physiological metabolism 1 Corresponding author: CHANG Qing, changqing@ysfri.ac.cn

117 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 刺参 (Apostichopus japonicus) 9 月龄 * 主要经济性状遗传力的估计 1,3 和飞孙明超 3 王印庚杜佗 1,2 1,2 廖梅杰张文泽 1,21 1,2 李彬范瑞用 (1. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛 ; 2. 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室青岛 ; 3. 上海海洋大学上海 ;4. 青岛瑞滋海珍品发展有限公司青岛 ) 4 1,2 摘要本研究基于全同胞组内相关法对 9 月龄刺参 (Apostichopus japonicus) 苗种体长 体重 肉刺总数 3 个性状的遗传力进行了评估 以前期收集 保存的刺参群体为亲本, 选取了健康刺参 29 头, 采用不平衡巢式设计方法及人工刺激采卵授精方法, 按照 1 雌配 2 5 雄的原则, 构建了 6 个母系半同胞家系及 23 个父系全同胞家系, 至 9 月龄时, 分别抽取每个家系 个后代测定相应个体的体长 体重及肉刺总数, 应用数量遗传学分析和全同胞组内相关法估计刺参 9 月龄体长 体重和肉刺总数共 3 个生长性状的遗传力 结果显示,9 月龄刺参体长雌性组分遗传力的估计值为 0.87, 雄性组分遗传力估计值为 0.85, 全同胞组分遗传力估计值为 0.86; 刺参体重雌性组分遗传力估计值为 0.20, 雄性组分遗传力估计值为 0.73, 全同胞组分遗传力估计值为 0.46; 肉刺总数雌性组分遗传力估计值为 0.43, 雄性组分遗传力估计值为 0.32, 全同胞组分遗传力估计值为 0.37 t 检验表明, 体长 体重的雄性组分遗传力达到显著水平 (P<0.05), 全同胞组分遗传力均达到极显著水平 (P<0.01), 肉刺总数的遗传力均未达到显著水平 关键词刺参 ; 大规格苗种 ; 体长 ; 体重 ; 肉刺总数 ; 家系 ; 遗传力中图分类号 S966.9 文献标识码 A 文章编号 (2017) 刺参 (Apostichopus japonicus) 具有很高的药用和营养保健价值, 被称为 海产八珍 之首 ( 廖玉麟, 1997) 海参增养殖产业迅猛发展, 目前, 已形成以山东 辽宁 河北沿海为主产区 以 北参南养 和 东参西养 等模式延伸到福建 浙江沿海和以黄河三角洲地区为代表的刺参增养殖产业群, 年产量达 万 t 养殖面积达 21 万 hm 2, 产值约 200 亿元 ( 王印庚等, 2014) 然而, 随着产业规模的急剧扩大, 养殖刺参出现了生长缓慢 抗逆能力下降等种质退化 现象, 亟需开展刺参良种的选育工作 水产动物的大多数经济性状属于数量性状 遗传参数反映数量性状的基本遗传规律, 解析数量性状的遗传参数, 对水产动物养殖生产中良种生产性能的保持 重要经济性能的提高和新品种的培育等具有重要的指导意义 ( 陈国宏等, 2009) 国内外在遗传参数研究方面涉及的水产动物品种涵盖了鱼 贝 虾和蟹 ( 唐瞻杨等, 2015; Frizzas et al, 2009; Sun et al, 2015) 国内刺参遗传参数的研究主要集中在耳状幼体 ( 浮游幼体期 ) 及 3 4 月 * 青岛海洋科学与技术国家实验室鳌山科技创新计划项目深海专项 (201ASKJ14) 山东省农业良种工程重大课题和山东省自主创新成果转化专项 (2013ZHZX2A0801) 共同资助 [This work was supported by the Scientific and Technological Innovation Project Financially Supported by Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology (201ASKJ14), Agriculture Seed Improvement Project of Shandong Province, and Special Research Funds for Independent Innovation and Scientific & Technology Achievements Transformation of Shandong Province (2013ZHZX2A0801)]. 和飞, hlcastle@163.com 1 通讯作者 : 廖梅杰, 副研究员, liaomj@ysfri.ac.cn 收稿日期 : , 收修改稿日期 :

118 第 5 期和飞等 : 刺参 (Apostichopusjaponicus) 9 月龄主要经济性状遗传力的估计 115 龄稚参培育期 ( 李云峰等, 2009; 栾生等, 2006; 孟思远等, 2010), 对于幼参培育期刺参经济性状遗传力的研究尚未有报道 对于刺参而言, 在不同的生长发育阶段生物经济性状的遗传力不同, 其浮游幼体期个体小, 除体长性状外, 其余性状均难以测量 ; 稚参培育期, 部分性状尚未完全表征且耳状幼体期及 3 4 月龄的稚参培育期均存在母性效应 ( 栾生等, 2006; 孟思远等, 2010) 使遗传力估计值准确度偏低 因此, 开展大规格刺参苗种的经济性状遗传力研究具有更重要的现实意义 经济性状测量的准确性是遗传力精确评估的前提, 鉴于刺参特殊的生理生活习性, 目前, 可精确测定的经济性状主要有体长 体重和肉刺总数, 并建立了相关测量方法 ( 魏杰等, 2007; 廖梅杰等, 2011; Chang et al, 2011) 特别提出的是刺参的市场价格与刺型( 肉刺总数 ) 密切相关, 往往多刺型刺参产品的价格是寡刺型的一倍以上 本研究参照刺参性状精确测量的方法与要求, 以课题组前期收集 保存的刺参群体为亲本, 以 6 头雌性刺参为母本,23 头雄性刺参为父本, 构建了全同胞和半同胞家系, 并以此对 9 月龄的大规格刺参苗种体长 体重以及肉刺总数 3 个经济性状进行测量以及遗传力评估, 解析了大规格苗种的经济性状遗传参数, 以期为刺参良种选育提供基础数据 1 材料与方法 1.1 材料实验所用亲参为本课题组前期收集 保存的刺参群体, 亲参种群存放于种参养殖池 (6 m 16 m) 内, 采取升温促熟的方式进行亲参培育 待性腺发育成熟后, 自亲参种群中选取健康 活力强的个体作为亲本, 进行苗种繁育和家系构建 1.2 方法 家系建立 2014 年 3 月 29 日, 待亲参性腺发育成熟后, 每个群体选择 20 头, 每个个体单独放入 30 L 的塑料水槽, 阴干 30 min 21 海水流水刺激, 选择可成功产卵或排精的亲参个体共 29 头 (6 雌 23 雄 ), 对刺参产卵量计数后量取每头雌参约 粒卵子和适量精液, 同时放入新的水槽中进行人工授精, 按照每头雌参配 2 5 头雄参的原则, 构建了 6 个母系半同胞家系和 23 个全同胞家系 苗种培育将家系配伍形成的受精卵转入 400 L(80 cm 80 cm 60 cm) 的白色塑料水槽中培育, 孵化水温为 22 23, 光照为 lx, 持续微量充气, 在孵化过程中每隔 1 h 搅动 1 次, 使受精卵处于悬浮状态 在受精卵发育到浮游幼体时进行布苗, 布苗密度为 0.5 个 /ml, 待幼体变态附板后转入 2.5 m 1.2 m 1.5 m 的长方形水泥培育池中进行培育 对刺参家系进行单独培育, 保证培育过程中环境条件 ( 养殖水体体积 养殖用水的盐度和温度 光照 充气 饵料等 ) 的一致性, 并分别在浮游幼体期 3 月龄 6 月龄进行养殖密度的均一化, 使所有家系维持在相同的密度进行养殖管理 苗种培育过程中所用的饵料在浮 游期以盐藻 (Dunaliella salina) 角毛藻(Chaetoceros sp.) 等单胞藻和海洋红酵母为主, 后期以发酵饲料为主 海参饲料由海带 (Saccharina japonica) 石莼(Ulva lactuca) 扇贝边 马尾藻 (Scagassum sp.) 豆粕 贝壳 海泥等主要成分构成的粉末饲料, 加入酵母发酵 24 h 后投喂 每天换水 1/3, 其他按照刺参苗种培育过程进行正常管理 性状测量在 9 月龄时, 分别从每个家系中随机抽取刺参 30 头进行体长 体重测量, 取 50 头用于肉刺总数计数 体长 体重测量过程中, 用 0.6 mol/l 的 MgSO 4 溶液浸泡参苗, 待参苗麻醉后, 用圆规标定参苗长度后再用游标卡尺测量其体长, 精确到 0.01 cm; 用电子天平测量其体重, 精确到 0.01 g, 并记录每个刺参的肉刺总数 ( 魏杰等, 2007; 廖梅杰等, 2011) 数据处理对于相关性状的方差分析 (ANOVA) 通过 IBM SPSS 22.0 的 GLM (General Line Model) 过程实现, 在二因素系统分组设计下, 刺参相关性状的表型和遗传参数的估计采用数学模型为 : Xijk u Si dij eijk (1) 式中, X ijk 为第 k 个个体相应经济性状的测量值, u 为相应性状在所有个体中的总体平均值, S i 第 i 个母本所产生的雌性效应, d ij 为第 i 个母本内第 j 个父本所产生的雄性效应, e ijk 为随机误差 对于利用巢式遗传设计的全同胞资料的方差分析见表 1( 盛志廉等, 2001) 表 1 不平衡巢式遗传设计下全同胞资料表型变量组成的方差分析 Tab.1 Analysis of variance (ANOVA) for phenotypic variation components of the full-sib families using unbalanced nested design 变异来源 Source of variation 雌性间 Within dams 雌内雄间 Sires within dams 雌雄内后代个体间 Full-sibs 自由度 df D 1 S N D D 总和 Total N 1 平方和 SS SS D SS S SS e SS T 均方 MS 期望均方 EMS MS D e K2 s d MS 2 2 S e K1 s MS 2 e e

119 116 渔业科学进展第 38 卷 表中,N 为测量后代总数,S 为刺参父本数目, 2 2 D 为刺参母本数目 ; s 为父系半同胞方差 ; d 为母系 2 半同胞方差 ; e 为全同胞个体间方差 对于巢式不平衡设计, 为保证参数计算的准确性, 在进行遗传力估计之前需要对每个雄性亲本的后代数 每个雌性亲本的后代数和雌性亲本内与配的雄性亲本平均后代数进行加权校正, 具体计算方法如下 : 2 1 d si N ij K1 N S D (2) i 1 j 1 Ni d si N d si ij N ij K2 D 1 (3) i 1 j 1Ni. i 1 j 1 N d K i. 1 N N D N (4) i 1 式中, K 1 为每个刺参母本内与配的父本所测定的平均后代数 ; K 2 为每个刺参父本所测定后代数 ; K 3 为每个母本所测定的后代数 ; N i. 为第 i 头雌性亲本与配的所有雄性亲本所测定后代数 ; N ij 为第 i 头雌性亲本与配的第 j 头雄性亲本所测定的后代数目 遗传参数计算根据巢式遗传设计方差分析结果与期望均方联立方程求得各组分方差分析得到父系半同胞 母系半同胞和全同胞 3 个遗传力估计值 ( 盛志廉等, 2001), 半同胞狭义遗传力估计值为半同胞组内相关系数的 4 倍, 全同胞估计的狭义遗传力为全同胞组内相关系数的 2 倍, 即 : 父系半同胞 : 母系半同胞 : 全同胞 : h 2 s 2 s s d e h 4 2 d 2 d s d e h 4 2 sd 2 2 s d s d e 2 (5) (6) (7) 式中, h 2 s 为父系半同胞估计的狭义遗传力, h 2 d 为母系半同胞估计的狭义遗传力, h 2 为全同胞估计的 sd 狭义遗传力 为检测所估计的遗传力的准确性, 需要对其进行显著性检验 采用盛志廉等 (2001) 所推荐的 t 检验对全同胞资料遗传力估计值的显著性进行评价, 检验原则为以被检测的统计量除以它的标准误后, 再依据 t 分布临界值表进行判断 相应检验方法为 : (1) 雌性组分遗传力估计值 ( h ) 的 t 检验 : A 2 p 2 d MSs MS d (8) 2 K df 3 s df d 2 4 ( hd ) A (9) 2 d 2 hd h t (10) ( ) (2) 雄性组分遗传力估计值 ( h ) 的 t 检验 : B 2 s MSs MSe 2 df 1 s dfe 2 4 ( hs ) B 2 p K (11) (12) 2 s 2 hs h t (13) ( ) (3) 雌雄组分合并估计值 ( h ) 的 t 检验 : 2 结果 2 sd 2 K 1 2 2MS e C B K 2 3 K1 df e ( hsd ) ( A B 2 C) 相关性状的表型参数 p 2 sd 2 hsd (14) (15) h t (16) ( ) 由所测体长 体重和肉刺总数 3 个性状数据资料所计算出的 9 月龄刺参经济性状的平均值和标准差 (Mean±SD) 见表 2 从表 2 可以看出,9 月龄所有刺参体长平均值为 (4.66±0.06) cm, 体重的平均值为 (4.75± 表 2 9 月龄刺参相关性状的表型参数 Tab.2 Phenotypic parameters of growth-related traits of 9-month-old A. japonicus 参数 Parameters 性状 Traits 体长 Body length(cm) 体重 Body weight(g) 肉刺总数 ( 个 ) The number of pallet 家系个数 Number of families 标准差 SD 平均值 Mean 4.66± ± ±0.38 变异系数 CV

120 第 5 期和飞等 : 刺参 (Apostichopusjaponicus) 9 月龄主要经济性状遗传力的估计 ) g, 肉刺总数平均值为 (40.32±0.38) 个 体长和肉刺总数的变异系数分别为 0.33 和 0.31, 体重的变异系数为 1.04 体重的变异系数约为体长和肉刺总数变异系数的 3 倍, 属于强度变异, 体长和肉刺总数的变异系数大致相等, 属于中度变异 由此可见, 体长 体重和肉刺总数 3 个性状均具有很大的选择潜力 以家系为单因素对各经济性状的方差分析见表 3 从表 3 可以看出, 各相关性状在不同家系间差异极其显著 (P<0.01), 说明这些性状具有较大的选择潜力 2.2 相关性状的方差分析 9 月龄刺参体长 体重和肉刺总数 3 个经济性状的方差分析结果见表 4 从表 4 可以看出, 对于 9 月龄大规格刺参苗种, 其体长 体重和肉刺总数 3 个经济性状在雌性亲本间和雌内雄间的 F 检验均达到极显著水平 (P<0.01) 2.3 表型变量方差组分分析根据公式 (2) 公式 (4), 计算出 9 月龄雌性与配的雄性个体的有效平均后代数目 K 1 雄性个体的有效平均后代数目 K 2 和雌性个体的有效平均后代数目 K 3 对于性状体长 体重而言,K 1 = K 2 =30,K 3 = 对于性状肉刺总数而言 :K 1 =48.85 K 2 =49.13 K 3 = 根据方差分析结果, 以各变异来源的均方与其期望均方相对应的建立方程, 求解方差组分, 分析结果见表 5 从表 5 可以看出,9 月龄刺参体长的雄性组分方差为 0.52, 雌性组分方差为 0.53, 雌雄组分方差大致相等 ; 体重的雄性组分方差为 4.50, 雌性组分方差为 1.21, 雄性组分方差大于雌性组分方差 ; 肉刺总数的雌性组分方差为 17.63, 雄性组分方差为 13.22, 雌性组分方差大于雄性组分方差 说明性状体长 体重在雌性亲本间个体变异较小, 母性效应基本消失 Tab.3 表 3 不同家系间各相关性状表型值的单因素方差分析 One-way ANOVA of phenotypic parameters of growth-related traits between the different families of A.japonicus 性状 Traits 指标 Index 自由度 df 平方和 SS 均方 MS F 值 F-value 体长 Body length 体重 Body weight 肉刺总数 The number of pallet 家系间 Between families ** 家系内 Within families 总计 Total 家系间 Between families ** 家系内 Within families 总计 Total 家系间 Between families ** 家系内 Within families 总计 Total ** 为差异极显著 (P<0.01), * 为差异显著 (P<0.05), 下同 ** Denoted extremely significance (P<0.01), * Denoted significance (P<0.05), the same as below Tab.4 性状 Traits 表 4 9 月龄刺参相关性状表型变量组成的方差分析 Analysis of variance components for phenotypic variation of 9-month-old A. japonicus 变异来源 Source of variation 雌性间 Within dams 雌内雄间 Sires within dams 全同胞个体 Full-sibs df MS F df MS F df MS 总和 Total 体长 Body length ** ** 体重 Body weight ** ** 肉刺总数 The number of pallet ** ** 表 5 9 月龄刺参相关性状表型变量的原因方差分析 Tab.5 Analysis of causal variance components of phenotypic variances of 9-month-old A. japonicus 方差组分 性状 Traits Variance components 体长 Body length 体重 Body weight 肉刺总数 The number of pallet 2 σ d σ 2 s σ 2 e σ 2 p = σ 2 s + σ 2 d + σ 2 e σ 2 s + σ 2 d

121 118 渔业科学进展第 38 卷 2.4 相关性状的遗传力估计及显著性检验将各个表型变量原因方差组分依次代入公式 (5) 公式 (6) 公式(7), 计算得到 9 月龄刺参体长 体重和肉刺总数 3 个经济性状的雌性组分 雌性内雄间组分及全同胞组分估计的狭义遗传力, 根据公式 (8) 公式 (16) 计算的遗传力估计完成的显著性 t 检验的结果见表 6 从表 6 可以看出,9 月龄刺参体长雌性组分遗传力的估计值为 0.87, 雄性组分遗传力估计值为 0.85, 全同胞组分遗传力估计值为 0.86; 刺参体重雌性组分遗传力估计值为 0.20, 雄性组分遗传力估计值为 0.73, 全同胞组分遗传力估计值为 0.46; 肉刺总数雌性组分遗 传力估计值为 0.43, 雄性组分遗传力估计值为 0.32, 全同胞组分遗传力估计值为 0.37 显示 t 检验结果显示,9 月龄刺参的体长和体重的全同胞组分遗传力达到了极显著水平 (P<0.01), 而肉刺总数的全同胞组分的遗传力尚未达到显著水平 (P>0.05) 体长 肉刺总数 2 个性状的雌性组分遗传力大于雄内组分的遗传力, 而体重的雌性组分遗传力要小于雄性组分的遗传力, 这与方差组分分析结果一致 另外, 由 t 值可以看出, 性状体长 体重估计的遗传力比肉刺总数遗传力估计值要好, 全同胞组分遗传力估计值比雄性组分遗传力估计值好, 肉刺总数遗传力估计值均未达到显著水平 表 6 9 月龄刺参相关性状的遗传力估计及 t 检验 Tab.6 Estimation of heritability for different growth-related traits and t-test of 9-month-old A. japonicus 性状 Traits 遗传力估计方法 Estimation method of heritability 遗传力 Heritability t 值 t value 体长 Body length 体重 Body weight 肉刺总数 The number of pallet 雌性组分 Maternal half-sibs 雄性组分 Paternal half-sibs * 全同胞组分 Full-sibs ** 雌性组分 Maternal half-sibs 雄性组分 Paternal half-sibs * 全同胞组分 Full-sibs ** 雌性组分 Maternal half-sibs 雄性组分 Paternal half-sibs 全同胞组分 Full-sibs 讨论 3.1 方差组分估计方法的选择个体育种值和群体遗传参数估计值的准确性是决定指导育种实践准确性的关键影响因素 ( 王金玉等, 2004) 从统计学角度上分析, 对遗传参数的估计本质是对方差组分的剖分与估计, 其在遗传力 重复力和遗传相关 3 大群体遗传参数计算, 预测误差 方差和遗传评定以及对遗传改良的预测中方差组分估计有重要意义 ( 白俊艳等, 2006) 因此, 提高方差组分估计的准确性是育种学家所追求的一项指标 水产动物多具有高繁殖性能的特性, 因此, 在进行遗传参数估计时多采用同胞分析进行 同胞分析所采用的方差组分估计方法, 主要包括方差分析法 极大似然法 (ML) 和限制性极大似然法 (REML) 最小范数二次无偏估计 (MINQUE) 和最小方差二次无偏估计法 (MIVQUE) 贝叶斯法(Bayesian) 吉布斯抽样方法 ( 宋传文等, 2013) 国内外学者利用不同方差组分估计方法对相同群体进行遗传参数评估表明, 相应遗传评估方法各有特色 ( 张胜利等, 1995; 王勇强等, 1998; Duangjinda et al, 2001; Cantet et al, 2000), 应根据所研 究群体的家系背景 群体结构以及记录的完整性选取相应的方差组分估计方法 本研究按照不平衡巢式设计,Herdenson(1953) 所提出的不平衡数据方差组分估计方法仍有较大的使用价值, 鉴于目前刺参遗传力方差组分估计方法报道较少, 为了更方便的与前期刺参遗传力相关研究结果进行对比分析, 本研究采用方差分析法进行刺参遗传力评估, 后期将利用更精确的限制性极大似然法进行遗传力估计比较, 为刺参遗传力计算提供更全面的参考数据 针对不同的海水养殖经济物种, 研究人员采用了不同的分析方法对遗传力进行评估 田永胜等 (2015) 采用 加性 显性 线性模型 最小范氏无偏估计法对牙鲆 (Paralichthys olivaceus) 生长性状的边际平均值 狭义遗传力 广义遗传力 杂交随机效应等遗传参数进行了评估 王炳谦等 (2013) 采用吉布斯抽样方法估计虹鳟 (Oncorhynchus mykiss) IHN 抗抗病力方差组分并计算 IHNV 抗病遗传力, 并在此基础上进行了抗病家系研究 高保全等 (2015) 采用 REML 方法对 80 和 100 日龄三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus) 生长性状遗传力进行了估计, 结果显示, 所测性状均属于中低度遗传力且适合家系选择育种 在刺参生长性状

122 第 5 期和飞等 : 刺参 (Apostichopusjaponicus) 9 月龄主要经济性状遗传力的估计 119 遗传力方面, 李云峰 (2009) 利用 MTDREML 软件中的混合动物模型对耳状幼体阶段 ( 授精后第 5 天 ) 和稚参期 ( 授精后第 35 天 ) 刺参体长进行遗传力估计 栾生等 (2006) 和孟思远等 (2010) 采用父系全同胞组内相关法分别对耳状幼体期刺参体长及稚参期 (3 4 月龄 )4 个生长性状遗传力进行了估计 刺参存在变态发育过程, 在其浮游幼体期, 变态过程较快且形态与成参完全不同, 因此, 在该阶段仅能进行体长性状的遗传力评估, 无法获得体重 肉刺总数等相关经济性状的测定和分析 ; 在刺参的稚参阶段, 由于其肉刺总数等性状无法充分表征出来, 该阶段的肉刺总数遗传力评估的精确性受到较大限制 ; 随着刺参生长发育的进行, 其体长 体重 肉刺总数等经济性状充分表征, 测定的准确性和遗传力的准确性也随之提高, 对选育实践的指导意义也大幅提升 因此, 在对比前期研究基础之上, 本研究采用巢式遗传设计构建了 6 个母系半同胞家系, 23 个全同胞家系, 利用全同胞组内相关法对 9 月龄大规格苗种的遗传力进行了评估, 为更全面的解析刺参不同发育时期的重要经济性状遗传力提供参考资料 3.2 遗传力结果的分析目前, 国内外对于遗传力有诸多研究报道 罗坤等 (2015) 应用多性状动物模型对俄罗斯鲟 (Acipenser gueldenstaedti)150 日龄和 410 日龄的体长 体重遗传力进行了估计, 分别为 和 王正等 (2015) 对三疣梭子蟹 Ⅱ 期幼蟹和 80 日龄幼蟹耐低盐性状进行了遗传力估计, 发现耐低盐性状遗传力为低度遗传力, 由此确定家系选育法更适合三疣梭子蟹耐低盐新品种的选育途径 贾永义等 (2014) 利用半同胞组内相关分析法对日本沼虾 (Macrobrachium nipponense) 孵化后 65 d 和 97 d 体长 腹部长和体重 3 个性状的遗传力分析结果显示, 日本沼虾适合利用家系选择和群体间杂交方法进行性状选择 杨创业等 (2015) 估计了马氏珠母贝 (Pinctada martensi) 全同胞家系的壳长 壳宽 壳高的广义遗传力, 结果显示, 3 个性状的广义遗传力均超过 40%, 属于中等遗传力 国外的研究报道对研究对象的遗传参数比较深入全面,García-Celdrán 等 (2015a b c) 对金头鲷 (Sparus aurata) 的肉质性状 胴体性状及不同日龄生长性状和体型畸形率遗传参数做出了全面细致研究, 为西班牙沿岸金头鲷良种选育提供了理论指导和参考 Caballero- Zamora 等 (2015) 估计了凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 130 日龄体重的遗传力为 (0.19±0.03);Hu 等 (2014) 估计了 3 个不同时间段大规格虹鳟鱼全长 体重的遗传力, 其中, 体重的遗传力估计范围为 , 全长的遗传力估计范围为 由此可以 看出, 不同物种的体长和体重遗传力存在较大差别, 且同一物种在不同的发育生长阶段各性状遗传力也存在很大差别 目前, 国内外关于刺参遗传力的研究报道较少, 其中, 栾生等 (2006) 基于全同胞组内相关法估计了刺参耳状幼体初期和中期的遗传力, 实验中估计的刺参耳状幼体初期和中期体长的狭义遗传力分别为 和 , 属于高遗传力范围 李云峰等 (2009) 估计了刺参早期生长发育的遗传力, 结果显示, 耳状幼体阶段的体长遗传力为 0.29, 稚参阶段的体长遗传力为 0.49, 表明刺参的不同发育阶段体长的遗传力属于中度遗传力范围 孟思远 (2010) 等运用父系全同胞组内相关法估计了 3 月龄和 4 月龄仿刺参体长 体重 肉刺长度 肉刺总数的遗传力, 结果显示,4 个性状在不同发育阶段的遗传力属于中低度遗传力 为对比不同发育时期的遗传力, 本研究对大规格苗种时期 (9 月龄 ) 刺参的体长 体重 肉刺总数 3 个重要经济性状的遗传力进行评估, 结果发现, 刺参体长遗传力估计值与栾生等 (2006) 得出的刺参耳状幼体初期 0.74 和中期 0.75 遗传力估计值接近, 但要比孟思远等 (2010) 和李云峰等 (2010) 所估计的刺参体长遗传力估计值要高 刺参体重遗传力估计值中, 雌性组分半同胞遗传力估计值与孟思远等 (2010) 所得出 4 月龄刺参体重遗传力估计值 0.23 接近, 全同胞组分遗传力估计值要高于孟思远等 (2010) 所得出 3 4 月龄刺参体重遗传力估计值 (0.184 和 0.200) 综上所述, 刺参幼参各阶段体 长 体重的遗传力属于中高度遗传力, 说明这 2 个生长性状均处于加性效应的控制下, 其性状的表现型和基因型的相关程度较高, 由表现型判断基因型及由上代判断下代的命中率较高, 采用混合选择方式可获得较好的选育进展 9 月龄刺参肉刺总数遗传力估计值 t 检验结果不显著, 表明所得的估计值准确度欠佳, 分析其原因可能是由于抽样误差太大, 也可能由于刺参个体较小, 肉刺总数统计时存在较大的主观性 本研究所得出的遗传力数据补充和完善了刺参不同发育阶段的遗传力数据资料, 为刺参遗传育种提供了重要参考和指导 鉴于刺参不同发育阶段其遗传力存在较大的差异, 还需补充和深入研究刺参发育后期阶段和成参阶段相关经济性状的遗传参数 此外, 针对肉刺总数遗传力的估计需要规范肉刺总数统计的手段和方法, 为准确评估其遗传力奠定基础 参考文献 Bai JY, Zhang Q, Jia XP. Progress of the genetic parameter estimation methods for livestock and poultry. Modern Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,

123 120 渔业科学进展第 38 卷 2006(1): [ 白俊艳, 张勤, 贾小平. 畜禽遗传参数估计方法的研究进展. 现代畜牧兽医, 2006(1): 51 54] Caballero-Zamora A, Cienfuegos-Rivas EG, Montaldo HH, et al. Genetic parameters for spawning and growth traits in the pacific white shrimp (Penaeus (Litopenaeus) vannamei). Aquaculture Research, 2015, 46(4): Cantet RJC, Birchmeier AN, Santos-Cristal MG, et al. Comparison of restricted maximum likelihood and Method R for estimating heritability and predicting breeding value under selection. Journal of Animal Science, 2000, 78(10): Chang YQ, Shi SB, Zhao C, et al. Characteristics of papillae in wild, cultivated and hybrid sea cucumbers (Apostichopus japonicus). African Journal of Biotechnology, 2011, 10(63): Chen GH, Zhang Q. Animal genetic principle and breeding methods. Beijing: China Agriculture Press, 2009, [ 陈国宏, 张勤. 动物遗传原理与育种方法. 北京 : 中国农业出版社, 2009, ] Duangjinda M, Misztal I, Bertrand JK, et al. The empirical bias of estimates by restricted maximum likelihood, Bayesian method, and Method R under selection for additive, maternal, and dominance models. Journal of Animal Science, 2001, 79(12): Frizzas OG, Grossi DA, Buzanskas ME, et al. Heritability estimates and genetic correlations for body weight and scrotal circumference adjusted to 12 and 18 months of age for male Nellore cattle. Animal, 2009, 3(3): Gao BQ, Liu P, Li J. Analysis of the growth and breeding value of Portunus trituberculatus Huangxuan NO.1. Journal of Fishery Sciences of China, 2015, 22(1): [ 高保全, 刘萍, 李健. 三疣梭子蟹 黄选一号 生长和育种性能分析. 中国水产科学, 2015, 22(1): 44 50] García-Celdrán M, Ramis G, Manchado M, et al. Estimates of heritabilities and genetic correlations of carcass quality traits in a reared gilthead sea bream (Sparus aurata L.) population sourced from broodstocks along the Spanish coasts. Aquaculture, 2015a, 446: García-Celdrán M, Ramis G, Manchado M, et al. Estimates of heritabilities and genetic correlations of growth and external skeletal deformities at different ages in a reared gilthead sea bream (Sparus aurata L.) population sourced from broodstocks along the Spanish coasts. Aquaculture, 2015b, 445: García-Celdrán M, Ramis G, Manchado M, et al. Estimates of heritabilities and genetic correlations of raw flesh quality traits in a reared gilthead sea bream (Sparus aurata L.) population sourced from broodstocks along the Spanish coasts. Aquaculture, 2015c, 446: Henderson CR. Estimation of variance and covariance components. Biometrics, 1953, 9(2): Hu G, Gu W, Jiang ZS, et al. Heritability estimates and genetic correlations among body weight and measurement traits of large-size rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, in China. Journal of the World Aquaculture Society, 2014, 45(6): Jia YY, Gu ZM, Yang YJ, et al. Initial family construction and heritability estimates for growth-related traits in Macrobrachium nipponensis. Journal of Zhejiang Ocean University (Natural Science), 2014, 33(2): [ 贾永义, 顾志敏, 杨元杰, 等. 日本沼虾家系的初步构建及生长相关性状的遗传力估计. 浙江海洋学院学报 ( 自然科学版 ), 2014, 33(2): ] Li YF, Chang YQ, Wang SH, et al. Heritability of early growth traits in larval and juvenile sea cucumber (Apostichopus japonicus). Journal of Dalian Fisheries University, 2009, 24(1): [ 李云峰, 常亚青, 王诗欢, 等. 仿刺参耳状幼体和稚参阶段的体长遗传力估计. 大连水产学院报, 2009, 24(1): 30 33] Liao MJ, Wang YG, Hao ZK, et al. Method for measuring body weight of live Apostichopus japonicus. ZL [ 廖梅杰, 王印庚, 郝志凯, 等. 活体刺参体重测量方法. 专利号 : ZL , 2010] Liao YL. Fauna sinica, Echinodermata, Holothuroidea. Beijing: Science Press, 1997 [ 廖玉麟. 中国动物志, 棘皮动物门, 海参纲. 北京 : 科学出版社, 1997] Luan S, Sun HL, Kong J. Heritability of auricularia larval body length for sea cucumber Apostichopus japonicus Selenka. Journal of Fishery Sciences of China, 2006, 13(3): [ 栾生, 孙慧玲, 孔杰. 刺参耳状幼体体长遗传力的估计. 中国水产科学, 2006, 13(3): ] Luo K, Xia YT, Wang B, et al. Estimates of genetic growth trait parameters during early development of Acipenser gueldenstaedtii. Journal of Fishery Sciences of China, 2015, 22(3): [ 罗坤, 夏永涛, 王斌, 等. 俄罗斯鲟早期生长性状遗传参数的估计. 中国水产科学, 2015, 22(3): ] Meng SY, Chang YQ, Li WD, et al. Heritability of four growth traits in juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus. Journal of Dalian Ocean University, 2010, 25(6): [ 孟思远, 常亚青, 李文东, 等. 仿刺参幼参阶段 4 个生长性状遗传力的估计. 大连海洋大学学报, 2010, 25(6): ] Sheng ZL, Chen YS. Quantitative genetics. Beijing: Science Press, 2001, [ 盛志廉, 陈瑶生. 数量遗传学. 北京 : 科学出版社, 2001, 60 74] Song CW, Yan XW, Sang ST, et al. Estimates for the heritability of growth of Mytilus edulis. Journal of Fisheries of China, 2013, 37(2): [ 宋传文, 闫喜武, 桑士田, 等. 紫贻贝生长性状的遗传力估计. 水产学报, 2013, 37(2): ] Sun MM, Huang JH, Jiang SG, et al. Estimates of heritability and genetic correlations for growth-related traits in the tiger prawn Penaeus monodon. Aquaculture Research, 2015, 46(6): Tang ZY, Chen WZ, Luo YJ, et al. Estimating quantitative trait heritability for Tilpapia nilotica of different months. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2015, 46(5): [ 唐瞻杨, 陈文治, 罗永巨, 等. 尼罗罗非鱼 (Tilapia nilotica) 不同月龄数量性状遗传力估计. 海洋与湖沼, 2015, 46(5): ] Tian YS, Chen HL, Qi WS, et al. Establishment and estimated genetic effects of Paralichthys olivaceus F3 families. Acta Oceanologica Sinica, 2015, 37(4): [ 田永胜, 陈红林, 齐文山, 等. 牙鲆选育 F3 代家系的建立及遗传效应分析. 海洋学报, 2015, 37(4): 40 51] Wang BQ, Jiang ZS, Hu G, et al. Estimation of genetic parameters for resistance to infectious hematopoietic necrosis and screening for higher resistance families in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Journal for Northeast Agricultural University, 2013, 44(9): [ 王炳谦, 姜再胜, 户国, 等. 虹鳟 ((Oncorhynchus Mykiss)) 传染性造血器官坏死病 (IHN) 抗病力遗传参数估计及其抗病家系筛选. 东北农业大学学报, 2013, 44(9): ] Wang JY, Chen GH, Yang ZP, et al. Quantitative genetics and

124 第 5 期和飞等 : 刺参 (Apostichopusjaponicus) 9 月龄主要经济性状遗传力的估计 121 animal breeding. Nanjing: Southeast University Press, 2004 [ 王金玉, 陈国宏, 杨章平, 等. 数量遗传与动物育种. 南京 : 东南大学出版社, 2004] Wang YG,Rong XJ, Liao MJ, et al. Sea cucumber culture and disease control technology. Beijing: China Agriculture Press, 2014, [ 王印庚, 荣小军, 廖梅杰, 等. 刺参健康养殖与病害防控技术丛解. 北京 : 中国农业出版社, 2014, 90 91] Wang YQ, Zhang Y, Zhang Q, et al. The simulation study on the effect of ML and Reml Method used for variance components estimation. Journal of Yellow Cattle Science. 1998, 24(3): 9 12 [ 王勇强, 张沅, 张勤, 等. ML 法和 REML 法方差组分估计效率的 Monte Carlo 模拟研究. 黄牛杂志, 1998, 24(3): 9 12] Wang Z, Gao BQ, Liu P, et al. Estimation of the heritability tolerance to low-salinity in Portunus trituberculatus. Progress in Fishery Sciences, 2015, 36(3): [ 王正, 高保全, 刘萍, 等. 三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus) 耐低盐的遗传力估计. 渔业科学进展, 2015, 36(3): 74 78] Wei J, Chang YQ, Nie ZL, et al. Method for accurately measuring body length of living Stichopus japonicus. ZL , 2007 [ 魏杰, 常亚青, 聂竹兰, 等. 准确测量活体刺参体长的方法. 专利号 : ZL , 2007] Yang CY, Wu DY, Wang QH, et al. Heritability estimation for growth traits of Pinctada martensili. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2015, 31(23): [ 杨创业, 吴丹阳, 王庆恒, 等. 马氏珠母贝生长性状遗传力估计. 中国农学通报, 2015, 31(23): 25 29] Zhang SL, Yang XW, Jin MW, et al. Comparison of methods for estimating genetic parameters. Hereditas, 1995, 17(6): [ 张胜利, 杨秀文, 靳明武, 等. 遗传参数不同估计方法的比较. 遗传, 1995, 17(6): 21 23] ( 编辑陈严 ) Estimation of the Heritability of Three Economic Traits in 9-month-old Sea Cucumber Apostichopus japonicus HE Fei 1,3, WANG Yingeng 1,2, LIAO Meijie 1,21, LI Bin 1,2, SUN Mingchao 3, DU Tuo 1,2, ZHANG Wenze 1,2, FAN Ruiyong 4 (1. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao ; 2. Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao ; 3. Shanghai Ocean University, Shanghai ; 4. Qingdao Ruizi Seafood Development Co., Ltd, Qingdao ) Abstract Heritability is the most basic parameter for estimation of selection effect, breeding value and comprehensive selection index. It is widely applied in the determination of the selection method and artificial breeding practice. In this study, the heritability of body length, body weight and the number of pallet were estimated in 9-month-old sea cucumber (Apostichopus japonicus), with the goal of providing heritability reference for breeding practice. A total of 29 mature sea cucumbers from five different populations were selected as parents. Six dams and twenty-three sires were mated by unbalanced nested design using artificial insemination. Each dam was mated with 2 to 5 sires, producing 6 half-sib families and 23 full-sib families. Full-sib families were reared separately under identical environmental conditions. Thirty to fifty individuals from each full-sib family were randomly selected for assessment of three economic traits: body length, body weight and the number of pallet in 9-month-old sea cucumber. The heritability of body length, weight and the number of pallet was compared statistically using GLM (General Linear Model) procedure of the SPSS software. The results indicated that the heritability of body length in full-sibs, maternal half-sibs and paternal half-sibs was estimated to be 0.86, 0.87 and 0.85, respectively. The heritability of body weight in full-sibs, maternal half-sibs and paternal half-sibs was estimated to be 0.46, 0.20 and 0.73, respectively. The heritability of the number of pallet in full-sibs, maternal half-sibs and paternal half-sibs was estimated to be 0.37, 0.43 and 0.32, respectively. Results obtained from t test showed that the heritability of body length and body weight in paternal half-sibs was significant (P<0.05), and the heritability of body length and body weight in full-sibs was highly significant (P<0.01). By contrast, the heritability of the number of papilla in full-sibs, maternal half-sibs and paternal half-sibs was not significant. The estimation of heritability of the three economic traits in the large-scale seeding program could provide theoretical basis and technical reference for future artificial breeding of A. japonicus. Key words Apostichopus japonicus; Large-scale seeds; Body length; Body weight; Number of pallet; Full-sib family; Heritability 1 Corresponding author: LIAO Meijie, liaomj@ysfri.ac.cn

125 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 不同浒苔型饲料对幼刺参 (Apostichopus japonicus) * 生长 消化及非特异性免疫的影响 李 猛 1,2 廖梅杰荣小军 1 1 常高 青磊 11 4 王印庚 3 范瑞用 (1. 中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室青岛 ;2. 上海海洋大学水产与生命学院上海 ; 3. 青岛瑞滋海珍品发展有限公司青岛 ;4. 蓬莱市大柳行兽医站烟台 ) 1 李 彬 1 摘要以浒苔 石莼 豆粕 扇贝边 葡萄糖 贝壳粉 维生素和矿物质预混料为原料配制刺参 (Apostichopus japonicus) 饲料, 利用酿酒酵母菌菌液和碱性蛋白酶制剂对刺参饲料进行 4 种不同的处理, 得到 5 组实验用饲料, 分别为对照组 发酵组 酶解组 复合组和鲜浒苔组 将上述饲料饲喂初始体重为 (1.92±0.02) g 的幼刺参 42 d, 每种饲料设 3 个重复, 每个重复 30 头幼刺参 结果显示, 不同的浒苔型饲料对幼刺参的存活率 (SR) 增重率(WGR) 特定生长率(SGR) 和饲料系数 (FC) 有显著影响 (P<0.05), 而对其脏壁比 (R) 无显著性影响 (P>0.05) 复合组和鲜浒苔组 SR 要显著高于酶解组 (P<0.05), 而与其他 2 组均无显著性差异 (P>0.05) 鲜浒苔组 WGR 远高于其他各组 (P<0.05), 而复合组和发酵组 WGR 显著高于酶解组 (P<0.05), 与对照组差异不显著 (P>0.05) 幼刺参的 SGR 规律与 WGR 一致 鲜浒苔组 FC 显著低于对照组 发酵组和酶解组 (P<0.05), 与复合组差异不显著 (P>0.05) 随着摄食饲料时间的推移, 对照组 发酵组 复合组和鲜浒苔组淀粉酶 (AMS) 活力先升高再下降后趋于稳定, 而酶解组一直呈现下降趋势 酶解组纤维素酶 (Cellulase) 活力呈现一直下降的趋势, 而其他组呈现波动变化, 且均高于初始活力值 随着摄食饲料时间的推移, 除酶解组外, 其余各组胰蛋白酶 (TRY) 活力前后时间点变化差异不大, 且每个采样点幼刺参 TRY 活力大小顺序始终是对照组 > 复合组 > 鲜浒苔组 > 发酵组 > 酶解组 不同浒苔型饲料饲喂的幼刺参体腔液中酸性磷酸酶 (ACP) 碱性磷酸酶(AKP) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 活力均有显著性差异 (P<0.05) 鲜浒苔组 ACP 活力最大, 且与复合组无显著性差异 (P>0.05), 而显著高于其他 3 组 (P<0.05) 鲜浒苔组和复合组 AKP 活力显著高于酶解组和对照组 (P<0.05), 与发酵组无显著性差异 (P>0.05) 复合组 SOD 活力最大, 且显著高于发酵组和酶解组 (P<0.05), 而与对照组和鲜浒苔组均无显著性差异 (P>0.05) 由此得出, 幼刺参在摄食先酶解后发酵的饲料后能够得到良好的生长效果, 并可改善自身肠道消化, 维持正常免疫 这为解决刺参饲料原料短缺以及浒苔高值化利用提供了依据和方法 关键词浒苔 ; 刺参 ; 发酵 ; 酶解 ; 生长 ; 消化 ; 非特异性免疫中图分类号 S965 文献标识码 A 文章编号 (2017) * 青岛市战略性新兴产业培育计划项目 ( hy) 青岛市民生科技计划项目( hy) 和青岛市市南区科技发展资金项目 ( SW) 共同资助 [This work was financially supported by the Science and Technology Program of Qingdao ( hy, hy and SW)]. 李猛, @qq.com 1 通讯作者 : 常青, 研究员, changqing@ysfri.ac.cn 收稿日期 : , 收修改稿日期 :

126 第 5 期李猛等 : 不同浒苔型饲料对幼刺参 (Apostichopus japonicus) 生长 消化及非特异性免疫的影响 123 浒苔 (Enteromorpha prolifera) 是一种底栖大型经济类绿藻 ( 王晓坤等, 2007), 自然繁殖能力强, 产量大, 在我国南 北方各海域均有分布 ( 张智芳等, 2009), 具有蛋白质种类丰富 碳水化合物含量高及矿物质均衡等特点 ( 徐大伦等, 2003; 李月欣等, 2015), 是一种潜在的优质饲料原料 目前, 由于刺参 (Apostichopus japonicus) 优质的天然饵料鼠尾藻 马尾藻等资源日渐匮乏, 有关浒苔作为刺参饲料添加成分的研究得到了广泛开展 这些研究多集中于浒苔干粉直接替代或对浒苔进行单一预处理等方面 ( 廖梅杰等, 2011; 朱建新等, 2009; 姜燕, ) ) 本研究通过有效结合微生物发酵技术与碱性蛋白酶 (Alkaline protease) 酶解技术, 以浒苔为饲料原料, 制作 5 组不同的浒苔型饲料, 研究其对幼刺参的生长 消化和非特异性免疫的影响, 确定了浒苔生物饲料的制备工艺, 为提高浒苔利用率 制作优质刺参配合饲料提供了一定的参考依据和理论支持 1 材料与方法 1.1 实验材料本实验所用浒苔于 2015 年 6 月中旬, 在山东省青岛市第一海水浴场采集获得 鲜浒苔经海水洗涤 去沙处理后, 一部分在 50 下烘干 粉碎 80 目过筛后, 20 下保存备用, 另一部分采用半自动匀浆机进行匀浆, 然后 20 下保存备用 本实验中采用的发酵菌种为酿酒酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae, 编号为 CICC1251), 购自中国工业微生物菌种保藏管理中心, 活化培养后经梯度耐盐筛选得到 在液体酵母浸出粉胨葡萄糖培养基 (Yeast extract peptone dextrose medium, YPD)( 赵斌等, 2002) 中 r/min 的恒温振荡培养 18 h, 所得菌悬液即为实验用发酵菌悬液 本实验采用的碱性蛋白酶购自诺维信 ( 中国 ) 生物技术有限公司, 活力为 2.4 AU/ml 1.2 实验饲料配方与制备 基础饲料配方采用浒苔粉 石莼粉 豆粕 扇贝边粉 葡萄糖 贝壳粉 维生素预混料 矿物质预混料为 的配比, 制成粗蛋白质为 19.16% 粗脂肪为 1.60% 的刺参 配合饲料 实验饲料的制备对照组 : 按照表 1 中的实验配方配制饲料 ; 酶解组 : 添加 8 的碱性蛋白酶对基础饲料进行酶解 ( 酶解条件 :50,2.5 h)( 以干物质计 ), 在 90 下灭活 15 min 发酵组 : 利用酿酒酵母菌菌液对基础饲料进行发酵 ( 发酵条件 :35 24 h 含水量 80% 接种量 16%) 复合组 : 先用碱性蛋白酶对基础饲料进行酶解 (8 剂量,50,2.5 h) 后, 在 90 下灭活 15 min, 再利用酿酒酵母菌菌液对酶解饲料发酵 ( 发酵条件 : h 含水量 80% 接种量 16%) 表 1 基础饲料组成及营养水平 Tab.1 Composition and nutrient levels of the basal experimental diets(dm) 原料 Ingredients 含量 Content(%) 浒苔粉 Enteromorpha prolifera powder 石莼粉 Ulva lactuca powder 豆粕 Soybean meal 8.00 扇贝边粉 Scallop side powder 葡萄糖 Glucose 1.00 贝壳粉 Shell powder 4.00 维生素预混料 Vitamin premix 矿物质预混料 Mineral premix 合计 Total 营养水平 Nutrient levels 粗蛋白质 Crude protein 粗脂肪 Ether extract : 每千克维生素预混料 Containing the following per kg of vitamin premix: V A IU, V D IU, V E 5000 mg, V B mg, V B mg, V B6 800 mg, V B12 5 mg, V C mg, V K mg, 生物素 Biotin 30 mg, 肌醇 Inositol mg, 叶酸 Folic acid 300 mg, 泛酸钙 Calcium pantothenate 3000 mg, 烟酸 Nicotinic acid mg 2: 每千克矿物质预混料含有 Containing the following per kg of mineral premix:cu 1500 mg, Se 25 mg, Fe 5000 mg, Co 500 mg, I 150 mg, Zn 2000 mg 鲜浒苔组 : 称取 40% 的鲜浒苔匀浆, 再与其他提前配合好的饲料成分 ( 干物质重量比 60%) 充分混合 ; 酶的用量为混合饲料干重的 8,pH 为 9 11, 含水量 75%, 反应温度为 50, 反应时间为 2.5 h; 酶解完成 1) Jiang Y. Study on the processing technology and application of fermentation feed for sea cucumber Apostichopus japonicas. Doctoral Dissertation of Ocean university of China, 2014, [ 姜燕. 刺参 (Apostichopus japonicas) 发酵饲料的制作工艺与应用效果研究. 中国海洋大学博士研究生学位论文, 2014, 43 72]

127 124 渔业科学进展第 38 卷 后对碱性蛋白酶进行灭活处理 然后进行微生物发酵, 酿酒酵母培养液的用量为饲料干重的 16%, 发酵基质含水量 80%, 反应温度为 35, 反应时间为 24 h, 发酵期间每 2 h 搅拌混匀 1 次, 反应结束后 20 低温保存 1.3 养殖实验分组与管理 养殖实验分组实验用幼刺参由山东青岛瑞滋海珍品发展有限公司提供, 为当年 3 月中旬同批次繁育的苗种, 挑选出体格健壮 活力良好 平均体重为 (1.92±0.02) g/ 头的刺参, 随机分为 5 组, 每组设 3 个重复, 每个重复 30 头, 称重之后放入 40 L 塑料水槽中暂养 养殖实验管理实验于 2015 年 8 月 14 日 2015 年 9 月 25 日在青岛瑞滋海珍品发展有限公司水族车间内进行, 共计 42 d 实验期间的海水盐度为 30 32, 溶氧浓度为 mg/l,ph 为 , 连续充气, 水温变化见图 1 每天 08:00 换水 1/4 1/2, 09:30 将饲料与海泥按 1 1 ( 以干重计 ) 的比例混合 浸泡 ;16:30 左右, 将浸泡后的混合料充分搅拌 均匀泼洒, 投喂量按刺参总重量的 3% 计算, 并根据刺参摄食情况及养殖用水透明度适时调整 定期观察刺参摄食情况, 并检查充氧设施工作状况 整个实验期间, 每 2 d 吸底 1 次 ; 每天记录水温 饲料投喂量 刺参摄食状况和死亡数目 活力的测定 指标测定计算幼刺参的成活率 (Survival rate, SR) 增重率(Weight gain rate, WGR) 特定生长率 (Specific growth rate, SGR) 饲料系数(Food coefficient, FC) 和脏壁比 (R) 各指标计算公式如下: SR(%)=100 终末刺参头数 / 初始刺参头数 ; WGR(%)=100 ( 终末平均体重 初始平均体重 )/ 初始平均体重 ; SGR(%/d)=100 (ln 终末平均体重 ln 初始平均体重 )/ 养殖天数 ; FC= 饲料投喂量 / 增重量 ; R(%)=100 内脏团重量 / 体壁重量粗蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法 (VELP, UDK-142 Automatic Distillation Unit, 意大利 ); 粗脂肪含量的测定采用索氏抽提法 ( 石油醚为抽提液 ) (FOSS 脂肪测定仪 SOXTEC-2050, 瑞士 ) 样品 ACP AKP SOD AMS 活力和蛋白质浓度, 采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定, 酶活力以比活力表示 ;TRY 活力的测定参照 Erlanger 等 (1961) 的方法 ; 纤维素酶活力的测定采用 3,5- 二硝基水杨酸法 ( 中山大学生物化学教研室, 1978) 1.5 数据处理与分析实验数据先采用 Excel 2010 进行数据统计与分析, 再采用 SPSS 17.0 进行单因素方差分析 (One-way ANOVA) 和 Duncan 氏多重比较进行统计分析, 设定显著水平为 P<0.05 实验结果以平均值 ± 标准误 (Mean±SE) 表示 2 结果 2.1 不同浒苔型饲料对幼刺参生长性能的影响 Fig 样品采集与测定 图 1 实验期间水温变化趋势 The variation of the water temperature during the experiment 样品的采集与处理在实验 0 d 时随机取出 4 头幼刺参,14 d 28 d 42 d 时各组随机取 3 头幼刺参, 解剖后取出肠道, 并将肠道内容物清理干净, 进行淀粉酶 (Amylase, AMS) 纤维素酶(Cellulase) 和胰蛋白酶 (Trypsin, TRY) 活力的测定 实验结束后, 取体壁 内脏团称重, 用于计算脏壁比 (Ratio of viscera to body wall, R); 抽取体腔液用于酸性磷酸酶 (Acid phosphatase, ACP) 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP) 和超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase, SOD) 由表 2 可知, 不同的浒苔型饲料对幼刺参的 SR WGR SGR 和 FC 有显著性影响 (P<0.05), 而对幼刺参的 R 影响不显著 (P>0.05) 复合组与鲜浒苔组中幼刺参的 SR 显著高于酶解组 (P<0.05), 而与其他 2 组均无显著性差异 (P>0.05) 鲜浒苔组中幼刺参的 WGR 远高于其他各组 (P<0.05), 而复合组与发酵组的 WGR 显著高于酶解组 (P<0.05), 与对照组差异不显著 (P>0.05) 幼刺参的 SGR 规律与 WGR 相一致 鲜浒苔组中幼刺参的 FC 显著低于对照组 发酵组和复合组 (P<0.05), 与复合组差异不显著 (P>0.05) 2.2 不同浒苔型饲料对幼刺参消化酶活力的影响由图 2 可知, 随着摄食饲料时间的推移, 对照组 发酵组 复合组和鲜浒苔组中幼刺参肠道 AMS 活力先升高再下降后趋于稳定, 而酶解组中一直呈现下降

128 第 5 期李猛等 : 不同浒苔型饲料对幼刺参 (Apostichopus japonicus) 生长 消化及非特异性免疫的影响 125 表 2 不同的浒苔型饲料对刺参生长性能的影响 Tab.2 Effects of different E. prolifera-diets on the growth performance of A. japonicus 组别 Groups 成活率 SR (%) 脏壁比 R (%) 增重率 WGR (%) 特定生长率 SGR (%/d) 饲料系数 FC 对照组 Control group 93.33±1.93 ab 0.52± ±0.09 ab 1.45±0.10 ab 1.77±0.11 b 发酵组 Fermented group 93.33±1.93 ab 0.55± ±0.03 b 1.69±0.04 b 1.65±0.08 b 酶解组 Hydrolyzed group 91.11±1.11 a 0.41± ±0.06 a 1.27±0.13 a 2.53±0.21 a 复合组 Composite group 97.78±2.22 b 0.49± ±0.01 b 1.68±0.07 b 1.53±0.03 bc 鲜浒苔组 Fresh group 97.78±1.11 b 0.51± ±0.09 c 1.99±0.11 c 1.12±0.04 c 注 : 同列数据肩标不同字母表示差异显著 (P<0.05) 下同 Note: Values in the same column with different letter superscripts were significantly different (P<0.05). The same as below (P<0.05), 且其余 3 组之间均无显著性差异 (P>0.05) 第 6 周, 鲜浒苔组中肠道 TRY 活力显著低于对照组 (P<0.05), 与复合组之间无显著性差异 (P>0.05), 但显著高于发酵组和酶解组 (P<0.05) Fig.2 图 2 幼刺参肠道淀粉酶活力的变化 The variation of the intestinal AMS activity of juvenile A. japonicus 趋势 第 2 周, 发酵组中幼刺参的 AMS 活力与对照组无显著差异 (P>0.05), 均显著高于酶解组 (P<0.05), 且显著低于鲜浒苔组和复合组 (P<0.05), 二者之间无显著性差异 (P>0.05) 在第 4 6 周, 各组中幼刺参的 AMS 活力的变化与第 2 周时相一致 由图 3 可知, 酶解组幼刺参肠道纤维素酶活力呈现一直下降的趋势, 而其他组呈现波动变化, 且均高于初始活力值 第 2 周, 复合组中幼刺参肠道纤维素酶活力最高, 显著高于酶解组和对照组 (P<0.05), 而与鲜浒苔组和发酵组无显著性差异 (P>0.05) 第 4 周, 发酵组幼刺参纤维素酶活力最高, 而各组中的肠道纤维素酶活力之间的规律与第 2 周基本相一致 第 6 周, 复合组中幼刺参肠道纤维素酶活力最高, 且显著高于其他各组 (P<0.05), 而鲜浒苔组 发酵组和对照组之间无显著差异 (P>0.05), 但均显著高于酶解组 (P<0.05) 由图 4 可知, 随着摄食饲料时间的推移, 除酶解组外, 其余各组中幼刺参肠道 TRY 活力前后时间点变化差异不大, 且在 3 个时间点上幼刺参肠道 TRY 活力大小顺序始终是对照组 > 复合组 > 鲜浒苔组 > 发酵组 > 酶解组 而在第 2 周, 各组之间的 TRY 活力无显著性差异 (P>0.05) 第 4 周, 发酵组中的肠道 TRY 活力显著高于酶解组 (P<0.05), 但显著低于其他 3 组 图 3 幼刺参肠道纤维素酶活力的变化 Fig.3 The variation of the intestinal cellulase activity of juvenile A. japonicus 图 4 幼刺参肠道胰蛋白酶活力的变化 Fig.4 The variation of the intestinal TRY activity of juvenile A. japonicus 2.3 不同浒苔型饲料对幼刺参体腔液非特异性免疫酶活力的影响 由表 3 可知, 不同浒苔型饲料饲喂的幼刺参体腔液中 ACP AKP 和 SOD 活力均有显著性差异 (P<0.05)

129 126 渔业科学进展第 38 卷 表 3 不同的浒苔型饲料对幼刺参体腔液非特异性免疫酶活力的影响 Tab.3 Effects of different E.prolifera-diets on non-specific immune enzyme activities in the coelomic fluid of juvenile A. japonicus 组别 Groups 酸性磷酸酶 ACP (U/100 ml) 碱性磷酸酶 AKP ( 金氏单位 /100 ml) 超氧化物歧化酶 SOD (U/ml prot) 对照组 Control group 2.12±0.09 b 1.34±0.08 b 2.60±0.16 ab 发酵组 Fermented group 2.22±0.14 b 1.50±0.11 ab 2.30±0.16 bc 酶解组 Hydrolyzed group 2.13±0.13 b 1.22±0.15 b 2.14±0.12 c 复合组 Composite group 2.60±0.26 ab 1.69±0.09 a 2.73±0.07 a 鲜浒苔组 Fresh group 2.91±0.14 a 1.79±0.08 a 2.36±0.08 abc 在各组的 ACP 中, 鲜浒苔组的活力最大, 且与复合组无显著性差异 (P>0.05), 而显著高于其他 3 组 (P<0.05), 酶解组的活力最小 在各组的 AKP 中, 鲜浒苔组和复合组 AKP 活力显著高于酶解组和对照组 (P<0.05), 与发酵组无显著性差异 (P>0.05) 而在各组的 SOD 中, 复合组的活力最大, 且显著高于发酵组和酶解组 (P<0.05), 而与对照组和鲜浒苔组均无显著性差异 (P>0.05) 3 讨论 3.1 不同浒苔型饲料对幼刺参生长性能的影响目前, 浒苔在刺参饲料中的应用已开展了大量的研究, 主要集中在浒苔纯粉直接投喂或经单一预处理后配合其他饲料成分进行投喂, 且得到了一定的效果 而本实验是结合微生物发酵与碱性蛋白酶水解技术对浒苔型配合饲料进行不同处理后, 对幼刺参开展投喂实验 在本研究中, 酶解组的幼刺参生长性能指标整体最差, 可能有两方面的原因 一是在酶解反应的过程中, 蛋白质的相对分子量逐渐变小, 并转化为肽或者氨基酸, 更易于消化吸收 (Arai et al, 1970), 但碱性蛋白酶作为一种内肽酶, 作用于蛋白质分子内部肽键, 生成小分子肽段而产生苦味 ( 林敏刚, 2009), 从而影响到酶解组饲料的适口性 ; 二是由于刺参饲料投喂的方式为泼洒投喂, 降解后小分子物质比例增加, 水溶性增强, 造成饲料营养物质不足或失衡等, 导致酶解组刺参的生长性能低下, 这与王黎 (2010) 1) 微胶团饲料对刺参生长影响的现象相符 而复合组刺参生长性能优于对照组和酶解组, 但与发酵组之间的差异不显著, 这可能是浒苔饲料经过酶解之后, 其中的小分子物质所占的比例变大, 促进了酿酒酵母菌发酵初期的生长与繁殖速率, 这与熊子书 (2002) 关于中国酿酒酵 母菌的研究结果一致 而酿酒酵母菌会利用饲料中的营养物质满足自身生长代谢需要, 并能够生成一些呈味物质, 比如有机酸, 还原糖等 ( 熊子书, 2002) 微生物发酵还可以提高饲料中菌体蛋白的含量, 为水产动物生长提供高品质的蛋白质 ( 丁理法等, 2008) 而鲜浒苔组中的刺参生长性能最优, 可能与饲料的物理性状有较大的关系 鲜浒苔组饲料是将鲜浒苔通过匀浆之后, 再混合其他饲料原料而得, 其粒径较大, 在水中的吸附作用增强, 小分子营养物质能够被有效吸附, 且研究证实浒苔作为吸附剂能发挥良好的作用 ( 程凤莲等, 2011); 此外, 鲜浒苔作为饲料原料能够有效保持藻体的鲜味, 促进刺参摄食行为 3.2 不同浒苔型饲料对幼刺参消化酶活力的影响刺参肠道中常见的消化酶有淀粉酶 蛋白酶和纤维素酶等, 消化酶活力的大小可以反映出刺参的摄食效果 淀粉酶是刺参肠道中最主要的内源性消化酶之一, 对刺参消化吸收淀粉等物质有很大作用 ( 秦博等, 2015) 本研究发现, 除酶解组的淀粉酶活力下降之外, 随着时间的推移, 其他组刺参的淀粉酶活力变化先升高后下降, 最后趋于稳定, 这与吴垠等 (2003) 在中国对虾 (Penaeus chinensis) 中的研究一致 吴永恒等 (2012) 认为造成这种现象的原因可能是刺参消化道内的消化酶活性与饲料改变后的应激反应有关, 随着投喂饲料时间的延长, 刺参通过神经调节内分泌系统使淀粉酶的分泌趋于稳定, 且本实验中的纤维素酶和胰蛋白酶活力的变化同样符合此规律 除酶解组外, 其他各组中的纤维素酶活力一致处于较高的水平, 分析原因可能是浒苔和石莼均属大型藻类, 其纤维素等大分子碳水化合物比重大, 可以促进刺参消化道分泌更多的纤维素酶 Kao 等 (1996) 研究认为, 纤维素酶活 1) Wang L. Effects of micro-mixed bolus feeds on the growth of sea cucumber, Apostichopus japonicas and water quality. Master s Thesis of Dalian University of Technology, 2010 [ 王黎. 微胶团饲料对刺参生长和水质的影响研究. 大连理工大学硕士研究生学位论文, 2010]

130 第 5 期李猛等 : 不同浒苔型饲料对幼刺参 (Apostichopus japonicus) 生长 消化及非特异性免疫的影响 127 力不仅与自身的内分泌调节有关, 同时会受到外源性因素 ( 饲料 环境等 ) 的影响 从图 4 中可以看出, 刺参肠道内胰蛋白酶活力与饲料蛋白质含量 分子量大小有关 : 对照组中的蛋白质未经酶解处理, 也未被酿酒酵母利用, 因此, 该组的刺参需要提高蛋白酶的分泌量来完成消化过程 ; 而复合组和鲜浒苔组中, 由于微生物在增殖过程中会合成大量的菌体蛋白, 提高了饲料中蛋白质的储备量, 因此, 两组的胰蛋白酶活力与对照组无显著差异 酶解组由于蛋白质水解程度大, 在水中的溶失增大, 因而被刺参摄食吸收的量小, 其胰蛋白酶活力最低 而酶解组的营养物质散失在水中的比例大, 刺参摄食营养不足, 导致其没有足够的营养物质供给合成消化酶 3.3 不同浒苔型饲料对幼刺参体腔液非特异性免疫酶活力的影响刺参体腔液中的非特异性免疫酶活力可以反映出刺参对所处内环境与外环境的调节能力 SOD 是重要的抗氧化酶之一, 在清除活性氧自由基 防止生物分子损伤方面有十分重要的作用, 对增强吞噬细胞的吞噬能力和整个机体的免疫功能也起着重要作用 ( 陈竞春等, 1996) ACP 和 AKP 是 2 种重要的水解酶, 在刺参抵抗疾病 免疫反应和细胞损伤与修复过程中具有重要的生物学意义 ( 张明等, 2004; Cajaravile et al, 2000; Rajalakshmi et al, 2005) 本研究中, 复合组与鲜浒苔组刺参体腔液中的 SOD ACP 和 AKP 活力略高于其他 3 组, 可能是微生物发酵饲料中的益生菌容易在养殖水体中扩散, 不仅可以改善水环境和底质, 而且被养殖动物摄食后可维持肠道菌群平衡 ( 李豫红等, 2003) 且 Gill 等 (2000) 研究证实, 发酵微生物生长代谢中产生的一些代谢产物可在一定程度上抑制或杀死病原菌, 预防或降低疾病的发生, 增强动物的免疫力 4 结论本研究中, 幼刺参在摄食鲜浒苔组的浒苔生物饲料后, 获得良好的生长效果, 适当改善肠道消化酶活力, 维持正常生理免疫功能 同时, 该结果证明了鲜浒苔作为刺参饲料成分的可靠性, 从而为减轻处理浒苔工作量 提高浒苔利用率提供了理论依据和实践方法 参考文献 Aria S, Yamashifa M, Kato H, et al. Applying proteolytic enzymes on soybean. Agricultural Biological Chemistry, 1970, 34: 729 Cajaravile MP, Bebianno MJ, Blasco J, et al. The use of biomarkers to assess the impact of pollution in coastal environments of the Iberian peninsula: A practical approach. Science of the Total Environment, 2000, 247(2/3): Chen JC, Shi AJ. Malacozoan immunobiology research: A review. Acta Hydrobiologica Sinica, 1996, 20(1): [ 陈竞春, 石安静. 贝类免疫生物学研究概况. 水生生物学报, 1996, 20(1): 74 78] Cheng FL, Meng FP, Zhou Y, et al. Large seaweed Enteromorpha to alkaline dye adsorption properties of methylene blue. Chemical Industry and Engineering Progress, 2011, 5(1): [ 程凤莲, 孟范平, 周游, 等. 大型海藻浒苔对碱性染料亚甲基蓝的吸附性能. 化工进展, 2011, 5(1): ] Ding LF, Ye J. The study of biotechnology in the aquatic animal nutrition and feed applications. Fisheries Science and Technology Information, 2008, 35(5): [ 丁理法, 叶婧. 生物技术在水产动物营养与饲料研究中的应用. 水产科技情报, 2008, 35(5): ] Erlanger BF, Kokowsky N, Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1961, 95(2): Gill HS, Rutherfurd KJ, Prasad J, et al. Enhancement of natural and acquired immunity by Lactobacillus rhamnosus (HN001), Lactobacillus acidophilus (HN017) and Bifidobacterium lactis (HN019). British Journal of Nutrition, 2000, 83(2): He Q. Evaluation on nutrition components of Enteromorpha linza. Marine Sciences, 2006, 30(1): [ 何清. 东海绿藻缘管浒苔营养成分分析及评价. 海洋科学, 2006, 30(1): 34 38] Kao C, Blaha J H, Skarkowa L. Estimation of the enzyme preparation required to obtain optimum nutrient utilization and growth performance in young broiler chicks fed on barley diets. Zivocisna Vyroba, 1996, 41(1): Liao MJ, Hao ZK, Shang DR, et al. Nutrition components analysis of Enteromorpha prolifera and its preliminary study on feeding Apostichopus japonicas. Fishery Modernization, 2011, 38(4): [ 廖梅杰, 郝志凯, 尚德荣, 等. 浒苔营养成分分析与投喂刺参试验. 渔业现代化, 2011, 38(4): 32 36] Lin MG. Application of alkaline protease in hydrolysis of vegetable protein. China Oils and Fats, 2009, 34(12): [ 林敏刚. 碱性蛋白酶在水解植物蛋白中的应用. 中国油脂, 2009, 34(12): 30 33] Li YH, Gao F. Introduction to the aquaculture microorganisms living bacteria preparation. Hebei Fisheries, 2003(1): 6 7

131 128 渔业科学进展第 38 卷 [ 李豫红, 高峰. 浅谈水产养殖中的微生物活菌制剂. 河北渔业, 2003(1): 6 7] Li YX, Liu N, Zhou DQ. Effects of complex enzymes extraction on adsorption capabilities of dietary fiber from Entenmorpha sp.. Progress in Fishery Sciences, 2015, 36(4): [ 李月欣, 刘楠, 周德庆. 复合酶提取法对浒苔 (Enteromorpha sp.) 膳食纤维吸附能力的影响. 渔业科学进展, 2015, 36(4): ] Qin B, Chen SQ, Chang Q, et al. Effects of Enteromorpha prolifera on growth, digestion and non-specific immunity of juvenile sea cucumber (Apostichopus japonicus Selenka). Journal of Fisheries of China, 2015, 39(4): [ 秦搏, 陈四清, 常青, 等. 饲料中浒苔添加量以及处理方法对幼刺参生长 消化率 消化酶和非特异性免疫酶的影响. 水产学报, 2015, 39(4): 66 75] Rajalakshmi S, Mohandas A. Copper-induced changes in tissue enzyme activity in a freshwater mussel. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2005, 62(1): Sun Yat-sen University Biochemistry Teaching and Research Section. Introduction to the biochemical technology. Beijing: People's Education Press, 1978: [ 中山大学生物化学教研室. 生化技术导论. 北京 : 人民教育出版社, 1978, 53 55] Wang XK, Ma JH, Ye DC, et al. Preliminary study on the life history of Enteromorpha prolifera. Marine Science Bulletin, 2007, 26(5): [ 王晓坤, 马家海, 叶道才, 等. 浒苔 (Enteromorpha prolifem) 生活史的初步研究. 海洋通报, 2007, 26(5): ] Wu Y, Sun JM, Zhou ZC, et al. The effects of dietary protein levels on the growth and activities of digestive enzymes in shrimp, Penaeus chinensis, Journal of Dalian Fisheries University, 2003, 18(4): [ 吴垠, 孙建明, 周遵春等. 饲料蛋白质水平对中国对虾生长和消化酶活性的影响. 大连水产学院学报, 2003, 18(4): ] Wu YH, Wang QY, Feng ZF, et al. The effect of dietary protein on the enzymes and intestinal structure of Apostichopus japonicas. Marine Sciences, 2012, 36(1): [ 吴永恒, 王秋月, 冯政夫, 等. 饲料组蛋白含量对刺参消化酶及消化道结构的影响. 海洋科学, 2012, 36(1): 36 41] Xiong ZS. Research on liquor-making yeasts in China-records on screening of varieties of yeast and their applications continous. Liquor-Making Science and Technology, 2002(5): [ 熊子书. 中国酿酒酵母菌的研究 不同酒类酵母筛选与应用纪实 ( 下 ), 酿酒科技, 2002(5): 19 21] Xu DL, Huang XC, Yang WG, et al. Analysis of nutrition composition of Enteromorpha prolifera. Journal of Zhejiang Ocean University (Natural Science), 2003, 22(4): [ 徐大伦, 黄晓春, 杨文鸽, 等. 浒苔营养成分分析. 浙江海洋学院学报 ( 自然科学版 ), 2003, 22(4): ] Zhang M, Wang L, Guo ZY, et al. Effect of lipopolysaccharide and Vibrio anguillarum on the activities of phosphatase, superoxide dismutase and the content of hemocyanin in the serum of Fenneropenaeus chinesis. Marine Sciences, 2004, 28(7): [ 张明, 王雷, 郭振宇, 等. 脂多糖和弧菌对中国对虾血清磷酸酶 超氧化物歧化酶和血蓝蛋白的影响. 海洋科学, 2004, 28(7): 22 25] Zhang ZF, Lin WT, Chen CK. Study on extraction process of water-soluble polysaccharide from Enteromorpha prolifera. Food and Nutrition in China, 2009(3): [ 张智芳, 林文庭, 陈灿坤. 浒苔水溶性多糖提取工艺研究. 中国食物与营养, 2009(3): 39 41] Zhao B, He SJ. Experiment of microbiology. Beijing: Science Press, 2002, [ 赵斌, 何绍江. 微生物学实验. 北京 : 科学出版社, 2002, 67 72] Zhu JX, Qu KM, Li J, et al. Growth of young sea cucumber Apostichopus japonicus fed on processed Enteromorpha prolifera. Progress in Fishery Sciences, 2009, 30(5): [ 朱建新, 曲克明, 李健, 等. 不同处理方法对浒苔饲喂稚幼刺参效果的影响. 渔业科学进展, 2009, 30(5): ] ( 编辑冯小花 )

132 第 5 期李猛等 : 不同浒苔型饲料对幼刺参 (Apostichopus japonicus) 生长 消化及非特异性免疫的影响 129 Effects of Different Diets Containing Enteromorpha prolifera on Growth, Digestion and Non-Specific Immunity of Juvenile Sea Cucumber (Apostichopus japonicus) LI Meng 1,2, LIAO Meijie 1, CHANG Qing 11, WANG Yingeng 1, LI Bin 1, RONG Xiaojun 1, GAO Lei 4, FAN Ruiyong 3 (1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao ; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai ; 3. Qingdao Ruizi Seafood Development Co., Ltd, Qingdao ; 4. Penglai Daliuhang Veterinary Station, Yantai ) Abstract In this study, the diets for sea cucumbers (Apostichopus japonicus Selenka) were formulated with Enteromorpha prolifera, Ulva lactuca, soybean meal, glucose, scallop side, shell powder, vitamins premix and mineral premix, and processed in four ways using Brewer s yeast and alkaline protease. The final products were 5 groups of experimental diets including the control group, the fermented group, the hydrolyzed group, the composite group and the fresh-group. Each diet was randomly given to 3 replicates of 30 sea cucumbers of which the average body weight was (1.92±0.02) g. The results were described as follows. E. prolifera-diets had significant different effects on the survival rate (SR), the weight gain rate (WGR), the specific growth rate (SGR) and the feed coefficient (FC) (P<0.05). The SR in the composite group and the fresh group was higher than that in the hydrolyzed group (P<0.05), but was not significantly different from other groups (P>0.05). The WGR in the fresh group was higher than that in other groups (P<0.05). The FC in the fresh group was lower than in all other groups except for the composite group. Over the feeding time, the intestinal amylase activity (AMS) showed an increasing-decreasing-stabilized pattern in the control group, the fermented group, the composite group and the fresh group; however, AMS had been constantly declining in the hydrolyzed group. The intestinal cellulase activity in the hydrolyzed group tended to decrease over time, and in other groups, it was higher than the initial values and had been fluctuating. Except for the hydrolyzed group, the trypsin activity in all other groups showed no significant change. E. prolifera-diets also affected the activities of acid phosphatase (ACP), alkaline phosphatase (AKP) and superoxide dismutase (SOD) in the coelomic fluid to different extents (P<0.05). ACP in the fresh group was the highest and was significantly higher than all other groups (P<0.05) except for the composite group (P>0.05). SOD in the composite group was the highest and was significantly higher than the hydrolyzed group and the fermented group. These results suggested that juvenile sea cucumbers could benefit from the diets of the composite group and the fresh group in terms of the growth performance, the intestinal digestion and immunity. Our study also provided information on solving the shortage in raw dietary materials for sea cucumbers and making good use of E.prolifera. Key words Enteromorpha prolifera; Sea cucumber (Apostichopus japonicus Selenka); Fermentation; Enzymolysis; Growth; Digestion; Non-specific immune 1 Corresponding author: CHANG Qing, changqing@ysfri.ac.cn

133 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 发酵豆粕替代藻粉对刺参 (Apostichopus * japonicus) 生长及体组成的影响 1 李宝山张利民张德瑞孙永智王世信王际英 ( 山东省海洋生态修复重点实验室山东省海洋资源与环境研究院烟台 ) 摘要为研究发酵豆粕替代藻粉对刺参 (Apostichopus japonicus) 生长及体组成的影响, 以发酵豆粕分别替代基础饲料中的藻粉及鱼粉藻粉混合物 (2 15), 配制 9 组等氮实验饲料, 饲喂初始体重为 17.7 g 左右的刺参幼参 70 d 结果显示, 随替代藻粉比例的升高, 实验刺参的增重率及特定生长率先升后降 (P<0.05); 随替代混合物比例的升高,D8 D9 组增重率及特定生长率显著低于前 3 组 (P<0.05), 但前 3 组之间无显著差异 (P>0.05); 替代藻粉降低了体壁粗脂肪含量 (P<0.05); 替代混合物降低了粗灰分含量 (P<0.05); 替代藻粉降低了体壁甘氨酸 蛋氨酸及半胱氨酸含量 (P<0.05), 提高了苯丙氨酸和组氨酸含量 (P<0.05); 替代混合物降低了丝氨酸 苏氨酸 甘氨酸 蛋氨酸 赖氨酸及组氨酸含量 (P<0.05), 提高了精氨酸 脯氨酸 苯丙氨酸及半胱氨酸含量 (P<0.05); 替代藻粉降低了体壁 Ca Mg Fe Zn Cu Cr Mn 及 Pb 含量 (P<0.05); 替代混合物降低了 Ca Mg Zn Cu Cr 及 Pb 含量 (P<0.05), 提高了 Fe 及 Mn 含量 (P<0.05) 以增重率为评价指标, 经 SAS REG 曲线拟合, 发酵豆粕替代藻粉的最佳比例为 29.75%; 经 SAS NLIN 曲线拟合, 替代 46.46% 的鱼粉藻粉混合物对刺参生长无显著影响 关键词刺参 ; 发酵豆粕 ; 生长 ; 体组成 ; 氨基酸 ; 矿物元素中图分类号 S963 文献标识码 A 文章编号 (2017) 豆粕具有来源稳定 价格合理 消化利用率高等优点, 是替代鱼粉的最佳植物蛋白原料 但由于存在抗营养因子等, 限制了其在高档水产饲料中的应用 利用现代生物工程技术, 将豆粕发酵, 可降低大豆凝集素 胰蛋白酶抑制因子和致甲状腺肿素的含量 ( 张丽靖等, 2008), 提高粗蛋白 粗脂肪和磷的含量 ( 马文强等, 2008), 同时可将大分子蛋白质降解为小分子肽 (Hong et al, 2004; 欧阳亮等, 2008) 此外, 豆粕发酵后, 微量元素及维生素含量有所提高 (Kim et al, 1999), 且具有一定的芳香味和鲜味, 可提高动物对其的消化利用率 发酵豆粕 (Fermented soybean meal, FSBM) 可替代牙鲆 (Paralichthys olivaceus) (Md et al, 2012) 黑鲷(Acanthopagrus schlegelii) (Zhou et al, 2011) 石斑鱼(Epinephelus coioides) (Luo et al, 2004) 等饲料中的部分鱼粉 刺参 (Apostichopus japonicus) 属于棘皮动物门 (Echinodermata) 海参纲(Holothroidea), 是我国名贵海珍品之一 近年来, 随着养殖规模的扩大, 饲料中主要原料藻粉出现了短缺 与鼠尾藻 (Sargassum thunbergii) 马尾藻(Sargassum muticum) 海带(Laminaria japonica)(xia et al, 2012a) 石莼(Ulva lactuca L)(Xia et al, 2012b) 裂壶藻(Schizochytrium) ( 黄亮华等, 2014) * 水生动物营养与饲料研发创新平台 ( ) 和山东省现代农业产业技术体系 - 刺参创新团队建设项目 (SDAIT-22-06) 共同资助 [This work was supported by Aquatic Animal Nutrition and Feed Research and Innovation Demonstration Platform ( ), and Modern Agricultural Industry Technology System of Shandong Province-Innovative Team of Sea Cucumber (SDAIT-22-06)]. 李宝山, bsleeyt@126.com 1 通讯作者 : 王际英, 研究员, ytwjy@126.com 收稿日期 : , 收修改稿日期 :

134 第 5 期李宝山等 : 发酵豆粕替代藻粉对刺参 (Apostichopus japonicus) 生长及体组成的影响 131 等海洋藻类相比, 陆生植物蛋白原料具有来源稳定 对环境影响小等优点 目前, 关于陆生植物蛋白在刺参配合饲料中的报道见于玉米蛋白 ( 王吉桥等, 2007) 豆粕 ( 樊月居等, 2010) 和甘薯 ( 赵斌等, 2016) 因此, 本实验以发酵豆粕分别替代配合饲料中的藻粉及藻粉鱼粉混合物, 研究其对刺参生长及体组成的影响, 以期为发酵豆粕在刺参配合饲料中的应用提供参考 1 材料与方法 1.1 实验饲料的配方及制作以鱼粉和藻粉为蛋白源, 设计粗蛋白含量为 22% 左右的基础饲料配方, 分别以 0 5% 10% 15% 19.35% 的发酵豆粕等蛋白替代基础饲料中的藻粉, 以 7.6% 15.2% 22.8% 30.4% 的发酵豆粕等蛋白替代基础饲料中鱼粉藻粉混合物 (2 15), 配制 9 组等氮实验饲料, 记为 D1 D9 组, 其中,D1 为对照组,D2 D5 为替代藻粉组,D6 D9 为替代混合物组 ( 表 1) 实验中所用主要蛋白原料及等蛋白平衡后原料氨基酸组成见表 2 固体原料按比例称重后粉碎过 200 目标准筛, 加入鱼油及适量的蒸馏水混匀, 用饲料制粒机制 成直径为 0.3 cm 的颗粒,60 烘干, 用小型粉碎机粉碎, 筛选 目之间的颗粒备用 1.2 养殖实验管理养殖实验在山东省海洋资源与环境研究院东营实验基地循环水养殖系统内进行, 实验用刺参购自山东蓬莱安源水产有限公司 实验采用循环微流水养殖, 水流速约为 100 ml/min 深蓝色圆柱形养殖水桶(Ф84 cm 80 cm) 内放置刺参养殖筐 1 个, 内嵌波纹板 20 张, 控制水深为 50 cm 实验开始前,2000 头规格整齐 体质健壮的刺参放养于系统中, 期间投喂对照组饲料, 使其适应养殖环境和实验饲料 21 d 后挑选体重约为 17.7 g 的刺参 810 头, 平均放养于 27 个养殖桶中, 每桶 30 头 每种实验饲料投喂 3 桶, 每日投喂 1 次 (16:00), 投喂时将饲料与海泥 (1 1) 混合均匀, 加水湿润后泼洒投喂, 投喂量为刺参体重的 4%, 并根据摄食状况随时调整 投喂时停气, 待饲料颗粒沉到水底或波纹板上后, 恢复充气 每隔 2 d 用虹吸法将粪便及残饵吸出, 并补充 1/3 新水 实验期间, 水温为 17 22,DO>6 mg/l,nh + 4 -N 及 NO -N 均小于 0.1 mg/l,ph 为 , 养殖周期为 70 d 表 1 实验饲料配方及其基本成分 (%) Tab.1 The formula and proximate composition of experimental diets (%) 原料 Ingredients 组别 Groups D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 鱼粉 Fish meal a 发酵豆粕 FSBM a 藻粉 Algae powder a α- 纤维素 α-cellulose 小麦粉 Wheat flour 虾粉 Shrimp powder 鱼油 Fish oil 磷脂 Phospholipids 磷酸二氢钙 Ca(H 2 PO 4 ) 维生素预混料 Vitamin premix b 矿物质预混料 Mineral premix b 粘合剂 Binder 合计 Total 基本成分 ( 干重 ) Proximate composition (DM) 粗蛋白 Crude protein 粗脂肪 Crude lipid 粗灰分 Crude ash 蛋氨酸 Met 赖氨酸 Lys a: 鱼粉为鳀鱼粉 ; 发酵豆粕购自北京市希普正慧生物饲料有限公司 ; 藻粉为鼠尾藻 大叶藻 海带 混合 b: 维生素预混料及矿物质预混料组成见王际英等 (2014) a: Anchovy fishmeal. FSBM was obtained from Great Beijing Puhuida Feed co.; mixture of Sargassum thunbergii, algae powder was the mixture of Zostera marina L. and Laminaria japonica at equal proportion b: Compositions of vitamin and mineral premixes followed the protocol of a previous study (Wang et al, 2014)

135 132 渔业科学进展第 38 卷 项目 Items Tab.2 鱼粉 Fish meal 表 2 实验所用主要蛋白原料的氨基酸组成 (mg/g) Composition of amino acids of main protein ingredients in the trials (mg/g) 藻粉 Algae powder 发酵豆粕 FSBM a 等蛋白藻粉 Algae powder with same protein level b 等蛋白混合物 Mixture with same protein level 粗蛋白 Crude protein 天冬氨酸 Asp 苏氨酸 Thr 丝氨酸 Ser 谷氨酸 Glu 甘氨酸 Gly 丙氨酸 Ala 半胱氨酸 Cys 缬氨酸 Val 蛋氨酸 Met 异亮氨酸 Ile 亮氨酸 Leu 酪氨酸 Tyr 苯丙氨酸 Phe 赖氨酸 Lys 组氨酸 His 精氨酸 Arg 脯氨酸 Pro a: 氨基酸含量 = 相应氨基酸含量 b: 氨基酸含量 =( 鱼粉相应氨基酸含量 2+ 藻粉相应氨基酸含量 15) [( 鱼粉粗蛋白含量 2+ 藻粉粗蛋白含量 15) 17] a: Amino acid content = amino acid content of algae powder b: Amino acid content = (amino acid content of fishmeal 2+amino acid content of algae powder 15) [(crude protein of fishmeal 2+crude protein of algae powder 15) 17] 1.3 样品采集与参数计算养殖实验结束后, 禁食 48 h, 放掉桶内水后收集实验刺参, 计数, 在空气中放置 30 s 后称重 每桶随机挑选 15 头刺参, 置于洁净的白瓷盘中, 待其恢复自然体长, 测量体长 体重后解剖, 分离消化道, 分别测量体壁重 肠道重和肠道长度 将体壁置于 20 保存待测 增重量 (Weight gain, WG, g)=w f W i ; 增重率 (Weight gain rate, WGR, %)=WG/W i 100; 特定生长率 (Specific growth rate, SGR, %/d)= (lnw f lnw i )/d 100; 存活率 (Survival rate, SR, %)=N f /N i 100; 脏壁比 (Ratio of visceral weight to body wall weight, VBR, %)=W v /W b 100; 肠壁比 (Ratio of intestine weight to body wall weight, IBR,%)=W in /W b 100; 肠长比 (Ratio of intestine length to body length, IBL)=L i /L b ; 式中,W f 为末体重 (g),w i 为初始体重 (g),d 为 养殖天数,N f 为存活刺参数量,N i 为实验初始刺参数量,W v 为内脏重量 (g),w b 为体壁重量 (g),w in 为肠道重量 (g),l i 为肠道长度 (cm),l b 为体长 (cm) 1.4 样品测定饲料或样本中水分测定采用 105 恒重法, 粗蛋白测定采用杜马斯燃烧法 (Leco, FP-528, 美国 ), 粗脂肪测定采用索氏抽提法, 粗灰分测定采用 550 灰化法, 能量测定采用燃烧法 (Parr, 6100, 美国 ); 样品酸水解后, 用全自动氨基酸分析仪 (Hitachi, L-8900, 日本 ) 测定氨基酸含量 ; 体壁浓硝酸微波消解后用电感耦合等离子质谱仪 (ICP-MS, Agilent 7700, 美国 ) 测定 Ca Fe Mg Zn Cu Cr 含量, 用原子荧光形态分析仪 ( 北京吉天, SA-10, 中国 ) 测定 Se Cd Pb As Hg 含量 1.5 数据处理实验所得数据采用 Excel 2007 及 SPSS 11.0 One-way ANOVA 处理, 结果以平均值 ± 标准差 (Mean± SD) 表示, 差异显著 (P<0.05) 时用 Duncan s 检验进行多

136 第 5 期李宝山等 : 发酵豆粕替代藻粉对刺参 (Apostichopus japonicus) 生长及体组成的影响 133 重比较分析, 分别采用 Statistical analysis system 9.2 (SAS Institute Inc. USA) REG 与 NLIN 对增重率与替代比例之间的关系进行回归分析 2 结果 2.1 发酵豆粕对刺参生长及形体指数的影响发酵豆粕替代藻粉后, 实验刺参的增重率 特定生长率 脏壁比 肠壁比均呈先升后降的趋势, 在 D2 组达到最高, 显著高于 D4 及 D5 组 (P<0.05); 随替代混合物比例的升高,D8 D9 组增重率及特定生长率显著低于前 3 组 (P<0.05), 前 3 组之间无显著差异 (P>0.05) 发酵豆粕替代藻粉或混合物对刺参的成活率无显著影响 (P>0.05)( 表 3) 以增重率为评价指标, 经 SAS REG 回归分析, 发酵豆粕替代藻粉的适宜比例为 29.75% ( 图 1); 经 SAS NLIN 回归分析, 发酵豆粕替代刺参配合饲料中 46.46% 的鱼粉藻粉混合物而不影响其生长 ( 图 2) 2.2 发酵豆粕对刺参体壁基本成分及氨基酸含量的影响发酵豆粕替代藻粉后, 刺参体壁中粗脂肪含量显著降低 (P<0.05), 水分 粗蛋白和粗灰分含量无显著变化 (P>0.05); 发酵豆粕替代混合物后, 刺参体壁粗灰分的含量显著降低 (P<0.05), 而水分 粗蛋白及粗脂肪含量无显著变化 (P>0.05) ( 表 4) 发酵豆粕替代藻粉后, 降低了刺参体壁中甘氨酸 蛋氨酸及半胱氨酸的含量 (P<0.05), 提高了苯丙氨酸和组氨酸的含量 (P<0.05); 发酵豆粕替代混合物后, 降低了刺参体壁中丝氨酸 苏氨酸 甘氨酸 蛋氨酸 赖氨酸及组氨酸含量 (P<0.05), 提高了精氨酸 脯氨酸 苯丙氨酸及半胱氨酸含量 (P<0.05); 发酵豆粕替代藻粉或混合物, 对体壁中天冬氨酸 谷氨酸 丙氨酸 缬氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 酪氨酸 必需氨基酸及总氨基酸含量无显著影响 (P>0.05)( 表 5) 2.3 发酵豆粕对刺参体壁矿物元素含量的影响 发酵豆粕替代藻粉后, 刺参体壁中 Ca Mg Fe Zn Cu Cr Mn 及 Pb 的含量降低 (P<0.05); 发酵豆粕替代混合物后, 刺参体壁中 Ca Mg Zn Cu Cr 及 Pb 含量显著降低 (P<0.05),Fe 及 Mn 的含量显著升高 (P<0.05) 发酵豆粕替代藻粉或混合物对 Se Cd As 及 Hg 含量影响不显著 (P>0.05)( 表 6) 3 讨论 3.1 发酵豆粕对刺参生长性能的影响 图 1 发酵豆粕替代藻粉对刺参增重率的影响 Fig.1 Effects of the replacement level of algal powder by FSBM on the WGR of juvenile A. japonicus 图 2 发酵豆粕替代鱼粉藻粉混合物对刺参增重率的影响 Fig.2 Effects of the replacement level of fishmeal and algal powder by FSBM on the WGR of juvenile A. japonicus 本研究结果显示, 发酵豆粕可以部分替代刺参配合饲料中的藻粉或鱼粉藻粉混合物 发酵豆粕替代藻粉后, 实验刺参的增重率呈先升后降的趋势, 这与几种蛋白原料中氨基酸模式互补有关 (Md et al, 2012), 随着替代量的升高, 导致饲料中某些氨基酸的缺乏, 破坏了氨基酸平衡模式 (Deng et al, 2006), 且可能由于发酵豆粕中抗营养因子去除不彻底 (Uyan et al, 2006), 导致刺参生长速度下降 随着替代量的升高, 实验刺参的肠壁比及肠长比显著降低, 说明相较于发酵豆粕, 藻粉更适合刺参肠道的发育 发酵豆粕替代 46% 的鱼粉藻粉混合物不会影响实验刺参的生长, 过高则抑制其生长, 这与在其他水生动物中的研究结果一致 (Luo et al, 2004; Yuan et al, 2013; Azarm et al, 2014), 可能与发酵豆粕中蛋氨酸缺乏有关 (Gallagher et al, 1994; 杨耐德等, 2008) 此外, 随着发酵豆粕含量的升高, 饲料粗灰分含量显著升高, 这可能是造成刺参生长性能下降的另一个原因, 但需要进一步的研究

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138 第 5 期李宝山等 : 发酵豆粕替代藻粉对刺参 (Apostichopus japonicus) 生长及体组成的影响 135

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140 第 5 期李宝山等 : 发酵豆粕替代藻粉对刺参 (Apostichopus japonicus) 生长及体组成的影响 发酵豆粕对刺参体壁组成的影响随着饲料中发酵豆粕含量的升高, 实验刺参体壁中水分及粗蛋白含量变化不显著, 粗脂肪含量显著降低, 与凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 中的结果一致 ( 杨耐德等, 2008) Ye 等 (2011) 研究发现, 饲料中豆粕添加过量, 可导致牙鲆机体脂肪代谢紊乱而造成脂肪蓄积降低 鱼类生长性能下降会导致机体中粗灰分含量上升 ( 段培昌等, 2009; 黄云等, 2012) 本研究中, 随着饲料中发酵豆粕含量的升高, 刺参体壁中粗灰分呈下降趋势 发酵豆粕替代藻粉后,7 种矿物元素含量显著降低 ; 发酵豆粕替代鱼粉藻粉混合物后,5 种矿物元素含量显著降低, 仅 2 种显著升高, 且降低幅度远大于升高幅度 豆粕发酵后呈酸性, 可以促进铁的吸收 (Pandey et al, 2008) 在对鸡(Gallus domesticus) 的研究中表明,Fe 2+ Mn 2+ Cu 2+ Zn 2+ 等在肠道中通过铁诱导型二价阳离子转运蛋白 1(DMT1) 进行吸收 ( 李晓丽等, 2013), 因而 Fe 2+ 会抑制其他二价阳离子的吸收利用 (Rodriguez-Matas et al, 1998) 两个实验中, 发酵豆粕最高添加量分别为 18.0% 和 30.4%, 这可能是导致矿物元素沉积差异的原因 与乳山刺参相比, 本实验刺参体壁矿物元素中的 Ca Mg 含量显著上升, 而 Fe Cu Mn Zn Cr 及 4 种重金属元素含量显著降低, 由于二者之间不存在显著的地域差异性 ( 刘小芳等, 2014) 1), 因此, 导致这种差异的原因更偏重于环境及饵料, 具体原因有待于进一步研究 本研究中所测的 4 种重金属元素有降低趋势, 但只有 Cr 和 Pb 含量下降达到显著水平, 这与饲料中藻粉含量的降低有关 ( 张永亮等, 2011) 本研究所测得的刺参体壁中重金属含量均低于相关食品卫生标准限量 饲料中发酵豆粕含量虽然没有影响实验刺参体壁粗蛋白含量, 但影响其氨基酸含量 本研究所测得的 17 种氨基酸中有 10 种含量发生了显著变化, 其中 6 种为必需氨基酸 (Thr, Arg, Met, Phe, Lys, His), 且体壁中氨基酸含量与饲料中氨基酸含量不存在相关性, 这与在银鲳 (Pampus argenteus) ( 彭士明等, 2012) 罗氏沼虾 (Macrobrachium rosenbergii)( 程媛媛等, 2009) 和凡纳滨对虾 ( 严晶等, 2012) 中的研究结果一致, 表明动物是按照一定的氨基酸模式利用饲料中的蛋白质 (Mai et al, 2006), 氨基酸不平衡会造成饲料蛋白质 的浪费 本研究中所测得 9 种必需氨基酸含量与其他研究类似 (Deng et al, 2006; 王哲平等, 2012), 以精氨酸含量最高, 而真鲷 (Pagrosomus major)( 唐宏刚等, 2008) 2) 和牙鲆 (Kim et al, 2000) 等海水鱼类肌肉中含量最高的必需氨基酸为赖氨酸, 这既体现了种属上的差异, 也表明了需求的不同 ( 王际英等, 2015) 4 结论 本实验条件下, 发酵豆粕替代藻粉的最佳比例为 29.75%, 而发酵豆粕最高可替代 46.46% 的鱼粉藻粉混合物而不影响实验刺参的生长 本研究所测得 4 种重金属含量均低于国家相关卫生标准限量 参考文献 Azarm HM, Lee SM. Effects of partial substitution of dietary fish meal by fermented soybean meal on growth performance, amino acid and biochemical parameters of juvenile black sea bream Acanthopagrus schlegelii. Aquaculture Research, 2014, 45(6): Cheng YY, Zhou HQ, Hua XM, et al. Effects of partial replacement of dietary fish meal by corn gluten meal on growth, nutrient ingredients and amino acid retention in muscle of Macrobrachium rosenbergii. Journal of Fishery Sciences of China, 2009, 16(4): [ 程媛媛, 周洪琪, 华雪铭, 等. 玉米蛋白粉部分替代鱼粉对罗氏沼虾生长 氨基酸沉积率和肌肉营养成分的影响. 中国水产科学, 2009, 16(4): ] Deng JM, Mai KS, Ai QH, et al. Effects of replacing fish meal with soy protein concentrate on feed intake and growth of juvenile Japanese flounder, Paralichthys olivaceus. Aquaculture, 2006, 258(1 4): Duan PC, Zhang LM, Wang JY, et al. The preliminary study on the effects of new protein sources replacing dietary fishmeal on growth performance, body composition and hematology of juvenile starry flounder (Platichthys stellatus). Journal of Fisheries of China, 2009, 33(5): [ 段培昌, 张利民, 王际英, 等. 新型蛋白源替代鱼粉对星斑川鲽幼鱼生长 体成分和血液学指标的影响. 水产学报, 2009, 33(5): ] Fan YJ, Li XD, Luo Z, et al. Effects of replacement of dietary fish meal by soybean meal on growth, body composition and digestive enzyme activities in sea cucumber Apostichopus japonicus juveniles. Journal of Dalian Fisheries University, 2010, 25(1): [ 樊月居, 李晓东, 罗智, 等. 饲料中用 1) Liu XF. Study of regional differences in nutrient compositions and bioactivities of phospholipids in sea cucumber (Apostichopus japonicus). Doctoral Dissertation of Ocean University of China, 2014, 41 [ 刘小芳. 刺参营养成分的地域性差异分析及其磷脂的活性研究. 中国海洋大学博士研究生学位论文, 2014, 41] 2) Tang HG. Effects of fish protein hydrolysate on growth, metabolism, flesh quality, immunity and antioxidation in large yellow croaker. Doctoral Dissertation of Zhejiang University, 2008, 26 [ 唐宏刚. 鱼蛋白水解物对大黄鱼生长代谢 肌肉品质 免疫及抗氧化性能的影响. 浙江大学博士研究生学位论文, 2008, 26]

141 138 渔业科学进展第 38 卷 豆粕替代鱼粉对仿刺参幼参生长 体成分及消化酶活性的影响. 大连水产学院学报, 2010, 25(1): 71 75] Gallagher ML. The use of soybean meal as a replacement for fish meal in diets for hybrid striped bass (Morone saxatilis M. chrysops). Aquaculture, 1994, 126(1 2): Hong KJ, Lee CH, Kim SW. Aspergillus oryzae GB-107 fermentation improve nutritional quality of soybeans and feed soybean meal. Journal of Medicinal Food, 2004, 7(4): Huang LH, Li HY, Li B, et al. Effects of dietary Schizochytrium limacinum on the growth, immunity and digestion enzyme activity of sea cucumber Apostichopus japonicas. Progress in Fishery Sciences, 2014, 35(3): [ 黄亮华, 李浩洋, 李彬, 等. 裂壶藻对刺参生长 免疫及消化酶的影响. 渔业科学进展, 2014, 35(3): 91 97] Huang Y, Hu Y, Xiao TY, et al. Influence of dietary canola meal levels on growth and biochemical indices in juvenile Mylopharvngodon piceus. Acta Hydrobiological Sinica, 2012, 36(1): [ 黄云, 胡毅, 肖调义, 等. 双低菜粕替代豆粕对青鱼幼鱼生长及生理生化指标的影响. 水生生物学报, 2012, 36(1): 41 48] Kim BN, Yang JL, Song YS. Physiological functions of chongkukjang. Food Industry and Nutrition, 1999(4): Kim JD, Lall SPP. Amino acid composition of whole body tissue of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus), yellowtail flounder (Pleuronectes ferruginea) and Japanese flounder (Paralichthys olivaceus). Aquaculture, 2000, 187(3 4): Li XL, Lu L, Xie JJ, et al. Characteristics, affecting factors and molecular mechanisms of manganese absorption in chicken intestine. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2013, 25(3): [ 李晓丽, 吕林, 解竞静, 等. 锰在鸡肠道中吸收的特点 影响因素及分子机制. 动物营养学报, 2013, 25(3): ] Luo Z, Liu YJ, Mai KS, et al. Partial replacement of fish meal by soybean protein in diets for grouper Epinephelus coioides juveniles. Journal of Fisheries of China, 2004, 28(2): Ma WQ, Feng J, Liu X. Nutritional characteristics of microbe fermented soybean meal. Journal of the Chinese Cereals and Oil Association, 2008, 23(1): [ 马文强, 冯杰, 刘欣. 微生物发酵豆粕营养特性研究. 中国粮油学报, 2008, 23(1): ] Mai KS, Wan JL, Ai QH, et al. Dietary methionine requirement of large yellow croaker, Pseudosciaena crocea R. Aquaculture, 2006, 253(1 4): Md AK, Shunsuke K, Manabu I, et al. Can fermented soybean meal and squid by-product blend be used as fishmeal replacements for Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)? Aquaculture Research, 2012, 43(10): Ouyang L, Li L, Cai YF. Study of anti-nutrition protein in soybean fermented by SDS-PAGE analysis. Feed Industry, 2008, 29(21): [ 欧阳亮, 李亮, 蔡源锋. 垂直型 SDS-PAGE 分析发酵豆粕中蛋白类抗营养因子的研究. 饲料工业, 2008, 29(21): 43 45] Pandey A, Satoh S. Effects of organic acids on growth and phosphorus utilization in rainbow trout Oncorhychus mykiss. Fisheries Science, 2008, 74(4): Peng SM, Shi ZH, Sun P, et al. Effects of diet composition on growth rate, muscle amino acid and fatty acid composition of juvenile silver pomfret (Pampus argenteus). Marine Fisheries, 2012, 34(1): [ 彭士明, 施兆鸿, 孙鹏, 等. 饲料组成对银鲳幼鱼生长率及肌肉氨基酸 脂肪酸组成的影响. 海洋渔业, 2012, 34(1): 51 56] Rodriguez-Matas MC, Lisbona F, Gomez-Ayala AEI, et al. Influence of nutritional iron deficiency development on some aspects of iron, copper and zinc metabolism. Laboratory Animals, 1998, 32(3): Uyan O, Koshio S, Teshima S, et al. Growth and phosphorus loading by partially replacing fishmeal with tuna muscle by-product powder in the diet of juvenile Japanese flounder, Paralichthys olivaceus. Aquaculture, 2006, 257(1 4): Wang JQ, Jiang XH, Zhao LJ, et al. Effects of dietary protein source on growth in juvenile sea cucumber (Apostichopus japonicus). Feed Review, 2007(19): 9 13 [ 王吉桥, 蒋湘辉, 赵丽娟, 等. 不同饲料蛋白源对仿刺参幼参生长的影响. 饲料博览, 2007(19): 9 13] Wang JY, Li BS, Zhang DR, et al. Effects of dietary arginine on growth performance, immune responses and digestive enzyme of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus Selenka. Journal of Fisheries of China, 2015, 39(3): [ 王际英, 李宝山, 张德瑞, 等. 饲料中添加精氨酸对仿刺参幼参生长 免疫能力及消化酶活力的影响. 水产学报, 2015, 39(3): ] Wang JY, Song ZD, Li PY, et al. Effects of dietary galactomannan oligosaccharides on growth, digestion, body wall nutritional composition and immunity of juvenile sea cucumber (Apostichopus japonicus). Journal of Fishery Sciences of China, 2014, 21(2): [ 王际英, 宋志东, 李培玉, 等. 饲料添加半乳甘露寡糖对刺参幼参生长 体壁营养组成及免疫力的影响. 中国水产科学, 2014, 21(2): ] Wang ZP, Liu Q, Cao R, et al. Comparative analysis of nutritive composition between wild and cultured sea cucumber Apostichopus japonicus. South China Fisheries Science, 2012, 8(2): [ 王哲平, 刘淇, 曹荣, 等. 野生与养殖刺参营养成分的比较分析. 南方水产科学, 2012, 8(2): 64 70] Xia SD, Zhao P, Chen K, et al. Feeding preferences of the sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) on various seaweed diets. Aquaculture, 2012a, : Xia SD, Yang HS, Li Y, et al. Effects of different seaweed diets on growth, digestibility, and ammonia-nitrogen production of the sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Aquaculture, 2012b, : Yan J, Cao JM, Wang GX, et al. Effects of replacement of fish meal with housefly maggot meal on muscle nutritional composition, amino acids, and inosine monophosphate content in juvenile Litopenaeus vannamei. Journal of Fishery Sciences of China, 2012, 19(2): [ 严晶, 曹俊明, 王国霞, 等. 家蝇蛆粉替代鱼粉对凡纳滨对虾肌肉营养成分 氨基酸和肌苷酸含量的影响. 中国水产科学, 2012, 19(2): ] Yang ND, Fu GC. Research on replacement fish meal by fermented soybean meal in Litopenaeus vannamei feed. Feed Industry, 2008, 29(10): [ 杨耐德, 符广才. 凡纳滨对虾饲料中发酵豆粕替代鱼粉的研究. 饲料工业, 2008, 29(10): 24 26]

142 第 5 期李宝山等 : 发酵豆粕替代藻粉对刺参 (Apostichopus japonicus) 生长及体组成的影响 139 Ye J, Wang Z, Wang K. Effect of partial fish meal replacement by soybean meal on the growth performance and biochemical indices of juvenile Japanese flounder (Paralichthys olivaceus). Aquaculture International, 2011, 19(1): Yuan YC, Lin YC, Yang HJ, et al. Evaluation of fermented soybean meal in the practical diets for juvenile Chinese sucker, Myxocyprinus asiaticus. Aquaculture Nutrition, 2013, 19(1): Zhang LJ, Qi LL, Yang Y. Effect of fermented Bacillus natto on urease activity of soymeal. Soybean Science, 2008, 27(4): [ 张丽靖, 齐莉莉, 杨郁. 纳豆菌对豆粕脲酶活性的影响. 大豆科学, 2008, 27(4): ] Zhang YL, Zhang HJ, Xie SB, et al. Research advance in adsorption of heavy metals by algae. Uranium Mining and Metallurgy, 2009, 28(1): [ 张永亮, 张浩江, 谢水波, 等. 藻类吸附重金属的研究进展. 铀矿冶, 2009, 28(1): 31 37] Zhao B, Hu W, Li CL, et al. The nutritional effects of two feedstuffs from sweet potato on feeding and growth of sea cucumber Apostichopus japonicus. Progress in Fishery Sciences, 2016, 37(1): [ 赵斌, 胡炜, 李成林, 等. 两种甘薯饲料原料的营养成分及其对仿刺参 (Apostichopus japonicus) 摄食与生长的影响. 渔业科学进展, 2016, 37(1): 80 86] Zhou F, Song WX, Shao QJ, et al. Partial replacement of fish meal by fermented soybean meal in diets for black sea bream, Acanthopagrus schlegelii, juveniles. Journal of World Aquaculture Society, 2011, 42(2): ( 编辑冯小花 ) Effects of the Fermented Soybean Meal as a Replacement of Algae Powder on the Growth Performance and Body Composition of Juvenile Sea Cucumber (Apostichopus japonicus) LI Baoshan, ZHANG Limin, ZHANG Derui, SUN Yongzhi, WANG Shixin, WANG Jiying 1 (Shandong Provincial Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology, Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai ) Abstract In recent years, the fast development of sea cucumber (Apostichopus japonicus) farming overwhelmed the supply of algae powder as the feed. In this study, we investigated whether fermented soybean meal (FSBM) could be an effective replacement of algae powder. The algae powder and the mixture of fishmeal and algae powder (2 15) were replaced with FSBM in this study. The growth performance and body composition were tested in A. japonicus with initial body weight of 17.7 g. In the 10-week feeding trial, nine isonitrogen experimental diets were formulated. D1 was the control group; D2 D5 were algae powder-replaced groups; and D6 D9 were mixture-replaced groups. Each diet was assigned randomly to three tanks each of which contained 30 sea cucumber juveniles. The results showed that: As the proportion of replacement of algae powder increased, the weight gain rate (WGR) and the specific growth rate (SGR) first increased and then decreased. D2 showed the highest WGR and SGR, which were significantly higher than those of D4 and D5 (P<0.05). As the proportion of replacement of the mixture increased, WGR and SGR decreased significantly (P<0.05). Replacement of algae powder caused decrease in the crude lipid, Gly, Met, and Cys, and it increased the contents of Phe and His; while replacement of mixture led to decrease in crude ash of the body wall and contents of Ser, Thr, Gly, Met, Lys, and His, and it increased the contents of Arg, Pro, Phe and Cys. Replacement of powder caused decrease in contents of Ca, Mg, Fe, Zn, Cu, Cr, Mn and Pb; Replacement of mixture led to decrease in contents of Ca, Mg, Zn, Cu, Cr and Pb, and it increased contents of Fe and Mn. Using WGR as the indictor, SAS REG analysis showed that the optimum proportion of replacement of algae powder with FSBM was 29.75%. NLIN analysis showed that the optimum replacement proportion of the mixture was 46.46%. Key words Sea cucumber Apostichopus japonicus; Fermented soybean meal; Growth; Body composition; Amino acid; Mineral 1 Corresponding author: WANG Jiying, ytwjy@126.com

143 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 氟苯尼考对脊尾白虾 (Exopalaemon * carinicauda) 免疫和抗氧化功能的影响 冯艳艳 1,2 李健连春盎 1,2,31 1,2 李吉涛 2 翟倩倩 (1. 上海海洋大学上海 ; 2. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛 ; 3. 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室青岛 ) 2 许 杨 1,2 摘要为研究氟苯尼考对脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 免疫和抗氧化功能的影响, 以低 中 高 (10 20 和 40 mg/kg BW) 3 种剂量氟苯尼考药饵连续投喂脊尾白虾 5 d, 对照组投喂基础饲料 于停止投喂药饵后的第 和 240 h 取血淋巴, 测定血蓝蛋白 (HEM) 含量 酸性磷酸酶 (ACP) 碱性磷酸酶(AKP) 超氧化物歧化酶(T-SOD) 过氧化氢酶(CAT) 和总抗氧化能力 (T-AOC) 等指标的变化情况 结果显示, 低 中剂量组 HEM 含量均在 3 h 时间点显著高于对照组 (P<0.05), 高剂量组在 3 48 h 显著高于对照组 (P<0.05); 低 中剂量组 ACP 活性在 3 h 和 6 h 显著高于对照组 (P<0.05), 高剂量组在 h 显著低于其他 3 组 (P<0.05); 低 中剂量组 AKP 活性在 3 h 均显著高于对照组 (P<0.05),6 48 h 显著低于对照组 (P<0.05), 高剂量组在 3 48 h 显著低于对照组 (P<0.05); 低 中剂量组 T-SOD 活性整体高于对照组, 分别在 6 h 和 24 h 达到最高值 (P<0.05), 高剂量组在 24 h 和 48 h 显著低于对照组 (P<0.05); 低 中 高剂量组 CAT 活性均在 3 h 和 6 h 显著高于对照组 (P<0.05), 之后在 h 显著低于对照组 (P<0.05), 于 24 h 达到最低值 (P<0.05); 低 中 高剂量组 T-AOC 活性均在 3 96 h 显著低于对照组 (P<0.05), 于 48 h 达到最低值 (P<0.05), 且出现剂量效应 本研究结果为氟苯尼考在海水养殖生产中使用的安全评估提供了数据支持 关键词氟苯尼考 ; 脊尾白虾 ; 免疫 ; 抗氧化活性中图分类号 S948 文献标识码 A 文章编号 (2017) 药物是水产病害防治的重要手段 氟苯尼考是新一代酰胺醇类 ( 氯霉素类 ) 广谱抗菌药物, 以其良好的抗菌活性 较低的毒性和不易产生耐药性等优点, 在 国内外畜牧和水产养殖方面得到广泛应用 ( 黄凯等, 2015; 陈晋旭等, 2012) 抗菌药物在水产养殖中起着重要作用, 但其过量使用对养殖生物和环境会造成不 * 国家虾产业技术体系 (CARS-47) 山东泰山产业领军人才工程项目(LJNY ) 国家自然科学基金项目 ( ) 中国水产科学研究院黄海水产研究所基本科研业务费( ) 青岛海洋科学与技术国家实验室鳌山科技创新计划项目 (2015ASKJ02) 和宁波市科技计划项目 (2016C11011) 共同资助 [This project was financially supported by the earmarked fund for Modern Agro-industry Technology Research System (CARS-47), Taishan Industrial Leader Talent Project of Shandong Province (LJNY ), National Natural Science Foundation of China ( ), Special Scientific Research Funds for Central Non-profit Institutes, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences ( ), Aoshan Scientific and Technological Innovation Project Financially Supported by Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology (2015ASKJ02) and Projects of Science and Technology Projects of Ningbo (2016C11011)]. 冯艳艳, yarufeng@sina.cn 1 通讯作者 : 李健, 研究员, lijian@ysfri.ac.cn 收稿日期 : , 收修改稿日期 :

144 第 5 期冯艳艳等 : 氟苯尼考对脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 免疫和抗氧化功能的影响 141 利影响 已有研究报道水产常用药物, 如土霉素 恶喹酸和氟苯尼考, 影响水产动物的免疫调节和引起氧化应激 (Guardiola et al, 2012; Caipang et al, 2009) Park 等 (1995) 研究发现, 磺胺间二甲氧嘧啶会降低凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 血细胞对微生物的吞噬能力 王永胜等 (2008) 研究表明, 氯霉素对凡纳滨对虾非特异性免疫系统具有一定的抑制作用 王海潮等 (2011) 研究发现, 水产中 17 种常见抗菌药物的高浓度组 (500 μg/ml) 均对锯缘青蟹 (Scylla serrata) 酚氧化酶 (PO) 活性有明显抑制作用 ; 低剂量组 (5 10 μg/ml)( 推荐使用剂量 ), 有的抗菌药物对 PO 有明显抑制作用, 有的抗菌药物对 PO 无抑制作用, 而阿维菌素和氟苯尼考对 PO 则有免疫促进作用 张喆等 (2011) 研究了不同剂量诺氟沙星药饵投喂中国对虾 (Fenneropenaeus chinensis)7 d 后, 发现其各剂量组鳃和肌肉中的抗氧化酶的变化趋势不同 Ren 等 (2014) 研究发现, 氟苯尼考对凡纳滨对虾血淋巴抗氧化能力产生显著影响 目前, 有关氟苯尼考对甲壳动物影响的研究大多集中在药代和残留检测方面 ( 岳刚毅等, 2011; 赵青松等, 2014; 杨倩等, 2010; 邵会等, 2015), 而氟苯尼考对甲壳动物免疫和抗氧化功能影响的研究较少 本研究向脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 配合饲料中添加低 (10 mg/kg BW) 中 (20 mg/kg BW) 高 (40 mg/kg BW) 3 个剂量的氟苯尼考药粉, 通过测定脊尾白虾血浆血蓝蛋白 (HEM) 含量 酸性磷酸酶 (ACP) 碱性磷酸酶 (AKP) 超氧化物歧化酶(T-SOD) 过氧化氢酶(CAT) 和总抗氧化能力 (T-AOC) 的变化情况, 探讨氟苯尼考对脊尾白虾免疫和抗氧化功能的影响, 以期为甲壳动物健康养殖提供技术支持 1 材料与方法 1.1 实验动物外观健康的脊尾白虾购于山东日照海辰水产有限公司 实验于昌邑市海丰水产养殖有限责任公司开展 实验用虾体长为 (46.0±4.8) mm, 体重为 (1.5±0.4) g 实验前, 在 10 cm 3 室内水泥池暂养 10 d, 水温为 (24.0±0.5), 盐度为 27±1,pH 为 6.5±0.3 连续充气, 每天换水 1 次, 换水量为 1/3, 并投喂对虾配合饲料 1.2 药物与试剂氟苯尼考由湖北中牧安达药业有限公司提供 ( 批号 ), 含量为 98%; 其他试剂为国产分析纯 1.3 基础饲料基础饲料配方 : 鱼粉 (45%) 花生粉(25%) 豆粕 (10%) 面粉 (7%) 鱼油 (5%) 玉米粉 (5%) 鱼膏 (2%) 1.4 实验设计 实验分为对照组 氟苯尼考低剂量组 (10 mg/kg BW) 中剂量组 (20 mg/kg BW) 和高剂量组 (mg/kg BW), 每组 90 尾 3 个平行, 每个平行 30 尾 鸡蛋为粘合剂, 每次投喂量为虾体重的 2%( 张喆等, 2011), 对照组投喂不含药物的基础饲料 每天于 07:00 和 17:00 投喂 2 次, 连续投喂 5 d, 之后各组均投喂基础饲料 于最后一次给药后的 和 240 h 分别随机挑选 9 尾虾, 用 1 ml 一次性无菌注射器 ( 先抽取 0.3 ml 抗凝剂 -EDTA 盐 ) 于围心腔取 0.3 ml 血淋巴, 置于 1.5 ml 无 RNA 酶离心管中, 液氮保存 1.5 样品处理 取血淋巴冰上解冻, r/min 离心 10 min, 取血浆待用 1.6 免疫和抗氧化酶活性测定 血蓝蛋白含量 : 取 100 μl 血浆样品, 加入 900 μl 双蒸水混匀,335 nm 下测吸光值 每个样品 3 个重复 计算公式 (Song et al, 2003): E 335 nm (mmol/l)=17.26 OD 335 nm ACP AKP T-SOD CAT 和 T-AOC 采用南京建成试剂盒测定 1.7 统计分析 数据以平均值 ± 标准差 (Mean±SD) 表示, 用 SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析 (One-way ANOVA) 并进行 Duncan 氏多重比较 (P<0.05 为差异显著 ) 2 结果 2.1 氟苯尼考对脊尾白虾血浆中 HEM 含量的影响 由图 1 可知, 与对照组相比,3 个剂量组 HEM 含量均呈上升趋势 低 中剂量组在 3 h 与对照组均为显著差异 (P<0.05); 高剂量组在 3 48 h 与对照组呈现显著差异 (P<0.05), 96 h 后恢复至对照组水平 (P>0.05) 比较不同组 同时间的 HEM 含量,3 h 时中剂量组显著高于低剂量组 (P<0.05);6 48 h 时高剂量组显著高于低 中剂量组 (P<0.05) 2.2 氟苯尼考对脊尾白虾血浆中 ACP 活性的影响 由图 2 可知, 低 中剂量组血浆 ACP 活性均呈先升高后下降的趋势, 在 3 h 均达到最高值, 中剂量组显著高于低剂量组 (P<0.05), 且 3 6 h 时间点与对照组表现出显著差异 (P<0.05),12 h 时间点后恢复至

145 142 渔业科学进展第 38 卷 对照组水平 (P>0.05); 高剂量组的血浆 ACP 活性呈现下降趋势, 在 h 显著低于其他 3 组 (P<0.05), 240 h 后恢复至对照组水平 (P>0.05) 趋势, 在 3 6 h 显著高于对照组 (P<0.05), 在 6 h 达最高值,12 h 后恢复至对照组水平 (P>0.05); 中剂量组血浆 T-SOD 活性呈先升高后下降的趋势, 在 3 48 h 显著高于对照组 (P<0.05), 在 24 h 达最高值,96 h 后恢复至对照组水平 (P>0.05); 高剂量组则前期呈现下降趋势, 在 48 h 达最低值 (P<0.05), 后逐渐恢复至对照组水平 (P>0.05) 比较不同实验组 同一时刻 T-SOD 活性,6 48 h 时中剂量组显著高于低剂量组 (P<0.05); 在 h 高剂量组显著低于低 中剂量组 (P<0.05) 图 1 氟苯尼考对脊尾白虾血浆中 HEM 含量的影响 Fig.1 Effects of florfenicol on the HEM concentration in the hemolymph serum of E. carinicauda 标有不同字母者表示在同一时间点组间差异显著 (P<0.05) 下同 Different letters indicated significant differences between the groups at the same time point (P<0.05). The same as below 图 3 氟苯尼考对脊尾白虾血浆中 AKP 活性的影响 Fig.3 Effects of florfenicol on the activities of AKP in the hemolymph serum of E. carinicauda 图 2 氟苯尼考对脊尾白虾血浆中 ACP 活性的影响 Fig.2 Effects of florfenicol on the activities of ACP in the hemolymph serum of E. carinicauda 2.3 氟苯尼考对脊尾白虾血浆中 AKP 活性的影响 由图 3 可知, 低 中剂量组血浆 AKP 活性均呈先升高后下降的趋势, 在 3 h 达到最高值 (P<0.05), 之后逐渐下降,6 48 h 显著低于对照组 (P<0.05),96 h 后恢复至对照组水平 (P>0.05); 高剂量组血浆 ACP 活性呈现下降趋势, 在 3 48 h 与对照组表现出显著差异 (P<0.05),96 h 后恢复至对照组水平 (P>0.05) 2.4 氟苯尼考对脊尾白虾血浆中 T-SOD 活性的影响 由图 4 可知, 低剂量组血浆 T-SOD 活性呈升高 图 4 氟苯尼考对脊尾白虾血浆中 T-SOD 活性的影响 Fig.4 Effects of florfenicol on the activities of T-SOD in the hemolymph serum of E. carinicauda 2.5 氟苯尼考对脊尾白虾血浆中 CAT 活性的影响 由图 5 可知, 低 中 高各剂量组血浆 CAT 活性呈先上升后下降再上升的趋势, 均在 24 h 达到最低值 (P<0.05), 且出现剂量效应 低 中剂量组在 h 显著低于对照组 (P<0.05),168 h 后恢复至对照组水平 (P>0.05); 高剂量组在 h 显著低于其他 3 组 (P<0.05),240 h 后恢复至对照组水平 (P>0.05)

146 第 5 期冯艳艳等 : 氟苯尼考对脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 免疫和抗氧化功能的影响 143 图 5 氟苯尼考对脊尾白虾血浆中 CAT 活性的影响 Fig.5 Effects of florfenicol on the activities of CAT in the hemolymph serum of E. carinicauda 2.6 氟苯尼考对脊尾白虾血浆中 T-AOC 的影响 由图 6 可知, 低 中 高各剂量组血浆 T-AOC 活性呈先下降后上升的趋势, 且出现剂量效应 各剂量组在 3 96 h 显著低于对照组 (P<0.05), 且高剂量组显著低于低剂量组 (P<0.05),3 个剂量组在 48 h 均达到最低值 (P<0.05),168 h 后恢复至对照组水平 (P>0.05) 图 6 氟苯尼考对脊尾白虾血浆中 T-AOC 活性的影响 Fig.6 Effects of florfenicol on the activities of T-AOC in the hemolymph serum of E. carinicauda 3 讨论 甲壳动物缺乏抗体和特异性免疫细胞, 长期进化过程中形成了自身独特的非特异性免疫防御机制, 从而保证其在生物界中的生存和繁衍 (Hoffmann et al, 1999) 血淋巴因同时含有体液免疫因子和细胞免疫因子, 是目前研究甲壳动物免疫机能的主要组织 存 在于软体动物和节肢动物血淋巴中的血蓝蛋白 (HEM) 是一种呼吸蛋白 ( 孙杰等, 2010) 除载氧外,HEM 还具有酚氧化酶活性 (Burmester, 2002) 抗菌功能 (Terwilliger, 1998) 和适应环境等作用 (Zhang et al, 2004) 近年来, 越来越多的研究证实 HEM 参与虾类机体的免疫防御 Fan 等 (2013) 研究发现, 凡纳滨对虾在受到病原菌刺激后, 其血淋巴中的 HEM 会通过转变为酚氧化物酶的形式或降解为抗菌片段等方式参与机体抵御病原菌侵染 HEM 含量受到各种因素的影响, 如个体发育情况或环境因子 ( 如温度 ph 值 ) 等 Song 等 (2003) 报道, 凡纳滨对虾在感染病原后其体内 HEM 浓度下降幅度达 33.3% 本研究发现, 低 中 高各剂量组 HEM 含量在实验前期整体高于对照组水平, 这可能是虾体处于应激状态, 诱导增强其免疫功能导致 ACP 和 AKP 是甲壳动物先天免疫反应的重要参与者,ACP 是吞噬溶酶体的重要组成部分, 在血细胞进行吞噬和包囊反应中会随着 ACP 的释放起到杀菌的作用 (Liu et al, 2011);AKP 存在于虾蟹血细胞的小颗粒细胞和中透明细胞 ( 刘晓云等, 2002), 有清除 水解 消化外源异物的功能, 同时还是生物体内重要的解毒体系 ( 何海琪等, 1992) 研究表明,ACP 和 AKP 是衡量机体免疫能力的重要指标 ( 杨志彪等, 2006, 陈昌福等, 2004) 目前, 关于抗菌药物对甲壳动物 ACP 和 AKP 的影响已有一些研究 刘立鹤等 (2006) 研究发现, 不同浓度黄霉素添加到基础饲料中饲喂凡纳滨对虾 8 周,4 mg/kg 组凡纳滨对虾血浆 ACP 活性显著升高,12 24 和 48 mg/kg 组凡纳滨对虾血浆 ACP 活性呈现下降趋势 温俊等 (2008) 研究发现,4 mg/kg 黄霉素饲喂凡纳滨对虾 30 d, 其 AKP 活性显著升高 本研究结果显示, 饲喂氟苯尼考 5 d 后, 低 中剂量对脊尾白虾血浆中 ACP 和 AKP 活性有明显促进作用, 高剂量则表现出抑制作用 这与郭明凯等 (2012) 在中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) 和刘立鹤等 (2006) 在凡纳滨对虾中的研究结果一致 当水产动物受到外界环境因子 ( 水温 盐度 溶氧 氨氮以及化学污染物质等 ) 胁迫时会产生氧化应激, 导致自由基在体内产生和积累, 如果机体抗氧化防御系统未能及时清除体内增加的自由基, 过多的活性氧自由基对机体本身会产生毒害作用 (Rånby et al, 1978) 虾类用来清除体内过多的活性氧自由基以维持正常的氧化状态的抗氧化防御系统是其非特异性免疫反应中的核心免疫机制 (Castex et al, 2010), 抗氧化能力是评价机体健康的重要指标 (Xu et al, 2013; 洪美玲等, 2007; Bebianno et al, 2005) 像其他甲壳动

147 144 渔业科学进展第 38 卷 物一样, 虾类抗氧化防御系统包括抗氧化酶 (SOD CAT 等 ) 和非酶小分子 (V A V C V E 还原型谷胱甘肽和类胡萝卜素等 )(Liu et al, 2004) T-SOD 和 CAT 等构成的抗氧化酶系统发挥了重要的抗氧化功能, 其活性的高低直接或间接反映了机体抗氧化功能的强弱 ( 任海等, 2014) 抗氧化酶本质上是相互依赖的, 因其固有的生物周期 外界理化环境因子和人为污染的影响而产生各种变化 (Sheehan et al, 1999) SOD 作为活性氧自由基的天然消除剂, 是唯一以超氧阴离子 (O 2 ) 为底物的酶, 是机体防御氧化损伤的一种重要酶类 (Winterbourn, 1993) 其活性高低可间接反映甲壳动物活性氧的水平和细胞受氧化损伤的程度, 且 SOD 与生物的免疫水平密切相关 本实验发现, 低 中剂量组氟苯尼考对脊尾白虾血浆 T-SOD 具有诱导作用, 呈先升高后降低的趋势 ; 高剂量氟苯尼考对脊尾白虾血浆 T-SOD 具有抑制作用 有研究发现, 当生物体受到轻度逆境胁迫时, 其 T-SOD 活性往往升高 ; 而当受到重度逆境胁迫时, 其 T-SOD 活性通常降低, 机体内积累过量的活性氧, 从而导致生物体受到伤害 (Cabell et al, 1999) 也有学者认为这种现象是生物体的 应激适应 和 应激损伤 ( 李毅平等, 1998) 本实验中, 低 中剂量作用下 T-SOD 活性显著上升可能是氟苯尼考代谢过程中产生过多氧自由基, 为了清除过多的氧自由基,T-SOD 表现为活性增强 ; 当氟苯尼考剂量增加, 机体产生的氧自由基超出其所能清除的范围, 氧自由基进攻抗氧化系统, 从而 T-SOD 表现为活性被抑制 一般条件下, 机体为克服不良环境对其的损害, 会通过 T-SOD CAT 等抗氧化酶的联合作用来清除氧自由基 (Lopes et al, 2001) CAT 是机体抗氧化防御 体系中重要的酶之一, 可以把 T-SOD 歧化 O 2 产生的过氧化氢 (H 2 O 2 ) 转变为水 (H 2 O) 和氧气 (O 2 ), 从而防止机体氧化损伤 (Mohankumar et al, 2006) 钟君伟等 (2014) 将不同质量浓度的敌百虫药浴克氏原螯虾 (Procambarus clarkii) 12 d, 在第 2 天,0.132 mg/l 和 mg/l 组的肝胰腺 CAT 活性明显上升, 之后, 各剂量组 CAT 活性逐渐下降, 在 12 d 时各剂量组 CAT 活性显著低于对照组水平 在本实验前期, 各剂量组血浆 CAT 活性表现出明显的诱导作用 ; 当实验进行到第 12 h 时, 各剂量组血浆 CAT 活性表现出明显的抑制作用, 并呈现剂量 效应关系 这可能是由于氟 苯尼考致使机体产生氧自由基, 使得 SOD 分解 O 2 生成过多的 H 2 O 2, 机体为清除过多的 H 2 O 2,CAT 的合成量升高, 降低了氟苯尼考对机体的氧化损伤作用 ; 随着实验的进行, 机体活性氧中间体增多, 超出了机体的清除能力, 大量活性氧中间体改变了 CAT 酶结构, 降低了 CAT 活性 ( 游学军等, 2001) T-AOC 是反映机体总抗氧化水平的综合性指标, 通过分解机体产生的过氧化物, 阻断过氧化链, 清除自由基和活性氧 ( 翟少伟等, 2016) T-AOC 大小可以反映机体对外来刺激的代偿能力和机体自由基代谢的状态 (Fuller, 1989) Ren 等 (2015) 研究发现, 将凡纳滨对虾暴露于不同剂量 ( μg/l) 多环芳烃化合物 CHR 中 21 d, 结果表明 CHR 对其鳃和肝胰腺中 T-AOC 活性有显著抑制作用, 且呈剂量 效应, 指出 T-AOC 活性可作为评估凡纳滨对虾养殖环境 CHR 污染的敏感指标 郭明凯 (2012) 1) 按 和 200 mg/kg 的剂量将恩诺沙星添加于饲料中投喂中华绒螯蟹 7 d, 各实验组血浆中 T-AOC 活性在实验期间显著高于对照组水平 而 Ren 等 (2014) 研究氟苯尼考对凡纳滨对虾 T-AOC 活性影响的结果发现, T-AOC 在投喂氟苯尼考 (0 6 d) 呈下降趋势, 且变化具有明显的时间规律性和显著的剂量效应 这可能是因为药物 物种不同而有所不同 本研究中,3 个氟苯尼考处理组的血浆 T-AOC 活性均被抑制 有学者认为机体的抗氧化能力在一定程度上反映其健康状况 (Xu et al, 2013) 本研究 T-AOC 活性降低推测是氟苯尼考在一定程度上损害了脊尾白虾的健康 4 结论本实验所用氟苯尼考的低 (10 mg/kg BW) 中 (20 mg/kg BW) 高(40 mg/kg BW) 3 种剂量均能够影响脊尾白虾血浆中免疫指标和抗氧化酶活性 低 中剂量氟苯尼考对 HEM 含量 ACP AKP T-SOD 和 CAT 活性具有诱导作用, 而高剂量氟苯尼考对 HEM 含量 ACP AKP T-SOD CAT 和 T-AOC 活性具有抑制作用 本实验结果可为制定抗菌药物在实际生产中的使用剂量和作用时间提供参考 参考文献 Bebianno M, Company R, Serafim A, et al. Antioxidant systems 1) Guo MK. Effects of enrofloxacin and cortisol on the immune function and intestinal microflora of Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis). Master s Thesis of Soochow University, 2012, [ 郭明凯. 恩诺沙星和皮质醇对中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) 免疫功能及肠道菌群的影响. 苏州大学硕士研究生学位论文, 2012, 26 27]

148 第 5 期冯艳艳等 : 氟苯尼考对脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 免疫和抗氧化功能的影响 145 and lipid peroxidation in Bathymodiolus azoricus from Mid-Atlantic Ridge hydrothermal vent fields. Aquatic Toxicology, 2005, 75(4): Burmester T. Origin and evolution of arthropod hemocyanins and related proteins. Journal of Comparative Physiology B, 2002, 172(2): Cabell LA, Monahan MK, Anslyn EV. A competition assay for determining glucose-6-phosphate concentration with a tris-boronic acid receptor. Tetrahedron Letters, 1999, 40(44): Caipang CMA, Lazado CC, Brinchmann MF, et al. In vivo modulation of immune response and antioxidant defense in Atlantic cod, Gadus morhua following oral administration of oxolinic acid and florfenicol. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology, 2009, 150(4): Chen CF, Yao J, Chen CR, et al. Prevention of epidemic diseases of shrimp and crab with immunologic stimulant. Freshwater Fisheries, 2004, 34(2): [ 陈昌福, 姚娟, 陈超然, 等. 利用免疫刺激剂预防虾 蟹的传染性疾病. 淡水渔业, 2004, 34(2): 56 58] Chen JX, Ji H, Peng L, et al. Residues and elimination of florfenicol and its metabolite florfenicol amine in the freshwater crayfish. Journal of Nanjing Agricultural University, 2012, 35(2): [ 陈晋旭, 季辉, 彭麟, 等. 氟苯尼考及其代谢物在淡水小龙虾中残留消除规律的研究. 南京农业大学学报, 2012, 35(2): ] Fan L, Wang A, Wu Y. Comparative proteomic identification of the hemocyte response to cold stress in white shrimp, Litopenaeus vannamei. Journal of Proteomics, 2013, 80(6): Fuller R. A review: Probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology, 1989, 66(5): Guardiola F, Cerezuela R, Meseguer J, et al. Modulation of the immune parameters and expression of genes of gilthead seabream (Sparus aurata) by dietary administration of oxytetracycline. Aquaculture, 2012, : Guo MK, Li Y, Wang YF, et al. Effects of enrofloxacin on the non-specific immune response of Eriocheir sinensis. Feed Research, 2012(2): [ 郭明凯, 李义, 王玉芬, 等. 恩诺沙星对中华绒螯蟹非特异性免疫的影响. 饲料研究, 2012(2): 66 68] He HQ, Sun F. Studies on the characteristics of acid and alkaline posphatases in Chinese shrimp. Oceanologia et Limnologia Sinica, 1992, 23(5): [ 何海琪, 孙凤. 中国对虾酸性和碱性磷酸酶的特性研究. 海洋与湖沼, 1992, 23(5): ] Hoffmann JA, Kafatos FC, Janeway CA, et al. Phylogenetic perspectives in innate immunity. Science, 1999, 284(5418): Hong ML, Chen LQ, Gu SZ, et al. Effects of ammonia exposure on immunity indicators of haemolymph and histological structure of hepatopancreas in Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis). Journal of Fishery Sciences of China, 2007, 14(3): [ 洪美玲, 陈立侨, 顾顺樟, 等. 氨氮胁迫对中华绒螯蟹免疫指标及肝胰腺组织结构的影响. 中国水产科学, 2007, 14(3): ] Huang K, Chen SJ, Huang J, et al. Analysis of antibiotic resistance of Salmonella isolated from animals and identification of its florfenicol resistant gene. China Animal Husbandry & Veteinary Medicine, 2015, 42(2): [ 黄凯, 陈素娟, 黄骏, 等. 动物源性沙门氏菌的耐药性分析及氟苯尼考类耐药基因的鉴定. 中国畜牧兽医, 2015, 42(2): ] Li YP, Gong H. The research progress of the system of antioxidant responses in insect. Chinese Bulletin of Life Sciences, 1998, 10(5): [ 李毅平, 龚和. 昆虫体内抗氧化系统研究进展. 生命科学, 1998, 10(5): ] Liu CH, Chen JC. Effect of ammonia on the immune response of white shrimp Litopenaeus vannamei and its susceptibility to Vibrio alginolyticus. Fish & Shellfish Immunology, 2004, 16(3): Liu LH, Liu HY, Dong AH, et al. Effects of flavomycin on the growth and non-specific immune response of Litopenaeus vannamei. Freshwater Fisheries, 2006, 36(6): [ 刘立鹤, 刘辉宇, 董爱华, 等. 饲料中添加黄霉素对凡纳滨对虾生长和非特异性免疫力的影响. 淡水渔业, 2006, 36(6): 25 28] Liu XL, Xi QY, Yang L, et al. The effect of dietary Panax ginseng polysaccharide extract on the immune responses in white shrimp, Litopenaeus vannamei. Fish & Shellfish Immunology, 2011, 30(2): Liu XY, Zhang ZF, Ma HM. Study on enzyme cyto-chemistry of bleed cells in Penaeus chinensis. Journal of Ocean University of Qingdao, 2002, 32(2): [ 刘晓云, 张志峰, 马洪明. 中国对虾血细胞酶细胞化学的初步研究. 青岛海洋大学学报 ( 自然科学版 ), 2002, 32(2): ] Lopes PA, Pinheiro T, Santos MC, et al. Response of antioxidant enzymes in freshwater fish populations (Leuciscus alburnoides complex) to inorganic pollutants exposure. Science of the Total Environment, 2001, 280(1 3): Mohankumar K, Ramasamy P. White spot syndrome virus infection decreases the activity of antioxidant enzymes in Fenneropenaeus indicus. Virus Research, 2006, 115(1): Park ED, Lightner DV, Milner N, et al. Exploratory bioavailability and pharmacokinetic studies of sulphadimethoxine and ormetoprim in the penaeid shrimp, Penaeus vannamei. Aquaculture, 1995, 130(2 3): Rånby BG, Rabek JF. Singlet oxygen reactions with organic compounds and polymers. John Wiley & Sons, 1978 Ren H, Li J, Li JT, et al. Effects of acute ammonia stresses on antioxidant enzyme activities and GPx gene expression in Exopalaemon carinicauda. Journal of Agro-Environment Science, 2014, 33(4): [ 任海, 李健, 李吉涛, 等. 急性氨氮胁迫对脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 抗氧化系统酶活性及 GPx 基因表达的影响. 农业环境科学学报, 2014, 33(4): ] Ren X, Pan L, Wang L. Effect of florfenicol on selected

149 146 渔业科学进展第 38 卷 parameters of immune and antioxidant systems, and damage indexes of juvenile Litopenaeus vannamei following oral administration. Aquaculture, 2014, 432(34): Ren X, Pan L, Wang L. The detoxification process, bioaccumulation and damage effect in juvenile white shrimp Litopenaeus vannamei exposed to chrysene. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2015, 114: Shao H, Leng KL, Zhou MY, et al. Simultaneous determination of chloramphenicol, thiamphenicol, florfenicol and florfenicol amine residues in aquatic products with gas chromatography/mass spectrometry. Progress in Fishery Sciences, 2015, 36(3): [ 邵会, 冷凯良, 周明莹, 等. 水产品中氯霉素 甲砜霉素 氟苯尼考 氟苯尼考胺多残留的同时测定 GC/MS 法. 渔业科学进展, 2015, 36(3): ] Sheehan D, Power A. Effects of seasonality on xenobiotic and antioxidant defence mechanisms of bivalve molluscs. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology, 1999, 123(3): Song YL, Yu CI, Lien TW, et al. Haemolymph parameters of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) infected with Taura syndrome virus. Fish & Shellfish Immunology, 2003, 14(4): Sun J, Wang BJ, Zhu SJ, et al. Purification, cdna cloning and relationship study on three kind of immune-related factors in shrimp Fenneropenaeus chinensis. Progress in Fishery Sciences, 2010, 31(1): [ 孙杰, 王宝杰, 孙姝娟, 等. 中国明对虾血蓝蛋白基因 cdna 的克隆与序列分析. 渔业科学进展, 2010, 31(1): 80 88] Terwilliger NB. Functional adaptations of oxygen-transport proteins. Journal of Experimental Biology, 1998, 201: Wang HC, Zhao HQ, Qian D, et al. Effect of common antibiotics in aquaculture on phenoloxidase activity in mud crab. Fisheries Science, 2011, 30(1): [ 王海潮, 赵海泉, 钱冬, 等. 水产常用抗菌药物对锯缘青蟹酚氧化酶的影响. 水产科学, 2011, 30(1): 38 41] Wang YS, Qian LM, Chen CQ, et al. Effect of antibiotic and probiotics on nonspecific immune system of pacific white shrimp, Litopenaeus vannarnei. Journal of Oceanography in Taiwan Strait, 2008, 27(2): [ 王永胜, 钱鲁闽, 陈昌生, 等. 抗生素和有益微生物对凡纳滨对虾非特异性免疫效应的研究. 台湾海峡, 2008, 27(2): ] Wen J, Sun M, Sun DY. Effects of synbiotic on growth and intestine of Litopenaeus vannarnei. Feed Research, 2008(10): [ 温俊, 孙鸣, 孙冬岩. 合生素对南美白对虾肠道菌群和免疫机能的影响. 饲料研究, 2008(10): 53 55] Winterbourn CC. Superoxide as an intracellular radical sink. Free Radical Biology and Medicine, 1993, 14(1): Xu WJ, Pan LQ. Enhancement of immune response and antioxidant status of Litopenaeus vannamei juvenile in biofloc-based culture tanks manipulating high C/N ratio of feed input. Aquaculture, 2013, s (6): Yang Q, Wu ZX, Chen XX, et al. Research advances of pharmacodynamics and pharmacokinetics of florfenicol in aquaculture animals. Journal of Hydroecology, 2010, 3(5): [ 杨倩, 吴志新, 陈孝煊, 等. 氟苯尼考的药效学及其在水产动物中的代谢动力学研究进展. 水生态学杂志, 2010, 3(5): ] Yang ZB, Zhao YL, Zhou ZL, et al. Effects of water-borne copper on activities of metabolism enzymes in Eriocheir sinensis. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2006, 37(2): [ 杨志彪, 赵云龙, 周忠良, 等. 水体铜对中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) 代谢酶活性的影响. 海洋与湖沼, 2006, 37(2): ] You XJ, Zheng YH. Effects of P-NCB on liver catalase activity of grasscarp (Ctenophoryngodon idellus). Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2001, 14(4): [ 游学军, 郑永华. 对氯硝基苯对草鱼种肝胰脏过氧化氢酶活性的影响. 西南农业学报, 2001, 14(4): 79 82] Yue GY, Wu ZX, Yang Q, et al. Pharmacokinetics of florenicol and its metabolite, florenicolamine, in red swamp crayfish, Procambarus clarkii. Acta Hydrobiologica Sinica, 2011, 35(2): [ 岳刚毅, 吴志新, 杨倩, 等. 氟苯尼考及氟苯尼考胺在克氏原螯虾体内药物代谢动力学. 水生生物学报, 2011, 35(2): ] Zhai SW, Shi QC, Chen XH. Effect of dietary animicrobial peptides-surfactin supplementation on parameters of intestinal health genetically improved farmed tilapia (GIFT, oreochromis niloticus). Acta Hydrobiologica Sinica, 2016, 40(4): 1 7 [ 翟少伟, 史庆超, 陈学豪. 饲料中添加抗菌肽 Surfactin 对吉富罗非鱼肠道健康的影响. 水生生物学报, 2016, 40(4): 1 7] Zhang X, Huang C, Qin Q. Antiviral properties of hemocyanin isolated from shrimp Penaeus monodon. Antiviral Research, 2004, 61(2): Zhang Z, Li J, Feng W, et al. Effects of norfloxacin on the non-specific immune response of Fenneropenaeus chinensis. Progress in Fishery Sciences, 2011, 32(2): [ 张喆, 李健, 冯伟, 等. 不同浓度诺氟沙星对中国对虾非特异性免疫酶活的影响. 渔业科学进展, 2011, 32(2): 53 59] Zhao QS, Jin S, Chen YE, et al. Pharmacokinetics of florfenicol in disease model of Portunus trituberculatus. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2014, 45(3): [ 赵青松, 金珊, 陈寅儿, 等. 氟苯尼考在三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus) 疾病模型内的代谢动力学. 海洋与湖沼, 2014, 45(3): ] Zhong JW, Zhu YA, Meng QL, et al. Effects of the stress of Trichlophon on some immune parameters of Procambarus clarkii. Journal of Hydroecology, 2014, 35(2): [ 钟君伟, 朱永安, 孟庆磊, 等. 敌百虫胁迫对克氏原螯虾免疫学相关指标的影响. 水生态学杂志, 2014, 35(2): ] ( 编辑冯小花 )

150 第 5 期冯艳艳等 : 氟苯尼考对脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 免疫和抗氧化功能的影响 147 Effects of Florfenicol on the Immune and Antioxidant Activities of Exopalaemon carinicauda FENG Yanyan 1,2, LI Jian 1,2,31, LI Jitao 2, XU Yang 1,2, LIAN Chunang 1,2, ZHAI Qianqian 2 (1. Shanghai Ocean University, Shanghai ; 2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao ; 3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao ) Abstract The abuse of antimicrobial has raised more and more attention in recent years because of its severe harm on environments and human health caused by the drug residues. In this study, we investigated the effects of florfenicol on immune and antioxidant activities of the Exopalaemon carinicauda by measuring the concentration of HEM and the activities of ACP, AKP, T-SOD, CAT and T-AOC in the plasma of E. carinicauda in the presence of florfenicol at different concentrations. At 3 h, the HEM concentration of the samples treated with low/medium dose of florfenicol (10 or 20 mg/kg BW) was significantly higher than that of the control group (P<0.05); from 3 h to 48 h, high dose of florfenicol (40 mg/kg BW) had the same effect (P<0.05). At 3 h and 6 h, the ACP activity in the presence of low/medium dose of florfenicol was higher than that of the control group (P<0.05); from 3 h to 168 h, high dose of florfenicol reduced the ACP activity (P<0.05). In the presence of low/medium dose of florfenicol, the activity of AKP was higher than the control at 3 h (P<0.05), from 6 h to 48 h, however, it decreased to a lower level than the control (P<0.05). At the end of the three experiments described above, all the values of the experimental groups returned to the control level. When treated with low/medium dose of florfenicol, the activity of T-SOD was higher than the control and peaked at 6 h and 24 h; in the contrast, the T-SOD activity was lower than the control at 24 h and 48 h when treated with high dose of florfenicol (P<0.05). Regardless of the florfenicol concentration, the activity of CAT was higher than the control at 3 h and 6 h (P<0.05), but was lower than the control group from 12 h to 96 h (P<0.05), and then recovered to the control level at the end of the experiment. Florfenicol at all three concentrations caused a decrease in the T-AOC activity up to 96 h (P<0.05) in a dose-dependent manner. Our results suggested that these parameters discussed above could serve as potential biomarkers to evaluate the safe use of florfenicol in the culture of E. carinicauda. Key words Florfenicol; Exopalaemon carinicauda; Immune; Antioxidant activity 1 Corresponding author: LI Jian, lijian@ysfri.ac.cn

151 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 致病性粪肠球菌对脊尾白虾 (Exopalaemon * carinicauda) 免疫相关基因表达的影响 段亚飞 1 李 健 2,3 李吉涛 2,3 张 喆 1 刘 萍 2,31 (1. 农业部南海渔业资源开发利用重点实验室 中国水产科学研究院南海水产研究所 广州 ; 2. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 ; 3. 青岛海洋科学与技术国家实验室 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 青岛 ) 摘要为了研究致病性粪肠球菌 (Enterococcus faecalis) 对脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 免疫相关基因表达的影响, 分别对健康脊尾白虾注射生理盐水和粪肠球菌, 测定了不同时间点血细胞和肝胰腺中酚氧化酶原 (propo) C 型凝集素 (CTL) 超氧化物歧化酶(SOD) 组织蛋白酶 D (Cat D) 和组织蛋白酶 L (Cat L) 基因的相对表达量变化 结果显示, 与对照组相比, 感染粪肠球菌后, 血细胞和肝胰腺中 propo 基因表达量均于 6 h 达到最大值 (P<0.05), 随后逐渐降低至对照组水平 ; 血细胞和肝胰腺中 CTL 基因表达量分别于 12 h 和 6 h 上升至最大值, 随后逐渐降低 ; 血细胞中 CTL 基因表达量于 72 h 虽有降低, 但仍显著高于对照组 (P<0.05); 血细胞和肝胰腺中 SOD 基因表达量分别于 6 h 和 3 h 达到最大值, 随后逐渐降低, 并于 72 h 达到正常水平 ; 血细胞和肝胰腺中 Cat D 基因表达量变化趋势基本一致, 呈现先降低后升高 然后显著降低再升高的趋势 ; 血细胞和肝胰腺中 Cat L 基因表达量分别于 6 h 和 3 h 显著降低, 随后逐渐升高至最大值, 并于 72 h 达到对照组水平 研究表明, 长时间的粪肠球菌感染对脊尾白虾免疫相关基因表达影响显著, 本研究所用免疫相关基因均可作为粪肠球菌感染疾病的监测指标 关键词脊尾白虾 ; 粪肠球菌 ; 酚氧化酶原 ; C 型凝集素 ; 超氧化物歧化酶 ; 组织蛋白酶中图分类号 S917 文献标识码 A 文章编号 (2017) 脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 是我国特有的海洋经济虾类, 以黄 渤海产量为最高, 具有生长速度快 繁殖能力强 环境适应性广等优点 ( 段亚飞等, 2013a b) 此外, 脊尾白虾成虾体型相对较小, 便于实验操作, 且世代周期短, 一年可多次繁殖, 具备作为甲壳类研究模式生物的潜力 ( 冯宁宁等, 2014) 近年来, 随着养殖规模的不断扩大, 虾类细菌性病害问题日益严重, 尤其以 早期死亡综合征 或 急性肝胰腺坏死综合征 最为突出, 成为阻碍虾类养殖产业健康发展的瓶颈之一 (Joshi et al, 2014) 因此, 虾类细菌病及其免疫机制的研究显得极为关键 粪肠球菌 (Enterococcus faecalis) 属于革兰氏阳性 * 国家虾产业技术体系 (CARS-47) 国家自然科学基金( ) 山东省泰山产业领军人才工程项目(LNJY ) 青岛市产业培育计划科技惠民专项 ( nsh) 宁波市科技计划项目(2016C11011) 和中国水产科学研究院南海水产研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金 (2016TS07) 共同资助 [This study was supported by the Earmarked Fund for Modern Agro-Industry Technology Research System (CARS-47), National Natural Science Foundation of China ( ), the Program of Shandong Leading Talent (LJNY ), Qingdao Industrial Development Program (Science and Technology Benefit Special Project) ( nsh), Ningbo Science and Technology Planning Project (2016C11011), and Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, South China Sea Fisheries Research Institute, CAFS (2016TS07)]. 段亚飞, duanyafei89@163.com 1 通讯作者 : 刘萍, 研究员, liuping@ysfri.ac.cn 收稿日期 : , 收修改稿日期 :

152 第 5 期段亚飞等 : 致病性粪肠球菌对脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 免疫相关基因表达的影响 149 菌, 具有较强的环境抵抗力 研究表明, 部分粪肠球菌属于动物肠道正常菌群, 作为益生菌用于调节肠道微生态 (Lee et al, 2000; Ricke, 2003) 但部分粪肠球菌具有多重耐药性 致病性毒力因子, 以及人与动物间复杂的感染传递机制等, 当动物受伤 体弱 抗病力降低和环境条件恶化时, 其会分泌毒性物质破坏细胞组织, 引发感染性疾病 ( 刘燕霏等, 2013; 狄婷婷等, 2012) Huycke 等 (2002) 发现,95% 的致病性粪肠球菌在人体肠道内会产生大量细胞外过氧化物和氧化自由基, 引起细胞 DNA 损伤, 破坏肠道屏障结构 因此, 粪肠球菌是医院临床感染的重要致病菌和环境中粪便污染的指示菌 粪肠球菌作为益生菌在水产养殖中的应用日益增多, 但携带毒力因子的菌株可能会造成养殖动物感染性疾病发生, 具有成为水产病原菌的可能性 ( 李斌等, 2011; 房海等, 2009) 例如, 粪肠球菌可以在虾夷扇贝 (Pactinopecten yessoensis) 组织中大量累积, 且显著影响其免疫酶活性 ( 李斌等, 2011); 当环境因子如盐度 ph 温度和氨氮等发生变化时, 罗氏沼虾 (Macrobrachium rosenbergii) 对肠球菌的易感性显著增加 (Cheng et al, a b) 研究表明, 粪肠球菌的致病性是多功能和多因子协同作用的结果, 不同来源粪肠球菌所携带毒力因子的种类不同, 且致病毒力因子的携带率及表达也因宿主或地区的不同而各有差异, 引起的感染类型不同, 可在人与动物中进行水平传播 ( 马立艳等, 2005; 刘燕霏等, 2013) 因此, 粪肠球菌对虾类的致病性以及免疫相关基因表达变化特征的研究具有重要意义 本研究通过对脊尾白虾注射感染致病性粪肠球菌, 测定不同时间点免疫相关基因如酚氧化酶原 (propo) C 型凝集素 (CTL) 超氧化物歧化酶 (SOD) 组织蛋白酶 D (Cat D) 和组织蛋白酶 L (Cat L) 表达量变化, 初步探讨致病性粪肠球菌感染对脊尾白虾免疫机制的影响, 以期为虾类应答致病性粪肠球菌感染的免疫机制研究提供基础数据 1 材料与方法 1.1 材料本研究所用健康脊尾白虾取自浙江宁波象山, 平均体长为 (5.81±0.32) cm, 平均体重为 (1.18±0.35) g; 于 200 L PVC 桶中暂养 7 d, 每桶 40 尾 实验期间, 水温为 24, 盐度为 25,pH=8.2, 不间断充气, 每天换水 1/3, 投喂对虾配合饲料 TRIzol Reagent 购自 Invitrogen 公司 ;M-MLV 反转录酶 DNaseⅠ SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ 均购 自 TaKaRa 公司 ; 本实验所用引物均由生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司合成 ; 其他试剂均为国产分析纯 1.2 粪肠球菌感染实验实验用人源致病性粪肠球菌菌种 (ATCC29212) 购自广东省微生物菌种保藏中心 感染前, 营养琼脂平板上活化菌种 ; 挑取单菌落于 TSB 液体培养基中, 36 扩大培养 24 h; r/min 离心 15 min, 取沉淀, 用 0.86% 无菌生理盐水稀释至 CFU/ml 的菌悬液,4 保存备用 将暂养 7 d 的脊尾白虾随机分为 2 组, 即对照组和感染组, 每组 3 个平行, 每个平行 50 尾虾 感染组每尾虾注射粪肠球菌菌悬液 20 μl ( 约 CFU), 对照组注射 0.86% 无菌生理盐水 20 μl, 注射部位均为虾的第 2 腹节 分别于注射后 和 72 h, 取血细胞和肝胰腺组织于液氮中冷冻保存, 用于基因表达分析 以内含抗凝剂 (0.45 mol/l NaCl, 0.1 mol/l 葡萄糖,30 mmol/l 柠檬酸钠,26 mmol/l 柠檬酸,10 mmol/l EDTA,pH=4.6) 的无菌注射器活体采取血液, 离心 (4, 800 r/min, 15 min) 收集血细胞沉淀 同一时间点每个平行组分别取 3 尾虾, 将血细胞或肝胰腺组织分别混合作为一组样品, 即每个时间点感染组或对照组共有 3 组样品 1.3 免疫基因表达分析 TRIzol 试剂提取脊尾白虾感染粪肠球菌后各时间点血细胞和肝胰腺组织的总 RNA, 核酸定量仪检测其纯度和浓度,1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测其质量及完整性 利用 DNaseⅠ 去除总 RNA 中残留的 DNA, 使用 M-MLV 反转录酶将 RNA 反转录为 cdna, 具体操作按照说明书进行,cDNA 保存于 20 备用 根据本实验室提交至 GenBank 中的脊尾白虾 propo CTL SOD Cat D 和 Cat L 和内参基因 18S rrna 的 cdna 序列, 使用 Primer premier 5.0 软件分别设计 1 对正反特异性引物 ( 表 1), 利用 Real-time PCR 对不同时间粪肠球菌感染后的脊尾白虾血细胞和肝胰腺中上述几种基因的表达量进行检测, 每个样品 3 个平行, 按照 SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ (TaKaRa) 试剂盒说明书进行 反应体系为 20 μl, 包括 10 μl SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ(2 ),0.8 μl 10 μmol/l 正向引物,0.8 μl 10 μmol/l 反向引物,0.4 μl ROX Reference Dye Ⅱ (50 ),2.0 μl cdna, 6.0 μl DEPC 水 反应程序 :95 30 s;95 5 s,60 34 s,40 个循环 ;95 15 s,60 1 min,95 15 s 采用 2 Ct 法计算各基因的相对表达量

153 150 渔业科学进展第 38 卷 表 1 本研究所用引物序列 Tab.1 The sequence of primers used in this study 基因名称 Gene name 登录号 Accession number 引物序列 Primer sequence (5 3 ) propo JQ F: AAACGATTCGACTACCATCTCCA R: GTTCATTCGGTTTCCCCTCTC CTL KF F: CCATGGATGGGGTATCAAATCCTG SOD KC R: AAGCTTCAAAGACAACGGTTTTGC F: CTCTCCTTGGATTGGATGTGTG Cat D JX R: TGCGGGCGTTTTCGTAG F: CAGTAGCCGTGAAAGACCAGA Cat L JX R: AAGAATCAACTCGCCACCTTC F: TGACTGGACTGACTAAGCTGGA 18S rrna GQ R: TTGAGATAGTCGTAGGCCCATT F: TATACGCTAGTGGAGCTGGAA R: GGGGAGGTAGTGACGAAAAAT 1.4 数据分析所得实验数据均以平均值 ± 标准差 (Mean±SD) 表示, 用 SPSS 11.0 进行单因素方差分析 (One-way ANOVA),P<0.05 表示差异显著 2 结果 2.1 粪肠球菌感染对脊尾白虾 propo 基因表达的影响与对照组相比, 脊尾白虾感染粪肠球菌后 6 h, 血细胞中 propo 基因相对表达量显著上升至最大值, 为对照组的 7.30 倍 (P<0.05); 随后相对表达量逐渐下降, 并于 24 h 下降至对照组水平 ( 图 1-a) 肝胰腺中 propo 基因相对表达量于感染后 3 h 开始上升, 并于 6 h 达到最大值, 为对照组的 5.30 倍 (P<0.05); 随后相对表达量逐渐下降, 并于 48 h 显著低于对照组 (P<0.05)( 图 1-b) 2.2 粪肠球菌感染对脊尾白虾 CTL 基因表达的影响与对照组相比, 感染粪肠球菌后 3 h, 血细胞和肝胰腺中 CTL 基因相对表达量显著上升, 并分别于 12 h 和 6 h 达到最大值, 为对照组的 倍和 8.71 倍 (P<0.05); 随后相对表达量逐渐下降 感染 h, 肝胰腺中 CTL 基因相对表达量恢复至对照组水平, 而血细胞中相对表达量虽呈下降趋势, 但仍显著高于对照组 (P<0.05) ( 图 2) 2.3 粪肠球菌感染对脊尾白虾 SOD 基因表达的影响与对照组相比, 感染粪肠球菌后 6 h, 血细胞中 SOD 基因相对表达量显著上升, 并于 12 h 达到最大值, 为对照组的 4.90 倍 (P<0.05); 随后相对表达量逐渐下降, 并于 48 h 恢复至对照组水平 ( 图 3-a) 肝胰腺中 SOD 基因相对表达量于 3 h 显著上升至最大值, 为对照组的 7.93 倍 (P<0.05), 随后相对表达量逐渐下降, 并于 12 h 恢复至对照组水平 ( 图 3-b) 2.4 粪肠球菌感染对脊尾白虾 Cat D 基因表达的影响与对照组相比, 感染粪肠球菌后脊尾白虾血细胞和肝胰腺中 Cat D 基因相对表达量变化趋势基本一致, 均于 3 h 显著下降, 然后于 6 h 达到最大值, 分别为对照组的 1.92 倍和 2.51 倍 (P<0.05); 随后于感染后 12 h 相对表达量显著下降, 分别于 48 h 和 24 h 再次上升至较高值 (P<0.05), 最后均于 72 h 恢复至对照组水平 ( 图 4) 2.5 粪肠球菌感染对脊尾白虾 Cat L 基因表达的影响与对照组相比, 感染粪肠球菌后 6 h, 脊尾白虾血细胞中 Cat L 基因的相对表达量显著下降, 为对照组的 0.28 倍 (P<0.05); 随后显著上升至最大值, 为对照组的 4.89 倍 (P<0.05); 最后于 72 h 逐渐下降至对照组水平 ( 图 5-a) 肝胰腺中 Cat L 基因的相对表达量于感染后 3 h 显著下降, 然后逐渐上升并于 24 h 时达到最大值, 为对照组的 2.21 倍 (P<0.05); 最后于 48 h 和 72 h 恢复至对照组水平 ( 图 5-b) 3 讨论动物养殖生产中, 粪肠球菌常被用作益生菌饲料添加剂来调节动物肠道菌群 (Lee et al, 2000; Ricke, 2003) 但许多研究已经证实, 粪肠球菌为条件性致病菌, 是一种新的人畜共患病病原体, 会在长期进化中出现毒力基因 当动物免疫力降低或肠道菌群失调时, 粪肠球菌通过大量繁殖并侵入宿主非寄居器官, 黏附于细胞并分泌毒性物质破坏细胞组织, 引起感染

154 第 5 期段亚飞等 : 致病性粪肠球菌对脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 免疫相关基因表达的影响 151 Fig.1 图 1 脊尾白虾感染粪肠球菌后血细胞 (a) 和肝胰腺 (b) 中 propo 基因表达情况 Expression of propo gene in hemocytes (a) and hepatopancreas (b) of E. carinicauda after E. faecalis challenge * 表示同一时间点感染组与对照组之间差异显著 (P<0.05) 下同 * indicated significant differences (P<0.05) between the infected group and control group at the same time. The same as below Fig. 2 图 2 脊尾白虾感染粪肠球菌后血细胞 (a) 和肝胰腺 (b) 中 CTL 基因表达情况 Expression of CTL gene in hemocytes (a) and hepatopancreas (b) of E. carinicauda after E. faecalis challenge Fig. 3 图 3 脊尾白虾感染粪肠球菌后血细胞 (a) 和肝胰腺 (b) 中 SOD 基因表达情况 Expression of SOD gene in hemocytes (a) and hepatopancreas (b) of E. carinicauda after E. faecalis challenge Fig. 4 图 4 脊尾白虾感染粪肠球菌后血细胞 (a) 和肝胰腺 (b) 中 Cat D 基因表达情况 Expression of Cat D gene in hemocytes (a) and hepatopancreas (b) of E. carinicauda after E. faecalis challenge

155 152 渔业科学进展第 38 卷 Fig. 5 图 5 脊尾白虾感染粪肠球菌后血细胞 (a) 和肝胰腺 (b) 中 Cat L 基因表达情况 Expression of Cat L gene in hemocytes (a) and hepatopancreas (b) of E. carinicauda after E. faecalis challenge 性疾病 ( 狄婷婷等, 2012; 刘燕霏等, 2013) 本研究中, 脊尾白虾注射致病性粪肠球菌后 3 h 未出现死亡现象, 大部分虾趴于桶底, 活动减弱, 摄食不积极 ;6 h 开始出现死亡现象, 濒死虾肌肉乳白色, 尾肢微红, 软壳 ; 感染 72 h 后, 虾活动增强, 摄食率增加 由此表明, 致病性粪肠球菌感染能够对脊尾白虾健康状况产生显著影响 3.1 粪肠球菌对脊尾白虾 propo 基因表达的影响 propo 系统是甲壳动物一种重要的 非己 识别系统, 可以有效识别革兰氏阴性菌的脂多糖 真菌的 β-1,3- 葡聚糖和革兰氏阳性菌的肽聚糖等, 在甲壳动物的伤口愈合 黑化包被 细胞吞噬和表皮硬化等免疫过程中发挥重要作用 PO 通常以无活性的酶原形式 propo 存在,proPO 通过一系列级联反应转化成具有活性的 PO, 从而在清除病原的免疫反应中发挥重要作用 ( 田丹等, 2013) 研究表明, 利用 RNAi 技术敲除 propo 基因后的虾类, 其对病原的抵抗力均显著降低 (Piti et al, 2009; Yeh et al, 2009) 感染金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 后, 拟穴青蟹 (Scylla paramamosain) 血细胞中 propo 基因表达水平显著上升 ( 杜志强等, 2013) 嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila) 在体内 (in vivo) 可显著诱导 propo 基因表达水平, 且其变化趋势与 PO 活性变化基本一致, 但基因表达水平的升高早于酶活性 ( 王文锋等, 2012) 本研究中, 脊尾白虾血细胞和肝胰腺中 propo 基因相对表达量于感染粪肠球菌后 6 h 和 12 h 显著升高, 表明粪肠球菌感染诱导 propo 基因转录, 产生大量 PO 以抵抗粪肠球菌对机体的感染 ; 感染后期,proPO 基因相对表达量逐渐恢复至对照组水平, 可能与脊尾白虾处于感染后恢复期有关 3.2 粪肠球菌对脊尾白虾 CTL 基因表达的影响甲壳动物的模式识别受体也可以识别与病原体相关的模式分子, 如细菌和真菌糖蛋白 脂多糖和由于受伤和感染所释放的细胞成分等, 从而激活其固有免疫系统 作为一种重要的模式识别受体,CTL 具有多种重要功能, 如细胞粘附 内吞作用和免疫识别等, 能够识别并结合各种病原微生物, 引起机体特异性免疫反应, 从而促进机体清除病原 ( 仉晓文, 2011) 1) 研究表明, 从对虾血液中分离纯化到的 CTL 对于多种细菌都有强烈的凝集活性, 且经 CTL 孵育过的对虾血细胞吞噬活性显著增强 ( 孙杰, 2009) 2) 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 感染溶壁微球菌 (Micrococcus lysodeikticus) 后, 其肝胰腺 CTL 基因表达量显著提高 ( 罗展等, 2010); 此外, 中国对虾 (Fenneropenaeus chinensis) 重组 CTL 能通过紧密结合鳗弧菌 (Vibrio anguillarum) 进而将其清除 (Wang et al, 2009) 本研究中, 脊尾白虾感染粪肠球菌后 6 h, 其血细胞和肝胰腺中 CTL 基因相对表达量均显著上升, 表明可能机体高水平转录用来合成并补充参与细菌结合的蛋白, 是机体应对病原菌侵染的一种防御机制 但是, 感染后期 (24 72 h), 血细胞中 CTL 基因相对表达量虽有下降, 但仍均显著高于对照组, 可能与粪肠球菌大量繁殖导致机体细胞受损有关 3.3 粪肠球菌对脊尾白虾 SOD 基因表达的影响外界病原入侵动物机体时, 会诱发机体免疫反应 1) Ji XW. Functional studies of C-type lectins from crustacean. Doctoral Dissertation of Shandong University, 2011 [ 仉晓文. 甲壳类 C- 型凝集素的功能研究. 山东大学博士研究生学位论文, 2011] 2) Sun J. Purification, cdna cloning and relationship study on three kind of immune-related factors in shrimp Fenneropenaeus chinensis. Doctoral Dissertation of Institute of Oceanology of Chinese Academy of Sciences, 2009 [ 孙杰. 中国明对虾 (Fenneropenaeus chinensis) 几种免疫相关因子的分离纯化 基因克隆及相互关系研究. 中国科学院研究生院 ( 海洋研究所 ) 博士研究生学位论文, 2009]

156 第 5 期段亚飞等 : 致病性粪肠球菌对脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 免疫相关基因表达的影响 153 产生大量活性氧 (ROS), 如 H 2 O 2 O 2 和 OH 等 ; 但过量的 ROS 会损坏机体生理机能和免疫功能 ( 段亚飞等, 2015; 于天基等, 2015) 机体抗氧化酶系统, 可以有效清除机体多余的 ROS, 保护机体免受氧化损伤 SOD 作为抗氧化酶系统的标志酶, 其首先将 O 2 歧化为 H 2 O 2 和 O 2, 其活性可以用于评价机体清除 ROS 的能力 ( 赵曼曼等, 2015; 肖炜等, 2015; 孙盛明等, 2016) 研究表明, 感染鳗弧菌后的中国对虾血淋巴 SOD 酶活性于 1 h 显著升高至最大值, 随后呈先升高再降低的趋势 ( 葛倩倩, 2013) 1) 凡纳滨对虾感染溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus) 后, 其 SOD 基因表达水平显著上升 (Liu et al, 2007) 本研究中, 感染初期, 脊尾白虾血细胞和肝胰腺中 SOD 基因相对表达量呈上升趋势, 表明粪肠球菌感染刺激机体抗氧化酶系统, 使得 SOD 基因表达量升高, 以清除机体在应对病原侵染过程中产生的大量 ROS; 感染后期,SOD 基因相对表达量逐渐下降, 可能是由于粪肠球菌的大量繁殖抑制了机体抗氧化酶活性, 机体因累积大量 ROS 而导致组织细胞受损, 抗氧化防御系统下降 3.4 粪肠球菌对脊尾白虾 Cat D 和 Cat L 基因表达的影响当外来病原入侵机体时, 细胞通过吞噬作用将致病菌与溶酶体融合, 利用各种水解酶将致病菌等大颗粒物质消化成生物大分子, 然后通过外排作用排出细胞 (Press et al, 1990) Cat D 和 Cat L 是溶酶体的重要组成部分, 除细胞内发挥蛋白质降解和整合蛋白水解的功能外,Cat D 还具有激活酶原 激素原与生长因子, 参与细胞凋亡等功能, 而 Cat L 参与激素原的激活 抗原呈递 组织再生 肿瘤入侵和转移 细胞凋亡等过程 ( 段亚飞等, 2013a b) Cho 等 (2002) 研究发现, 鲶鱼 (Parasilurus asotus) Cat D 前体与抗菌肽 ParasinⅠ 的形成相关 家蚕 (Bombyx mori) 感染藤黄微球菌 (Micrococcus luteus) 后, 其血细胞中 Cat L 基因的表达水平和 Cat L 蛋白酶活性均显著上调 ( 刘敏敏等, 2015); 此外, 被弧菌感染后, 水产动物 Cat D 和 Cat L 基因表达量显著上升 ( 段亚飞等, 2013a b; 潘俐伶等, 2012; Li et al, 2010), 表明其在水产动物免疫反应中发挥重要作用 本研究中,Cat D 和 Cat L 基因表达量在感染初期出现显著下降现象, 可能是由于粪肠球菌感染抑制了其 基因的表达 ; 随后基因表达量先上升后下降, 表明 Cat D 和 Cat L 基因的升高是脊尾白虾应对粪肠球菌感染机体的一种免疫防御机制 综上所述, 致病性粪肠球菌对脊尾白虾免疫相关基因 propo CTL SOD Cat D 和 Cat L 相对表达量影响显著, 会导致其机体生理功能紊乱 鉴于粪肠球菌在食品和益生菌制剂中的应用日益增多, 在使用前应对其携带耐药质粒和毒力因子的菌株进行严格鉴别, 防止造成养殖动物感染性疾病发生 目前, 关于致病性粪肠球菌感染水产动物的研究相对较少, 尚无免疫相关基因表达的研究 本研究可为虾类应答致病性粪肠球菌感染的免疫基因表达机制研究提供理论依据 参考文献 Cheng W, Chen JC. The virulence of Enterococcus to freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii and its immune resistance under ammonia stress. Fish and Shellfish Immunology, 2002b, 12(2): Cheng W, Chen JC. Enterococcus-like infections Macrobrachium rosenbergii are exacerbated by high ph and temperature but reduced by low salinity. Diseases of Aquatic Organisms, 1998, 34(2): Cheng W, Liu CH, Hsu JP, et al. Effect of hypoxia on the immune response of giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii and its susceptibility to pathogen Enterococcus. Fish and Shellfish Immunology, 2002a, 13(5): Cho JH, Park IY, Kim HS, et al. Cathepsin D produces antimicrobial peptide parasin I from histone H2A in the skin mucosa of fish. Faseb Journal, 2002, 16(1): Di TT, Gao Y. Advances in research on pathogenicity islands of Enterococcus faecalis. Journal of Pathogen Biology, 2012, 7(3): [ 狄婷婷, 高原. 粪肠球菌主要毒力因子研究进展. 中国病原生物学杂志, 2012, 7(3): ] Du ZQ, Lin T, Li XC. Study on antibacterial immunity response of prophenoloxidase gene in Scylla paramamosain. Guangdong Agricultural Sciences, 2013, 40(19): [ 杜志强, 林涛, 李新苍. 拟穴青蟹酚氧化酶原基因的抗菌免疫反应研究. 广东农业科学, 2013, 40(19): ] Duan YF, Dong HB, Wang Y, et al. Effect of desiccation on antioxidant enzyme activities of kuruma shrimp (Marsupenaeus japonicus). South China Fisheries Science, 2015, 11(4): [ 段亚飞, 董宏标, 王芸, 等. 干露胁迫对日本囊对虾抗氧化酶活性的影响. 南方水产科学, 2015, 11(4): ] 1) Ge QQ. Effects on the Imd pathway genes expression and non-specific immunity of Fenneropenaeus chinensis and Exopalaemon carinicauda by Vibrio anguillarum. Master s Thesis of Ocean University of China, 2013 [ 葛倩倩. 鳗弧菌感染对 Imd 免疫通路相关基因表达及非特异性免疫因子的影响. 中国海洋大学硕士研究生学位论文, 2013]

157 154 渔业科学进展第 38 卷 Duan YF, Liu P, Li JT, et al. Cloning and expression analysis of Cathepsin L cdna of Exopalaemon carinicauda. Zoological Research, 2013a, 34(1): [ 段亚飞, 刘萍, 李吉涛, 等. 脊尾白虾组织蛋白酶 L 基因的克隆及其表达分析. 动物学研究, 2013a, 34(1): 39 46] Duan YF, Liu P, Li JT, et al. Cloning and expression of cathepsin D gene in Exopalaemon carinicauda. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2013b, 44(3): [ 段亚飞, 刘萍, 李吉涛, 等. 脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 组织蛋白酶 D 基因的克隆及其表达分析. 海洋与湖沼, 2013b, 44(3): ]Fang H, Chen CZ, Zhang XJ. Aquacultural animal pathogenic bacteriology. Beijing: China Agriculture Press, 2009, [ 房海, 陈翠珍, 张晓君. 水产养殖动物病原细菌学. 北京 : 中国农业出版社, 2009, ] Feng NN, Sun YM, Wen R, et al. Analysis on the activity of immune related enzymes in survived Exopalaemon carinicauda from WSSV infection. Marine Sciences, 2014, 38(3): [ 冯宁宁, 孙玉苗, 温荣, 等. 脊尾白虾白斑综合征病毒耐受群体重要免疫相关酶的活性分析. 海洋科学, 2014, 38(3): 75 79] Huycke MM, Abrams V, Moore DR. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis, 2002, 23(3): Joshi J, Srisala J, Truong VH, et al. Variation in Vibrio parahaemolyticus isolates from a single Thai shrimp farm experiencing an outbreak of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND). Aquaculture, 2014, 428: Lee YK, Lim CY, Teng WL, et al. Quantitative approach in the study of adhesion of lactic acid bacteria to intestinal cells and their competition with enterobacteria. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(9): Li B, Chen BJ, Qi ZH, et al. Accumulation of Enterococcus faecalis and variation of SOD and ACP activities in scallop Pactinopecten yessoensis tissues. Journal of Fishery Sciences China, 2011, 18(1): [ 李斌, 陈碧鹃, 齐占会, 等. 粪肠球菌累积对虾夷扇贝免疫酶活性的影响. 中国水产科学, 2011, 18(1): 89 95] Li WW, Jin XK, He L, et al. Molecular cloning, characterization, expression and activity analysis of cathepsin L in Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis. Fish and Shellfish Immunology, 2010, 29(6): Liu CH, Tseng MC, Cheng W. Identification and cloning of the antioxidant enzyme, glutathione peroxidase, of white shrimp, Litopenaeus vannamei, and its expression following Vibrio alginolyticus infection. Fish and Shellfish Immunology, 2007, 23(1): Liu MM, Zhan PF, Huang SH, et al. Study on the immune response of silkworm cathepsin L and its specific inhibitor gene to microorganism induction. Science of Sericulture, 2015, 41(4): [ 刘敏敏, 占鹏飞, 黄绍华, 等. 家蚕组织蛋白酶 L 及其特异性抑制剂基因参与微生物诱导蚕体的免疫响应研究. 蚕业科学, 2015, 41(4): ] Liu YF, Yang JD, Zhao RL. Research progress of animal disease caused by Enterococcus faecalis. Journal of Domestic Animal Ecology, 2013, 34(11): [ 刘燕霏, 杨建德, 赵瑞利. 粪肠球菌动物致病的研究进展. 家畜生态学报, 2013, 34(11): 75 77] Luo Z, Zhang JQ, Li FH, et al. Cloning of a novel C-type lectin LvLec2 from the shrimp Litopenaeus vannamei and its immune response to different challenges. Marine Sciences, 2010, 34(11): [ 罗展, 张继泉, 李富花, 等. 凡纳滨对虾 C- 型凝集素 LvLec2 对不同刺激的免疫应答. 海洋科学, 2010, 34(11): ] Ma LY, Xu SZ, Ma JP. Research progress of pathogenic mechanism of Enterococcus. Chinese Journal of Nosocomiology, 2005, 15(3): [ 马立艳, 徐淑珍, 马纪平. 肠球菌致病机制的研究进展, 中华医院感染学杂志, 2005, 15(3): ] Pan LL, Huang GJ, Cheng SY, et al. cdna cloning, characterization and challenge-based expression profiles of cathepsin D in winged pearl oyster Pteria penguin. South China Fisheries Science, 2012, 8(2): [ 潘俐伶, 黄桂菊, 成书营, 等. 企鹅珍珠贝组织蛋白酶 D 的 cdna 克隆 序列特征分析和应激表达研究. 南方水产科学, 2012, 8(2): 22 29] Piti A, Walaiporn C, Anchalee T. Two prophenoloxidases are important for the survival of Vibrio harveyi challenged shrimp Penaeus monodon. Developmental and Comparative Immunology, 2009, 33(2): Press OW, Desantes K, Anderson SK, et al. Inhibition of catabolism of radiolabeled antibodies by tumor cells using lysosomotropic amines and carboxylic ionophores. Cancer Research, 1990, 50(4): Ricke SC. Perspectives on the use of organic acids and short chain fatty acids as antimicrobials. Poultry Science, 2003, 82(4): Sun SM, Ge XP, Zhu J, et al. Effects of bioflocs on growth performance, digestive enzyme and immunity enzyme activities in juvenile blunt snout bream (Megalobrama amblycephala). Progress in Fishery Sciences, 2016, 37(2): [ 孙盛明, 戈贤平, 朱健, 等. 生物絮团对团头鲂 (Megalobrama amblycephala) 生长 消化酶和免疫相关酶活性的影响. 渔业科学进展, 2016, 37(2): 49 55] Tian D, Jiang GL, Liu Y. Study on immune activity of sea cucumber (Apostichopus japonicus) with different weight. Marine Sciences, 2013, 37(10): [ 田丹, 姜国良, 刘云. 不同体质量仿刺参免疫活性的研究. 海洋科学, 2013, 37(10): 47 52] Wang WF, Ma JM, Yang H, et al. cdna cloning and characterisation of prophenoloxidase from Macrobrachium nipponense. Acta Anatomica Sinica, 2012, 43(6): [ 王文锋, 马建敏, 杨洪, 等. 日本沼虾酚氧化酶原基因 cdna 的全长克隆及表达分析. 解剖细胞, 2012, 43(6): ] Wang XW, Zhang XW, Xu WT, et al. A novel C-type lectin (FcLec4) facilities the clearance of Vibrio anguillarum in

158 第 5 期段亚飞等 : 致病性粪肠球菌对脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 免疫相关基因表达的影响 155 vivo in Chinese white shrimp. Developmental and Comparative Immunology, 2009, 33(9): Xiao W, Li DY, Xu Y, et al. Effects of chronic external ammonia stress on growth, immunity and metabolism of juvenile GIFT tilapia (Oreochromis niloticus). South China Fisheries Science, 2015, 11(4): [ 肖炜, 李大宇, 徐杨, 等. 慢性氨氮胁迫对吉富罗非鱼幼鱼生长 免疫及代谢的影响. 南方水产科学, 2015, 11(4): 81 87] Yeh MS, Lai CY, Liu CH, et al. A second propo present in white shrimp Litopenaeus vannamei and expression of the propos during a Vibrio alginolyticus injection, molt stage, and oral sodium alginate ingestion. Fish and Shellfish Immunology, 2009, 26(1): Yu TJ, Li J, Li JT, et al. The effects of ph changes on antioxidant enzyme activities of ridgetail white prawn (Palaemon carinicauda). Marine Sciences, 2015, 39(5): [ 于天基, 李健, 李吉涛, 等. ph 胁迫对脊尾白虾抗氧化酶活力的影响. 海洋科学, 2015, 39(5): 47 53] Zhao MM, Jiang JZ, He J, et al. The effect of Vibrio harveyi and abalone herpesvirus on immune factors of Haliotis diversicolor. Marine Sciences, 2015, 39(11): [ 赵曼曼, 姜敬哲, 何健, 等. 哈维弧菌和鲍类疱疹病毒刺激对杂色鲍免疫相关因子的影响. 海洋科学, 2015, 39(11): 39 48] ( 编辑冯小花 ) The Expression Profiles of Immunity-Related Genes After Pathogenic Enterococcus faecalis Challenge in Exopalaemon carinicauda DUAN Yafei 1, LI Jian 2,3, LI Jitao 2,3, ZHANG Zhe 1, LIU Ping 2,31 (1. Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization, Ministry of Agriculture, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou ; 2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao ; 3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao ) Abstract In this study, we investigated the effect of pathogenic Enterococcus faecalis challenge on the non-specific immunity-related gene expression of Exopalaemon carinicauda. The expression levels of prophenoloxidase (propo), C-type lectin (CTL), superoxide dismutase (SOD), cathepsin D (Cat D) and cathepsin L (Cat L) in hemocytes and hepatopancreas were measured with quantitative real-time PCR at different sampling time points after healthy E. carinicauda were injected with 0.86% sterile saline (control) or pathogenic E. faecalis. Compared to the control group, after infected with E. faecalis, the relative expression levels of propo gene in hemocytes and hepatopancreas both increased to the highest at 6 h (P<0.05), and then decreased gradually back to normal. The relative expression levels of CTL gene in hemocytes and hepatopancreas increased to the peak value at 12 h and 6 h respectively (P<0.05), and then decreased gradually. Although the relative expression levels of CTL gene in hemocytes decreased at 72 h, it was still significantly higher than the control (P<0.05). The relative expression levels of SOD gene in hemocytes and hepatopancreas both increased to the highest at 6 h and 3 h respectively (P<0.05), then decreased gradually back to normal at 72 h. The dynamic expression of Cat D gene in hemocytes and hepatopancreas was consistent, which was a significant decreased in the beginning followed by an increase. After the decrease of expression at 12 h, it was increased significantly again. The Cat L gene expression in hemocytes and hepatopancreas both decreased significantly at 6 h and 3 h respectively (P<0.05), then it increased to the highest and recovered to the control level at 72 h. The results indicated that pathogenic E. faecalis challenge affected the immune status of E. carinicauda probably by changing the immunity-related gene expression, and that propo, CTL, SOD, Cat D and Cat L were all sensitive to E. faecalis infection. Key words Exopalaemon carinicauda; Enterococcus faecalis; Prophenoloxidase; C-type lectin; Superoxide dismutase; Cathepsin 1 Corresponding author: LIU Ping, liuping@ysfri.ac.cn

159 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 野生条斑紫菜 (Pyropia yezoensis) 叶状体 * 对干出胁迫的抗氧化生理响应特征 李晓蕾 1,2,3 汪文俊曹原 2,31 1,2,3 梁洲瑞姚海芹 2,3 1,2,3 刘福利王飞久 2,3 2,3 孙修涛 (1. 上海海洋大学水产与生命学院上海 ; 2. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛 ; 3. 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室青岛 ) 2,3 摘要失水胁迫是野生条斑紫菜 (Pyropia yezoensis) 主要胁迫因子之一 为揭示条斑紫菜对失水胁迫的响应机制, 本研究以 2016 年 3 月采自山东青岛湛山的野生藻体为材料, 研究了失水胁迫下其光合作用和抗氧化生理响应特征 结果显示, 随着失水胁迫程度的增大,PSⅡ 原初光能转化效率 (F v /F m ) 显著降低, 在失水率 60% 左右时降至最低值, 但复水 1 h 后可恢复正常值 叶绿素 a (Chl a) 类胡萝卜素 (Car) 和可溶性蛋白 (SP) 含量逐渐降低, 藻红蛋白 (R-PE) 和藻蓝蛋白 (R-PC) 含量先下降后上升 藻胆蛋白 (R-PE+R-PC) SP 比值的变化趋势与藻胆蛋白的变化趋势类似, 但在失水率 40% 时上升至对照水平, 失水 80% 时显著高于对照值 丙二醛 (MDA) 含量在失水率 30% 时没有显著变化, 失水率 40% 时显著上升, 但失水率在 40% 80% 时, 藻体间没有显著差异 在失水率 20% 时, 超氧化物歧化酶 (SOD) 和过氧化氢酶 (CAT) 的活性没有显著变化, 过氧化物酶 (POD) 活性显著上升 ; 随着失水率增加,3 种酶的活力显著下降, 低于对照组, 但失水率在 50% 80% 时, 组间没有显著差异 根据以上结果推测 : 失水早期, 抗氧化酶 SOD CAT, 尤其 POD 起着关键的清除自由基作用, 因此,MDA 含量没有明显变化 ; 随着失水程度增加, 藻胆蛋白的抗逆作用逐渐显现, 为藻体在复水后快速恢复光合作用 (F v /F m ) 提供保障 关键词干出 ; 条斑紫菜 ; 光合 ; 抗氧化中图分类号 S985 文献标识码 A 文章编号 (2017) 紫菜 (Pyropia) 味道鲜美, 营养丰富, 具有较高的经济价值, 我国主要栽培品种是条斑紫菜 (P. yezoensis) 和坛紫菜 (P. haitanensis) 其中, 条斑紫菜主要分布 在中国的黄海 渤海 东海, 日本列岛以及朝鲜半岛 ( 何文君, 2009) 1) 近年来, 条斑紫菜养殖面积不断增大, 成为我国长江以北主要经济海藻物种 大 * 中国水产科学研究院基本科研业务费专项资金项目 (2015A02) 山东省重点研发计划(2016GSF115038) 和长岛县科技计划项目 ( 适于长岛海区的紫菜养殖模式研究与示范 ) 共同资助 [This work was supported by the Special Scientific Research Funds for Central Non-profit Institutes, Chinese Academy of Fishery Sciences (2015A02), Key Research and Development Plan of Shandong Province (2016GSF115038), and Changdao Science and Technology Project (Establishment and application of Porphyra farming protocol for Changdao Island)]. 李晓蕾, @qq.com 1 通讯作者 : 汪文俊, 副研究员, wjwang@ysfri.ac.cn 收稿日期 : , 收修改稿日期 : He WJ. Physiological effects of high temperature stress on and cloning and expression of Hsp70 gene from conchocelis of Porphyra yezoensis. Master s Thesis of Liaoning Normal University, 2009, 1 2 [ 何文君. 高温胁迫对条斑紫菜丝状体生理影响及 Hsp70 基因的克隆和表达. 辽宁师范大学硕士研究生学位论文, 2009, 1 2]

160 第 5 期李晓蕾等 : 野生条斑紫菜 (Pyropia yezoensis) 叶状体对干出胁迫的抗氧化生理响应特征 157 多数紫菜的生命周期包括两个阶段 : 丝状体时期和叶状体时期 紫菜叶状体多生长在潮间带的岩石上 ( 钱飞箭, 2014) 1) 随着潮汐作用, 潮间带海藻生长于两种不同环境中 : 低潮时暴露于空气中, 高潮时沉没于海水中 两种环境条件下, 其光合能力和作用机理不同 沉没于海水时, 海藻利用水体中的溶解性无机碳 ( 主要为 HCO 3 ) 进行光合作用 ; 在干出状态下, 某些藻体主要利用空气中的 CO 2 进行光合作用 ( 邹定辉等, 2001) 不同紫菜物种对外界环境变化的适应能力不同 坛紫菜叶状体干露在空气中长达 8 h, 失水率达 90% 以上, 复水后藻体仍健康生长 ( 谢佳等, 2014); 而生长在潮间带水沼中的半叶紫菜 (Pyropia katadae var. hemiphylla) 耐受失水胁迫的临界点为 42% 46% (Lin et al, 2009; Wang et al, 2016) 植物在经历逆境胁迫时, 通常产生活性氧成分 (ROS), 致使膜脂过氧化 丙二醛 (MDA) 积累是膜脂过氧化的重要指标 如在 Cu 2+ 和盐胁迫初期, 条斑紫菜体内 MDA 含量迅速增加, 增幅可高达 300% ( 冯琛等, 2004) 在逆境胁迫下, 植物体内的抗氧化体系起着关键的调节作用 抗氧化体系包括还原物质和抗氧化酶类, 在经历失水和复水的过程中, 不同紫菜其体内氧化还原物质的含量与活性的变化也不尽相同 随着失水胁迫的增大, 坛紫菜藻体活性氧成分呈上升趋势, 超氧化物歧化酶 (SOD) 过氧化氢酶 (CAT) 的活性呈现下降的趋势, 谷胱甘肽还原酶 (GR) 抗坏血酸(ASA) 还原型谷胱甘肽(GSH) 呈现上升的趋势, 表明坛紫菜细胞在发生高度失水胁迫时所产生的活性氧成分, 主要由 GR ASA GSH 去除 ( 谢佳等, 2014);Porphyra columbina 藻体 CAT 活力 光系统 Ⅱ(PSⅡ) 原初光能转化效率 (F v /F m ) 以及叶绿素 a (Chl a) 含量呈现下降趋势, 藻红蛋白 (R-PE) 藻蓝蛋白 (R-PC) 含量则呈现上升的趋势 (Contreras- Porcia et al, 2010) 已有研究表明, 条斑紫菜中某些多糖和黄酮类物质具有体外抗氧化活性 ( 陈利梅, 2012; 何芳等, 2015) 但在失水胁迫下, 条斑紫菜体内重要的氧化还原物质的含量或活性的反应情况, 尚知之甚少 本研究拟通过测定野生条斑紫菜叶状体在不同干出胁迫下, 藻体内光合作用 光合色素 可溶性蛋白 (SP) 和 MDA 含量, 以及重要抗氧化酶活力的变化情况, 以探讨野生条斑紫菜对干出胁迫的生理响应特征, 为揭示条斑紫菜叶状体对干出失水的适 应机制奠定基础 1 材料与方法 1.1 实验材料的处理 实验材料于 2016 年 3 月采自山东青岛湛山潮间带岩石上 取回后立刻将紫菜叶状体擦干并置于光照培养箱中, 光强为 30 µmol photons m 2 s 1, 温度为 13, 放置不同时间, 计算失水率 : 失水率 =( 鲜重 藻体失水后重量 )/ 鲜重 100% 对失水率为 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 的样品, 分别测量 F v /F m 光合色素 Chl a Car R-PE R-PC SP MDA 的含量, 以及抗氧化酶 SOD POD CAT 的活性 每组样品设 3 个生物学重复 1.2 叶绿素荧光参数的测定 将新鲜紫菜叶状体擦干表面水分, 置于光照培养箱中进行干出实验, 将样品置于黑暗中 10 min, 测定 F v /F m 值 每个实验组设置 3 个重复 随后对处理样品进行复水处理 1.3 叶绿素 a 和类胡萝卜素含量的测定 称取干出后的藻体 0.1 g, 液氮充分研磨后, 用 5 ml 100% 甲醇进行提取, 然后放入 4 冰箱中 ( 避光保存 ), 静置 24 h g 离心 10 min, 用紫外可见光分光光度计测定上清液的吸光度, 对照液为 100% 甲醇 根据公式计算 Chl a 的含量 (Robert, 1983):[Chl a]= A 665 nm 8.54 A 652 nm 根据公式计算 Car 的含量 : [Car]=7.6 (A 480 nm 1.49 A 510 nm ) 1.4 藻胆蛋白含量的测定 R-PE 和 R-PC 含量的测定参考高洪峰等 (1993) 取干出后的藻体 0.1 g, 用 0.1 mol/l 的磷酸缓冲液进行提取, g 离心 10 min, 取上清液, 定容至 25 ml, 测其在 nm 处的吸光值, 对照液为磷酸缓冲液 计算公式 : [R-PE]=0.123 A 560 nm 0.07 A 618 nm A 650 nm [R-PC]=0.187 A 618 nm A 650 nm 1.5 可溶性蛋白含量的测定 考马斯亮蓝溶液 (CBB) 配制 : 考马斯亮蓝 G mg 溶于 50 ml 95% 乙醇, 加入 100 ml 85% H 3 PO 4, 用 1) Qian JF. Study on the mechanism of Pyropia haitanensis induced by stressed and lipid metabolism related gene. Master s Thesis of Ningbo University, 2014, 1 2 [ 钱飞箭. 坛紫菜受高温和干出胁迫的机理及脂代谢关键基因的研究. 宁波大学硕士研究生学位论文, 2014, 1 2]

161 158 渔业科学进展第 38 卷 蒸馏水稀释至 1000 ml 蛋白标准曲线 : 牛血清蛋白, 根据其浓度用 0.15 mol/l NaCl 配制成 100 μg/ml 的蛋白溶液 标准曲线按表 1 制作 以 OD 595 nm 为纵坐标, 标准蛋白含量为横坐标, 在坐标轴上绘制标准曲线 ( 张志良, 2001) 表 1 蛋白标准曲线 Tab.1 The standard protein curve 试管编号 Tube number 标准蛋白 Standard protein(ml) 蒸馏水 Distilled water(ml) 考马斯亮蓝 Coomassie brilliant blue (ml) 蛋白质的提取 : 取 0.1 g 藻体, 液氮充分研磨后, 用蒸馏水定容至 5 ml, 涡旋 20 min, g 离心 10 min 得到提取液 0.1 ml 提取液加 0.9 ml 蒸馏水加 5 ml CBB 混匀,2 5 min 后测 OD 595 nm 对照液为 1 ml 蒸馏水加 5 ml CBB 对照组 ( 失水率为 0) Chl a 和 Car 的含量显著高于实验组 (P<0.05) 在失水率为 10% 20% 时,Chl a 和 Car 含量与对照组相比显著下降 (P<0.05); 失水率为 30% 70%,Chl a 和 Car 的含量比失水率 20% 时显著下降 ; 在失水率为 80% 时,Chl a 和 Car 的含量降到最低值, 与失水率 40% 组差异显著 (P<0.05) 图 1 干出胁迫对野生条斑紫菜 F v /F m 的影响 Fig.1 Effect of water loss on the optimal chlorophyll fluorescence quantum yields (F v /F m ) of wild P. yezoensis 1.6 MDA 及 POD SOD CAT 含量的测定 MDA 及 POD SOD CAT 含量的测定均采用南京建成试剂盒依次测定, 记录结果 1.7 数据处理 因材料进行了失水处理, 计算色素 SP MDA 的含量时, 需进行调整 : 以上公式测定含量 (1 失水率 ), 再进行不同失水率组间的对比 采用 Excel 2007 Origin 8 以及 SPSS 数据处理系统进行数据的统计分析并做图, 设显著水平为 P< 结果 2.1 干出胁迫对野生条斑紫菜 F v /F m 的影响如图 1 所示, 随着失水率的增加,F v /F m 显著下降 (P<0.05), 当失水率达到 60% 时,F v /F m 达到最小值 当藻体失水 66% 时, 对藻体进行 1 h 复水处理, 藻体的 F v /F m 可恢复正常值 ( ); 失水率 80% 的藻体复水 1 h 后,F v /F m 可恢复至 干出胁迫对野生条斑紫菜 Chl a 和 Car 含量的影响从图 2 和图 3 可以看出, 随着失水率的增大, 紫菜叶状体 Chl a 和 Car 的含量呈现逐渐下降的趋势 图 2 干出胁迫对野生条斑紫菜 Chl a 含量的影响 Fig.2 Effects of water loss on the Chlorophyll a content of wild P. yezoensis 标有不同字母者表示差异显著 (P<0.05) 下同 Different letters indicated significant differences (P<0.05). The same as below 2.3 干出胁迫对野生条斑紫菜 R-PE R-PC 和 SP 含量的影响 如图 4 5 所示,R-PE 和 R-PC 的变化趋势一致, 对照组含量最高, 在失水胁迫初期 ( 失水率 10% 20%), R-PE 和 R-PC 含量显著下降 (P<0.05); 随着藻体失水率从 20% 增加到 60%,R-PE 和 R-PC 含量呈上升趋势 ; 随着藻体继续失水直至失水率达 80%,R-PE 和 R-PC 含量没有显著变化 总体来说, 与对照组相比, 藻胆蛋白 (R-PE 和 R-PC) 含量在失水藻体中是降低的

162 第 5 期李晓蕾等 : 野生条斑紫菜 (Pyropia yezoensis) 叶状体对干出胁迫的抗氧化生理响应特征 159 图 3 干出胁迫对野生条斑紫菜 Car 含量的影响 Fig.3 Effects of water loss on the carotenoid content of wild P. yezoensis 验组 (P<0.05), 失水率为 10% 70% 时, 组间差异不显著 ; 失水率达到 80% 时, 即高失水胁迫下,SP 含量显著下降 (P<0.05) 总体来说, 与对照组相比,SP 含量在失水藻体中是降低的 在失水胁迫初期 ( 失水率为 10% 20%), 藻胆蛋白 (R-PE+R-PC) 与 SP 的比值呈急剧下降趋势 ; 随着藻体失水率从 20% 增加到 40%, 该比值上升至对照水平 ( 失水率 =0); 随着藻体继续失水直至失水率达 80%, 该比值显著高于对照值 总之, 与对照组相比, 藻胆蛋白 (R-PE+R-PC) 与 SP 的比值呈现先下降后升高的趋势 ( 图 7) 图 6 干出胁迫对野生条斑紫菜 SP 含量的影响 Fig.6 Effects of water loss on the soluble protein content of wild P. yezoensis 图 4 干出胁迫对野生条斑紫菜 R-PE 含量的影响 Fig.4 Effects of water loss on the R-phycoerythrin content of wild P. yezoensis 图 7 干出胁迫下野生条斑紫菜藻胆蛋白与 SP 比值 Fig.7 The ratio of phycobiliproteins to soluble proteins of wild P. yezoensis during water loss 图 5 干出胁迫对野生条斑紫菜 R-PC 含量的影响 Fig.5 Effects of water loss on the R-phycocyanin content of wild P. yezoensis 从图 6 可以看出, 随着失水胁迫的增大,SP 含量呈现逐渐下降的趋势 对照组 SP 含量显著高于实 2.4 干出胁迫对野生条斑紫菜 MDA 含量的影响失水率为 10% 30% 时, 藻体 MDA 含量与对照组相比差异不显著 (P>0.05); 失水率为 40% 时,MDA 含量与对照组相比显著升高 (P<0.05), 但直至失水率由 40% 增加到 80%,MDA 含量没有显著变化 ( 图 8)

163 160 渔业科学进展第 38 卷 力降低至对照以下 (P<0.05); 失水率 50% 80% 处理组, 其 POD 活力水平与失水率 30% 40% 组相比, 又有显著下降, 但彼此间没有显著差异 (P>0.05) ( 图 11) 图 8 干出胁迫对野生条斑紫菜 MDA 含量的影响 Fig.8 Effects of water loss on the malondialdehyde content of wild P. yezoensis 2.5 干出胁迫对野生条斑紫菜抗氧化酶活力的影响失水率达到 10% 20% 时, 总 SOD 活力与对照组没有显著差异 (P>0.05) ( 图 9); 当失水率达到 30% 时, 总 SOD 活力显著降低 (P<0.05); 失水率从 50% 至 80%, 其间差异不显著, 但与失水率 <40% 组相比, 总 SOD 活力显著降低 (P<0.05) 如图 10 所示, 失水率 20% 时,CAT 活力维持在对照水平 ; 失水率 30% 时,CAT 活力下降, 显著低于对照组 (P<0.05); 失水率增加到 70%,CAT 酶活力变化不大 ; 失水率 80% 组的 CAT 活力又显著下降 图 10 干出胁迫对野生条斑紫菜 CAT 活力的影响 Fig.10 Effects of water loss on the catalase activity of wild P. yezoensis 图 11 干出胁迫对野生条斑紫菜 POD 活力的影响 Fig.11 Effects of water loss on the POD activity of wild P. yezoensis 3 讨论 图 9 干出胁迫对野生条斑紫菜总 SOD 活力的影响 Fig.9 Effects of water loss rate on the total superoxide dismutase activity of wild P. yezoensis 在干出过程中,POD 活力的变化趋势与 SOD 和 CAT 明显不同 失水率 10% 的处理相比对照组,POD 活力显著上升 (P<0.05); 随着失水率增加,POD 活力逐渐下降 (P<0.05), 但失水率 20% 时其活力仍然显著高于对照组 ; 当失水率 30% 时, 处理组的 POD 活 紫菜的光合色素主要是藻胆蛋白和叶绿素, 而藻胆蛋白包括 R-PE R-PC 和别藻蓝蛋白 藻胆蛋白是红藻的主要捕光色素, 能高效捕获光能, 并传递至 PS Ⅱ 光合色素的含量极易受外界环境的影响(Shen, 1995) 对刚采集的新鲜野生紫菜进行不同程度的干出胁迫发现, 随着失水率的增大, 紫菜叶状体的 Chl a 和 Car 含量不断下降, 藻胆蛋白的含量呈现先下降后上升的趋势, 失水处理组与对照组相比, 藻胆蛋白含量降低 本研究发现, 随着失水程度加大,F v /F m 显著降低, 推测是由于失水抑制了光合色素的合成 光

164 第 5 期李晓蕾等 : 野生条斑紫菜 (Pyropia yezoensis) 叶状体对干出胁迫的抗氧化生理响应特征 161 合链的电子传递和一些酶的活性 Hader 等 (2002) 指出, 藻体在氧化应激状态下,PSⅡ 呈现下调状态, 其间的能量以热能形式耗散, 以保护光合膜不受损伤 Oh 等 (2013) 研究发现,Car 不仅参与吸收传递光能的过程, 而且还会接受过剩的叶绿体激发态的能量, 避免单线态氧的产生, 进而起到保护作用 ( 白志英等, 2009) 在逆境条件下,Car 还会被 ROS 氧化, 以减少 ROS 的产生 因此, 推测 Car 含量的降低与参与抗氧化反应有关 藻胆蛋白不仅是主要的捕光色素, 还是紫菜体内重要的抗氧化物质 Contreras-Porciaet 等 (2010) 研究发现, 在 Porphyra columbina 干出过程中, R-PE 和 R-PC 以热能的形式耗散藻体产生的过多热量, 抑制活性氧的暴发 Romay 等 (2003) 研究指出, R-PC 可以直接清除不同类型的活性氧, 降低脂质过氧化的水平 藻胆蛋白是 SP 的重要组成部分, 虽然失水胁迫导致藻体的藻胆蛋白 (R-PE 和 R-PC) 和 SP 含量降低 ( 相比对照组 ), 但对比不同程度失水胁迫藻体的藻胆蛋白 (R-PE 和 R-PC) SP 比值, 发现该比值呈现先下降后上升的趋势, 在失水率 40% 时达到对照水平, 失水 80% 时显著超出对照水平 表明随着失水胁迫加剧, 条斑紫菜藻胆蛋白的抗逆作用逐渐显现, 一方面作为类囊体膜的重要组成部分, 对维持光合膜的完整性起着积极作用, 为保证复水后快速恢复光合作用 (F v /F m ) 做准备 ; 另一方面, 作为抗氧化物质, 抑制细胞内活性氧的过度累积, 减轻膜脂的过氧化作用 (MDA 的产生 ) Davison 等 (1996) 研究表明, 植物体在干出胁迫的过程中, 最先受到伤害的是细胞膜, 即发生膜脂过氧化, 产生 MDA 随着失水程度加剧, 植物细胞中活性氧不断积累,MDA 的含量也逐渐增加 本研究发现, 随着失水胁迫处理, 藻体 MDA 水平分为两个阶段 : 对照水平和胁迫水平 MDA 含量在失水率 30% 时没有显著变化, 失水率 40% 时显著上升, 但失水率为 40% 80% 时, 藻体间没有显著差异 表明失水率达 40% 时, 细胞膜脂发生明显过氧化 ; 但失水程度进一步加剧, 条斑紫菜膜脂过氧化程度没有随之加剧, 藻胆蛋白在可溶性蛋白中比重的增加可能对抑制 MDA 的产生具有重要贡献 失水胁迫初期,MDA 水平没有明显积累, 应该与抗氧化酶的作用相关 为了避免过量活性氧对植物细胞的损伤, 植物细胞通常会通过提高相关抗氧化酶的活性与抗氧化物质含量来清除过多的活性氧以应对胁迫 ( 曾超西等, 1997; Lee et al, 1982) 野生条斑紫菜叶状体在失水胁 迫初期 (10% 20%),SOD 和 CAT 活性与对照组无显著性差异 ; 随着失水胁迫的增大, 其活力显著下降, 但失水率 40% 80% 组无显著性差异 说明野生条斑紫菜细胞中的 SOD 和 CAT 在低失水胁迫下参与过量活性氧的清除, 但随着细胞含水量的减少,SOD 和 CAT 活力逐渐降低 在植物经历胁迫的过程中, 由于物种 生长环境以及地区分布的差异, 细胞内相应的抗氧化应激途径也会有所差异 陆生植物 SOD 活性随干旱脱水可呈现一直下降 先上升后下降 保持不变等多种模式 ( 李明等, 2002; 赵天宏等, 2008) 生活在中高潮区的脐形紫菜 (Porphyra umbilicalis) 在失水胁迫后藻体 SOD 活力轻微下降, 而生活在中低潮区的条斑紫菜没有发现此现象 (Liu, 2009) 1) 而本研究中 SOD 活力随着失水胁迫增加显著降低, 可能由于本研究所采集的条斑紫菜品系和生长环境与 Liu(2009) 1) 不同导致 CAT 活力受外界条件影响较为明显, 它是一类光敏感性酶类, 强光下易发生光失活 ( 赵天宏等, 2008); 另外, 超氧阴离子和过氧化氢共同或分别与 CAT 形成复合物, 也可降低 CAT 的活力 (Asada, 1999) 在干出过程中,POD 活力的变化趋势与 SOD 和 CAT 明显不同 在失水初期 (10% 20%), 其活力显著上升, 随后其活力随着胁迫程度的加大逐渐降低, 这与邵世光等 (2009) 在对条斑紫菜进行盐度胁迫处理时测定的 POD 活力变化一致, 表明在失水胁迫初期藻体通过提高 POD 酶活性以减少胁迫产生的超氧化物自由基的伤害 结果表明, 野生条斑紫菜在干出胁迫的过程中,POD SOD 与 CAT 在胁迫初期清除超氧化物自由基的过程中发挥了一定的作用, 随着胁迫程度的增大, 藻体细胞内水量减少, 不能够为抗氧化酶系的抗氧化反应提供足够的水环境, 进而导致相关酶活力降低 综上所述, 随着条斑紫菜失水胁迫的增大, 藻体光合作用降低, 复水后可恢复到正常状态 ;Chl a Car 和 SP 含量减少 ; 藻胆蛋白含量呈现先下降后上升的趋势 ; 藻胆蛋白与 SP 比值的变化趋势与藻胆蛋白变化趋势类似, 但在高失水胁迫下, 该值显著高于对照组 ; 细胞在失水率达 40% 以上 ( 含 ) 产生过量 MDA;SOD CAT POD 的活力均在低失水胁迫 ( 20%) 时活力较高, 随着胁迫的增大, 活力逐渐下降 由结果推测, 在失水胁迫初期, 主要由 POD SOD 以及 CAT 等抗氧化酶抑制活性氧的暴发 ; 在失水胁迫后期, 抗氧化酶活力降低, 藻胆蛋白可能起着清除活性氧的作用 1 Liu YC. Mechanism for differential desiccation tolerance in porphyra specie. Boston: Doctoral Dissertation of Northeastern University, 2009, 47 60

165 162 渔业科学进展第 38 卷 参考文献 Asada K. The water-water cycle in chloroplasts: Scavenging of active oxygens and dissipation of excess photons. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 1999, 50: Bai ZY, Li CD, Sun HC, et al. The effect and chromosomal control on chlorophyll content and corticoid content under drought stress in wheat (Triticum aestivum L.). Acta Agriculturae Boreali-Sinic, 2009, 24(1): 1 6 [ 白志英, 李存东, 孙红春, 等. 干旱胁迫对小麦叶片叶绿素和类胡萝卜素含量的影响及染色体调控. 华北农学报, 2009, 24(1): 1 6] Chen LM. Ultrasonic-assisted aqueous two-phase extraction and antioxidant activity of total flavonoids from Porphyra yezoensis. Food Science, 2012, 33(4): [ 陈利梅. 超声波辅助双水相提取条斑紫菜黄酮类物质及其抗氧化活性研究. 食品科学, 2012, 33(4): 41 46] Contreras-Porcia L, Thomas D, Flores V, et al. Tolerance to oxidative stress induced by desiccation in Porphyra columbina (Bangiales, Rhodophyta). Journal of Experimental Botany, 2010, 62(6): Davison IR, Pearson GA. Stress tolerance in intertidal seaweeds. Journal of Phycology, 1996, 32(2): Feng C, Lu X, Yu W. Biochemical and physiological effects of adversity stress on Porphyra yezoensis. Transactions of Oceanology and Limnology, 2004(3): [ 冯琛, 路新枝, 于文功. 逆境胁迫对条斑紫菜生理生化指标的影响. 海洋湖沼通报, 2004(3): 22 26] Gao HF. The variation in the contents of phycobiliproteins from Porphyra haitanensis collected in different growing stages. Oceanologia Et Limnologia Sinica, 1993, 24(6): [ 高洪峰. 不同生长期坛紫菜中藻胆蛋白的含量变化. 海洋与湖沼, 1993, 24(6): ] Hader D, Lebert M, Sinha RP, et al. Role of protective and repair mechanisms in the inhibition of photosynthesis in marine macroalgae. Photochemical and Photobiological Sciences, 2002, 1(10): He F, Wang ZH, Ma WW, et al. Study on antioxidant activity of polysaccharides with different molecular weights from Pyropia yeoensis in vitro. Journal of Shanghai Ocean University, 2015, 24(5): [ 何芳, 汪之和, 马婉婉, 等. 不同分子量条斑紫菜多糖体外抗氧化活性研究. 上海海洋大学学报, 2015, 25(5): ] Lee EH, Bennett JH. Superoxide dismutases. Plant Physiology, 1982, 69(12): Li M, Wang GX. Effect of drought stress on activities of cell defense enzymes and lipid peroxidation in Glycyrrhiza uralensis seedlings. Acta Ecologica Sinica, 2002, 22(4): [ 李明, 王根轩. 干旱胁迫对甘草幼苗保护酶活性及脂质过氧化作用的影响. 生态学报, 2002, 22(4): ] Lin AP, Wang GC, Yang F, et al. Photosynthetic parameters of sexually different parts of Porphyra katadai var. hemiphylla (Bangiales, Rhodophyta) during dehydration and rehydration. Planta, 2009, 229: Oh S, Shin M, Lee K, et al. Effects of water activity on pigments in dried laver (Porphyra) during storage. Food Science & Biotechnology, 2013, 22(6): Robert J. The chequered history of the development and use of simultaneous equations for the accurate determination of chlorophylls a and b. Photosynthesis Research, 1983, 88(C7): Romay Ch, González R, Ledón N, et al. C-phycocyanin: A biliprotein with antioxidant, anti-inflammatory and neuroprotective effects. Current Protein and Peptide Science, 2003, 4(3): Shao SG, Yan BL, Li TY, et al. Effects of the stress of Cr 6+, Pb 2+, Cd 2+ on protective enzyme system in Porphyra yezoensis. Journal of Hydroecology, 2009, 2(4): [ 邵世光, 阎斌伦, 李廷友, 等. Cr 6+ Pb 2+ Cd 2+ 胁迫下条斑紫菜保护酶系统的响应. 水生态学杂志, 2009, 2(4): 94 97] Shen DL. Chromosomal and mutagenic study of the marine macroalgae, Gracilaria enuistipitata. Journal of Applied Phycology, 1995, 7(1): Wang WJ, Sun XT, Liu FL, et al. Effect of abiotic stress on the gameophyte of Pyropia katadae var. hemiphylla (Bangiales, Rhodophyta). Journal of Applied Phycology, 2016, 28(1): Xie J, Xu Y, Ji DH, et al. Physiological response of the antioxidant system in Pyropia haitanensis to desiccation stress. Journal of Fishery Sciences of China, 2014, 21(2): [ 谢佳, 徐燕, 纪德华, 等. 坛紫菜叶状体对失水胁迫的抗氧化生理响应. 中国水产科学, 2014, 21(2): ] Zeng CX, Wang YR. Low temperature injury and peroxidation of membranes lipids in rice seedlings. Acta Botanica Sinica, 1997, 29(5): [ 曾超西, 王以柔. 水稻幼苗的低温伤害与膜脂过氧化. 植物学报, 1997, 29(5): ] Zhang ZL. Plant Physiology experiment instruction. Beijing: Higher Education Press, 2000, [ 张志良. 植物生理学实验指导. 北京 : 高等教育出版社, 2000, ] Zhao TH, Sun JW, Fu Y. Advances of research on metabolism of plant reactive oxygen species and exogenous regulation under abiotic stresses. Crops, 2008(3): [ 赵天宏, 孙加伟, 付宇. 逆境胁迫下植物活性氧代谢及外源调控机理的研究进展. 作物杂志, 2008(3): 10 13] Zou DH, Gao KS. Progress in studies on photosynthetic in organic carbon utilization in marine macroalgae. Marine Science Bulletin, 2001, 20(5): [ 邹定辉, 高坤山. 大型海藻类光合无机碳利用研究进展. 海洋通报, 2001, 20(5): 83 90] ( 编辑冯小花 )

166 第 5 期李晓蕾等 : 野生条斑紫菜 (Pyropia yezoensis) 叶状体对干出胁迫的抗氧化生理响应特征 163 Antioxidant Physiological Characteristics of Wild Pyropia yezoensis Under Desiccation Stress LI Xiaolei 1,2,3, WANG Wenjun 2,31, LIANG Zhourui 2,3, LIU Fuli 2,3, SUN Xiutao 2,3, CAO Yuan 1,2,3, YAO Haiqin 1,2,3, WANG Feijiu 2,3 (1. College of Fisheries and Life Science of Shanghai Ocean University, Shanghai ; 2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao ; 3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao ) Abstract Desiccation is the main abiotic stress for Pyropia yezoensis. In this study we investigated the photosynthetic and antioxidant physiological responses of a wild P. yezoensis thallus to desiccation stress, including the optimal chlorophyll fluorescence quantum yields of photosystem Ⅱ (F v /F m ), the contents of photosynthetic pigments [chlorophyll a (Chl a), carotenoid (Car), R-phycoerythrin (R-PE), R-phycocyanin (R-PC)], soluble proteins (SPs), malondialdehyde (MDA), and the activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), and catalase (CAT). The results revealed that as the water loss increased, F v /F m decreased linearly and reached the lowest when the water loss was 60%; F v /F m returned to the normal level after the blades were rehydrated for 1 h. The contents of Chl a, Car, and SPs decreased gradually. The contents of R-PE and R-PC decreased when the water loss was <30% and then increased as the water loss was 30%. The change of phycobiliproteins/soluble proteins was similar to that of phycobiliproteins. This ratio increased to the control level when the water loss was 40% and was significantly higher than the control when the water loss was 80%. There was no significant difference in the content of MDA between the control and the blades when the water loss was 30%. The content of MDA increased significantly when the water loss was 40%. However, there was no significant difference between the blades when the water loss ranged from 40% to 80%. There was no significant change in the activities of SOD and CAT when the water loss was 20%. The activity of POD was significantly increased when the water loss was 20%. When the water loss increased to 30%, the activities of SOD, CAT and POD decreased significantly. There was no significant difference between the blades when the water loss ranged from 50% to 80%. The results above suggested that during the early stage of water loss, the antioxidant enzymes POD, CAT and SOD played key roles in scavenging the reactive oxygen species, which inhibited the yield of excessive MDA; as water loss increased, the water condition became disadvantageous for the antioxidant enzymes, and MDA was accumulated as a result. Based on the change of phycolibiprotein/sp, we speculated that the function of phycobiliproteins became more and more significant in protecting the blades against desiccation stress when the water loss was 30%, which could help with the rapid recovery of photosynthesis (F v /F m ) during rehydration. Key words Desiccation; Pyropia yezoensis; Photosynthetic; Antioxidant 1 Corresponding author: WANG Wenjun, wjwang@ysfri.ac.cn

167 第 38 卷第 5 期渔业科学进展 Vol.38, No 年 10 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct., 2017 DOI: /yykxjz 基于钨丝原子阱与直接进样技术的 * 原子荧光光谱法快速测定贝类中的镉 徐 正 1,3# 翟明丽尚德荣 1,4# 1 翟毓秀 1 赵艳芳 冯礼 1 宁劲松 11 2 刘霁欣 (1. 农业部水产品质量安全检测与评价重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛 ; 2. 北京吉天仪器有限公司北京 ; 3. 山东省产品质量检验研究院济南 ; 4. 南京农业大学无锡渔业学院无锡 ) 2 摘要本研究利用集成多孔石墨管电热蒸发器和钨丝捕获阱技术的原子荧光光谱分析系统, 基于固体进样技术建立了适用于现场快速检测贝类中镉 (Cd) 的测定方法, 实现了贝类中 Cd 的快速灵敏检测 结果显示, 仪器在最佳参数条件下稳定性良好, 采用 在线原子阱 捕获后释放的信号可以消除大多数基体干扰 贝类样品匀浆后在酸性条件下直接进样可快速测定 Cd, 且使用 1% 硝酸进样效果最好 采用标准曲线和标准加入法验证, 均线性良好 (R ), 样品加标回收率分别为 98.1% 110.6% 和 96.4% 105.5%, 相对标准偏差 (RSD) 分别为 3.3% 11.6% 和 7.5% 8.7%, 方法检出限分别为 3 pg 和 0.6 pg, 满足贝类样品的现场快速检测要求 但相对标准曲线法, 标准加入法具有更好的准确度 精密度和稳定性, 用标准物质验证, 检测结果在参考值范围内 因此, 标准加入法更适合贝类中 Cd 的快速测定 关键词固体进样 ; 原子荧光 ; 贝类 ; 镉 ; 测定中图分类号 TS254.7 文献标识码 A 文章编号 (2017) 镉 (Cd) 作为有毒有害重金属元素, 一直是人们关注的重点 海洋生物对重金属有很强的富集作用, 尤其是贝类体内 Cd 含量较高 ( 吴春峰等, 2013; 崔正国等, 2015), 是人体摄入 Cd 的重要来源之一 因此, 监测环境及水产品中 Cd 的含量, 是预防和减少 Cd 对人体危害的重要举措 目前, 国际上 Cd 的检测方法已较为成熟, 如原子吸收法 (AAS)(Miranda et al, 2012; 李立等, 2011) 原子荧光法(AFS) (Cava-Montesinos et al, 2004; 王志嘉等, 2012) 电感耦合等离子体发射光谱和质谱法 (ICP-AES/MS) (O'Sullivan et al, 2013; 陈国娟, 2012; Juranović et al, 2012) 等, 但均需繁琐的样品消解, 难以实现现场及快速检测 直接进样分析是解决这一问题的有效手段, 且已与多种检测方法结合并得到应用 (Duarte et al, 2013; 张英等, 2015; Bu et al, 2013), 然而, 直接进样引入复杂基体所产生的干扰则需要用加入基体改进剂的方法来进行消除 ( 叶佩琳等, 2015; Török et al, 2012) 此外, 也可以利用捕获技术来消除基体干扰, 如 Feng 等 (2010) 利用钨丝 在线原子阱 实现了电热蒸出 Cd 的捕获, 消除了基体干扰, 并成功应用到了蔬菜 鸡肉等农产品中 Cd 的测定 (Zhang et al, 2012) 目前, 电热蒸发钨丝在线捕获技术与光谱技术联用直 * 国家重大科学仪器设备开发专项 (2011YQ ) 和国家自然科学基金 ( ) 共同资助 [This work was supported by the National Key Scientific Instrument and Equipment Development Project (2011YQ ), and the National Natural Science Foundation of China ( )] # 共同第一作者 : 徐正, zheng-x@foxmail.com; 翟明丽, muziningyuan@163.com 1 通讯作者 : 翟毓秀, 研究员, zhaiyx@ysfri.ac.cn 收稿日期 : , 收修改稿日期 :

168 第 5 期徐正等 : 基于钨丝原子阱与直接进样技术的原子荧光光谱法快速测定贝类中的镉 165 接测定食品中的 Cd 含量在粮食 蔬菜 水果 茶叶 猪肝及干粉贝类中已有报道 (Zhang et al, 2016; 冯礼等, 2014; Zhang et al, 2015; 黄亚涛等, 2013; 王昌钊等, 2012; Mao et al, ) ; 毛雪飞, 2015) 而水产品由于含水量高 粘度大 基质复杂等特点, 在该方面的研究应用还较少 (Wen et al, 2009; Yang et al, 2015) 本研究应用集成多孔石墨管电热蒸发和钨丝捕获阱技术的固体进样测 Cd 装置串联原子荧光光谱分析系统, 针对贝类样品特点, 通过优化前处理方法, 确定最佳测定程序和条件, 建立了适用于现场快速检测贝类中 Cd 的测定方法, 旨在为贝类中 Cd 的现场快速检测提供一种有效技术手段 1 材料与方法 1.1 材料 实验材料扇贝 菲律宾蛤仔 (Ruditapes philippinarum) 缢蛏(Sinonovacula constricta) 等贝类样品 ( 采集于山东青岛胶南地区 ) ; 扇贝标准物质 GBW10024( 国家标准物质中心 ); 贻贝 (Mytilus edulis) 标准物质 GBW0857 ( 国家海洋局第二海洋研究所 ); 牡蛎 (Ostrea gigas) 标准物质 ESA-2( 中国环境监测总站 ); 其他验证试剂均为分析纯 ; 所用标准溶液均来自国家标准物质中心 ; 实验用水为超纯水 ; 载气及屏蔽气为 Ar-H 2 (9 1, V/V) 混合气 仪器设备 DCD-200 固体进样装置 AFS-8230 原子荧光光度计 ( 北京吉天仪器有限公司 ); AA800 石墨炉原子吸收光度计 ( 美国 Perkin-Elmer 公司 );Milli-Q 超纯水 ( 密理博公司 ); 微量移液器 ( 德国 Eppendorf 公司 );T18 均质机 ( 德国 IKA 集团 ); 旋涡混匀器 ( 德国 IKA 集团 ) 1.2 实验方法 样品处理取新鲜贝类可食部分用均质机处理, 称 20 mg 左右样品于进样舟中直接上机测量 ( 视样品含量高低, 用 1% 硝酸稀释上机 ) 称取 1.00 g 标准物质用 1% 硝酸稀释至 10 ml, 充分混匀, 吸取 20 μl 于进样舟中上机测定 标准曲线的制备分别取 50 μg/l Cd 标准溶液 μl, 于石墨进样舟中测定其荧光值, 以进样 Cd 的绝对含量 (ng) 与测定荧光值绘制标准曲线 标准加入法样品系列制备取等量待测样品 1 ml 分装至 5 个试管中, 分别吸取 5 μg/ml Cd 标准溶液 μl 于相应管中 ( 对应加标量分别为 ng), 用 1% 硝酸稀释至 2 ml, 混匀, 制备加标样品系列 测定方法实验以 1% 硝酸溶液作为空白, 进样 10 μl 于样品舟中上机检测, 每个样品平行测定 3 次, 取平均值 仪器条件固体进样测 Cd 装置与电热蒸发原子荧光光谱仪联用 ( 王昌钊等, 2012; 王金玉等, 2013), 原子荧光光谱仪工作参数见表 1 用于方法验证的石墨炉原子吸收光谱仪 (GF-AAS) 仪器条件参考 GB/T 表 1 原子荧光光谱仪工作参数 Tab.1 The operating parameters of atomic fluorescence spectrometry (AFS) 参数 Parameters 值 Value 灯电流 Lamp current (ma) 光电倍增管负高压 Voltage for PMT (V) 载气流速 Carrier gas flow rate (ml/min) 500 屏蔽气流速 Shielding gas flow rate (ml/min) 500 读数时间 Reading time (s) 统计分析 采用 SPSS 18 统计软件进行 t 检验分析, 比较电热蒸发原子荧光法 (ETV-AFS) 和湿法消解法 (GF-AAS) 测定贝类样品中 Cd 含量结果的差异性 在 95% 的置信度下, 如 P>0.05, 则说明两种方法之间不存在显著性差异 2 结果与讨论 2.1 固体进样装置参数优化 根据设备操作相关信息, 通过添加 0.1 ng Cd 标准溶液, 对灰化功率 灰化时间 蒸发功率 蒸发时间进行四因素三水平的正交实验, 研究灰化和蒸发功率及时间对测定的影响 结果以测定的荧光响应值面积为判定依据, 重复测定 3 次的相对标准偏差 RSD 值作为参考 温控程序的正交实验设计和结果分别如表 2 表 3 所示 1) Mao XF. Study on Determination of cadmium and mercury in agri-foods by solid sampling electrothermal vaporization spectrometry using atomic traps. Doctoral Dissertation of Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2015 [ 毛雪飞. 固体进样电热蒸发原子阱捕获光谱技术快速测定农产品中镉和汞的研究. 中国农业科学院博士研究生学位论文, 2015]

169 166 渔业科学进展第 38 卷 水平 Level Tab.2 A 灰化功率 Ashing power(w) 表 2 温度程序正交实验设计 The orthogonal experimental design of temperature programs B 灰化时间 Ashing time (s) C 蒸发功率 Vaporization power(w) D 蒸发时间 Vaporization time(s) 由正交实验 L 9 (3 4 )( 表 3) 可知,R C > R D >R A >R B, 说明 C 因素影响最大, 其次为 D A B 因素, 影响逐渐变小, 即固体进样温控程序中影响测定结果的程序因素依次为蒸发功率 > 蒸发时间 > 灰化功率 > 灰化时间, 根据 Cd 因素指标趋势得出最佳温控程序组合为 C 3 D 3 A 3 B 2 因此, 实验最终确定灰化功率为 100 W, 灰化时间为 50 s, 蒸发功率为 80 W, 蒸发时间为 40 s 按照最佳条件进行验证实验 ( 表 4), 重复 3 次, 测得荧光面积为 mv s,rsd 为 3.7% 实验号 No. 灰化功率 Ashing power (W) 表 3 温度程序控制的正交实验结果 Tab.3 Orthogonal experimental results of temperature programs 灰化时间 Ashing time (s) 蒸发功率 Vaporization power (W) 蒸发时间 Vaporization time (s) 荧光面积 Fluorescent area (mv s) 1 1(50) 1(30) 1(60) 1(20) (50) 2(70) 2(30) (70) 3(80) 3(40) (70) (100) K K K k k k R RSD(%) Tab.4 表 4 固体进样装置分析过程 Analytical procedures of the solid sampling device 程序 Programs 时间 Time (s) 功率 Power (W) 信号采集 Signal acquisition (1) 灰化 Ashing 否 No (2) 灰化 Ashing 否 No (3) 蒸发 / 捕获 Vaporization/trap 否 No (4) 蒸发 / 捕获 Vaporization/trap 否 No (5) 释放 Release 是 Yes (6) 释放 Release 是 Yes (7) 蒸发 Vaporization 否 No (8) 冷却 Cooling 否 No (9) 清除 Cleaning 否 No (10) 冷却 Cooling 否 No 2.2 仪器稳定性实验实验在最优条件下添加不同 Cd 标准溶液的多谱图如图 1 所示 仪器在最适条件下,8 h 内每隔 1 h 测量 1 次, 每次平行测定 3 次, 其测量值的相对标准偏差 (RSD) 为 7.41% 测量含 Cd 0.1 ng 的 RSD 小于 10%, 测定稳定性较好 图 1 标准溶液光谱 Fig.1 The spectrogram of standard solutions

170 第 5 期徐正等 : 基于钨丝原子阱与直接进样技术的原子荧光光谱法快速测定贝类中的镉 干扰实验基于鲜贝样品基体成分特点 ( 李苹苹, 2014; 俞佳锋等, 2014), 实验以 1 ng Cd 为基准, 通过添加一定量的有机成分 ( 葡萄糖 蛋白胨 琼脂等用于验证糖 类 蛋白等主要组分 ) 和无机元素 (Ca Na Zn Se Al Pb Hg As 等样品中的主要元素 ), 验证基体干扰情况 实验结果如表 5 所示, 除 NaCl 干扰较大外, Cd 回收率 (n=3) 在 99.3% 110.8%, 干扰不显著 干扰物 Interferents Tab.5 表 5 干扰物对测量的影响 The interferences of inorganic and organic materials 浓度 Concentration (mg/l) 回收率 Recovery (%) 干扰物 Interferents 浓度 Concentration (mg/l) 回收率 Recovery (%) 葡萄糖 Glucose As 琼脂 Agar Zn 胰蛋白胨 Casein tryptone Se 葡聚糖 Glucan Al NaCl Pb Ca Hg 酸溶液对检测的影响 贝类样品 Cd 含量较高且基体成分复杂, 为保证实验测量精确度, 需将样品稀释, 同时为减少可能的干扰, 通过稀释减少基体对测量的影响 研究发现, 酸性条件有助于分解有机物 降低干扰 实验研究了常用的酸, 包括硝酸 盐酸 高氯酸和硫酸, 发现同浓度的硝酸介质在测定试样时荧光响应值及稳定性优于盐酸 硫酸和高氯酸 ( 图 2) 进一步研究表明, 样品加入 1% 硝酸效果较好, 如图 3 所示 因此, 本方法选择 1% 硝酸作为样品稀释液 2.5 标准曲线 图 3 硝酸浓度对荧光值的影响 Fig.3 The effect of HNO 3 concentration on fluorescence intensity Cd 元素测定的常规方法是标准溶液曲线法 (Shai et al, 1994), 但对于固体进样方式, 标准加入法是消除基质干扰的有效方法之一, 因此应用更多 (Pouny et al, 1992) 本研究采用扇贝标准物质作为基质添加标准溶液进行验证, 两者无显著差异 图 4 图 5 分别为标准溶液拟合标准曲线及扇贝标准物质的标准加入法拟合曲线,R 2 >0.995, 相关性较好 Fig.4 图 4 标准曲线法拟合曲线 The fitting curves of standard curve method Fig.2 图 2 不同酸条件下的荧光值 Fluorescence intensities in different acid solutions 2.6 方法验证 方法稳定性和灵敏度室温条件下, 仪器在 10 h 内每隔 1 h 测量 1 次 (n=3), 其 RSD 为 8.4%, 说明仪器稳定性良好 ; 对同一样品连续测定 6 次, 其 RSD 在 6.1% 12.1% 之间 按 IUPAC 标准, 以 0.2 μg/l Cd 标准溶液 (n=20) 测得标准加入法和标准曲线法的方法检测限分别为 0.6 pg 和 3 pg