实验结果 中药目标类群成分发现 鉴定和中药组学研究流程 由 LTQ Orbitrap 高分辨质谱与相关软件所构建的中药目标类 群成分发现 鉴定和中药组学研究流程如图 1 所示 利用 LTQ Orbitrap 质谱系统进行一级和多级数据的同时采集 在目标类群成分发现和鉴定部分, 对于已知的目标类群成分

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1 基于 LTQ Orbitrap 线性离子阱 - 静电场轨道阱高分辨质谱的中药目标类群成分发现 鉴定和中药组学研究策略 : 基于特征类群苯乙醇苷类成分的肉苁蓉品种区分 李晨赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司张加余北京中医药大学 AN_C_LCMSMS_14_201509Y 关键词 LTQ Orbitrap; 中药组学 ; 肉苁蓉 ; 目标类群 ; 苯乙醇苷 引言 中药存在多基源问题, 很多中药品种来源于不止一种植物 动物或矿物 不同基源的药材通常化学成分有一定差异, 从而导致药理活性存在差异, 直接影响到中药的有效性与安全性 因此中药基源是关系中药质量与疗效非常重要的因素 肉苁蓉是我国传统的名贵中药材, 素有 沙漠人参 之美誉, 具有极高的药用价值 其可用以治疗精血不足之阳痿 遗精 白浊 尿频余沥 腰痛脚弱 耳鸣目花 月经衍期 宫寒不孕 肠燥便秘等症 在历史上就被西域各国作为上贡朝廷的珍品, 也是历代补肾壮阳类处方中使用频度最高的补益药物之一 肉苁蓉作为多基源中药, 有多个品种均被作为肉苁蓉药材使用, 其中肉苁蓉 Cistanche deserticola Y.C. Ma (CD) 管花肉苁蓉 C. tubulosa (Schrenk) Wig (CT) 和沙苁蓉 C. sinensis (C. A. Mey.) G. Beck(CS) 为常用的三个品种 2010 版 中国药典 规定肉苁蓉为肉苁蓉 (CD) 或管花肉苁蓉 (CT) 的干燥带鳞叶的肉质茎 因此, 揭示不同品种肉苁蓉化学成分的差异, 并且区分不同的品种, 对于保证肉苁蓉的质量与临床疗效至关重要 肉苁蓉中含有多种成分, 其中苯乙醇苷类成分为肉苁蓉的主要特征成分 本文结合 LTQ Orbitrap 线性离子阱 - 静电场轨道阱高分辨质谱及相关软件, 建立了中药目标类群成分发现 鉴定和中药组学研究策略, 并应用该流程从 2 种正品和 1 种混淆品肉苁蓉中鉴定出 69 个苯乙醇苷类成分, 并找到 8 个可清晰区分三种肉苁蓉的生物标志物 实验条件液相色谱条件 色谱系统 :Thermo Scientific Accela 600 液相色谱仪 色谱柱 :Agilent Zorbax Extended C18 ( mm, 5 µm) 流动相 :A 为水相,0.1% 甲酸水 ;B 为有机相, 乙腈 梯度条件 : 时间 (min) A(%) B(%) 流速 :1.0 ml/min 质谱条件 质谱系统 :LTQ Orbitrap 线性离子阱 - 静电场轨道阱高分辨质谱 参数设置 : 离子源参数 扫描参数 离子化方式 HESI MS 分辨率 30,000 FWHM 喷雾电压 4 kv MS2 分辨率 15,000 FWHM 鞘气 30 arb 扫描范围 m/z 辅助气 5 arb 裂解方式 CID 离子源温度 350 碰撞能量 40% 离子传输管温度 350 扫描模式 Full scan+ dd-ms2 实验目的 建立基于 LTQ Orbitrap 线性离子阱 - 静电场轨道阱高分辨质谱及相关软件的中药目标类群成分发现 鉴定和中药组学研究流程, 用以快速发现并鉴定中药的目标类群成分, 并对中药品种进行区分 本文以中药肉苁蓉为例, 应用所建立流程对肉苁蓉中苯乙醇苷类成分进行发现与鉴定, 并利用苯乙醇苷类成分实现了 3 个不同品种肉苁蓉的清晰区分

2 实验结果 中药目标类群成分发现 鉴定和中药组学研究流程 由 LTQ Orbitrap 高分辨质谱与相关软件所构建的中药目标类 群成分发现 鉴定和中药组学研究流程如图 1 所示 利用 LTQ Orbitrap 质谱系统进行一级和多级数据的同时采集 在目标类群成分发现和鉴定部分, 对于已知的目标类群成分, 将文献报道的一级精确质量数等信息录入 TraceFinder 软件实现已知成分的搜索 对于未知的目标类群成分, 利用 MetWorks 软件自带的代谢通路以及 Mass Frontier 软件的 FISh 功能, 分别从一级和多级进行同类型结构的搜索 在发现目标类群成分之后, 采用 Mass Frontier 软件进行成分结构的解析 图 1. 基于 LTQ Orbitrap 高分辨质谱与相关软件的中药目标类群成分发现 鉴定和中药组学研究流程 在中药组学研究部分, 首先用 TraceFinder 软件提取成分的峰面积信息, 然后通过主成分分析 (PCA) 和载荷分析 (Loading Analysis) 筛选生物标志物, 最后通过 OPLS-DA 分析对生物标志物进行验证 肉苁蓉中苯乙醇苷类成分的鉴定采用 LTQ Orbitrap 质谱同时采集 MS1~MS3 的多级数据, 并用 Mass Frontier 软件进行解析 利用 Mass Frontier 软件可自动生成离子树, 将多级数据相关联, 并可以用该软件的谱图注解功能进行多级谱图的解析 以异毛蕊花糖苷为例, 对多级谱图解析结果如下 图 2. Mass Frontier 软件自动注解异毛蕊花糖苷多级质谱离子树

3 鉴定出的苯乙醇苷类成分结果如表 1 所示 表 1. 肉苁蓉中苯乙醇苷类成分鉴定结果 Peak t R /min Formula Theoretical Experimental Mass error / ppm C 26 O C 20 H 29 O C 14 H 19 O C 20 H 29 O C 20 H 29 O C 20 H 29 O C 21 H 31 O C 28 H 41 O C 21 H 31 O C 22 H 31 O C 16 H 21 O C C 22 H 31 O C 29 H C C ESI MS2 (m/z) ESI MS3 (m/z) Structural identification 477(100), 461(77.4), 459(22.0) 297(10.9), 161(11.8) 119(100), 137(91.2) 135(74.9), 161(28.8) 299(100), 161(27.7) 299(100), 161(22.2), 205(19.1) 161(32.6), 143(10.5) 605(8.6), 461(1.9) 311(22.9), 161(34.3) 443(3.5) 281(100), 179(24.7), 161(14.0), 119(12.1) 783(100), 621(29.0), 639(11.3) 443(100), 461(69.0) 295(6.0) 653(100), 797(27.6), 635(10.3) 477(1.0) Kankanoside F 221(12.6) 135(100), Decaffeoylacteoside isomer 113(3.6) - Salidroside 135(100) Decaffeoylacteoside 179(100), 143(97.0), 113(81.0), Cistanoside G isomer 161(41.1), 119(80.7) 179(100), 161(66.2), Cistanoside G 143(33.5) 161(100), 179(86.2), Cistanoside E isomer 149(77.1) 477(100), 461(96.0), 459(18.1), Decaffeoyltubuloside A 315(13.1), 179(1.0) 161(100), 179(85.4), Cistanoside E 149(78.3) 135(35.0), Cistanoside H isomer 297(12.0) acetylsalidroside 621(100) Cistantubuloside C1/C2 261(100), 297(77.5), Cistanoside H 215(25.0), 177(25.0) 295(100), 269(76.9), Crenatoside 267(55.3) 507(34.6), Kankanosides K1/K2 329(10.3) 477(100), 461(87.9), Echinacoside 459(22.1)

4 Peak t R /min Formula Theoretical Experimental Mass error / ppm C 16 H 21 O C 35 O C C 35 O C 34 H 43 O C C C 43 H 53 O C C 43 H 53 O C C C C 35 O C 29 H C C C C ESI MS2 (m/z) ESI MS3 (m/z) Structural identification 281(100), 119(11.5), 164(100) 4 - acetylsalidroside 179(9.7), 461(13.9), 445(11.2) 623(18.9), 491(10.2) 605(6.8) 593(100), 623(2.3) 665(100), 623(63.2), 785(8.2) 315(41.9), 443(10.6), 477(8.9) 811(100), 607(43.1) 443(12.6), 477(6.9) 811(100), 607(77.9) 653(16.0), 623(4.9) 619(100), 473(19.1), 491(13.7) 476(4.1) 623(3.4) 459(100), 179(19.2), 487(15.7) 665(100), 623(33.5), 799(34.5) 638(9.3), 507(6.1) 461(11.2), 427(11.2) 665(100), 649(27.1), 769(12.6 ) 461(81.1), Cistantubuloside A 443(31.2) 475(48.3), Cistanoside A 473(34.7) 477(100), 461(92.2), Cistantubuloside B1/ B2 459(20.9) 447(100), 461(98.4), Arenarioside 429(23.3) 605(69.4), Tubuloside A 519(10.7), 503(7.8) 297(26.1), Acteoside 135(17.0) - Tubuloside D 135(77.0), Cisacteoside 205(36.7) - Cistubuloside D 461(100) Wiedemanninoside C 473(100), 457(38.8), Cistanoside B 443(16.8) 476(100), 345(38.9), Campneoside I 150(10.0) Poliumoside 443(14.5) 151(100), 277(39.8) Crenatoside isomer 605(8.4) Cistanoside N isomer 476(100), 345(38.9) Isocampneoside I 299(100), 161(15.0), Kankanoside G 179(11.2) 605(7.8) Kankanoside H1/H2

5 Peak t R /min Formula Theoretical Experimental Mass error / ppm C 29 H C C C C C 35 O C C C C 35 O C C 29 O C C C C 32 O C ESI MS2 (m/z) ESI MS3 (m/z) Structural identification 315(11.3), 477(7.4) 799(100), 637(49.8), 619(19.0) 475 (100), 461(45.9), 491(14.8), 457(12.2) 443(1.4), 445(100), 461(11.2), 427(11.2) 503(38.9), 443(5.7) 591(100), 607(11.3) 461(31.1), 457(15.7) 695(100), 653(39.9), 799(23.8) 445(49.1) 589(4.5) 503(100), 605(48.6), 443(39.1), 623(34.0), 461(23.0), 519(4.0) 427(28.6) 491(36.9), 475(17.3) 427(44.7), 175(40.7) 443(2.39) 653(34.3), 533.2(23.4) 457(42.8), 443(11.6) 297(42.6), Isoacteoside 135(16.4) - Cistanoside N isomer 161(30.2), Cistanoside C 315(12.5) Cis-Kankanoside G 297(17.0) 2 -O-acetylacteoside 297(19.6) Kankanoside I 427(34.2) Jionoside D 161(35.3) - Cistanoside N Isosyringalide-3 -α-l 135(59.2), rhamnose 161(18.9) Ciskankanoside I 443(15.2) 443(100), 461(70.2), Cistubuloside B 357(36.7) 299(100), 145(24.7), Osmanthuside B 163(23.5), 161(22.9) 135(67.6), Isocistanoside C 297(17.6) - Cistanoside M ismor Syringalide A-3 -α-l 135(46.5), rhamnose 161(16.0) 345(100) Kankanosides J1/J2 Cistanoside M 161(45.3)

6 Peak t R /min Formula Theoretical Experimental Mass error / ppm C C C C C C C C C C 29 O C 33 H C C C 32 H C 33 H C C ESI MS2 (m/z) ESI MS3 (m/z) Structural identification 193(24.3), 457(22.7) 649(66.4), 769(22.8) 475(16.6), 461(8.3) 461(88.3), 491(74.7) 503(39.4), 461(356.6) 503(53.9), 623(47.2) 457(49.6), 505(31.3) 475(25.7) 505(100), 475(52.4), 487(27.8) 445((100), 427(13.9) 651(100), 633(21.8), 505(14.7) 461(36.4), 503(34.5) 783(100), 621(56.2), 603(27.0), 663(22.6) 503(14.5), 461(11.0) 651(100), 633(21.1) 461(9.6), 619(8.7) 475(8.3), 619(8.3), 461(4.7) 161(62.6), Cistanoside D 311(17.6) 2 -O-acetylpoliumoside 443(18.5) 491(11.6), Isocistansinenside A 475(6.3) Plantainoside C 161(37.2) Salsaside D 443(2.6) 135(46.1), Tubuloside B 297(19.3), 161(14.3) 161(45.3), Epimeridinoside A 311(10.3) 461(58.3), Salsaside E 491(36.6) 161(100), 193(48.1), Isomartynoside 297(37.3) 145(100), 299(47.8), Osmanthuside B6 (Z/E) 163(42.4), 265(30.6) 505(100), 475(46.5), Cistanoside J 487(27.1) Salsaside F 443(2.7) 637(100) Cistansinenside B Isocistanoside K 491(8.4) 505(94.3), Isocistanoside J 193(29.5) 491(39.9), Cistanoside K 475(11.2) 491(51.0), Ciscistanoside K 475(46.8)

7 肉苁蓉品种区分生物标志物筛选 用 TraceFinder 软件提取鉴定出的 69 个苯乙醇苷类成分的峰面积信息, 然后进行主成分分析 (PCA) 和载荷分析 (Loading Analysis), 进行生物标志物的筛选 主成分分析图 ( 图 3A) 和载荷分析图 ( 图 3B) 如图 3 所示 图 3. 三种肉苁蓉品种区分主成分分析图 (A) 和载荷分析图 (B) 如图 3A 所示, 三种肉苁蓉可以清晰的按照品种区分为三组, 说明三种肉苁蓉所含成分有一定差异 结合载荷分析图 ( 图 3B), 选取化合物 echinacoside (C16) cistanoside A (C19) tubuloside A (C22) poliumoside (C30) isosyringalide 3' α L rhamnose (C34) cistanoside C (C38) 2' O acetylacteoside (C40) 和 2' O acetylpoliumoside (C54) 为品种区分的生物标志物 肉苁蓉品种区分生物标志物验证将 36 批肉苁蓉样品随机分为 2 组 : 建模组和验证组 其中样品 CD-6 CD-10 CD-14 CT-1 CT-9 CS-8 CS-12 为验证组, 其余样品为建模组 以选取的 8 个生物标志物为指标, 用建模组样品建立 OPLS-DA 模型 ( 图 5), 并用验证组样品进行判别分析, 判别结果如表 2 所示 从表 2 中可看出,7 份样品品种判别结果均正确 选取的 8 个生物标志物在三种肉苁蓉 (CD CS CT) 中的相对含量如图 4 所示 从图中可看出,8 个生物标志物在三种肉苁蓉中的相对含量差异明显 图 5. 三种肉苁蓉 (CD CS CT) 的 OPLS-DA 分析图 图 4. 8 个生物标志物在三种肉苁蓉 (CD CS CT) 中的相对含量

8 Samples 结论 Recognition value CD 表 2. 验证组样品判别结果 Recognition value CT Recognition value CS CD CD CD CT CT CS CS 参考文献 1. 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 [M]. 北京 : 中国医药科技出版社, L. Lei, Z.H. Song, P.F. Tu. Advances in research of chemical constituents in plants of Cistanche Hoffing. et Link, Chin. Trad. Herb. Drugs 34 (2003) Y.P. He, Z.Z. Yin, P.F. Tu, Z.C. Lou, Identification and survey of commercial crude drug of Herba Cistanches, J. Chin. Med. Mater. 20 (1997) 本文结合 LTQ Orbitrap 线性离子阱 - 静电场轨道阱高分辨质谱及相关软件, 建立了中药目标类群成分发现 鉴定和中药组学的研究流程 并将此流程应用于肉苁蓉中苯乙醇苷类成分的发现与鉴定, 以及肉苁蓉的品种区分 利用 LTQ Orbitrap 的多级质谱功能, 一次进样同时获得 MS1 ~ MS3 的丰富质谱数据, 有助于成分结构的解析 结合 TraceFinder MetWorks Mass Frontier 软件的相应功能, 从肉苁蓉中发现并鉴定出 69 个苯乙醇苷类成分 结合统计学软件, 实现了 3 个不同品种肉苁蓉的清晰区分, 并找到可用于肉苁蓉品种区分的 8 个生物标志物 本文建立策略可用以快速发现并鉴定中药的目标类群成分, 并对中药品种 产地等进行区分 Orbitrap 组学俱乐部 赛默飞小分子质谱应用技术群 赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司 全国服务热线 : ( 支持手机用户 ) AN_C_LCMSMS_14_201510Y

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