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1 微生物学通报 Microbiology China JUL 20, 2012, 39(7): by Institute of Microbiology, CAS 研究报告 CP7 抗菌蛋白对嗜水气单胞菌的抑杀作用机理 * 苑园园刘清明钟杨生廖富蘋林健荣 ( 华南农业大学动物科学学院广东广州 ) 摘要 : 目的研究多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) CP7 菌株的抗菌蛋白 (CP7ACP) 对嗜水气单胞菌的抑杀作用机理, 为防治嗜水气单胞菌引起的鱼病提供新的潜在天然药物方法采用抑菌试验钼锑抗比色法和紫外光谱法研究其对嗜水气单胞菌 S12 菌株生长磷泄漏和生物大分子的影响, 并利用扫描电镜和透射电镜观察了嗜水气单胞菌细胞结构遭受的破坏作用结果 CP7ACP 对嗜水气单胞菌的抑菌圈直径约 8.1 mm, 最小抑菌浓度 (MIC) 与最小杀菌浓度 (MBC) 分别为原液浓度的 1/8 和 1/4; 嗜水气单胞菌受 CP7ACP 处理后, 电镜观察发现其细胞壁细胞膜细胞器以及菌体均受到不同程度的破坏, 胞内的生物大分子和磷泄漏明显, 基因组 DNA 发生增色效应结论 CP7ACP 抑制嗜水气单胞菌生长, 可用于防治嗜水气单胞菌引起的鱼病关键词 : CP7 菌, 抗菌蛋白, 嗜水气单胞菌, 作用机理, 电镜 Mechanism of CP7 antibacterial protein against Aeromonas hydrophila YUAN Yuan-Yuan LIU Qing-Ming ZHONG Yang-Sheng LIAO Fu-Ping LIN Jian-Rong * (College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou, Guangdong , China) Abstract: [Objective] The efficacy of the CP7 antimicrobial proteins (CP7ACP) to Aeromonas hydrophila was evaluated to provide potential novel natural drug for treating fish disease caused by Aeromonas hydrophila. [Methods] The effect on Growth, phosphorus divulges and biomacromolecule of Aeromonas hydrophila S12 were tested using Antibacterial test, Mo-Sb colorimetry and UV spectroscopy, while destructive effects of Aeromonas hydrophila cell * 通讯作者 :Tel: ; : jrlin@scau.edu.cn 收稿日期 : ; 接受日期 :

2 950 微生物学通报 2012, Vol.39, No.7 structure by CP7ACP were observed under both scanning electron microscope and transmission electron microscope. [Results] The inhibition zone diameter was about 8.1 mm, the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) was 1/8 and 1/4 of stock solution respectively. After treated by CP7ACP, electron microscope reveals that cell wall, membrane, organelles and the thallus of Aeromonas hydrophila are subject to different degrees of damage, while intracellular biomacromolecule and phosphorus significantly divulge, genomic DNA become hyperchromic effect. [Conclusion] CP7ACP inhibit the growth of Aeromonas hydrophila, can be used for preventing fish disease caused by Aeromonas hydrophila. Keywords: CP7 strain, Antibacterial protein, Aeromonas hydrophila, Mechanism, Electron microscope 嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila) 是水产养殖重要的条件致病菌, 能够引起多种水产动物败血症, 危害极大目前由该菌感染引起的疾病绝大多数依赖抗生素药物治疗, 对水环境水产品质量和人类健康等的安全造成重要影响 [1] 因而, 采用生物防治技术或利用生物产物进行水产养殖动物嗜水气单孢菌感染症的预防和治疗有重要意义近年来, 我国在嗜水气单胞菌的生物防治领 [2] 域已取得一些进展, 单晓枫等研究了粪肠球菌 MLS-7 对嗜水气单胞菌有较强的抑菌作用, 宋铁 [3] 英等从土壤和植物中分离纯化出拮抗菌 LB3 K1 K29 E43, 对防治鳖的嗜水气单胞菌感染症 [4] 有效, 秦生巨等发现 8 株蛙弧菌对河蚌嗜水气 [5] 单胞菌具有裂解效果周飞等发现金银花对嗜 [6] 水气单胞菌有较强的抑菌作用, 彭金菊等在 32 味中药中筛选出五倍子栀子诃子五味子乌梅黄芩川黄连石榴皮等 8 味药物对嗜水 [7] 气单胞菌具有较强的抑菌活性, 张梁的研究表明大蒜素对引起草鱼肠炎的豚鼠气单胞菌具有显著的体外抑菌及防治效果芽孢杆菌是一类重要的具有生防潜力的细菌, 这类菌株能产生多种抗菌物质 [8], 多粘类芽孢杆菌 (Paenibacillus polymyxa) CP7 菌株是本课题组分离获得的一株具有广谱抗病原菌活性的拮抗性细菌, 能够分泌多种抗菌活性物质 [9], 在其发酵培养的上清液中, 已知有 3 种抗菌物质存在 : 第 1 种是由 23 个氨基酸组成的具有抗革兰氏阳性菌的 Cpacin 抗菌肽 ( 廖富蘋等, 发明专利号 : ) [10] ; 第 2 种是抗革兰氏阴性菌的多粘菌素类物质 [11] ; 第 3 种是抗真菌的 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶 [12] 本文研究了 CP7 菌株的抗菌蛋白 (CP7ACP) 对嗜水气单胞菌 S12 菌株的抑杀作用机理, 为 CP7ACP 在水产致病菌嗜水气单胞菌的生物防治提供理论依据 1 材料与方法 1.1 菌株多粘类芽孢杆菌 CP7 菌株为本实验室保存, 嗜水气单胞菌 S12 菌株来自中国水产科学研究院珠江水产研究所 1.2 CP7ACP 的制备挑取平板培养的 CP7 菌株单菌落接种于 5 ml YEPD 液体培养基中, 于 30 C 180 r/min 恒温摇床中培养 24 h 作为种子菌液, 按 1% 接种量 ( 体积比 ) 转接到发酵培养基中, 于 30 C 180 r/min 恒温摇床中培养 48 h 将培养液置于沸水浴中处理 20 min 后, 迅速取出冰浴冷却, 于 4 C r/min 离心 20 min, 收集的上清液经 0.22 µm 滤膜过滤后用 33% 硫酸铵饱和度沉淀其蛋白, 经透析, 即为菌株抗菌蛋白提取液, 于

3 苑园园等 : CP7 抗菌蛋白对嗜水气单胞菌的抑杀作用机理 C 冰箱保存备用可溶性蛋白的含量测定采用考马斯亮蓝显色法测定抑菌蛋白的浓度 1.3 抑菌试验和杀菌试验 S12 菌液浓度经血球计数板计数为 CFU/mL 用 CP7ACP 原液 ( 浓度为 g/l) 对 S12 的抗菌活性参照琼脂板孔穴扩散法 [13], 孔穴直径 2.7 mm, 每孔穴加粗提液 5 μl, 以消毒营养肉汤培养基为对照, 30 C 倒置培养过夜, 测量 CP7ACP 对 S12 抑菌圈的直径采用二倍稀释法测定 CP7ACP 对 S12 的最小抑菌浓度 (MIC) 与最小杀菌浓度 (MBC) [14] 1.4 S12 磷泄漏的检测 [15] 参照 Newton 等的方法并做改进, 将处于对数生长期的 S12 菌液于 r/min 离心 10 min, 收集菌体用 ph mmol/l 的 HEPES-Na 缓冲液 ( 含 1% NaCl) 重新悬浮洗涤除去杂质, 重复 2 3 次, 调节浓度约 CFU/mL; 然后依次向 10 ml 离心管中加入 HEPES-Na 缓冲液 S12 菌液和 CP7ACP 的 2 4 倍稀释液使菌液最终浓度为 CFU/mL 以灭菌水处理作为对照组, 30 C 分别孵育 min 后, 迅即放置在冰浴上, 4 C r/min 离心 5 min, 收集上清, 用紫外分光光度计在 OD 700 测定上清液中磷的吸光度, 通过标准曲线的回归方程计算出含量, 从而测算 CP7ACP 作用菌体后引起菌体磷泄漏的变化情况处理样品中磷含量的测定采用钼锑抗 ( 即钼酸铵 - 酒石酸锑钾 - 抗坏血酸 ) 比色法 [16] 1.5 CP7ACP 对 S12 胞内的生物大分子物质影响的检测生物体内的紫外吸收物质主要有蛋白质 DNA 和 RNA 等, 可通过检测紫外吸收量来衡量分析, 参照邹文政等的方法 [17] 取对数生长期的 S12, 用 0.1 mol/l ph 7.4 磷酸盐缓冲液稀释为 CFU/mL CP7ACP 的 2 倍 4 倍稀释液的分别与稀释菌液于 30 C 共同孵育 min, 以未加 CP7ACP 的稀释菌液为对照 ; 用 0.22 μm 滤膜过滤检测液, 滤液于紫外分光光度计 260 nm 波长测定其吸光值, 以其衡量 CP7ACP 引起 S12 内泄出生物大分子物质的效应 1.6 紫外光谱法分析 S12 基因组 DNA 增色效应利用 TIANamp Bacteria DNA Kit 细菌基因组 DNA 提取试剂盒, 提取 S12 基因组 DNA, 在 0.01 mol/l Tris-HCl 缓冲液 (ph 7.2) 介质中, S12 基因组 DNA 与 CP7ACP 2 倍稀释液混合于 30 C 避光孵育, 孵育时间经过 h 后 ; 以水调零做基线, 置于紫外 - 可见分光光度计中进行扫描, 分别测其波长在 nm 范围内的紫外吸光光谱 [18] 在整个操作过程中, 样品实行避光保存 1.7 CP7ACP 对 S12 作用的电镜观察 CP7ACP 对 S12 菌体作用处理过程是 : S12 在营养肉汤培养基 30 C 条件下摇床培养 12 h, 在对数生长期取菌液经 r/min 离心 10 min, 弃上清收集沉淀, 用 10 mmol/l 磷酸缓冲液 (ph 7.0) 调节菌的浓度为 CFU/mL, 吸取制备好的 S12 菌液 2 ml 至离心管中, 然后加入 CP7ACP 至终浓度为 2 倍稀释液, 混匀, 于 30 C 保温 h 后, r/min 离心 5 min, 收集菌体加入适量的 PBS 缓冲液洗涤菌体 3 次, 收集菌体以灭菌水处理的菌液为对照分别取上述经处理的样品, 加入 1 ml 4% 戊二醛固定液, 混匀菌体, 于 4 C 固定过夜然后按常规方法处理样品后, 扫描电镜观察记录拍照分别是取上述经处理的样品, 加入适量的 PBS 缓冲液洗涤菌体 3 次, 弃缓冲液 ( 不打散细胞 ), 加入 2.5% 戊二醛固定液 10 min, 然后 r/min 离心 10 min, 于 4 C 冰箱中固定过夜然后按常规方法处理样品, 透射电镜观察记录拍照

4 952 微生物学通报 2012, Vol.39, No.7 2 结果与分析 2.1 CP7ACP 对 S12 的抑杀作用 CP7ACP 对 S12 进行抑菌试验, 结果见图 1, 经检测抑菌圈直径约 8.1 mm 经测定, CP7ACP 对 S12 的最小抑制浓度 (MIC) 为 3.48 g/l, 即只需 CP7ACP 原液浓度的 1/8 便可完全抑制 S12 菌体的生长, 最小杀菌浓度 (MBC) 为 6.96 g/l, 即只需 CP7ACP 原液浓度的 1/4 便可全部杀死菌体结果表明 CP7ACP 对 S12 有明显的抑杀作用图 1 CP7ACP 对 S12 的抑菌作用 Fig. 1 Antimicrobial effect of CP7ACP to S12 注 : A: 对照 ; B: 处理. Note: A: Control; B: Treatment. 从图 2 中看出 CP7ACP 的 2 4 倍稀释液处理 30 min, S12 胞外的磷就分别达到和 89.7 μmol/l, 60 min 后磷浓度达到最高值, 分别是和 94.3 μmol/l, 经方差分析显示, P>0.05, 即 2 4 倍稀释液分别处理 min 时磷泄漏没有显著性差异, 而与对照组相比差异显著 (P<0.05) 结果表明 CP7ACP 能使 S12 胞内在短时内发生明显的泄露, 并且 CP7ACP 浓度越高泄漏量越多 2.3 CP7ACP 对 S12 胞内的生物大分子物质影响生物体内的紫外吸收物质主要有蛋白质 DNA 和 RNA 等大分子物质, 以 CP7ACP 的 2 4 倍稀释液处理 S12, 在 260 nm 处检测培养液吸光值, 分析 CP7ACP 影响菌体大分子物质泄漏情况, 结果见图 CP7ACP 对 S12 磷泄漏的影响 CP7ACP 对 S12 作用后, 菌体内磷的泄漏情况如图 2 所示图 3 CP7ACP 对胞内生物大分子物质泄出的影响 Fig. 3 The effect of CP7ACP on the biomacromolecule 图 2 CP7ACP 对胞内磷泄漏的影响 Fig. 2 The effect of CP7ACP on phosphorus leakage 可见紫外吸收物质发生明显的变化, 在处理 0 30 min 时, 紫外吸收物质量急剧上升, min 时达到峰值, 此后处于平缓的状态对照区几乎检测不出紫外吸收物质的量值经方差分析显示, CP7ACP 的 2 4 倍稀释液作用后的吸光值差异显著 (P<0.05), 2 4 倍稀释液作用后的吸光值与对照相比差异极显著 (P<0.01) 由此推测, CP7ACP 会引起 S12 胞内紫外吸收物质即生物大分子的

后的增色效应检测情况如图 4 所示从图 4 中可以看出, CP7ACP 处理 S12 基因组 DNA 后, 在紫外光波长为 260 nm 处发生了增色效应, 处理时间越长增色效益越明显, 即 18

分子沟槽中, 使 DNA 原本收缩的构象趋于松散变性 2.5 CP7ACP 对 S12 抑杀作用的电镜观察 2.5.1 CP7ACP 对 S12 作用的扫描电镜观察 : S12 被 CP7ACP 的 2 倍稀释液处理 0.

4 The changes of UV spectrum after S12 DNA treated by CP7ACP 图 5 扫描电镜观察 CP7ACP 处理后的 S12 Fig.

5 苑园园等 : CP7 抗菌蛋白对嗜水气单胞菌的抑杀作用机理 953 外泄 2.4 CP7ACP 对 S12 基因组 DNA 的作用增色效应通常是由于 DNA 变性引起的光吸收增加, 可作为衡量 DNA 变性的依据 CP7ACP 处理 S12 基因组 DNA 后的增色效应检测情况如图 4 所示从图 4 中可以看出, CP7ACP 处理 S12 基因组 DNA 后, 在紫外光波长为 260 nm 处发生了增色效应, 处理时间越长增色效益越明显, 即 18 h> 12 h>6 h>3 h, 细菌基因组 DNA 的紫外吸光值随作用时间的延长而上升增色效应的发生, 可能是 CP7ACP 与 DNA 表面的磷酸基团作用 ; 或者部分结构嵌入到 DNA 分子沟槽中, 使 DNA 原本收缩的构象趋于松散变性 2.5 CP7ACP 对 S12 抑杀作用的电镜观察 CP7ACP 对 S12 作用的扫描电镜观察 : S12 被 CP7ACP 的 2 倍稀释液处理 h 在扫描电镜下观察其菌体的变化, 如图 5 所示图 4 CP7ACP 处理 S12 DNA 后的紫外光谱变化 Fig. 4 The changes of UV spectrum after S12 DNA treated by CP7ACP 图 5 扫描电镜观察 CP7ACP 处理后的 S12 Fig. 5 Scanning electron microscopy observed S12 after treated by CP7ACP 注 : A: 正常对照 ; B: 处理 0.5 h; C: 处理 1 h; D: 处理 3 h; E: 处理 3 h. Note: A: Control; B: 0.5 h treated; C: 1 h treated; D: 3 h treated; E: 3 h treated.

内容物泄漏而使菌体细胞干瘪皱缩, 表面粗糙程度加重 ( 如图 5D 箭头所示 ), 另胞外可看到许多大而明显的附着在菌体上的白色分泌物, 推测是正在外泄的细胞内容物 ( 如图 5E 箭头所示 ) 2.5.2 CP7ACP 对 S12 作用的透射电镜观察 : S12 被 CP7ACP 的 2 倍稀释液处理 0.

6 954 微生物学通报 2012, Vol.39, No.7 正常 S12 的形态特征 ( 图 5A), 菌体呈杆状, 两端钝圆, 结构完整, 外观饱满, 表面光滑圆润无孔洞 CP7ACP 处理 S12, 0.5 h 后细胞表面变得粗糙, 有孔洞出现, 并且有些细胞间出现粘连 ( 如图 5B 箭头所示 ); 1 h 后有些菌体表面有明显孔洞出现, 表面凸凹不平, 细胞与细胞之间的界限略变模糊, 细胞形态趋向变形, 边缘模糊部分粘连在一起 ( 如图 5C 箭头所示 ); 3 h 后菌体细胞壁呈溶解状, 细胞变形破裂严重, 内容物泄漏而使菌体细胞干瘪皱缩, 表面粗糙程度加重 ( 如图 5D 箭头所示 ), 另胞外可看到许多大而明显的附着在菌体上的白色分泌物, 推测是正在外泄的细胞内容物 ( 如图 5E 箭头所示 ) CP7ACP 对 S12 作用的透射电镜观察 : S12 被 CP7ACP 的 2 倍稀释液处理 h 后, 用透射电镜观察其细胞的超微结构变化, 见图 6 注 : A: 正常对照 ; B: 处理 0.5 h; C: 处理 1 h; D: 处理 3 h. 图 6 透射电镜观察 CP7ACP 处理后的 S12 ( ) Fig. 6 TEM observed S12 after treated by CP7ACP ( ) Note: A: Control; B: 0.5 h treated; C: 1 h treated; D: 1 h treated; E: 3 h treated.

7 苑园园等 : CP7 抗菌蛋白对嗜水气单胞菌的抑杀作用机理 955 对照组菌体细胞的内膜和外膜结构完整, 轮廓层次清晰致密, 胞内内容物充实且分布均匀, 细胞边缘光滑, 圆润 ( 如图 6A 所示 ) CP7ACP 处理 S12, 30 min 后细胞内容物出现溶解, 质壁分离, 细胞膜开始有破损, 细胞边缘及结构层次性模糊, 细胞变成不规则多边形, 细胞外围可见许多短线状的絮状物 ( 如图 6B 箭头所示 ); 1 h 后细胞壁破坏严重, 出现许多缺损, 细胞内结构模糊不清, 原有的微细结构紊乱甚至消失, 胞内内容物大量溢出, 形成大片空白区 ( 图 6C 箭头所示 ); 3 h 后细胞壁细胞膜破损更严重, 细胞变形, 出现很多缺口, 胞内内容物大量流失, 胞内空虚, 整个细胞处于崩溃状态 ( 图 6D 箭头所示 ) 3 讨论目前认为抗菌肽杀菌的作用机制主要是其作用于病原菌的细胞壁细胞膜, 进而形成有规则结构的离子通道, 胞浆完整性遭到破坏, 细胞内外离子不平衡, 使得离子或胞内内容物外泄, 最终引起细菌死亡 [19 21] [22] Harder 等认为人抗菌肽 β-defensin3 能够使细胞壁形成孔洞, 导致细菌死 [23] 亡徐进署等证明细胞膜结构是家蚕抗菌肽 CM4 攻击的首要靶点而 Melittin 和 Pandinin 是通过 α- 螺旋的疏水中心垂直插入到细胞膜内, 破坏细胞膜的正常结构 [24 25] 本研究通过扫描电镜观察发现, 受处理的菌体细胞表面变得粗糙, 细胞间出现粘连, 随着作用时间的延长, 细胞形态变形, 细胞表面出现明显缺损, 内容物外泄而塌陷, 菌体破裂, 菌体干瘪, 皱缩而坏死透射电镜观察细胞结构也明显看到, S12 的细胞壁受损, 出现孔洞 ; 细胞膜甚至溶解, 细胞器被破坏 Robert [26] [27] 等和 Reddy 等认为抗菌物质作用于菌体后引起细胞内无机磷 DNA 和蛋白质等生物大分子泄漏的原因是抗菌物质破坏了细胞壁, 继而破坏细胞膜, 细胞内大分子结构受到破坏, 生化级联反应被阻断, 从而导致胞内离子的外泄, DNA 和 RNA 等核酸物质的泄漏, 以及胞内 ATP 水解等, 使得受处理菌菌液中的磷 DNA 和核酸类物质含量增多本研究也发现受 CP7ACP 处理的 S12 菌体内无机磷和胞内生物大分子物质大量外泄, 且是在短时间内发生呈现急剧性的此外, Boman [28] [29] 等和 Chatterji 等认为抗菌肽通过与细菌 DNA 结合进而阻断 DNA 的合成也是抗菌肽杀菌的原因之一本研究发现 CP7ACP 使 S12 基因组 DNA 产生增色效应这可能是 CP7ACP 与 DNA 表面的磷酸基团作用, 或者 CP7ACP 部分结构嵌入到 DNA 分子沟槽中, 使 DNA 构象趋于松散变性综上所述, CP7ACP 的杀菌机制可能破坏 S12 的细胞壁和细胞膜, 使 S12 胞内无机磷和 DNA 等生物大分子外泄或者是抗菌物质进入胞内与基因组 DNA 发生结合, 引起细胞结构功能的破坏而导致细菌死亡的嗜水气单胞菌是在水体等环境中广泛分布的有害性细菌, 能够引起淡水鱼类败血症, 对水产养殖危害极大目前对该病的防治, 主要使用化学药物然而, 因长期大量使用抗生素等化学药品, 现已引起了许多病原菌产生了耐药性, 并产生残留, 影响了水产品的质量与食用安全为此, 采用生物防治技术或利用生物产物进行水产养殖动物嗜水气单孢菌感染症的预防和治疗受到越来越多的重视 CP7 菌株的发酵上清液有 Cpacin 抗菌肽多粘菌素类物质和 β-1,3-1,4- 葡聚糖酶等 3 种成分分别抵抗革兰氏阳性阴性菌和真菌, 本研究中的 CP7ACP 实际上包括以上 3 种物质在内的蛋白质混合物本研究利用 CP7ACP 体外作用嗜水气单胞菌, 研究表明 CP7ACP 能够抑制鱼嗜水气单胞菌在琼脂平板上生长, 扫描电镜和透射电镜可明显观察到 CP7ACP 能够抑杀鱼嗜水气单胞菌嗜水气单胞菌是革兰氏阴性菌, CP7ACP 中抑制革兰氏阴性菌的成分是多粘菌素

8 956 微生物学通报 2012, Vol.39, No.7 类物质因此认为 CP7 菌株是嗜水气单胞菌的拮抗菌, 其分泌的活性成分多粘菌素类物质能够强烈抑杀嗜水气单胞菌的生长, 可以考虑通过进一步的研究开发应用于防治鱼嗜水气单胞菌引起的病害参考文献 [1] 贾杰. 抗生素的耐药性与抗生素的应用 [J]. 中国热带医学, 2007, 7(9): [2] 单晓枫, 张洪波, 郭伟生, 等. 嗜水气单胞菌拮抗菌的筛选 [J]. 淡水渔业, 2007, 37(6): [3] 宋铁英, 郑伟文. 嗜水气单胞菌的拮抗菌及其拮抗物质测定 [J]. 福建农业科技, 1999(5): [4] 秦生巨, 舒泉. 噬菌蛭弧菌对嗜水气单胞菌裂解作用的研究 [J]. 中国微生态学杂志, 1991, 3(2): [5] 周飞, 刘娟, 黎德兵. 黄鳝嗜水气单胞菌的分离鉴定及中药体外抑菌效果研究 [J]. 中国畜牧兽医, 2010, 37(2): [6] 彭金菊, 马驿, 罗伟英, 等. 32 种中药及其复方对嗜水气单胞菌体外抑菌效果 [J]. 中兽医医药杂志, 2009(6): 5 7. [7] 张梁. 大蒜素对嗜水气单胞菌的药效学研究 [J]. 水利渔业, 2003, 23(6): [8] 刘训理, 王智文, 孙海新, 等. 圆孢芽孢杆菌 A95 抗菌蛋白的分离纯化及性质研究 [J]. 蚕业科学, 2006, 32(3): [9] 陈海英, 廖富蘋, 林健荣, 等. CP7 菌株的抗菌活性及菌种鉴定 [J]. 中国生物防治, 2007, 23( 增刊 ): [10] 廖富苹, 林健荣, 徐凤霞, 等. 一种新的杀菌肽及其产生菌株和用途 : 中国, [P]. 2008/ 01/16. [11] 陈海英, 廖富蘋, 林健荣. Paenibacillus polymyxa CP7 菌抗革兰氏阴性菌活性组分的分离和结构分析 [J]. 中国农业科学, 2009, 42(6): [12] 文凤云, 廖富蘋, 林健荣, 等. 多粘类芽孢杆菌 CP7 β-1, 3-1, 4- 葡聚糖酶基因的克隆表达及应用 [J]. 中国农业科学, 2010, 43(22): [13] Hultmark D, Steiner H, Rasmuson T, et al. Insect immunity. Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia[j]. European Journal of Biochemistry, 1980, 106(1): [14] 李仪奎. 中药药理实验方法学 [M]. 上海 : 上海科学技术出版社, 1991: [15] Newton BA. The release of soluble constituents from washed cells of Pseudomonas aeruginosa by the action of Polymyxin[J]. Microbiology, 1953, 9(1): [16] 陈念. 万隆霉素对细菌抑制作用机理的研究 [D]. 广州 : 华南农业大学硕士学位论文, [17] 邹文政, 张俊杰, 鄢庆枇, 等. 嗜水气单胞菌感染后牛蛙血清中抗菌物质的初步研究 [J]. 水产学报, 2007, 31(1): [18] 宫霞, 施用晖, 乐国伟. 抗菌活性肽与细菌染色体 DNA 的相互作用机理 [J]. 自然科学进展, 2004, 14(5): [19] Minahk CJ, Farías ME, Sesma F, et al. Effect of Enterocin CRL35 on Listeria monocytogenes cell membrane[j]. FEMS Microbiology Letters, 2000, 192(1): [20] 蒙显英, 黎起秦, 冯家勋, 等. 芽孢杆菌产生的抗菌物质的研究进展 [J]. 中国植保导刊, 2004, 24(12): [21] Dekker N, Cox RC, Kramer RA, et al. Substrate specificity of the integral membrane protease OmpT determined by spatially addressed peptide libraries[j]. Biochemistry, 2001, 40(6): [22] Harder J, Bartels J, Christophers E, et al. Isolation and characterization of human β-defensin-3, a novel human inducible peptide antibiotic[j]. Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(8): [23] 徐进署, 张双全. 家蚕抗菌肽 CM4 组分杀菌机理

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微生物学通报 Microbiology China 研究报告 NOV 20, 2010, 37(11): by Institute of Microbiology, CAS 茶多酚对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌机理 * 钱丽红陶妍

微生物学通报 Microbiology China 研究报告 NOV 20, 2010, 37(11): by Institute of Microbiology, CAS 茶多酚对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌机理 * 钱丽红陶妍微生物学通报 Microbiology China tongbao@im.ac.cn 研究报告 NOV 20, 2010, 37(11): 1628 1633 2010 by Institute of Microbiology, CAS 茶多酚对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌机理 * 钱丽红陶妍谢晶 ( 201306) 摘要 : 以革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性的铜绿假单胞菌为试验菌,