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虔公晏
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中国组织工程研究第 21 卷第 10 期 2017 04 08 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research April 8, 2017 Vol.21, No.

1 中国组织工程研究第 21 卷第 10 期出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research April 8, 2017 Vol.21, No.10 人 β- 防御素 3/ 聚乳酸 - 羟基乙酸缓释微球制备及体外释药性能研究原著孙治邦, 周义钦, 陈松, 吴海山 ( 解放军第二军医大学附属长征医院, 上海市 ) 引用本文 : 孙治邦, 周义钦, 陈松, 吴海山. 人 β- 防御素 3/ 聚乳酸 - 羟基乙酸缓释微球制备及体外释药性能 [J]. 中国组织工程研究,2017, 21(10): DOI: /j.issn ORCID: ( 孙怡邦 ) 文章快速阅读 : 人 β- 防御素 3/ 聚乳酸 - 羟基乙酸缓释微球的理化性质及体外释药特性改良复乳 - 溶剂挥发法制备人 β- 防御素 3/ 聚乳酸 - 羟基乙酸缓释微球表征分布体外释药行为微球表面形态微球粒径及分布释药特性及抗菌潜力文题释义 : 人防御素 -3: 是首先在银屑病患者的皮损组织中被发现的一种内源性小分子多肽, 后续的研究表明它在人体的上皮细胞和黏膜组织中均存在广泛的表达人防御素 -3 具有广谱的抗菌性能, 同时也有报道具有促进愈合抗肿瘤等多种特性体外释药性能 : 在体外对药物进行释放速率的监测, 以观察药物的释放特性, 判断药物的作用时间以及为后续用量提供参考孙治邦, 男,1988 年生, 安徽省六安市人, 汉族, 解放军第二军医大学在读硕士, 主要从事关节置换感染方面的研究通讯作者 : 吴海山, 博士, 教授, 解放军第二军医大学附属长征医院, 上海市中图分类号 :R318 文献标识码 :A 文章编号 : (2017) 稿件接受 : 摘要背景 : 目前, 关节置换后感染的治疗方法为早期的一期清创手术和标准的二期翻修手术, 单纯使用抗生素治疗疗效甚微, 课题组拟使用载药缓释微球来探索局部抑制感染治疗方法的可行性目的 : 观察人 β- 防御素 3/ 聚乳酸 - 羟基乙酸缓释微球的理化性质及体外释药特性方法 : 采用改良复乳 - 溶剂挥发法, 以聚乳酸 - 羟基乙酸为载体材料, 人 β- 防御素 3 为药物制备人 β- 防御素 3/ 聚乳酸 - 羟基乙酸缓释微球采用扫描电镜观察其表面形态, 标尺精确测量每个微球大小, 采用分光光度计测定微球的载药量和包封率, 通过测定人 β- 防御素 3/ 聚乳酸 - 羟基乙酸微球的缓释时间, 分析微球的体外释药特性结果与结论 :1 人 β- 防御素 3/ 聚乳酸 - 羟基乙酸缓释微球的表面光滑, 均匀分布, 流动性良好, 其平均粒径为 nm;2 人 β- 防御素 3 的载药量为 (20.67±0.17)%, 包封率为 (54.52±1.31)%;3 人 β- 防御素 3 的 25 d 累计释药量平均为 (74.12±0.43)%;4 结果表明, 人 β- 防御素 3/ 聚乳酸 - 羟基乙酸缓释微球的体外释药性能良好, 理论上可以达到缓释抗菌的目的, 为后续的动物抗菌实验研究奠定基础关键词 : 生物材料 ; 缓释材料 ;HBD-3/PLGA 缓释微球 ; 理化性质 ; 载药量 ; 包封率 ; 体外释药性能主题词 : β 防御素 ; 迟效制剂 ; 关节成形术, 置换 ; 感染 ; 组织工程基金资助 : 上海市卫生局课题 ( ), 课题名称 :β- 防御素 -3/ 聚乳酸聚乙醇酸缓释微球抑制人工关节术后生物膜形成的机制研究缩略语 : 人 β- 防御素 3:human Beta-defense-3,HBD-3; 聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物 :poly lactic-co-glycolic acid, PLGA Human beta defense 3/poly(lactic-co-glycolic acid) controlled-release microspheres preparation and in vitro releasing performance Sun Zhi-bang, Studying for master s degree, Changzheng Hospital, Second Military Medical University of PLA, Shanghai , China Sun Zhi-bang, Zhou Yi-qin, Chen Song, Wu Hai-shan (Changzheng Hospital, Second Military Medical University of PLA, Shanghai , China) Abstract BACKGROUND: A simple use of antibiotic drugs as anti-infection therapy after joint replacement is not enough for subsequent debridement and secondary revision surgeries. Therefore, our team intended to Corresponding author: Wu Hai-shan, M.D., Professor, Changzheng Hospital, Second Military Medical University of PLA, Shanghai , China 1514 P.O. Box 10002, Shenyang

2 confirm the feasible use of controlled-release microspheres in the local anti-infection treatment. OBJECTIVE: To prepare the Human beta defense 3 (HBD-3)/poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) micro-spheres and to investigate the microsphere physicochemical properties and drug release characteristics in vitro. METHODS: With PLGA as a carrier, HBD-3/PLGA controlled-release microspheres were prepared by using double emulsion-solvent evaporation method. Scanning electron microscopy was used to observe its surface morphology. The size of each microsphere was accurately determined using scaleplate. Drug loading capacity and encapsulation efficiency of HBD-3/PLGA controlled-release microspheres were calculated using spectrophotometer. HBD-3/PLGA microsphere controlled-release time was determined in order to analyze the drug release characteristics of the microsphere. RESULTS AND CONCLUSION: The HBD-3/PLGA controlled-release microsphere possessed smooth surface, uniform distribution and good liquidity. The average particle size was nm, the drug loading capacity of HBD-3 was (20.67±0.17)% and the encapsulation efficiency was (54.52±1.31)%. The cumulative release percentage of HBD-3 was (74.12±0.43)%. The HBD-3/PLGA controlled-release microsphere has well controlled-release performance in vitro. In theory, the purpose of antibacterial controlled-release can be achieved, laying a foundation for subsequent animal antibacterial experiments. Subject headings: beta-defensins; Delayed-Action Preparations;Arthroplasty, Replacement; Infection; Tissue Engineering Funding: the Project of Shanghai Health Bureau, No Cite this article: Sun ZB, Zhou YQ, Chen S, Wu HS. Human beta defense 3/poly(lactic-co-glycolic acid) controlled-release microspheres: preparation and in vitro releasing performance. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(10): 引言 Introduction 感染是人工关节置换后的一种灾难性并发症, 一旦发生会导致整个手术的彻底失败根据美国卫生保健顾问委员会的预测, 从 2006 到 2016 年, 美国年髋膝关节置换量从 91 万将增加到 130 万初次置换感染的比例在 1%-2%, 而翻修手术可高达 5.6% 随着中国老龄化社会的到来, 越来越多的患者将接受人工关节置换手术, 而关节置换后感染的数量也将会显著增加感染造成的社会经济负担和对患者及医护人员的心理影响已成为当今关节外科最重视的问题之一感染难以治愈的根本原因与假体表面生物膜的形成有关, 由于生物膜具有独特的结构, 可以帮助细菌逃避宿主的免疫机制及抗生素的攻击, 并且膜内细菌拥有严重的耐 [1] 药性, 有些耐药性可达同类浮游细菌的倍以上, 其 [2-4] 原因主要有 :1 细菌带负电荷, 可以限制大分子物质 ( 如抗生素补体和酶类 ) 的扩散 ;2 由于营养的缺乏和代谢产物的积累, 细菌进入休眠状态, 致使一些生长期杀菌的抗生素难以发挥作用, 这些细菌从生物膜内分离出后, 可迅速恢复对抗生素的敏感性 ;3 生物膜相当于一个低级进化的多细胞生物体, 其耐药基因更容易在其中传递现在临床上应用的抗生素并不能达到完全治愈感染的要求生物膜是细菌在生长过程中为适应生存环境而形成的一种与浮游细胞相对应的存在形式, 由细菌和它所形成的胞外多聚 [5] 物 (extracellular polymeric substance,eps) 组成它可附着在植入物表面形成一种高度组织化的多细胞结构, 是细菌的保护性生长方式, 这种黏附定植方式不仅利于细菌附着在植入物表面, 更重要的是, 与单个或混悬的菌细胞相比更易于抵抗宿主免疫细胞免疫分子和抗菌药物的攻击, 同时可增强毒理基因和耐药基因的传递, 这些结构和功能特点是其难以被消除的根本原因广义的抗菌肽是指具有抵抗病原微生物入侵, 清除体内突变细胞的一类小分子多肽这类小分子多肽能够在体内快速地合成并且大量存储, 是生物细胞特定基因编码经特定外界条件诱导产生的一类多肽除了能非特异性地杀灭真菌细菌病毒以外, 还能够在炎症反应的部位迅速聚集, 作为免疫反应的趋化因子, 抑制致病菌生成内毒 [6-10] 素等细胞因子尽管具有广谱的抗菌作用, 但是防御素家族中不同的成员具有不同的一级和高级结构, 它们的 [11] 抗菌谱自然也有差异人 β- 防御素 3(human Betadefense-3,HBD-3) 是由 45 个氨基酸组成的高度保守的抗菌肽, 它最早从银屑病患者的皮屑中被发现, 作为抗菌肽家族的新成员,HBD-3 被认为是最具有潜力的防御素类抗 [7] 菌肽, 对包括耐甲氧西林金葡菌和耐万古霉素金葡菌在内的所有需氧菌有极强的杀伤力, 同时它产生耐药性的可 [12-13] 能性极低因此 HBD-3 表现出了独有的优越性而具备研究和开发价值聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物 (poly lactic-co-glycolic acid,plga) 由乳酸和乙醇酸共聚而成, 是无刺激无毒的生物降解性聚合物, 在体内生物相容性好, 降解产物乳酸和羟基乙酸可参与人体的新陈代谢, 最终形成二氧化碳和水被排出体外, 因此是理想的绿色高分子材料微球作为药物载体已经成为热门研究方向, 它不仅能够实现药物释放速度的均匀化来延长药物的作用时间, 减少血药浓度的波动, 同时也能够减少使用药物的次数, [14] 减少药物不良反应发生的可能性, 提高药物的稳定性此前较多的实验使用复乳挥发法和改良复乳挥发法来制 [15-18] 作微球实验以 PLGA 为载体, 采用改良复乳挥发法制成 HBD-3/PLGA 缓释微粒, 随着微球的降解, 其携带的药物将会缓慢释放, 即可达到缓释的目的, 从而产生持久稳定 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 1515

3 的抗菌作用通过检测其理化性质及体外释药性能, 为后续动物体内局部抗菌实验奠定研究基础 1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计观察性研究 1.2 时间及地点于 2016 年 1 至 11 月在解放军第二军医大学组胚实验室完成 1.3 材料人 β- 防御素 3(HBD-3, 美国 Sigma 公司 ); 聚乳酸 - 羟基乙酸 (PLGA, 美国 Sigma 公司 );PBS (ph=7.4, 美国 Hyclone 公司 ); 生理盐水 ; 二氯甲烷 (DCM); 牛血清白蛋白 (BSA, 中国上海生工生物工程公司 ); 吐温 -20( 上海纪宁生物科技有限公司 ); 光学显微镜 (Olympus, 日本 );EVO HD 扫描电子显微镜 (SEM, 德国 Carl Zeiss);1901 系列紫外可见分光光度计 ( 中国北京普析通用有限责任公司 ); 高效液相色谱仪 ( 日立中国有限责任公司 ); 高速离心机 ( 中国凯达实验仪器有限公司 ); 高速搅拌机 ( 上海智威有限公司 ); 冷冻干燥机 ( 美国 Labconco 公司 ) 1.4 实验方法改良复乳 - 溶剂挥发法制备微球取 200 ml 生理盐水备用, 精确称取 10 mg HBD-3 溶解于其中将得到的 200 ml HBD-3 平均分成 2 份备用, 取其中 1 份 100 ml 溶液, 加入 5 g 牛血清白蛋白作为保护剂, 搅拌均匀, 形成内水相精确量取 0.7 ml 二氯甲烷备用, 称取 100 mg PLGA 晶体溶解于其中并搅拌均匀得到油相将上述得到的内水相和油相在冰浴中超声乳化 (200 W,60 s) 得到初乳量取 10 ml 外水相 ( 含 1% 聚乙烯醇 0.5% 吐温 -20), 将初乳溶解于其中, 并在高速搅拌机 (800 r/min 条件下 ) 中搅拌 4 h, 使溶剂充分挥发, 将得到的液体过滤, 过滤物使用蒸馏水冲洗 3 次, 在真空条件下冻干, 使用相同的实验条件及步骤制备 5 份, 得到的微球粉末置于 4-8 条件下储存, 备用微球粒径分布及表面形态学观察精确称取前述步骤制得的 HBD-3/PLGA 缓释微球 5 mg, 在玻片上均匀铺开, 光学显微镜观察, 镜下用标尺随机测量 200 个缓释微球的直径, 得到缓释微球的粒径分布图表精确称取 HBD-3/PLGA 缓释微球 5 mg, 在冷冻干燥机下干燥, 喷金, 通过扫描电镜观察 HBD-3/PLGA 缓释微球并拍照记录微球载药量和包封率的测定取 5 ml 二氯甲烷, 称取制得的缓释微球 5 mg 放入其中溶解, 另取 5 ml HCl 将得到的溶液进行萃取, 放入高速离心机, 在 r/min 条件下离心, 取最上层的液体, 并使用稀盐酸同样萃取 3 次, 萃取液备用 HBD-3 的标准浓度 - 吸光度曲线的绘制方法 :1 使用电子天平精确称取 10 mg HBD-3 干粉, 将并溶解于 200 ml 二氯甲烷溶液中, 充分溶解均匀后备用 ;2 使用移液器量取上述备用溶液分别为 0.5,1,2,4,8,10 ml 放入 20 ml 容量瓶中, 均加入二氯甲烷至 20 ml 满刻度, 这样就得到 1.25,2.5,5,10,20,25 mg/l 的 HBD-3 溶液, 另外单独准备 1 份单纯二氯甲烷溶液作为空白对照 ;3 使用分光光度计在 214 nm 波长处, 分别测出第 2 步制得的不同质量浓度 HBD-3 溶液的吸光度值, 将得到的吸光度值 (A) 做浓度 (C) 的线性回归方程, 得到 A= C ,R 2 = , 表明线性关系良好将之前得到的 3 份萃取液分别放入分光光度计中, 在 214 nm 波长处测定吸光度值, 把得到的数值带入标准曲线的方程中, 计算出 HBD-3 质量浓度, 取平均值 HBD-3/PLGA 缓释微球载药量和包封率通过以下公式计算得到 : 载药率 =( 微球中含有 HBD-3 的质量 / 微球的总质量 ) 100%; 包封率 =( 微球中含有 HBD-3 的质量 / 制备微球时 HBD-3 的投药量 ) 100% 微球的体外释药行为精确称取 3 份 1 mg HBD-3/ PLGA 缓释微球, 装入透析袋中, 加入 1 ml ph=7.4 的 PBS 溶液在 37 的水浴恒温振荡器内将透析袋放置于 10 ml PBS 中, 于 0.125,0.25,0.5,1,2,3,6,9,12,15, 18,25 d 的准确时间分别取出洗提液 5 ml, 同时向缓冲液中补入 5 ml PBS 取出的洗提液使用液相色谱仪计算出药物的释放量, 再计算累计释放量, 以累计的释放百分比为 Y 轴, 以缓释的时间点为 X 轴, 做出缓释的累计释放百分比曲线 1.5 主要观察指标 HBD-3/PLGA 缓释微球的粒径包封率载药率以及缓释实验中每个阶段的释放量 1.6 统计学分析使用 SPSS 17.0 统计软件对所得数据进行分析处理, 以 P=0.05 为检验水准 2 结果 Results 2.1 HBD-3/PLGA 缓释微球粒径分布及表面形态冷冻干燥后获得的 HBD-3/PLGA 缓释微球外观为乳白色粉末, 在光镜下观察, 缓释微球的表面光滑, 均匀分布, 流动性良好扫描电子显微镜下观察, 可见缓释微球光滑饱满规整, 分布均匀, 无明显粘连, 见图 1 微球粒径分布于 nm, 平均粒径为 nm, 粒径相对集中, 分布差异不大, 具体结果见图 HBD-3/PLGA 缓释微球载药量和包封率 HBD-3/ PLGA 载药微球的载药量为 (20.67±0.17)%, 包封率为 (54.52±1.31)% 2.3 HBD-3/PLGA 缓释微球的体外释药情况从表 1 可以看出,HBD-3/PLGA 缓释微球的释药情况相对均匀, 前 3 d 的释放量将近 50%, 第 6 天的累计释药量平均为 (54.21±3.40)%, 在第 25 天时累计的药物释放量平均达到 (74.12±0.43)%, 通过缓释载体能够有效使药物的释放时间延长, 维持局部药物浓度, 使缓释的性能得到优化, 保证每个阶段 HBD-3 的释放量相对维持在稳定水平, 缓释曲线见图 P.O. Box 10002, Shenyang

60 50 图注 : 微球分布均匀, 无明显粘连, 粒径相对一致数量 ( 个 ) 40 30 20 10 图 1 HBD-3/PLGA 缓释微球扫描电镜图 ( 15 000) Figure 1 Scanning electron micrographs of human beta defense 3/ poly(lactic-co-glycolic acid)

4 60 50 图注 : 微球分布均匀, 无明显粘连, 粒径相对一致数量 ( 个 ) 图 1 HBD-3/PLGA 缓释微球扫描电镜图 ( ) Figure 1 Scanning electron micrographs of human beta defense 3/ poly(lactic-co-glycolic acid) controlled-release microspheres ( ) 粒径 (nm) 图 2 HBD-3/PLGA 缓释微球的粒径分布 Figure 2 Particle size distribution of human beta defense 3/ poly(lactic-co-glycolic acid) controlled-release microspheres 时间 (d) 图 3 HBD-3/PLGA 缓释微球累计释放百分比微球累计释放百分比 (%) Figure 3 The cumulative release percentage of human beta defense 3/poly(lactic-co-glycolic acid) controlled-release microspheres at each stage 表 1 HBD-3/PLGA 缓释微球每个阶段的释药量及累计释放百分比 ( x±s) _ Table 1 Release drug amount and cumulative release percentage of human beta defense 3/poly(lactic-co-glycolic acid) controlled-release microspheres at each stage 时间 (d) 每个阶段释放量 (μg) 累计释放量 (%) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 讨论 Discussion 随着外科手术技术假体材料以及生物力学方面的不断进步, 人工关节置换术已经成为治疗骨性关节炎类风湿性关节炎以及股骨头坏死等严重关节病变的常规治疗方案手术后的良好效果和长时间的随访结果也使患者及医生感到满意然而, 自从人工关节置换术开展以来, 感染一直是最严重也是最难治疗的并发症尽管抗生素的出现, 使人类在对抗细菌中占据了上风, 但是近年来, 高度耐药菌多重耐药菌甚至超级细菌的出现, 使得感染的治疗越来越困难常规的静脉使用抗生素及关节置换中使用抗生素骨水泥对于关节置换手术来说, 大部分起到的是预防感 [19] 染作用对于关节置换后细菌感染的治疗, 由于生物膜的存在, 临床上常用的抗生素也收效甚微手术治疗也以二期翻修手术为主因此, 发现一种新型的抗菌药物及抗菌手段具有重要的意义 HBD-3 的表面为正电荷, 同时含有螺旋结构, 能够在细菌的细胞膜上形成通道, 使细菌的细胞质不断渗出而死 [20] 亡此外它还具有以下特点:1 抗菌谱广, 对 G + G - 以及真菌都有很高的杀灭效果 ;2 杀菌快速, 大多数抗菌肽都可以在 5 min 内引起细胞死亡 ;3 不产生耐药性 ;4 无致畸作用 ;5 不易产生蓄积中毒 HBD-3 是非盐离子浓度敏感性的, 也就是说对于低生理盐浓度, 正常生理盐浓度和略高于生理盐浓度的情况, 它都能表现良好的抗菌活性, 因此它对于因局部盐浓度过高而引起其他抗菌肽失效的患者可望有好的抗菌作用同时在生理盐水浓度范围内, 即使使用高于抗菌浓度几十倍的用量, 它也不会攻击真核细胞, 即不会引起其他抗菌肽可能出现的溶血, 体现出 HBD-3 [21] 在临床上的抗菌作用具有极大的开发价值 HBD-3 于 2006 年在人体骨组织和骨细胞中被发现, 跟进的研究表明正常骨组织中的浓度过低以至于不能起到抗菌作用, 但是有研究表明感染灶周围的组织中 HBD-3 的浓度远远高于血浆浓度, 而这种释放的机制可能是机体抵抗感染的表现, [22] 分泌的细胞后来被证实为巨噬细胞和血管内皮细胞, 课题组下一步的研究同样是希望能够模拟缓释条件, 制出缓释微粒, 局部使用后进一步提高 HBD-3 的浓度, 达到抗感染的目的 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 1517

5 PLGA 经美国 FDA 批准可用于临床上的多种疾病, 其在人体内生物相容性好, 产生的降解产物无毒无害, 作为医用生物类的可吸收高分子材料, 它是目前研究的活跃领域, 除了用作医用缝合线骨科内固定材料组织工程支架以外, 还可以作为药物缓释的载体, 不仅能够搭载传统 [23-24] 药物, 还能够搭载包括蛋白抗体等生物药物使用 PLGA 制成的微球粒径均匀, 对其他药物的载药率包封 [25-27] 率均良好实验以 PLGA 为载体, 制成 HBD-3/PLGA 缓释微球, 探索其治疗人工关节置换后细菌感染及抑制生物膜形成的可行性, 并为其抑制人工关节置换后生物膜形成的体外研究打下基础实验探索 HBD-3/PLGA 缓释微球理化性质及释药规律微球制成后成型率好, 平均粒径为 nm, 分布相对集中缓释微球的包封率及载药量是评价缓释性能的重要指标 HBD-3/PLGA 缓释微球的载药量为 (20.67± 0.17)%, 包封率为 (54.52±1.31)% HBD-3 在 25 d 的累计释放量平均为 (74.12±0.43)%, 从数据结果可以看出, 缓释微球在前 3 d 的突释比较明显, 可能与微球表面的药物突然溶解有一定关系, 从第 6 天开始, 释放 HBD-3 的速度开始趋于平缓, 这样的缓释性质可以在局部维持一定的药物浓度并且保持下去 HBD-3 对于金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为 15 mg/l, 而防御素的抗菌活性与很多因素均有密切关系, [28] 如温度存放时间酸碱度均会影响其抗菌活性, 缓释微球的制备工艺可能需要进一步改善, 其中乳化剂浓度种类, 水油相体积比以及 PLGA 在二氯甲烷中的浓度均对 [29] 微球的大小及形态有影响而超声乳化的时间长短是影响微球包封率的主要因素之一, 时间越长, 包封率也越高, [30] 但是药物的性能也会受到影响此外, 有研究在复乳挥发法的基础上, 内水相中加入海藻酸钠, 外水相中加入氯化钙提高了微球的包封率和载药量, 但是该研究的方法使 [31] 微球的内部孔洞较大, 孔径分布不均当然, 水油相体积比聚乙烯醇的质量分数以及 HBD-3 和 PLGA 的投药配比对载药量和包封率的影响应该也是存在的, 需要进一步研究来得到最优化的制作比例, 目前尚无相关研究报道在微球的释放性能方面, 制备方法微球的理化性质微球的载药量和外界环境的温度对突释的性能有明显的影 [32-40] 响实验以 PLGA 作为载体,HBD-3 为抗菌药物来制备缓释微球, 其载药及缓释效果达到了初步预期的效果理论上可以为后期人工关节置换后局部抗感染的研究提供实验基础但是研究的结果依然存在载药量低缓释量不足缓释时间不足等缺点, 仍然需要进一步研究完善微球的制作工艺最佳配比, 以提高载药量及缓释时间, 为后续的动物实验以及临床试验奠定基础现在市场上使用 PLGA 作为缓释载体的药物并不多, 同时目前 HBD-3 的高昂价格也不利于其在临床广泛应用 1518 致谢 : 感谢上海长征医院关节外科吴宇黎教授的帮助作者贡献 : 实验设计为吴海山陈松孙治邦, 实验实施为孙治邦陈松, 实验评估为周义钦, 资料收集为孙治邦利益冲突 : 所有作者共同认可文章无相关利益冲突伦理问题 : 文章的撰写与编辑修改后文章遵守了国际医学期刊编辑委员会学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范文章查重 : 文章出版前已经过 CNKI 反剽窃文献检测系统进行 3 次查重文章外审 : 文章经国内小同行外审专家双盲外审, 符合本刊发稿宗旨作者声明 : 第一作者对于研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任论文中涉及的原始图片数据 ( 包括计算机数据库 ) 记录及样本已按照有关规定保存分享和销毁, 可接受核查文章版权 : 文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议开放获取声明 : 这是一篇开放获取文章, 文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议根据知识共享许可协议署名 - 非商业性使用 - 相同方式共享 3.0 条款, 在合理引用的情况下, 允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑调整和扩展, 同时允许任何用户阅读下载拷贝传递打印检索超级链接该文献, 并为之建立索引, 用作软件的输入数据或其它任何合法用途 4 参考文献 References [1] 吴宇黎, 王继芳. 感染人工关节周围生物膜对细菌影响的研究 [J]. 中华外科杂志,1997,35(8): [2] 吴宇黎, 李晓华, 钱齐荣, 等. 感染性人工关节生物膜中细胞外多粘质物质对抗生素的影响 [J]. 中国矫形外科杂志, 2002,9(10): [3] Esteban J, Molina-Manso D, Spiliopoulou I,et al. Biofilm development by clinical isolates of Staphylococcus spp. from retrieved orthopedic prostheses.acta Orthop. 2010;81(6): [4] Al-Ahmad A, Wiedmann-Al-Ahmad M, Faust J, et al. Biofilm formation and composition on different implant materials in vivo. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2010;95(1): [5] 吴宇黎, 王继芳, 卢世璧, 等. 大剂量灌注冲洗对感染性假体表面生物膜中细胞外多粘质物质 (ESS) 的影响 [J]. 中国矫形外科杂志, 2001,8(8): [6] 吴宇黎, 王继芳, 卢世璧, 等. 假体表面感染性生物膜中细胞外多粘质物质对淋巴细胞和多形核白细胞功能的影响 [J]. 第二军医大学学报,2001,22(z1): [7] Bruellhoff K, Fiedler J, Möller M, et al. Surface coating strategies to prevent biofilm formation on implant surfaces. Int J Artif Organs. 2010;33(9): [8] Zanger P, Holzer J, Schleucher R, et al. Severity of Staphylococcus aureus infection of the skin is associated with inducibility of human beta-defensin 3 but not human beta-defensin 2. Infect Immun. 2010;78(7): [9] Hirsch T, Spielmann M, Zuhaili B, et al. Human beta-defensin-3 promotes wound healing in infected diabetic wounds. J Gene Med. 2009;11(3): [10] Reichel M, Heisig A, Heisig P, et al. Skin bacteria after chlorhexidine exposure-is there a difference in response to human beta-defensin-3. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2010; 29(6): [11] 李冠楠, 夏雪娟, 隆耀航, 等. 抗菌肽的研究进展及其应用 [J]. 动物营养学报,2014,26(1): P.O. Box 10002, Shenyang

6 [12] Warnke PH, Springer IN, Russo PA, et al. Innate immunity in human bone. Bone. 2006;38(3): [13] Dhople V, Krukemeyer A, Ramamoorthy A. The human beta-defensin-3, an antibacterial peptide with multiple biological functions. Biochim Biophys Acta. 2006;1758(9): [14] 韩敏, 苏秀霞, 李仲谨. 载药微球制剂的研究进展 [J]. 应用化工, 2007,36(5): [15] Karal-Yılmaz O, Serhatlı M, Baysal K, et al. Preparation and in vitro characterization of vascular endothelial growth factor (VEGF)-loaded poly(d,l-lactic-co-glycolic acid) microspheres using a double emulsion/solvent evaporation technique. J Microencapsul. 2011;28(1): [16] 罗字燕, 张永明, 吴传斌. 一种聚乳酸聚乙醇酸缓释微球的制备工艺 [J]. 中国医院药学杂志,2011,31(11) : [17] 罗宇燕, 李姝瑾, 张永明. 聚乳酸聚乙醇酸微球体外突释的影响因素的研究 [J]. 今日药学,2011,21(4): [18] Yang F, Song FL, Pan YF, et al. Preparation and characteristics of interferon-alpha poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres. J Microencapsul. 2010;27(2): [19] Thomes B, Murray P, Bouchier-Hayes D. Development of resistant strains of Staphylococcus epidermidis on gentamicin-loaded bone cement in vivo. J Bone Joint Surg Br. 2002;84(5): [20] Wilmes M, Cammue BP, Sahl HG, et al. Antibiotic activities of host defense peptides: more to it than lipid bilayer perturbation. Nat Prod Rep. 2011;28(8): [21] Schibli DJ, Hunter HN, Aseyev V, et al. The solution structures of the human beta-defensins lead to a better understanding of the potent bactericidal activity of HBD3 against Staphylococcus aureus. J Biol Chem. 2002;277(10): [22] Levón J, Al-Samadi A, Mackiewicz Z, et al. Human beta-defensin-3 producing cells in septic implant loosening. J Mater Sci Mater Med. 2015;26(2):98. [23] Ford Versypt AN, Pack DW, Braatz RD. Mathematical modeling of drug delivery from autocatalytically degradable PLGA microspheres--a review. J Control Release. 2013; 165(1): [24] Qi F, Wu J, Fan Q, et al. Preparation of uniform-sized exenatide-loaded PLGA microspheres as long-effective release system with high encapsulation efficiency and bio-stability. Colloids Surf B Biointerfaces. 2013;112: [25] Wang Y, Li P, Kong L. Chitosan-modified PLGA nanoparticles with versatile surface for improved drug delivery. AAPS Pharm Sci Tech. 2013;14(2): [26] 李卫红, 司鹏, 雷文. 药用合成高分子缓控释材料研究进展 [J]. 高分子通报,2015(1): [27] Astete CE, Sabliov CM. Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles. J Biomater Sci Polym Ed. 2006;17(3): [28] 高飞, 赵燕. 重组人 β 防御素 -3 抗菌活性及影响因素的研究 [J]. 生物学通报, 2016,51(6): [29] 钱婷玉, 崔爱军, 彭松, 等. 聚乳酸 - 羟基乙酸 (PLGA) 及其载药微球的制备研究 [J]. 化工新型材料,2015,43(12): [30] 孙美丽, 班俊峰, 黄思玉, 等.PLGA 微球的载药量和包封率的影响因素及控制 [J]. 广东药学院学报,2011,27(6): [31] 罗宇燕, 麦海燕, 黎呐, 等. 复乳法及其改良法制备的干扰素 PLGA 微球载药释药特性的对比 [J]. 中山大学学报 : 自然科学版, 2014,53(3): [32] Qian F, Ni N, Burton LS, et al. Sustained release subcutaneous delivery of BMS , a GLP-1 receptor peptide agonist, via a zinc adduct. Int J Pharm. 2009;374 (1-2): [33] Xuan J, Lin Y, Huang J, et al. Exenatide-loaded PLGA microspheres with improved glycemic control: in vitro bioactivity and in vivo pharmacokinetic profiles after subcutaneous administration to SD rats. Peptides. 2013;46: [34] Zaky A, Elbakry A, Ehmer A, et al. The mechanism of protein release from triglyceride microspheres. J Control Release. 2010;147(2): [35] Wang Y, Gu B, Burgess DJ. Microspheres prepared with PLGA blends for delivery of dexamethasone for implantable medical devices. Pharm Res. 2014;31(2): [36] Gu B, Burgess DJ.Prediction of dexamethasone release from PLGA microspheres prepared with polymer blends using a design of experiment approach.int J Pharm. 2015; 495(1): [37] Zolnik BS, Burgess DJ.Evaluation of in vivo-in vitro release of dexamethasone from PLGA microspheres.j Control Release. 2008; 127(2): [38] Zolnik BS, Leary PE, Burgess DJ.Elevated temperature accelerated release testing of PLGA microspheres.j Control Release. 2006; 112(3): [39] Liu B, Dong Q, Wang M, et al.preparation, characterization, and pharmacodynamics of exenatide-loaded poly(dl-lactic-co-glycolic acid) microspheres.chem Pharm Bull (Tokyo). 2010; 58(11): [40] Lim SM, Eom HN, Jiang HH, et al. Evaluation of PEGylated exendin-4 released from poly (lactic-co-glycolic acid) microspheres for antidiabetic therapy.j Pharm Sci. 2015; 104(1): ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 1519

% TFA 1. 0 ml rahp-pl- min nm GA AUFS 20 μl LC 20A Eclipse XDB-C mm 250 mm Ag- % = / + ilent ALPHA 2-4 PL

% TFA 1. 0 ml rahp-pl- min nm GA AUFS 20 μl LC 20A Eclipse XDB-C mm 250 mm Ag- % = / + ilent ALPHA 2-4 PL - * 孙海燕, 方科伟, 刘冬 518055 制备重组降血压肽 ( rahp, 氨基酸序列为 VLPVPR) 缓释微球以不同单体比和相对分子质量的乳酸 - 羟基乙酸共聚物 ( PLGA) 为缓释材料, 利用正交设计优化微球制备的最佳工艺条件, 并考察微球的体外释药特性乳酸 - 羟基乙酸共聚物相对分子质量越小, 微球粒径越小 ( P < 0. 05), 孔隙率越高 ; 乳酸 - 羟基乙酸共聚物中乳酸比例越大,