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浪刹怀
5 years ago
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1 ICS B 44 DB33 浙江省地方标准 DB33/T 实验动物长爪沙鼠第 1 部分 : 微生物控制等级及监测 Laboratory animal Mongolian gerbil Part1: Microbiological standards and monitoring 发布实施浙江省质量技术监督局发布

3 前言实验动物长爪沙鼠分为七个部分 : 第 1 部分 : 微生物控制等级及监测 ; 第 2 部分 : 寄生虫控制等级及监测 ; 第 3 部分 : 遗传质量控制 ; 第 4 部分 : 组织病理检查规程 ; 第 5 部分 : 配合饲料营养成分 ; 第 6 部分 : 环境及设施 ; 第 7 部分 : 饲养管理规程本部分为实验动物长爪沙鼠的第 1 部分本部分依据 GB/T 给出的规则起草本部分由浙江省科技厅提出并归口本部分起草单位 : 浙江省医学科学院杭州师范大学本部分主要起草人 : 褚晓峰戴方伟宋晓明王吉周莎桑岳秉飞李巍杜江涛郭红刚应华忠萨晓婴本部分为首次发布 I

5 实验动物长爪沙鼠第 1 部分 : 微生物控制等级及监测 1 范围本部分规定了实验动物长爪沙鼠 (Mongolian gerbil) 微生物学等级分类检测要求检测程序检测方法检测规则结果判定和检测结论等本部分适用于实验动物长爪沙鼠微生物控制等级及监测 2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件, 其最新版本 ( 包括所有的修改单 ) 适用于本文件 GB 实验动物微生物学等级及监测 GB/T 实验动物沙门菌检测方法 GB/T 实验动物皮肤病原真菌检测方法 GB/T 实验动物多杀巴斯德杆菌检测方法 GB/T 实验动物支气管鲍特杆菌检测方法 GB/T 实验动物支原体检测方法 GB/T 实验动物鼠棒状杆菌检测方法 GB/T 实验动物泰泽病原体检测方法 GB/T 实验动物大肠埃希菌检测方法 GB/T 实验动物嗜肺巴斯德杆菌检测方法 GB/T 实验动物肺炎克雷伯杆菌检测方法 GB/T 实验动物金黄色葡萄球菌检测方法 GB/T 实验动物肺炎链球菌检测方法 GB/T 实验动物乙型溶血性链球菌检测方法 GB/T 实验动物绿脓杆菌检测方法 GB/T 实验动物淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒检测方法 GB/T 实验动物汉坦病毒检测方法 GB/T 实验动物小鼠肝炎病毒检测方法 GB/T 实验动物仙台病毒检测方法 GB/T 实验动物小鼠肺炎病毒检测方法 GB/T 实验动物呼肠孤病毒 III 型检测方法 GB/T 实验动物小鼠脑脊髓炎病毒检测方法 GB/T 实验动物小鼠细小病毒检测方法 GB/T 实验动物无菌动物生活环境及粪便标本的检测方法 GB/T 实验动物细菌学检测标本采集 GB/T 实验动物细菌学检测染色法培养基和试剂 1

6 GB/T 实验动物酶联免疫吸附试验 GB/T 实验动物免疫酶试验 GB/T 实验动物免疫荧光试验 GB/T 实验动物血凝抑制试验 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件 3.1 长爪沙鼠 Mongolian gerbil (Meriones unguieulataus) 经人工饲育, 对其携带的病原微生物和寄生虫实行控制, 遗传背景明确或者来源清楚, 用于科学研究教学生产和检定以及其他科学实验的长爪沙鼠 3.2 普通级长爪沙鼠 conventional (CV) Mongolian gerbil 不携带重要人兽共患病病原和烈性传染病病原 3.3 清洁级长爪沙鼠 clean (CL) Mongolian gerbil 除普通级应排除的病原外, 不携带对科学实验干扰大的病原 3.4 无特定病原体级长爪沙鼠 specific-pathogen free(spf)mongolian gerbil 除清洁级动物应排除的病原外, 不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验产生干扰的病原 3.5 无菌级长爪沙鼠 germ free(gf)mongolian gerbil 利用现有的生物学技术, 无可检出的一切生命体 4 缩略语 ELISA: 酶联免疫吸附试验 HAI: 间接血凝试验 IEA: 免疫酶试验 IFA: 免疫荧光试验 5 长爪沙鼠等级 2

7 根据对病原微生物和寄生虫控制的程度, 长爪沙鼠分为普通级清洁级无特定病原体级和无菌级四个等级, 各等级的具体控制指标见表 1 表 2 6 检测要求 6.1 临床观察外观检查无异常 6.2 微生物检测项目微生物检测项目分为必须检测项目和必要检测项目必须检测项目是在进行长爪沙鼠质量评价时必须检测的项目在引进种源和疑有本病流行时, 除必须检测项目外, 需增加必要检测项目病原菌检测项目按表 1 执行, 病毒检测项目按表 2 执行表 1 长爪沙鼠病原菌检测项目动物等级病原菌检测项目检测要求普沙门菌 Salmonella spp. 通清级皮肤病原真菌 Pathogenic dermal fungi 洁泰泽病原体 Tyzzer's organism 无菌级无特定病原体级级支原体 Mycoplasma spp. 多杀巴斯德杆菌 Pasteurella multocida 支气管鲍特杆菌 Bordetella bronchiseptica 大肠埃希菌 0115a,c:K(B)Escherichia coli 0115a,c:K(B) 嗜肺巴斯德杆菌 Pasteurella pneumotropica 肺炎克雷伯杆菌 Klebsiella pneumonia 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 鼠棒状杆菌 Corynebacterium kutscheri 绿脓杆菌 Pseudomonas aeruginosa 肺炎链球菌 Streptococcus pnemoniae 乙型溶血性链球菌 β-hemolytic Streptococcus 产酸克雷伯杆菌 Klebsiella oxytoca 螺杆菌 Helicobacter spp. 幽门螺旋杆菌 Helicobacter pylori 用现有的生物学技术, 无可检出的病原菌注 : 为必须检测项目, 为必要检测项目 3

8 表 2 实验动物长爪沙鼠病毒检测项目动物等级病毒检测项目检测要求无菌级普汉坦病毒 Hantavirus (HV) 无通清淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒 Lymphocytic Choriomeningitis Virus 特级洁 (LCMV) 定级病仙台病毒 Seandai Virus (SV) 原体小鼠肝炎病毒 Mouse Hepatitis Virus (MHV) 级小鼠肺炎病毒 Pneumonia Virus of Mice (PVM) 呼肠孤病毒 III 型 Reovirus type Ⅲ (Reo-3) 小鼠细小病毒 Minute Virus of Mice (MVM) 小鼠脑脊髓炎病毒 Theiler's Mouse Encephalomyelitis Virus (TMEV) 用现有的生物学技术, 无可检出的病毒注 : 为必须检测项目 7 检测程序检测程序按图 1 执行在采样时, 结合临床症状和实验室检查结果, 需要进一步确证的, 可取特定样本进行检测编号外观检查麻醉采样皮肤取样真菌检查采血分离血清, 病原抗体检查无菌解剖, 取器官分泌物肠内容物 ( 新鲜粪便 ) 脏器等样本细菌检查检测结果判定检测报告图 1 检测程序 4

9 8 检测方法检测方法见表 3 表 3 长爪沙鼠微生物检测方法微生物检测项目方法沙门菌 GB/T 皮肤病原真菌 GB/T 多杀巴斯德杆菌 GB/T 支气管鲍特杆菌 GB/T 支原体 GB/T 鼠棒状杆菌 GB/T 泰泽病原体 GB/T 大肠埃希菌 GB/T 嗜肺巴斯德杆菌 GB/T 肺炎克雷伯杆菌 GB/T 金黄色葡萄球菌 GB/T 肺炎链球菌 GB/T 乙型溶血性链球菌 GB/T 绿脓杆菌 GB/T 小鼠细小病毒见附录 A 汉坦病毒见附录 B 小鼠肝炎病毒见附录 C 小鼠肺炎病毒见附录 D 呼肠孤病毒 III 型见附录 E 仙台病毒见附录 F 淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒见附录 G 9 检测规则 9.1 检测频率普通级清洁级和无特定病原体级长爪沙鼠 : 每三个月至少检测一次无菌级长爪沙鼠 : 每年至少检测一次每 2 周 ~4 周检查一次动物的生活环境标本和粪便等标本 9.2 采样方式选择 12 周龄以上的长爪沙鼠用于检测, 随机取样 ; 新鲜粪便样本应在饲养单元中选取至少 4 个点随机取样微生物的采样应当与寄生虫采样联合进行 5

10 9.2.2 方法采样方法按照标准 NY/T 541 进行数量根据实验动物长爪沙鼠群体大小, 采样数量见表 4 血液采样不少于 1 毫升 / 只 ; 每个隔离器采样不少于 2 只动物表 4 采样数量群体大小 ( 只 ) < ~500 >500 采样数量不少于 5 只不少于 10 只不少于 15 只 9.3 送检要求样本要求有明显标识, 包装完好, 安全送达实验室, 送检单应写明检品名称品系等级数量及检测项目等内容 10 结果判定 10.1 抗体检查待检血清经 ELISA IEA IFA 或 HAI 检测, 血清特异性抗体阴性判为合格 10.2 病原体检查待检样品经分离培养和鉴定, 未见病原体判为合格 11 结论与报告按照相应的等级控制要求, 所有项目的检测结果均为阴性, 判为合格报告应包括检测结果检验结论等内容 6

11 附录 A ( 规范性附录 ) 长爪沙鼠的小鼠细小病毒 (MVM) 检测方法 A.1 原理根据免疫学原理, 采用 MVM 抗原检测长爪沙鼠血清中 MVM 抗体 A.2 主要试剂和器材 A,2,1 试剂 A ELISA 抗原 A 特异性抗原 MVM 接种小鼠胚胎 (ME) 或 3T3 细胞, 加维持液培养 7 d~10 d, 当细胞病变达 +++~++++ 时收获, 冻融三次或超声波处理后, 低速离心去除细胞碎片, 上清液再经超速离心浓缩后制成 ELISA 抗原 A 正常抗原 ME 或 3T3 细胞冻融破碎后, 经低速离心去除细胞碎片而获得的上清液 A 抗原片 MVM 接种大鼠胚胎 (RE) 或 ME 细胞, 培养 7 d~10 d, 病变达 ++~+++ 时, 将细胞用胰酶消化分散, 用 PBS 洗涤, 涂片室温干燥的同时, 冷丙酮固定 10 min,-20 保存 A 阳性血清 MVM 抗原免疫 SPF 级长爪沙鼠所获得的抗血清 A 阴性血清 SPF 级长爪沙鼠血清 A 酶结合物辣根过氧化物酶标记羊抗长爪沙鼠 IgG 抗体或兔抗长爪沙鼠 IgG 抗体用于检测相应动物血清抗体 A 荧光抗体异硫氰酸荧光素标记羊抗长爪沙鼠 IgG 抗体或兔抗长爪沙鼠 IgG 抗体 A.2.2 器材主要有酶标仪荧光显微镜 37 培养箱或水浴箱 A.3 检测方法 7

12 采用 ELISA 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测采用 IEA 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测采用 IFA 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测 A.4 结果判断血清特异性抗体阴性判为合格 8

13 附录 B ( 规范性附录 ) 长爪沙鼠的汉坦病毒 (HV) 检测方法 B.1 原理根据免疫学原理, 采用 HV 抗原检测长爪沙鼠血清中 HV 抗体 B.2 主要试剂和器材 B.2.1 试剂 B ELISA 抗原 B 特异性抗原在生物安全柜内, 用 Hantaan 型或 Seoul 型毒株感染的 E6 细胞, 当特异性荧光达 +++ 时, 即可收获培养物冻融三次或超声波处理后, 低速离心去除细胞碎片, 上清液再经超速离心浓缩后制成 ELISA 抗原 B 正常抗原 E6 细胞冻融破碎后, 经低速离心去除细胞碎片而获得的上清液 B 抗原片生物安全柜内, 用 Hantaan 型或 Seoul 型毒株感染的 E6 细胞, 每 2 d~3 d 更换维持液, 培养 7 d~ 10 d, 用 IFA 法测定细胞内特异性荧光当荧光达 +++ 时, 将细胞用胰酶分散, 用 PBS 洗涤, 涂片室温干燥的同时, 在紫外线下 20 cm 处照射 30 min, 冷丙酮固定 10 min,-20 保存 B 阳性血清用 β - 丙内脂灭活 HV 抗原, 免疫 SPF 级长爪沙鼠所获得的抗血清 B 阴性血清 SPF 级长爪沙鼠血清 B 酶结合物辣根过氧化物酶标记羊抗长爪沙鼠 IgG 抗体或兔抗长爪沙鼠 IgG 抗体用于检测相应动物血清抗体 B 荧光抗体异硫氰酸荧光素标记羊抗长爪沙鼠 IgG 抗体或兔抗长爪沙鼠 IgG 抗体, 用于检测相应动物血清抗体 B.2.2 器材主要有酶标仪荧光显微镜 37 培养箱或水浴箱 9

14 B.3 检测方法采用 ELISA 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测采用 IFA 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测 B.4 结果判断血清特异性抗体阴性判为合格 10

15 附录 C ( 规范性附录 ) 长爪沙鼠的小鼠肝炎病毒 (MHV) 检测方法 C.1 原理根据免疫学原理, 采用 MHV 抗原检测长爪沙鼠血清中 MHV 抗体 C.2 主要试剂和器材 C.2.1 试剂 C ELISA 抗原 C 特异性抗原 MHV( 包括 MHV1 MHV3 MHV-A59 MHV-JHM 四个毒株 ) 感染 DBT 或 L929 细胞, 接种后 2 d~4 d, 病变达 +++~++++ 时收获冻融三次或超声波处理后, 低速离心去除细胞碎片, 上清液再经超速离心浓缩后制成 ELISA 抗原 C 正常抗原 DBT 或 L929 细胞细胞冻融破碎后, 经低速离心去除细胞碎片而获得的上清液 C 抗原片 MHV 感染 DBT 或 L929 细胞, 接种后 2 d~4 d, 病变达 ++~+++ 时收获, 将细胞用胰酶分散, 用 PBS 洗涤, 涂片室温干燥后, 冷丙酮固定 10 min,-20 保存 C 阳性血清 MHV 抗原免疫 SPF 级长爪沙鼠所获得的抗血清 C 阴性血清 SPF 级长爪沙鼠血清 C 酶结合物辣根过氧化物酶标记羊抗长爪沙鼠 IgG 抗体或兔抗长爪沙鼠 IgG 抗体用于检测相应动物血清抗体 C 荧光抗体异硫氰酸荧光素标记羊抗长爪沙鼠 IgG 抗体或兔抗长爪沙鼠 IgG 抗体, 用于检测相应动物血清抗体 C.2.2 器材主要有酶标仪荧光显微镜 37 培养箱或水浴箱 11

16 C.3 检测方法采用 ELISA 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测采用 IEA 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测采用 IFA 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测 C.4 结果判断血清特异性抗体阴性判为合格 12

17 附录 D ( 规范性附录 ) 长爪沙鼠的小鼠肺炎病毒 (PVM) 检测方法 D.1 原理根据免疫学原理, 采用 PVM 抗原检测长爪沙鼠血清中 PVM 抗体 D.2 主要试剂和器材 D.2.1 试剂 D ELISA 抗原 D 特异性抗原 PVM 感染小鼠, 待发病后取肺脏, 研磨, 制成 10% 悬液,3000 rpm 离心 10 min 后取上清液感染 BHK21 细胞, 吸附 1.5 h~2 h, 加维持液培养 10 d~14 d, 当细胞病变达 +++ 时收获, 冻融三次或超声波处理后, 低速离心去除细胞碎片, 上清液再经超速离心浓缩后制成 ELISA 抗原 D 正常抗原 BHK21 细胞冻融破碎后, 经低速离心去除细胞碎片而获得的上清液 D 抗原片用 PVM 感染的 BHK21 细胞, 培养 5 d~7 d, 病变达 ++~+++ 时, 将细胞用胰酶消化分散, 用 PBS 洗涤, 涂片室温干燥后, 冷丙酮固定 10 min,-20 冷保存 D 阳性血清 PVM 免疫 SPF 级长爪沙鼠所获得的抗血清 D 阴性血清 SPF 级长爪沙鼠血清 D 酶结合物辣根过氧化物酶标记羊抗长爪沙鼠 IgG 抗体或兔抗长爪沙鼠 IgG 抗体用于检测相应动物血清抗体 D 荧光抗体异硫氰酸荧光素标记羊抗长爪沙鼠 IgG 抗体或兔抗长爪沙鼠 IgG 抗体, 用于检测相应动物血清抗体 D.2.2 器材主要有酶标仪荧光显微镜 37 培养箱或水浴箱 13

18 D.3 检测方法采用 ELISA 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测采用 IEA 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测采用 IFA 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测 D.4 结果判断血清特异性抗体阴性判为合格 14

19 附录 E ( 规范性附录 ) 长爪沙鼠的呼肠孤病毒 III 型 (Reo3) 检测方法 E.1 原理根据免疫学原理, 采用 Reo3 抗原检测长爪沙鼠血清中 Reo3 抗体 E.2 主要试剂和器材 E.2.1 试剂 E ELISA 抗原 E 特异性抗原用 Reo3 感染的 BSC-1 或 BHK21 细胞, 当病变达 +++~++++ 时, 收获培养物冻融三次或超声波处理后, 低速离心去除细胞碎片, 上清液再经超速离心浓缩后制成 ELISA 抗原 E 正常抗原 BSC-1 或 BHK21 细胞冻融破碎后, 经低速离心去除细胞碎片而获得的上清液 E 抗原片用 Reo3 感染的 BSC-1 或 BHK21 细胞, 每 4 d~5 d, 病变达 ++~+++ 时, 将细胞用胰酶分散, 用 PBS 洗涤, 涂片室温干燥的同时, 在紫外线下 20 cm 处照射 30 min, 冷丙酮固定 10 min,-20 + 保存 E 阳性血清 Reo3 免疫 SPF 级长爪沙鼠所获得的抗血清 E 阴性血清 SPF 级长爪沙鼠血清 E 酶结合物辣根过氧化物酶标记羊抗长爪沙鼠 IgG 抗体或兔抗长爪沙鼠 IgG 抗体用于检测相应动物血清抗体 E 荧光抗体异硫氰酸荧光素标记羊抗长爪沙鼠 IgG 抗体或兔抗长爪沙鼠 IgG 抗体, 用于检测相应动物血清抗体 E.2.2 器材主要有酶标仪荧光显微镜 37 培养箱或水浴箱 E.3 检测方法 15

20 采用 ELISA 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测采用 IFA 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测采用 IEA 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测 E.4 结果判断血清特异性抗体阴性判为合格 16

21 附录 F ( 规范性附录 ) 长爪沙鼠的仙台病毒 (SV) 检测方法 F.1 原理根据免疫学原理, 采用 SV 抗原检测长爪沙鼠血清中 SV 抗体 ; 或根据 SV 在一定条件下, 能凝集鸡豚鼠红细胞这种凝集红细胞的能力可被特异性所抑制的原理, 检测长爪沙鼠血清中的 SV 抗体 F.2 主要试剂和器材 F.2.1 试剂 F ELISA 抗原 F 特异性抗原用 SV 感染 SPF 鸡胚尿囊腔, 培养于 36 温箱,72 h 后收冻于 4, 次日无菌收取尿囊液,4 以 2000 rpm 离心 10 min, 用 0.5% 鸡或豚鼠红细胞和 SV 阳性血清做血凝和血凝抑制试验, 验证其病毒特异性和血凝效价上清液再经过超速离心浓缩后制成 ELISA 抗原 F 正常抗原 9 d 龄 SPF 鸡胚尿囊液 F 抗原片用 SV 感染的 BHK21 细胞, 接种后 2 d~3 d, 病变达 ++~+++ 时用胰蛋白酶消化分散, 用 PBS 洗涤, 涂片室温干燥后, 冷丙酮固定 10 min,-20 保存 F 血凝素见 ELISA 特异性抗原制备 F 阳性血清 SV 免疫 SPF 级长爪沙鼠所获得的抗血清 F 阴性血清 SPF 级长爪沙鼠血清 F 酶结合物辣根过氧化物酶标记羊抗长爪沙鼠 IgG 抗体或兔抗长爪沙鼠 IgG 抗体用于检测相应动物血清抗体 F 荧光抗体异硫氰酸荧光素标记羊抗长爪沙鼠 IgG 抗体或兔抗长爪沙鼠 IgG 抗体, 用于检测相应动物血清抗体 17

22 F.2.2 器材主要有酶标仪荧光显微镜 37 培养箱或水浴箱 F.3 检测方法采用 ELISA 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测采用 IFA 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测采用 IEA 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测采用 HAI 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测 F.4 结果判断血清特异性抗体阴性判为合格 18

23 附录 G ( 规范性附录 ) 长爪沙鼠的淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒 (LCMV) 检测方法 G.1 原理根据免疫学原理, 采用 LCMV 抗原检测长爪沙鼠血清中 LCMV 抗体 G.2 主要试剂和器材 G.2.1 试剂 G ELISA 抗原 G 特异性抗原用 LCMV 感染的 Vero 细胞, 当特异性荧光达 +++~++++ 时, 收获培养物冻融三次或超声波处理后, 低速离心去除细胞碎片, 上清液再经超速离心浓缩后制成 ELISA 抗原 G 正常抗原 Vero 细胞冻融破碎后, 经低速离心去除细胞碎片而获得的上清液 G 抗原片用 LCMV 感染的 E6 细胞, 每 2 d~3 d 更换维持液, 培养 7 d~10 d, 用 IFA 法测定细胞内特异性荧光当荧光达 ++~+++ 时, 将细胞用胰酶消化分散, 用 PBS 洗涤, 涂片室温干燥的同时, 在紫外线下 20 cm 处照射 30 min, 冷丙酮固定 10 min,-20 保存 G 阳性血清用 β- 丙内脂灭活 LCMV 抗原, 免疫 SPF 级长爪沙鼠所获得的抗血清 G 阴性血清 SPF 级长爪沙鼠血清 G 酶结合物辣根过氧化物酶标记羊抗长爪沙鼠 IgG 抗体或兔抗长爪沙鼠 IgG 抗体用于检测相应动物血清抗体 G 荧光抗体异硫氰酸荧光素标记羊抗长爪沙鼠 IgG 抗体或兔抗长爪沙鼠 IgG 抗体, 用于检测相应动物血清抗体 G.2.2 器材主要有酶标仪荧光显微镜 37 培养箱或水浴箱 19

24 G.3 检测方法采用 ELISA 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测采用 IFA 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测采用 IEA 方法 ( 见 GB/T ) 进行血清学检测 G.4 结果判断血清特异性抗体阴性判为合格 20

GB : Laboratory animals—Microbiological standards and monitoring

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