中华人民共和国出入境检验检疫 行业标准 食品中多种致病菌快速检测方法 犘犆犚法 SN/T 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街 16 号邮政编码 : 网址 电话 : 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本

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1 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 食品中多种致病菌快速检测方法犘犆犚法 犚犪狆犻犱犱犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱狊犳狅狉狆犪狋犺狅犵犲狀狊犻狀犳狅狅犱狊 犘犆犚犿犲狋犺狅犱 发布 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布

2 中华人民共和国出入境检验检疫 行业标准 食品中多种致病菌快速检测方法 犘犆犚法 SN/T 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街 16 号邮政编码 : 网址 电话 : 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本 /16 印张 1 字数 25 千字 2007 年 6 月第一版 2007 年 6 月第一次印刷印数 书号 : 定价 元

3 前 言 本标准的附录 A 是规范性附录, 附录 B 附录 C 和附录 D 是资料性附录 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 本标准起草单位 : 中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局 中华人民共和国汕头出入境检验检疫局 中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局 中国合格评定国家认可委员会 大连产品质量检验所 中华人民共和国青岛出入境检验检疫局 中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局 中华人民共和国浙江出入境检验检疫局 深圳太太基因工程有限公司 本标准起草人 : 卢行安 许业莉 曹际娟 李苏龙 谢昭聪 朱海 李宏 郑卫平 秦成 王刚 刘艳泓 雷质文 刘中学 施伟良 孙杰 刘冉 郑秋月 段莹 张经纬 肖性龙 本标准系首次发布的检验检疫行业标准 Ⅰ

4 食品中多种致病菌快速检测方法犘犆犚法 1 范围 本标准规定了用普通 PCR 技术快速检测食品中沙门氏菌 志贺氏菌 金黄色葡萄球菌 小肠结肠炎 耶尔森氏菌 单核细胞增生李斯特氏菌 空肠弯曲菌 肠出血性大肠埃希氏菌 O157 H7 副溶血性弧 菌 霍乱弧菌和创伤弧菌的方法 ; 用 BAX? 1) 全自动致病菌 PCR 检测系统检测食品中沙门氏菌 单核细 胞增生李斯特氏菌 空肠弯曲菌 肠出血性大肠埃希氏菌 O157 H7 和阪崎肠杆菌的方法 本标准适用于食品中沙门氏菌 志贺氏菌 金黄色葡萄球菌 小肠结肠炎耶尔森氏菌 单核细胞增生 李斯特氏菌 空肠弯曲菌 肠出血性大肠埃希氏菌 O157 H7 副溶血性弧菌 霍乱弧菌和创伤弧菌的 检验 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件, 其随后所有 的修改单 ( 不包括勘误的内容 ) 或修订版均不适用于本标准, 然而, 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件, 其最新版本适用于本标准 GB/T 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 GB/T 食品微生物学检验 志贺氏菌检验 CB/T 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验 GB/T 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验 GB/T 食品微生物学检验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验 GB/T 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验 GB/T 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验 GB/T 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB19489 实验室 生物安全通用要求 SN0170 出口食品中沙门氏菌检验方法 SN0172 出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法 SN0173 出口食品副溶血性弧菌检验方法 SN0174 出口食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌检验方法 SN0175 出口食品中空肠弯曲菌检验方法 SN0184 出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法 SN/T0973 进出口肉及肉制品中肠出血性大肠杆菌 O157 H7 检验方法 SN/T1022 出口食品中霍乱弧菌检验方法 WS/T230 临床诊断中聚合酶链反应 (PCR) 技术的应用 ISO6579 微生物学 沙门氏菌检验方法指南 ISO 食品和动物饲料微生物学 单核细胞增生李斯特氏菌定性和定量检测方法 第 1 部分 : 定性检测方法 1) 为美国杜邦公司 (DuPontQualicon) 的产品 1

5 ISO16654 食品和动物饲料微生物学 大肠杆菌 O157 检测方法 NMKLNo.156 北欧食品协会食品中致病性弧菌定性和定量检测方法 FDA/BAM Chapter5 美国食品药品管理局微生物学分析手册第 2 章沙门氏菌 FDA/BAM Chapter9 美国食品药品管理局微生物学分析手册第 9 章弧菌 FDA/BAM Chapter10 美国食品药品管理局微生物学分析手册食品中单核细胞增生李斯特氏菌定性和定量检测方法 USDA/FSIS MLG4C.01 美国农业部食品安全检验局生肉 畜胴体擦拭样品 整鸡淋洗液 即食食品 禽肉制品和巴氏蛋制品中沙门氏菌 BAX PCR 筛选方法 USDA/PSIS MLG8A.01 美国农业部食品安全检验局单核细胞增生李斯特氏菌 BAX 筛选方法 3 缩略语下列缩略语适合于本标准 3.1 犘犆犚狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀聚合酶链反应, 简称 PCR 3.2 犱犖犜犘犱犲狅狓狔狉犻犫狅狀狌犮犾犲狅狊犻犱犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧核苷三磷酸 3.3 犱犃犜犘犱犲狅狓狔犪犱犲狀狅狊犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧腺苷三磷酸 3.4 犱犌犜犘犱犲狅狓狔犵狌犪狀狅狊犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧鸟苷三磷酸 3.5 犱犆犜犘犱犲狅狓狔犮狔狋犻犱犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧胞苷三磷酸 3.6 犱犜犜犘犱犲狅狓狔狋犺狔犿犻犱犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧胸苷三磷酸 3.7 犱犝犜犘犱犲狅狓狔狌狉犻犱犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧尿苷三磷酸 3.8 犛犇犛狊狅犱犻狌犿犱狅犱犲犮狔犾狊狌犾犳犪狋犲十二烷基硫酸钠 3.9 犜狉犻狊狋狉犻狊 ( 犺狔犱狉狅狓狔犿犲狋犺狔犾 ) 犪犿犻狀狅犿犲狋犺犪狀犲三 ( 羟甲基 ) 氨基甲烷 3.10 犇犈犘犆焦碳酸乙二酯 2

6 3.11 犜犪狇酶犜犪狇 DNA 聚合酶 3.12 犝犖犌酶 uracildnaglycosylase 尿嘧啶 DNA 糖基酶 4 生物安全措施为了保护实验室人员的安全, 应由具备资格的工作人员检测沙门氏菌, 所有培养物和废弃物应小心处置 并按 GB19489 中的有关规定执行 5 防污染措施参照标准 临床诊断中聚合酶链反应 (PCR) 技术的应用 (WS/T230) 中第 6 章污染的预防和控制 6 试剂和材料除另有规定外, 所有试剂均采用分析纯 6.1 水 : 应符合 GB/T6682 中一级水的规格 6.2 DNA 提取液 : 主要成分是 SDS,Tris,EDTA PCR 缓冲液 [ 其中氯化钾 (KCl):500mmol/L;Tris HCl(pH8.3):100mmol/L; 明胶 :0.1%] 6.4 PCR 反应液 : 含氯化镁 (MgCl 2 ) 的 PCR 缓冲液 datp dttp dctp dgtp dutp 犜犪狇酶 UNG 酶 6.5 琼脂糖 上样缓冲液 : 含 0.25% 溴酚蓝,0.25% 二甲苯青 FF,30% 甘油水溶液 TAE 缓冲液 : 称取 484gTris, 量取 114.2mL 冰醋酸,200mL0.5mol/LEDTA (ph:8.0), 溶于水中, 定容至 2L 分装后高压灭菌备用 6.8 DNA 分子量标记物 (100bp~1000bp) 6.9 Eppendorf 管和 PCR 反应管 6.10 mlst Vm 肉汤 : 阪崎肠杆菌检测用, 参见附录第 D.1 章 6.11 BHI 肉汤 : 阪崎肠杆菌检测用, 参见附录第 D.2 章 6.12 常见致病菌 ( 沙门氏菌 志贺氏菌 金黄色葡萄球菌 小肠结肠炎耶尔森氏菌 单核细胞增生李斯特氏菌 空肠弯曲菌 肠出血性大肠埃希氏菌 O157 H7 副溶血性弧菌 霍乱弧菌和创伤弧菌 ) 普通 2) PCR 检测试剂盒 ( 试剂盒组成 功能及使用注意事项参见附录 B) 6.13 BAX? 沙门氏菌的 PCR 检测试剂盒 (Qualicon # , 试剂盒组成参见附录 C),5 ±3 放置 6.14 BAX? 单核细胞增生李斯特氏菌 PCR 检测试剂盒 (Qualicon # ),5 ±3 放置 6.15 BAX? 弯曲菌的 PCR 检测试剂盒 (Qualicon # ),5 ±3 放置 6.16 BAX? 系统肠出血性大肠杆菌 O157 H7 多重 (MP)PCR 筛选试剂盒 (Qualicon # ) 6.17 BAX? 系统肠出血性大肠杆菌 O157 H7(MP)PCR 快速检测增菌培养基 (Qualicon # , ) 2) 由指定单位提供, 给出这一信息是为了方便本标准的使用者, 并不表示对该产品的认可 如果其他等效产品具有相同的效果, 则可使用这些等效的产品 3

7 6.18 BAX? 阪崎肠杆菌的 PCR 检测试剂盒 (Qualicon # ),5 ±3 放置 7 仪器和设备 7.1 PCR 仪 7.2 电泳装置 7.3 凝胶分析成像系统 7.4 PCR 超净工作台 7.5 高速台式离心机 ( 离心转速 12000r/min 以上 ), 台式离心机 ( 离心转速 2000r/min) 7.6 微量可调移液器 (2μL 10μL 100μL 1000μL) 7.7 BAX? 全自动致病菌检测系统 ( 启动包 ) 第一法 普通犘犆犚法 8 检测程序 普通 PCR 方法检测程序见图 1 图 1 犘犆犚检测致病菌程序图 9 操作步骤 9.1 样品制备 增菌培养和分离 沙门氏菌按照 GB/T 或 SN0170 或 ISO6579 或 FDA/BAM Chapter5 或 USDA/FSIS MLG4C.01 方法进行 志贺氏菌按照 GB/T 方法进行 金黄色葡萄球菌可按照 GB/T 或 SN0172 方法进行 小肠结肠炎耶尔森氏菌可按照 GB/T 或 SN0174 方法 4

8 9.1.5 单核细胞增生李斯特氏菌可按照 GB/T 或 SN 0184 或 ISO11290 或 FDA/BAM Chapter10 或 USDA/FSIS MLG8A.01 方法进行 空肠弯曲菌按照 GB/T 或 SN0175 方法进行 肠出血性大肠埃希氏菌 O157 H7 按照 GB/T 或 SN/T0973 或 ISO16654 方法进行 副溶血性弧菌按照 GB/T 或 SN0173 或 FDA/BAMChapter9 或 NMKLNo.156 方法进行 霍乱弧菌按照 SN/T1022 或 FDA/BAM Chapter9 或 NMKLNo.156 方法进行 创伤弧菌按照 FDA/BAM Chapter9 或 NMKLNo.156 方法进行 9.2 细菌模板犇犖犃的提取 直接提取法 对于上述方法培养的增菌液, 可直接取该增菌液 1mL 加到 1.5mL 无菌离心管中,8000r/min 离 心 5min, 尽量吸弃上清 ; 加入 50μLDNA 提取液 ( 参见附录 B), 混匀后沸水浴 5min,12000r/min 离 心 5min, 取上清保存于 -20 备用以待检测 -70 可长期保存 对于 9.1 方法分离到的可疑菌落, 可直接挑取可疑菌落, 加入 50μLDNA 提取液, 再按照上述步骤制备模板 DNA 以待检测 有机溶剂提纯法 取待测样本 ( 增菌培养液或分离菌落菌悬液 )1mL, 加到 1.5mL 离心管中,8000r/min 离心 4min, 尽量吸弃上清 ; 加入 750μLDNA 提取液, 沸水浴 5 min, 加酚 三氯甲烷 (1 1, 体积比 )700μL, 振荡 混匀,13000r/min 离心 5min, 去上清液,70% 乙醇冲洗一次,13000r/min 离心 5min, 沉淀溶于 20μL 核酸溶解液中 保存在 -20 备用 -70 可长期保存 也可使用等效的商业化的 DNA 提取试剂盒并按其说明提取制备模板 DNA 9.3 犘犆犚扩增 引物的序列 引物的序列见附录 A 空白对照 阴性对照和阳性对照设置 空白对照设为以水代替 DNA 模板 ; 阴性对照采用非目标菌的 DNA 作为 PCR 反应的模板 ; 阳性对照采用含有检测序列的 DNA( 或质粒 ) 作为 PCR 反应的模板 犘犆犚反应体系 普通 PCR 反应体系见表 1 表 1 普通犘犆犚反应体系 试剂 贮备液浓度 25μL 反应体系中加样体积 / μ L 10 PCR 缓冲液 2.5 氯化镁 (MgCl2) 25mmol/L 3.0 dntps( 含 dutp) 各 2.5mmol/L 1.0 UNG 酶 1U/ μ L 0.06 上游引物 下游引物 20pmol/ μ L 犜犪狇酶 5U/ μ L 0.5 DNA 模板 2.0 双蒸水 补至 25 注 1: 反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整 注 2: 每个反应体系应设置两个平行反应 5

9 9.3.4 犘犆犚反应参数 PCR 反应参数见附录 A 犘犆犚扩增产物的电泳检测用电泳缓冲液 (1 TAE) 制备 1.8% ~2% 琼脂糖凝胶 (55 ~60 时加入溴化乙锭至终浓度为 0.5μg/mL, 也可在电泳后进行染色 ) 取 8μL~15μLPCR 扩增产物, 分别和 2μL 上样缓冲液混合, 进行点样, 用 DNA 分子量标记物做参照 3V/cm~5V/cm 恒压电泳, 电泳 20min~40min, 电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存 10 结果判定和报告在阴性对照未出现条带, 阳性对照出现预期大小的扩增条带条件下, 如待测样品未出现相应大小的扩增条带, 则可报告该样品检验结果为阴性 ; 如待测样品出现相应大小扩增条带则可判定该样品结果为假定阳性, 则回到传统的检测步骤, 进一步应按 9.1 中该致病菌对应的标准检测方法进行确认, 最终结果以后者的检测结果为准 如果阴性对照出现条带和 /( 或 ) 阳性对照未出现预期大小的扩增条带, 本次待测样品的结果无效, 应重新做实验, 并排除污染因素 第二法? 犅犃犡全自动致病菌犘犆犚检测方法 11 适用范围 BAX? 全自动致病菌 PCR 检测方法, 包括食品中沙门氏菌 单核细胞增生李斯特氏菌 空肠弯曲菌 肠出血性大肠埃希氏菌 O157 H7 和阪崎肠杆菌的检测方法 12 原理 BAX 全自动致病菌检测系统是应用 PCR 技术检测食品中的致病菌的自动方法 扩增反应开始,BAX? 系统 PCR 片剂中的荧光染料就会与双链 DNA 结合, 光照时发出荧光信号 扩增反应后,BAX? 系统开始检测, 接着自动化的 BAX? 系统利用荧光检测来分析 PCR 产物, 从而得到阳性或阴性结果 13 检验程序 13.1 沙门氏菌 单核细胞增生李斯特氏菌 空肠弯曲菌 肠出血性大肠埃希氏菌 O157 H7 检测程序参见图 1( 没有电泳步骤 ) 13.2 BAX 阪崎肠杆菌 PCR 方法检测程序见图 2 14 操作步骤 14.1 样品增菌 沙门氏菌 单核细胞增生李斯特氏菌 空肠弯曲菌的样品制备 增菌培养和分离见 肠出血性大肠埃希氏菌 O157 H7 增菌方法按照 BAX? 系统 O157 H7 增菌培养基用户指导书进行 阪崎肠杆菌增菌 : 以无菌操作称取 25g 样品, 放入装有 225 ml mlst Vm 肉汤中, 混匀, 在 45 ±0.5 培养箱内培养 20h~22h; 取 10μL 上述增菌液加入 500μL 的 BHI 肉汤中,36 ±1 培养 3h 6

10 14.2 细菌模板犇犖犃的制备沙门氏菌 单核细胞增生李斯特氏菌 空肠弯曲菌 肠出血性大肠杆菌 O157 H7 和阪崎肠杆菌增菌肉汤或菌落的细菌模板 DNA 的制备按各自 BAX? 系统筛选的 PCR 分析试剂盒说明书进行? 14.3 犅犃犡系统致病菌的检测按照 BAX? 用户指导书来准备试剂, 进行检测和读取结果 图 2 犅犃犡阪崎肠杆菌犘犆犚方法检测程序 15 结果说明 15.1 BAX? 检测结果为阴性的样品可以出具阴性报告 15.2 检测结果显示为阳性的样品需要继续按照传统的方法进行确认 15.3 检测结果显示为不确定或错误时, 用 BAX? 系统重新进行检测 7

11 附录犃 ( 规范性附录 ) 犘犆犚检测的靶基因 引物序列和反应参数 表犃.1 犘犆犚检测的靶基因 引物序列和反应参数表 扩增片段致病菌靶基因名称引物序列长度 PCR 反应条件预变性扩增循环数后延伸 95,30s 5 gtgaaa tatcgccacgttcgggcaa 3 沙门氏菌犻狀狏犃 284bp 95,5min 64,30s 35 72,5min 5 tcatcgcaccgtcaaaggaacc 3 72,30s 95,15s 5 gtccttgaccgccttccgataccgtc 3 志贺氏菌犻狆犪犎 629bp 95,5min 65,30s 35 72,5min 5 gccggtcagccaccctctgagagtac 3 72,30s 94,2min 5 aaaaaagcacataacaagcg 3 金黄色葡萄球菌犳犲犿犃 132bp 94,5min 57,2min 35 72,7min 5 gataaagaagaaaccagcag 3 72,1min 95,30s 5 aataccgcataacgtctcg 3 小肠结肠炎耶尔森氏菌 16s 330bp 95,5min 52,1min 35 72,5min 5 ctctctgcgagtaacgtc 3 72,1min 95,30s 5 gatacagaaacatcggtggc 3 单增李斯特氏菌狆狉犳犃 274bp 95,5min 55,30s 35 72,5min 5 gtgtaatcttgatgccatcag 3 74,1min 95,30s 5 gatatgtatgat tatc tgc 3 空肠弯曲杆菌犞犛 1 358bp 95,5min 56,30s 35 72,5min 5 gaatgaaat tagaatgggg 3 72,30s 8

12 致病菌靶基因名称引物序列 肠出血性大肠埃希氏菌狉犳犫犈 O157 H7 5 atgcgctgaagccttg 3 5 cgagtacattggcatcgtg 3 副溶血性弧菌狋犾犺 5 aaagcggattatgcagaagcactg 3 5 gctacttctagcat tctctgc 3 霍乱弧菌狅犿狆犠 5 caccaagaaggtgac tatgtg 3 5 gaactataaccacccgcg 3 创伤弧菌狏狏犺犃 5 ccgcggtacagg tggcgca 3 5 cgccacccacttcgggcc 3 注 :PCR 反应参数可根据基因的扩增仪型号的不同进行适当的调整 表犃.1 ( 续 ) 扩增片段长度 PCR 反应条件预变性扩增循环数后延伸 95,15s 499bp 95,5min 55,30s 35 72,5min 72,1min 95,1min 450bp 95,5min 60,1min 35 72,5min 72,2min 95,30s 588bp 95,5min 64,30s 35 72,5min 72,30s 95,1min 519bp 95,5min 62,1min 35 72,5min 72,1min 9

13 附录犅 ( 资料性附录 ) 致病菌普通犘犆犚检测试剂盒 犅.1 试剂盒组成 每个试剂盒 ( 每个反应体系体积为 25μL) 成分见表 B.1 表犅.1 试剂盒成分组成成分规格 PCR 反应液犜犪狇酶 UNG 酶阳性对照阴性对照 1100μL 1 管 25μL 1 管 5μL 1 管 1mL 1 管 1mL 1 管 犅.2 说明 犅.2.1 PCR 反应液中含有特异性引物及各种离子 犅.2.2 核酸溶解液是去离子水, 用于溶解核酸 犅.3 使用注意事项 犅.3.1 严格执行行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检验实验室的管理规范 犅.3.2 本试剂盒仅用于体外检测, 操作人员应经过专业培训, 开始检测前要仔细阅读本说明书全文 犅.3.3 试剂盒内各试剂使用前, 充分融化后要稍事离心 反应液分装时应尽量避免产生气泡, 上机前 注意检查各反应管是否盖紧, 以免泄露污染仪器 10

14 附录犆 ( 资料性附录 )? 犅犃犡全自动致病菌犘犆犚检测试剂盒组成以沙门氏菌为例 ( 产品序列号 ;96 个测试 ) 犆.1 犘犆犚片剂 2 袋, 每个 PCR 管中一个片剂,12 个八联管 片剂包括检测反应和内置阳性对照反应所需的试剂 ( 有了内置阳性对照不需另设质控反应 ) 片剂重 7.6mg±0.1mg 犆.2 犘犆犚管盖 1 袋,12 个八联管盖 犆.3 裂解缓冲液 2 瓶,12mL/ 瓶 ;ph8.35±0.05(25 ), 用于制备工作裂解液 犆.4 蛋白酶溶液 1 瓶,400μL/ 瓶 用于制备工作裂解液

15 附录犇 ( 资料性附录 ) 培养基 2007 犛犖 / 犜 1869 犇.1 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 ( 犿犔犛犜 犞犿 ) 犇.1.1 成分 胰酪胨 20.0g 氯化钠 34.22g 乳糖 5.0g 磷酸氢二钾 2.75g 磷酸二氢钾 2.75g 月桂基硫酸钠 0.1g 万古霉素 0.01g 蒸馏水 mL 犇.1.2 制法 除万古霉素外将各成分加入蒸馏水中, 加热溶解, 调节 ph 至 6.8± 高压灭菌 15 min 万古霉素配成 10mg/mL 的溶液, 用 0.2μm 的滤膜过滤除菌 临用时, 取 1 ml 万古霉素溶液加到 1000mL mlst 中 犇.2 犅犎犐肉汤 犇.2.1 成分 犊牛脑 200.0g 牛心 250.0g 多价蛋白胨 10.0g 葡萄糖 2.0g 氯化钠 5.0g 磷酸氢二钠 2.5g 蒸馏水 mL 犇.2.2 制法 将除去结缔组织并绞碎的犊牛脑和牛心肌分别加水各 500mL, 搅拌, 放入 4 左右冰箱过夜, 次日 取出, 分别加热至 60 ~70 约 30min, 再煮沸约 1h, 搅拌并补充蒸发水分, 防止沉渣烧焦 用纱布过 滤, 再将两液混合于同一容器, 并补充水分至 1000mL, 加入其他成分, 适当加热使完全溶解, 调节 ph 至 7.4±0.2 再适当加热后过滤, 分装,121 灭菌 15min 书号 : 定价 : 元

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;54 ;1 ( ' ) Vol.54 No JournalofXiamenUniversity (NaturalScience) Jan.2015 doi: /j.issn RSTU V ; &! Y,,, [,2\ ;54 ;1 ( ' ) Vol.54 No.1 2015 1 JournalofXiamenUniversity (NaturalScience) Jan.2015 doi:10.6043/j.issn.0438 0479.2015.01.011 RSTU V ; &! Y,,, Z,@ [,2\] ( 8+ =,>^ E G,Y7,>^ 361102) ; : ( 犕狔犮犪犾犲狆犺狔犾狅狆犺犻犾犪

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