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1 第 7 章 真核生物的遗传分析 1. 真核生物基因组 2. 真核生物的遗传重组 3. 真核生物的基因转变 4. 真核生物的体细胞交换与基因定位 5. 真核生物基因的消除与扩增和重排

2 7.1 真核生物基因组 真核生物与原核生物细胞与基因组结构的区别原核生物 (prokaryote): 细胞中无核膜包围细胞核的生物, 如细菌 (bacterium) 蓝细菌 (cyano-bacterium) 等 细菌蓝细菌 真核细胞 真核生物 (eukaryote): 有核膜包围细胞核的生物, 如真菌 藻类 原生动物 植物和动物等

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4 真核生物与原核生物的主要区别是 : 1 真核生物遗传物质 DNA 与组蛋白结合构成核小体, 是构成染色体的基本结构单位 而原核生物的遗传物质是 DNA 或 RNA, 其染色体是单纯的 DNA 或 RNA 2 真核生物染色体一般为多条, 间期有核膜所包被而组成细胞核 原核生物的染色体往往只有一条, 没有膜包围, 形成拟核 3 真核生物基因组由核基因组和细胞器基因组组成, 核基因组为线性 DNA 分子 细胞器基因组主要有线粒体基因组和叶绿体基因组, 都为环状 DNA 分子 真核细胞内由膜间隔成许多功能区, 除细胞核外还有由膜包围的细胞器 原核生物基因组为环状 DNA 分子, 没有内膜系统, 细胞内未达到分区化 另外, 原核生物质粒 DNA 基因对细菌的生存往往不是必需的 4 真核生物的染色体上具有一个着丝粒, 在细胞分裂过程中出现纺锤体, 原核生物染色体无着丝粒, 在细胞分裂过程中则不会出现纺锤体, 而是采取二分或出芽方式进行分裂

5 (1)C 值悖理 真核生物基因组结构特点 一个物种单倍体的染色体数目及其所携带的全部基因称为该物种的基因组 ( genome) 基因组 DNA 测序的结果表明基因组中不仅包含着整套基因的编码序列, 同时还包含着大量非编码序列, 即基因之间的序列 这些序列同样包含着遗传指令 (genetic instruction) 因此, 基因组 ( 应该 ) 是整套染色体所包含的 DNA 分子以及 DNA 分子所携带的全部遗传指令 genome -- The complete set of sequences in the genetic material of an organism. It includes the sequence of each chromosome plus any DNA in organelles.( Genes Ⅹ)

6 生物体的单倍体基因组所含 DNA 总量称为 C 值 (C-value) 每种生物各有其相对恒定的 C 值不同物种的 C 值之间有很大差别 能营独立生活的最小的生物 枝原体 (Mycoplasma) 的 C 值不到 10 6 bp 一些显花植物和两栖类动物的 C 值则可多达 bp, 相差 10 万倍 C 值同生物的进化有什么关系? 生物的 C 值, 即基因组的 DNA 总量是不是随着生物的进化而相应地增加?

7 一方面 : 在一些低等生物中, 随着生物进化, 增加了生物体的结构和功能的复杂性, 基因组也相应地增大即 C 值 如蠕虫的 C 值大于霉菌 藻类 真菌 细菌和支原体

8 另一方面 : 随着进一步的进化, 在其他生物中则看不到这种规律 显花植物和两栖类动物的基因组最大两栖类动物 C 值小的 10 9 bp 大的 bp 软骨鱼 硬骨鱼甚至昆虫和软体动物的基因组都大于包括人类在内的哺乳动物的基因组 爬行类和棘皮动物的基因组大小同哺乳动物几乎相等

9 因此, 从总体上说 生物基因组的大小同生物在进化上所处的地位及复杂性之间无严格的对应关系, 这种现象称为 C 值悖理 (C-value paradox) C-value paradox: the lack of direct relationship between the C-value and phylogenetic complex. 人们对 C 值悖理已经提出许多解释 : 包括基因组的部分或完全加倍 转座 反转录已加工假基因 DNA 复制滑动 不等交换和 DNA 扩增等, Petrov 等又提出一个解释是 : 各种生物基因组的大小是由于基因组中长 期积累起来的过量的非编码 DNA 被清除的速率不同所造成的结果, 即 DNA 丢失的速率愈慢, 那么基因组 DNA 含量愈高

10 (2)N 值悖理 N(number of genes) 值悖理 (N-value paradox) 物种的基因数目与生物进化程度或生物复杂性的不对应性, 这被称之为 N 值悖理 (N-value paradox) G 值悖理 (G-value paradox)

11 面对由基因组测序和注释所揭示出来的线虫 果蝇 植物以及人等的有关蛋白质编码基因的数目如何进行解释? 比如 : 人的基因组 (3300Mb): 26,000 个左右的基因 ; 线虫 (C. elegans) 基因组 (97Mb):19,000 个基因 ; 果蝇 (D. melanogaster) 基因组常染色质部分的 120Mb : 13,600 个基因 ; 啤酒酵母 (S. cerevisiae) 基因组 (12Mb): 约 个基因 ; 水稻 (O. sativa) 基因组 (389Mb):37,544 蛋白质编码基因

12 非常明显, 果蝇基因组比线虫基因组大, 进化地位比线虫高, 而编码基因反而比线虫少 ; 人的基因组应该是最复杂的, 人的进化地位最高, 但编码的基因还没有水稻基因组的多 显然, 要理解每一个物种发育 代谢 生长 繁殖 行为等等的本质, 仅用基因组的序列测定的结果是不能直接地回答这些问题的 在对基因组进行注释后, 人们试图用基因组的结构和基因数目的多少来説明基因的功能以及各物种间的关系也不是一个简单的问题

13 (3) 真核生物基因组 DNA 序列的复杂性 真核生物基因组 DNA C 值和 N 值悖理现象都表明其 DNA 序列的复杂度, 为此可通过复性动力学来检测基因组 DNA 序列的复杂性 也就是通过 DNA 的变性 ( denaturation) 和复性 (renaturation) 反应的动力学过程分析 DNA 序列的性质, 由于复性的速率取决于互补的 DNA 序列之间的随机碰撞, 所以 DNA 复性是一个双分子二级反应

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15 2 DNA 复性动力学 基因组内单一序列和重复序列的组成可通过 DNA 复性动力学研究来确定 DNA 复性 : 当变性 DNA 的两条互补链在除去变性因素后, 可以重新或部分恢复成双螺旋结构 复性的必要条件 : 足够的盐浓度 ; 温度适中 ( 低于 Tm ) 复性过程缓慢 : 成核作用 拉链作用 当两条单链 DNA 接触时, 如果某个区段可以互补配对, 就先形成一个双链核心区, 然后扩展其互补配对区段而复性形成双链 复性过程很复杂, 但基本符合二级反应动力学 ds DNA k 1 k 2 2SS DNA 复性的速率可用下列公式表示 : dc/dt=-kc 2

16 这里,C 是在 t 时单链 DNA 的浓度,k 是二级反应常数 上述公式可以重排为 : -dc/c 2 =kdt 对上式积分整理得 : C/C 0 = 1/(1+kC 0 t) 这里 C 0 是 t=0 时 DNA 的初始浓度 这个公式表明反应中单链 DNA 所占百分数 (C/C 0 ) 是 DNA 浓度 (C 0 ) 同反应时间 (t) 乘积的函数, 通常用 C 0 t 来表示 在一个特定的实验中,C 0 是已知的,C 是可以测定的, 如 C/C 0 对 C 0 t 作图可以得到下图的曲线, 称为 C 0 t 曲线 ( 见图 5-4) 当 C/C 0 =0.5 即复性反应完成一半时 (t 1/2 ) 的 C 0 t 值定义为 C 0 t 1/2

17 基因组 A的 C0t1/ 2 基因组 B的 C0t1/ 2 = 基因组 A的核苷酸对数基因组 B的核苷酸对数 基因组 A的 C0t1/ 2 基因组 B的 C0t1/ 2 = 基因组 A的核苷酸对数基因组 B的核苷酸对数

18 当条件一定时 : C 0 t ½ 的大小与 DNA 的分子量及复杂性有关 (1)C 0 t ½ 越大, 表示复性速度越慢,DNA 的分子量越大 DNA 总量一定时, 基因组越复杂, 任何特定顺序的拷贝数就越少 例如,DNA 起始总量为 12pg, 一种细菌基因组大小为 0.004pg, 则它的各种顺序有 :12/0.004=3000 拷贝 另一种真核生物基因组大小 3pg, 12/3=4 拷贝 尽管测得的 C 0 绝对量相同是 12pg ( 核苷酸 mol/l) 而事实上后者各顺序的浓度比前者低了 3000/4=750( 倍 ) 要使该真核生物基因的拷贝数也达到 3000, 则要多加 750 倍的 DNA. 因此, 该真核生物 DNA 复性反应的 C 0 t ½ 是细菌 DNA 反应 C 0 t ½ 的 750 倍

19 (2) 在不存在重复序列的情况下,C 0 t ½ 值与基因组的大小 成正比, 也即与反应体系中的复杂度成正比 : X=K C 0 t ½ A. 在一般标准条件下 ( 阳离子浓度为 0.18 mol/l, 片段大小为 400bp) K = 则有 : X= C 0 t ½

20 B. 在非标准条件下, 通常用大肠杆菌 DNA 作为标准测定未知 DNA 的复杂度 : C 0 C t 1/ 2 0 t ( 欲测基因组 DNA) 复杂度 ( 欲测基因组 DNA) = 6 ( 大肠杆菌 DNA) bp 1/ 2 (3). 在有重复顺序的复性中, 在同一个复性曲线上的各动力学组分的 C 0 t 1/2 并不因基因组的大小而增减, 而是与 DNA 序列的重复频率成反比 : C 0 t ½ (1): C 0 t ½ (2)=f (2): f(1) 式中 (1) 和 (2) 代表两个不同的动力学组分,f 代表其重复频率 ( 拷贝数 ) 复性动力学研究表明 原核生物基因组的 C 0 t 曲线是单一的 S 形曲线 真核生物基因组的 C 0 t 曲线是多 S 形曲线, 由 若干个 ( 一般 2-3 个 )S 形加合成的曲线

21 如图 5-6 所示 : 求 A B C 的复杂性和各自的重复频率? 已知 : 基因组 : bp A: 25% C 0 t (A)1/2 = B: 30% C 0 t (B)1/2 = 1.9 C: 45% C 0 t (C)1/2 = 630 以上数值是从复性动力学曲线上查得 根据 : ( 在某一 S 曲线内的总长度 ) f 化学复杂长度动力学复杂长度 ( 在相应 S 曲线内的每个拷贝长度 ) 以大肠杆菌的 C 0 t ½ 为标准时有 : 待测样品的 DNA复杂性 = (E.coli C 0 t ½ = 4.0) 6 S (A) 样品 DNA C0t E.coil DNA C t 0 1/2 1/2 S (B) S (C)

22 求每一 S 的动力学复杂性 : C 0 t(c) 1/2 = %=283 C DNA 复杂性 = /4.0 = (bp) C 0 t(b) 1/2 = % =0.57 B DNA 复杂性 = /4.0 = (bp) C 0 t(a) 1/2 = % = A DNA 复杂性 = /4.0 =340(bp) S (A) S (B) S (C)

23 根据化学长度和复杂性求重复频率 : B 化学长度 = %=2.1x10 8 (bp) B 动力学长度 = (bp) f (B)= / = 350 A 化学长度 = % A 动力学长度 = 340 f(a)= % /340 = 由此可见, 在真核生物中复性反应最快的组分是一些高度重复序列, 复性反应次之的是中度重复序列, 复性反应最慢的组成则是单一序列以及在基因组中出现 2-3 份拷贝的一些序列

24 7.2 真核生物的遗传重组 遗传重组的概述遗传重组 (genetic recombination) 是 DNA 双螺旋间的遗 传物质断裂并发生重组, 从而改变基因组成和排列顺序, 导 致生物体的变异, 产生新的性状的过程 遗传重组不仅发生在细胞减数分裂过程中, 而且也发生 在高等真核生物的体细胞有丝分裂过程中 在核基因 叶绿 体基因或线粒体基因间也会发生基因重组 遗传重组可分为 : 同源重组 (homologous recombination) 位点专一性重组 (site-specific recombination) 异常重组 (illegitimate recombination)

25 同源重组是依赖于大范围的 DNA 同源序列间的联会, 重组可以发生在联会部分的任何位点上 如图 7-4 α- 地中海贫血症患者的 α 珠蛋白基因的缺失可能起源于基因序列间的同源不等交换 在 α 1 (HbA 1 ) 和 α 2 (HbA 2 ) 珠蛋白基因的两侧都有同源序列 ( 以 X 框和 Z 框表示 ), 在减数分裂过程中, 两条同源染色体之间的这些同源序列之间均有可能进行配对而发生同源不等交换, 从而导致 α 珠蛋白基因的缺失和重复, 无论这种不等交换是两个相邻同源 X 框 [ 图 7-4(a)], 还是发生在两个相邻 Z 框 [ 图 7-4(b)], 结果都是一条同源染色体上只剩下一个 α 珠蛋白基因, 而另一条同源染色体上有 3 个 α 珠蛋白基因

26 位点专一性重组只依赖于小范围内同源序列的联会, 而且重组也只限于在这一小范围内 λ 噬菌体感染大肠杆菌后的整合与切离是典型的位点专一性重组, 详见第 9 章 异常重组则是完全不依赖于 DNA 序列间的同源性, 如转座子从染色体的一个位置转座到另一位置, 或从一条染色体转座至另一条染色体, 这与染色体序列间同源性无关, 只需在转座和复制有关的酶作用下进行, 因此该重组又称为复制重组 (replicative recombination), 详见第 13 章

27 7.2.2 同源重组的机制 (1) 同源重组发生在减数分裂前期 同源重组又称普遍性重组 ( generalized recombination), 它的发生是依赖于较大范围的 DNA 同源序列的联会 真核生物的遗传重组发生在减数分裂时期的同源染色体的非姊妹染色单体之间, 而且染色体或 DNA 分子之间相互交换对等的部分 重组热点 : 即某类序列发生重组的概率高于其他序列 真核生物的染色质状态影响重组, 如异染色质及其附近区域很少发生重组 同源重组对同源区的长度要求 : E.coli 活体重组至少要求 20~ 40 bp 同源序列 哺乳动物基因间的重组要求同源序列在 150 bp 以上 同源区越长越有利于同源重组 在真核生物中, 双链 DNA 分子间基因重组是完成减数分裂所必需的, 而且基因重组发生在减数分裂前期 ( 图 6-12)

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29 (2) 同源重组的分子模型 1 Holliday 模型 ( 霍利迪模型 ) 狭义的遗传重组专指因为 DNA 分子内断裂 接合而 引起基因交流的过程 同源重组有时又叫交换 (crossing over) 它发生在 DNA 同源序列之间 1964 年,R. Holliday 设想了一个模式, 用来解释同源重组, 经过许多细节上的修改 : Holliday model for reciprocal genetic recombination 图 7-5

30 1 同源染色体的识别和配对排列 2 两条多核苷酸链在对应位置断裂并相互侵入( 交换 ) 3 酶的作用使交换的链连接形成 Holliday 中间体 4 分枝移位(Branch migration) 形成异源双链 DNA(Heteroduplex DNA) 5 异源双链 DNA 转动, 再次拉长 Holliday 中间体 6 由内切酶在水平方向或垂直方向切开 Holliday 中间体 7 产生带间隙的双螺旋 8 酶的作用使隙连接起来图 7-5

31 2 Meselson-Radding 模型 ( 单链侵入模型 ) 单链侵入模型 首先,DNA 分子中的一条单链发生断裂, 游离出的一条单链末端侵人到另一条 DNA 分子中 接着,DNA 聚合酶对留下的缺口进行修复 ( 虚线 ) 在另一条 DNA 分子中被替代的链降解, 而两个末端被连接 ( 见箭头 ) 开始, 形成异源双链 ( 用斜线代表 ) DNA 分子, 支链迁移将在另一个 DNA 分子上产生另一个异源双链 像在 Holliday 模型一样, 异构化使两侧的 DNA 分子重组 通过这个模型, 异源双链首先只在两个 DNA 分子中的一个形成 然后一旦 Holliday 连接体形成, 支链迁移能在另一个 DNA 分子上产生异源双链 这就解释了两个 DNA 分子中异源双链是如何形成的

32 3 双链断裂重组模型 (Double-strand breaks initiate recombination) Holliday 模型和 Meselson 和 Radding 模型对一些例外的重组现象, 如基因转换 (gene conversion) 不能很好解释 基因转换在许多生物中都存在, 最早在酵母及真菌中被发现 酵母中配子融合产生杂合子, 后者经减数分裂形成有 4 个孢子的子囊 假如配子在某一座位有不同的等位基因, 正常情况下 2 个孢子将表现同一基因型, 另 2 个孢子表现另一基因型 但有时会出现例外, 即这种 2:2 的分离比例由 3:1 比例取代 这种现象被称为基因转换, 即一种等位基因形式转变为另一种等位基因形式, 只发生在减数分裂时期 有一种双链断裂模型用于解释重组过程中发生的基因转换事件, 它们并非由单链缺口起始, 而是先在 1 个双链分子中产生断裂, 即 2 个单链在同一位置产生缺口, 然后将这 2 个缺口转移到同源的另一双链分子

33 7.3 真核生物的基因转变 异常分离与基因转变 在四分子分析中已知一对等位基因杂交子代的子囊可形成 6 种正常分离类型 : AAAAaaaa 或 aaaaaaaa AAaaAAaa 或 aaaaaaaa AAaaaaaAA 或 aaaaaaaa 这只是四分子中是否发生重组和纺锤体随机取向而形成, 两种孢子的比例相等, 即等位基因 A:a= 4:4 后来发现有些孢子分离比例异常如 3: 5 和 6: 2 以及异常的 4: 4 分离

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35 在脉孢菌和粪生粪壳菌 (Sodaria fimicala) 等子囊菌中也发现了一些异常分离 (abnormal segregation) 现象 Mitchell 将与维生素 B6 合成有关的不同的突变型进行杂交, 将两个吡哆醇突变株杂交 : + pdxp pdx + 取得子一代子囊后, 对 585 个子囊中的孢子依次解剖, 进行培养和鉴定 他发现其中 4 个子囊中有野生型的孢子对出现, 可是跟预期的相反, 如果这两个基因间发生了重组, 重组后应该同时出现的双突变型 ( pdx pdxp) 孢子对却没有发现 ( 表 7-3)

36 怎样解释这一现象? 不可能是突变, 因为它们的频率远比这些基因的正常突变率高得多 分析的方法是灵敏的, 如果有双突变的话, 就能够检出 Mitchell 的上述实验结果用图 7-7 来表示

37 由于重组, 出现了完全野生型的孢子对 ( +,+ ), 但没有重组的对应产物 双突变型的孢子对 ( pdx pdxp), 结果应如图 7-7 所示 然而发生的情况说明尽管 pdxp 出现异常的 3:1 分离, 但紧密连锁的 pdx 基因却显示出正常 2:2 分离 这些反常的情况, 好像是一个基因转变为它的等位基因, 这种现象称为基因转变 ( gene conversion) 图 7-7 中, 基因 pdxp 转变为 pdxp + ( 或 + ), 图中以 + 表示该基因发生了基因转变 所以双突变型的孢子对没有出现 异常 3:1

38 7.3.2 基因转变的类型 基因转变的类型分为 : 1 染色单体转变 (chromatid conversion), 即减数分裂的 4 个产物中有一个产物发生了基因转变, 出现 6g + : 2g - 或 2g + : 6g - 类型的子囊 图 7-8(a) 2 半染色单体转变 ( half-chromatid conversion), 即减数分裂的 4 个产物中, 有 1 个产物的一半或两个产物的各一半出现基因转变, 因而形成 5: 3 或 3: 5 和异常 4:4 即 3:1: 3:1 类型的子囊, 基因转变只影响半个染色单体分离, 显然是发生在减数分裂后的有丝分裂中, 所以又称为减数后分离 ( postmeiotic segregation) 图 7-8(b),(c)

39 7.3.3 基因转变的分子机制 由 Holliday 模型和 DSB 起始重组模型都已清楚表明在对 称的异源双链区存在着不配对碱基 ( 如 G-A,C-T), 形成 两个杂种分子 异源 DNA 不稳定, 细胞内的修复系统能够识 别不配对碱基, 并以切除修复的方式完成修复过程 ( 详见第 11 章 ), 杂种分子得到校正 研究表明基因转变产生的机制是由于 DNA 的错配修复 ( mis-mathch repair) 具体过程为 : 图 7-z1 1 在减数分裂前期亲本染色体配对 2 链的交换产生两个错配部分 3 经 DNA 合成过程切除和修复某条单链的某部分 4 产生 6:2(3:1) 基因转变的 m+ 基因转变是由于 重组和修复所产生

40 根据错配切除修复原理, 基因转变的几种类型产生的分子机制归纳如 P159 图 7-9: 1 两个杂种分子均未校正, 复制后出现异常的 4+ 4g( 或 ) 的分离 [ 图 7-9(a)] 2 一个杂种分子校正为 +, 或校正为 g 时, 则发生另一种类型的半染色单体转变, 前者修复后出现 5 3 的分离, 后者子囊孢子的异常分离比为 3 5[ 图 7-9(b)] 3 两个杂种分子都被校正到 +( 或 g) 时, 修复后出现 6 + 2g( 或 2+ 6g) 的异常分离 [ 图 7-9(c)] 4 当两个杂种分子都按原来两个亲本的遗传结构进行修复时, 则减数分裂 4 个产物恢复成 G C G C A T A T 的正常配对状态, 子囊孢子分离正常, 呈现 4+ 4g 的结果 [ 图 7-9(d)]

41 本节几个名词解释 : 正干涉 : 一次交换后引起邻近的第二次交换的频率下降 负干涉 : 一个区域发生交换后使邻近的交换频率增加的遗传学现象 共转变 : 彼此相距很近的几个位点的基因同时发生转变 极化现象 : 越靠近断裂位点的基因, 越容易发生转换, 越远的越不容易发生转换 极化子 : 染色体上呈现基因极化现象的区域

42 由于某些不配对碱基切除修复校正的结果与该区发生双交换的效应一致, 其实是基因转变的结果, 因此出现 C 值 ( 并发系数 ) 大于 1, 这称为负干涉 ( negative interference), 即一个区域的交换引起邻近区域另一次交换频率增加的现象 大量实验结果表明, 大约有一半的子囊发生基因转变的同时伴随两侧遗传标记的重组, 而 负干涉 形成的原因显然是基因转变的同时并不伴随两侧遗传标记的重组

43 基因转变具有以下几个特点 : (1) 基因转变具有极性 (polarity): 一个基因内部不同位点的基因转变频率有一个梯度 ( gradient) 或者极性, 靠近某一端的转变频率比远离该端的基因转变频率高, 这是由于交换仅在异源双链 DNA 中产生错配部分, 异源双链 DNA 出现在断裂点和在 Holliday 结构分开部位的分枝点之间, 愈远的基因愈离断裂点远 图七

44 (2) 基因转变常与旁侧的基因的交换相连系 : 交换几乎经常是在转变的位点的一侧, 而且经常是在转变的那条染色单体上

45 (3) 共转变 (coconversion)/ 共转换当同一基因内不同突变型杂交时, 在某些子囊中可以看到几个位点同时发生转变 : m m 2 m 1 + m 1 + m 1 + m 1 + m m m 2 + m 2 + m 2 m m 2 + m 2 + m 2 + m 2 + m 2 No coversion single conversion coconversin coconversion (+ m 1 (m 1 + (m 1 +) m 2 +) + m 2 ) 1:1 3:1 3:1 1:3 共转变机理

46 基因转变不仅是专一的, 而且是有方向的, 它不仅涉及单个位点 ( 或基因座 ), 而且涉及染色体的一个区段, 如一对含有两个基因差异的突变型杂交时, 在某些子囊中可以发生几个基因同时发生转变的现象, 称为共转变 ( coconversion) 共转变的频率大于独立转变的预期频率, 两个基因距离越近, 共转变频率越大, 即在异源双链的同一区域内沿相同方向同时被修复校正的概率越大

47 基因转变的极化子模型 ( polaron model ): 该模型假定内切酶首先作用于基因的一端, 从起点开始, 基因转变频率由高到低形成一个梯度, 在染色体上呈现基因转变极化现象的这样一个区域称为一个极化子 ( polaron), 有时一个极化子就相当于一个基因

48 7.4 真核生物的体细胞交换与基因定位 体细胞交换与单倍体化构巢曲霉 ( Aspergillus nidulan) 的分生孢子是单核的 将两个不同营养缺陷型菌株所产生的分生孢子大量混合接种在基本培养基的表面, 可以得到少量的原养型菌落 由于这些原养型菌落细胞含有来自两亲本的细胞核, 因此称为异核体 ( heterokaryon) 异核体 : 在同一个细胞质中含有两种或多种不同基因型的细胞核的细胞 孢子或菌丝体 大量异核体中的核仍保持单倍体状态, 但有少数单倍体细胞核融合成为二倍体细胞核或合核体 ( synkaryon)

49 利用分生孢子颜色突变的遗传标记来鉴别一种菌落是二倍体还是异核体 如构巢曲霉 野生型 ( w + y + ) 分生孢子是绿色的 突变型有黄色分生孢子 ( w + y - ) 和白色分生孢子 ( w - y + ) 由产生黄色孢子的某一营养缺陷型 ( A - B + w + y - ) 和产生白色孢子的另一缺陷型 ( A + B - w - y + ) 组成的异核体的基因型为 : A - B + w + y - /A + B - w - y + 二倍体比异核体较为稳定, 从大量二倍体分生孢子中可以得到少数体细胞分离子 ( segregant ), 所谓分离子是重组体和非整倍体或单倍体的总称 在这里产生非整倍体或单倍体的过程称为单倍体化 (haploidization), 产生重组体的过程称为体细胞交换 ( somatic crossing over)

50 单倍体 图 7-10 化是在有丝 分裂过程中 染色体不分 离的结果 M 是决定细长刚毛性状的显性基因 正常的体细胞有丝分裂两条染色体各自趋向一极, 导致了在表型上的分离现象 最初是 Bridges 观察果蝇杂合基因型 M + M(M 是决定细长刚毛性状的显性基因 ) 的雌蝇时, 发现有些具有 M 基因的雌蝇长出了一块扇形的野生型刚毛 表明杂合体的等位基因在表型上发生了分离 Bridges 证明这是有丝分裂不分离 ( mitotic nondisjunction) 造成的 ( 图 7-10 ( a))

51 2n+1 也称为三体, 它常失去一条染色体而成为二倍体 在此过程中, 可以由杂合体转变为纯合体 ;2n-1 也称为单体, 生长迟缓, 且不稳定, 常进一步失去其他染色体而最后成为一个稳定的单倍体 ( 图 7-10 (b))

52 在单倍体化过程中, 如果排除染色体携带的是某一个显性基因, 那么相应的隐性基因所决定的性状就得以表现, 这正像高等植物杂交 F 1 中不分离, 而在子二代中分离出隐性性状个体的原理一样 单倍体化过程使隐性性状表现, 这种现象也称分离 此外, 杂合体细胞中在有丝分裂后的子细胞核重建时, 发生一条染色体丢失的现象称为有丝分裂染色体丢失 ( mitotic chromosome loss), 从而也导致表型的分离 [ 图 7-10( c)]

53 杂合二倍体的体细胞交换是产生分离子的第二个途径 : 例构巢曲霉的体细胞在有丝分裂过程中, 同源染色体间却可发生染色体交换, 即体细胞交换 由于体细胞交换可导致原杂合二倍体的部分基因纯合化, 这种现象也称为有丝分裂交换 ( mitotic crossing over) 构巢曲霉 5 个隐性基因 paba( 对氨基苯甲酸 ) y ( 黄色孢子 ) ad 16 ( 嘌呤 16) ad 8 ( 嘌呤 8) bi( 生物素 ) 的杂合二倍体 paba y+ ad 8 +/++ ad 16 + bi 为例, 说明在发生体细胞重组后形成末端 ad 8 与 bi 基因纯合二倍体的过程

54 (1) 有丝分裂重组 (Mitotic recombination) 1936 年 Curt Stern 首先观察到 Mitotic crossing-over 果蝇性连锁隐性突变基因 y( 黄体,yellow body color,y) Sn ( 焦刚毛,Short twisty bristles, singed,sn) y+ Sn / y+ Sn y Sn+/ ( 纯合灰体, 焦刚毛 ) ( 黄体, 正常刚毛 ) F 1 雌蝇大多数是野生型表现 基因型 :y+ Sn/y Sn+ 表型 : 灰体, 正常刚毛 但某些雌果蝇有斑块 (patches) Single yellow spot 黄斑 Single singed spot 焦刚毛斑块图 7-12 twin spots 双斑黄斑焦刚毛斑 mosaic phenotype

55 以上这些不能用正常的基因分离进行解释也不能用染色体不分离或染色体丢失进行解释, 因为这里观察到的变化是体细胞的 (body cells), 而不是种系 (germline) 的变化 对以上现象最好的解释是 : mitotic crossing-over event 所产生的结果如图 7.15 所示 : 某些细胞的有丝分裂中 Y 座位和 Sn 座位之间或 Sn 座位和着丝 粒之间同源染色体发生了交换, 也可能是双交换 由于交换了的细胞形成的组织分别表现为 : 黄斑 双斑 焦刚毛斑 最后一种斑的出现代表着双交换的结果, 和减数分 裂一样, 双交换出现的频率最低

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57 (2) 有丝分裂交换的机理 Mechanism of Mitotic crossing-over 有丝分裂交换只能在二倍体细胞中进行研究 图 (gp181f6.10) 是一假设的杂合子细胞, 在没有交换的情况下其一对 同源染色体上所具有的基因的分离模式, 亲本细胞和子代细胞在表现型上 都为野生型 有丝分裂交换发生在类似于减数分裂四线阶段 (Four-strand) 图 GP181,6.11 所示与图 6.10 相同的细胞类型, 在基因 c 和 d 之间发生了有丝分 裂交换 从母本和从父本衍生而来的染色单体靠在一起形成一个四联体 (tetrad), 这类似于减数分裂的四线阶段, 正是在这个时期发生交换 交换后, 两对染色单体分离并独立迁移到赤道板上, 导致了两种取向 : 当类型 (a) 完成有丝分裂, 产生两个二倍体细胞 1 和 2, 子代细胞 1 是纯合的 d+ e+/d+ e+, 因此表现为野生型, 子代细胞 2 是纯合的 de/de, 在该性状上表现为突变型

58 (3) 视网膜母细胞瘤 Retinoblastoma 视网膜母细胞瘤是人类的一种肿瘤, 可能是由有丝分裂重组引起的 视网膜母细胞瘤是一种儿童眼癌 (gp183f6.12) 常见于出生至 4 岁儿童中, 若发现得早,90% 以上的经 λ 射线照射, 可以根除肿瘤 有两种形式的成视网膜细胞瘤 : 一种是无家族史的 散发型 视网膜母细胞瘤 (sporadic retinoblastoma, nonhereditary)(60% 的病例 ), 自然产生, 家族无该病的历史 单侧肿瘤 (unilateral tumor) 即肿瘤只出现在一只眼睛中 另一种是 家族型 (hereditary) 视网膜母细胞瘤 (40% 的病例 ), 对产生眼瘤的易感性 (susceptibility) 是遗传的 通常产生包括双眼的多种眼瘤 (bilateral tumors) 比散发型病人得病年龄早, 这种家庭中, 同胞兄弟姐妹和子女常常出现同样类型的肿瘤

59 系谱分析得到的结果与单基因编码该病说法一致,1971 年 Alfred Knudson 提出了一个模型来解释散发型和家族型视 网膜母细胞病的出现 [ 二次突变 学说 two-hit hypothesis, 第一次突变型发生在 生殖细胞期, 第二次突变发生于分化的体细胞中 ] 他假设基 因组中双拷贝的视网膜母细胞瘤基因 (RB) 独立地突变时产 生视网膜母细胞瘤 对于散发型视网膜母细胞瘤, 他提出孩子出生时带有两份野 生型基因拷贝 (Genotype RB + /RB + ), 然后两个突变发生在相同 的成视网膜细胞中 因为在相同的细胞内出现两次这样突变事情 的机会非常低, 所以 散发型 多数产生单侧眼瘤 5.16

60 第一次突变产生 RB/RB + 细胞 ( 在家族型中已产生这种 细胞 RB/RB + ), 第二次突变可能是在着丝粒与 13P 14 之间发生 了有丝分裂交换, 得到了一个突变等位基因的纯合子 :

61

62 7.4.2 有丝分裂交换与基因定位 基因定位 : 通过有性过程中细胞的减数分裂 同源染色体联会 基因间 的重组率来确定基因的位置 有丝分裂交换进行基因定位的原理 : 是依据体细胞同源染色体的交换使得染色体远端的杂合基因纯合化的规律, 用来确定基因的排列位置和距离 ( 图 7-13) 1+3 离着丝粒愈近的 基因纯合的机会 愈小, 愈远的则大, 而且着丝粒一端的基因纯合不影响着丝粒另一端基因的纯合

63 因此, 如果发现两个染色体臂上的基因同时出现纯合化现象, 就有可能是体细胞同源染色体的交换结果 真菌在二倍体的有丝分裂过程中, 偶尔发生同源染色体交换, 导致连锁基因的重组, 这一遗传变异过程称为准性生殖 (parasexuality); 或 : 不经过减数分裂而导致基因重组的一种生殖方式, 常见于霉菌中 准性生殖产生的重组体细胞一般和营养体细胞没有形态 生理上的差异, 而且不产生在特殊的囊器中 准性生殖过程中染色体交换和染色体的减少是不规律且不协调的, 这便是准性生殖过程与有性生殖过程中基因重组的主要区别

64 通过有丝分裂定位得到的构巢曲霉的第一染色体右臂的 各基因之间的图距如下 : 有丝分裂 减数分裂定位数据 数据 在图距中, 上面是染色体有丝分裂数据, 下面是减数分裂定位数据, 两者定位数据相差甚远, 这正是有丝分裂与减数分裂交换过程的基本差别, 但二者在顺序上是一致的 有丝分裂重组的频率比减数分裂的频率要低得多, 有人认为这可能是由于有丝分裂中同源染色体只有某些部分发生配对的缘故

65 7.5 真核生物基因的消除与扩增和重排 基因消除 某些原生动物, 如线虫 昆虫和甲壳类动物等在个体发育中, 许多体细胞常常丢掉整条或部分的染色体, 只有将要分化形成生殖细胞的那些细胞一直保留全部染色体 通过丢失染色体, 丢失某些基因而删除这些基因的活性的现象称为基因消除 ( gene elimination) 如马蛔虫 ( Ascaris megalocephalus ) 受精卵细胞内只有一对染色体 (2n= 2), 其上具有若干个着丝粒, 在发育为成体的早期阶段, 只有其中一个着丝粒行使功能, 保证正常的有丝分裂 当个体发育到一定阶段后, 在将要分化形成体细胞的那些细胞中, 这对染色体破碎, 形成许多小的染色体, 而其中一些小染色体并不含着丝粒, 因而在以后的细胞分裂过程中丢失, 但是在那些将要分化形成生殖细胞的细胞中则不存在染色体破碎现象

66 例 : 小麦瘿蚊 ( Mayetiole destructor ) 的个体发育过程中, 其卵的后端含有一种特殊细胞质 极细胞质 在极细胞质中的核保留全部 40 条染色体其他细胞质区域的核只保留了 8 条 ( 发生染色体消减而丢失了 32 条染色体 ) 有 40 条染色体的细胞分化为 生殖细胞而只有 8 条染色体的细胞继续增殖成为 体细胞如用尼龙线结扎卵, 使细胞核不能向极细胞质移动, 或用紫外线照射极细胞质, 那么所有的核都丢失 32 条染色体, 其结果体内没有生殖细胞而发育成为不育的瘿蚊 ( 图 7-14)

67 极细胞质中何种物质可控制染色体丢失, 而使生殖细胞的分化成为可能? 分析表明 : 在极细胞质中有含有丰富 RNA 的颗粒 核糖体颗粒的集合体 用离心的方法使这种颗粒移动, 让极细胞质以外的核也接触到这种颗粒, 结果这些细胞核的染色体就不再发生丢失 此外, 紫外线照射可使极细胞质中这类颗粒性物质失活, 使染色体消减而无法分化为生殖细胞 说明调控染色体丢失的主要物质是核酸

68 7.5.2 基因扩增 基因扩增 ( gene amplification) 是指基因组内某些基因的拷贝数专一地大量增加的现象 它是细胞在短期内为满足发育或生理适应的需要而产生足够多的基因产物的一种调控手段, 其实质是通过差别的基因复制 ( differential gene replication) 而完成的 例 : 爪蟾 ( Xenopus ) 的卵母细胞便是通过 rdna 的扩增而大量合成 rrna 体细胞 rdna 的拷贝数 :500 个 卵母细胞中的拷贝数约 :2, 000,000 个 以供转录合成卵裂期所需要的 个核糖体 爪蟾的 rdna 单位, 每一单位中包含 18 S rrna 基因 5.8 S rrna 基因和 28 S rrna 基因, 它们成簇存在, 重复串联在一起形成核仁组织区 ( nucleolar organizer)

69 NTS ( nontranscribed spacer,): 非转录间区 ; ETS(external transcibed spacer): 外间区 ; ITS (internal trascribed spacer): 内间区 高等真核生物中有 4 种 rrna, 其中 18 S 5.8 S 和 28 S rrna 为主体 rrna, 它们的基因组成重复单位 ; 而 5 S rrna 基因与主体 rrna 基因分隔开, 独立成为串联重复单位, 每个重复单位由 5 S rrna 基因和转录区之前的非转录区组成. 5 S rrna 基因没有基因扩增现象

70 主体 rrna 基因在卵母细胞中扩增后, 以独立的染色体外分子形式出现, 形成一个个环状 rdna 小分子, 每个环状 rdna 分子可能来自基因组上的一个 rdna 拷贝并含间隔区在内 rdna 扩增就以此环状 rdna 重复单位作为模板, 以滚环方式进行复制 扩增后的 rdna 虽然不在染色体上, 但仍包含在核仁中, 每一个核仁中包含一个复制单位, 因此卵细胞核中的核仁数往往增加到几百个 当卵细胞成熟后, rdna 便失去了继续存在的意义, 因而非但扩增停止, 而且所扩增的 rdna 也开始逐渐降解 当受精卵分裂至数百个细胞后, 这类染色体外的 rdna 分子便完全消失了

71 (1) 由于发育过程的需要而出现基因扩增现象 : 在一些昆虫 两栖动物 鱼类的卵母细胞发育中和原生动物的大核形成过程中都观察到 rdna 扩增 ; (2) 外界环境条件的改变, 也会造成基因扩增 : 在哺乳动物离体培养的细胞系中加入二氢叶酸还原酶 ( dihydrofolate reductase,dhfr) 的抑制剂氨甲蝶呤 ( methotrexate,m TX ) 后, 可以使该酶的结构基因 dhfr 扩增达到 40~ 400 个拷贝, 于是细胞产生更高的酶活性来增强对氨甲蝶呤的抗性

72 7.5.3 基因重排 基因重排 ( gene rearrangement ) 是指 DNA 分子的核苷酸序列的重新排列, 序列的重排不仅可形成新的基因, 还可调节基因的表达 酿酒酵母 ( Saccharomyces cerevisiae) 中接合型 ( mating types) 的决定属于基因重排 单倍体酵母有两种接合型 : a 由基因 Mata (mating 的缩写 ) 控制 α 由基因 Matα 所控制 一个单倍体细胞不是 a 型就是 α 型 两个不同接合型细胞可接合, 相同接合型细胞不能接合 根据分泌物质的不同识别不同的接合型 : MATa 细胞产生 a 因子,MATα 细胞产生 α 因子, 它们是促进不同接合型细胞相互接合的物质基础

73 接合后的二倍体细胞基因型为 a/α, 此杂合二倍体可产生 MATa 和 MATα (Fig. 18.2)

74 但是 a 型可以转变 α 型,α 型 a 型 这种相互转化的现象称为接合型互变 ( mating type interconversion) Mat( 接合型基因 ) 位于酵母细胞的第 3 号染色体上, 而接合型互变又依赖位于显性基因 HO(homothallism, 同宗接合,HO), 它位于另一染色体上 不管起始为哪种接合型, 由于 HO 基因的存在使酵母菌居群基因型发生变化, 经几代后出现两种接合型细胞, 并导致大量二倍体 MATa/MATα 形成, 于是由单倍体居群转变为二倍体居群 一个单倍体细胞同时存在着 Mata 和 Matα 的遗传信息, 但在特定时刻只有其中一个表达

75 分析表明在 MAT 基因的两侧座位上有两个基因 位于左侧的称为 HMLa, 它是使细胞由 α 型转变为 a 型所必需的 ; 位于右侧的称为 HMRα, 它是 a 型转变为 α 型所必需的 盒子模型 ( cassette model ) 解释接合型互变的机制 : MAT 位置上存在活跃盒 ( active cassettes), 原来位 置上的 HMLa 和 HMRα 基因都不表达, 称为沉默盒 ( silent cassettes), 当它们转移到 MAT 活跃盒时便表达, 如 HMLa 转移到 MAT 座位上后细胞便呈 a 型, 但是当 HMRα 转 移到了 MAT 座位而取代了 HMLa 后, 细胞便由 a 型转变为 α 型 MAT 位置出现 HMLa 或 HMRα 后, 原来位置上的 HMLa 或 HMRα 并不消失, 仍然保留一个拷贝的沉默盒

76 这说明在取代的过程中必然伴随着 DNA 的复制, 该机制有些类似于转座行为, 但又不完全相同 这一取代只发生在特定的位点, 并不涉及在 DNA 中插入一段序列, 在 HMLa 或 HMRα 两端未发现反向重复序列, 而且接合型的转换是有方向性的, 受体为 MAT 一个, 供体有 HMLa 和 HMRα 两个 由此认为这种取代是属于位点专一性重组 ( 图 7-16)

77 比较两个沉默盒 ( HMLa 和 HMRα) 与两个活跃盒 ( MATa 和 MATα) 的序列, 结果表明 :HMLa MATa MATα 均由 W X Y Z 1 Z 2 5 部分组成, 而 HMRα 仅由 X Y Z 1 3 部分组成 ( 表 7-5)

78 Y 为中心区, 两个活跃盒的差异就在 Y 区, 因此基因产物也不同 MATa 编码 a 1 和 a 2 两种调节蛋白 ;MATα 仅编码 α 1 一种调节蛋白 同时在 Y 区的左端,4 种盒都有序列完全相同的启动子, 但只有两个活跃盒表达, 而且有相同的 Y 区的沉默盒都不能表达 ( 图 6-30) MATa MATα

79 沉默盒的表达调节不是直接依赖于识别启动子位点来完成的 接合型的建立和转换功能的实现涉及一系列基因 : 控制接合型的基因 ( MAT) 控制接合型转换的基因 ( HO) 抑制 HO 表达的基因 ( SIN 1~ 5), 阻遏沉默盒基因表达的阻遏蛋白 4 个亚基的基因 sir1~ 4 ( silent information repressor,sir ) 缺失突变分析表明, 在两个沉默盒启动子上游 1.5 kb 有抑制表达的靶位点 : EL 是位于 HML 上游的靶位点, ER 是位于 HMR 上游的靶位点 E 位点的行为类似负增强子 ( negative enhancers), 可在离启动子 2.5 kb 远距离行使功能, 且无方向性 有时称它为沉默子 ( silencer) 而活跃盒上游无 E 位点 阻遏蛋白 ( SIR) 的结合位点正是 E 位点, 它们可能是通过改变染色质结构而阻止基因表达的 此外, 两个沉默盒又缺乏 DNA 酶 Ⅰ 超敏感点, 而活跃盒的两个转录单位上游各含有一个超敏感点 这也可能是造成活跃盒和沉默盒表达活性差异的原因

80 酵母 MAT 序列的转换是一种具有多方面特性的重组过程接合型转换说明发生了基因转变, 即受体位点 ( MAT) 转变成供体类型 ( HML 或 HMR) 的序列, 而且此过程是单向的 通过点突变已鉴定出在 MAT 的 Y 右侧一位点是结合型转换的必需位点,Y Z 边界是一个 DNA 改变位点, 它标志着转换事件的起始位点, 在经历转换的细胞群体中,MAT 座位有 1% ~ 3% DNA 在此位置上有双链切口, 此切口靠近边界且与 DNase 超敏感位点一致 已知 HO 基因编码一种内切酶, 该酶作用于 M AT 盒上 Y 区的右侧, 其识别序列为 TTTCAGCTTTCCGC AACAGTATA 切开双链缺口, 分裂产生一个 4 bp 的单链末端 [ 图 6-31( a)] 正是这种双链断裂起始了 MAT 序列的转变过程

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83 本章结束作业 :P170-5 P170-7 p 谢谢!

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88 gp177 返回 返回 b

89 图 7-12 返回

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91 Gp183f6.12 返回

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