王建等 : 复合乳酸菌最佳培养基成分的优化本实验从青贮饲料中在自行分离纯化 17 株单株乳酸菌, 从其中筛选出 3 株产酸性能强生长速度快, 且抑菌效果较好的优良乳酸菌菌株组成复合乳酸菌, 并对其最佳培养基成分进行筛选和优化 1 材料与方法菌种 (1) 植物乳杆菌 : 自行分离 (

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矶瞬郁
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1 第30卷第1期 201年1月北京农业职业学院学报 Journal of Beijing Agricultural Vocation College Vol.30 No.1 Jan. 201 复合乳酸菌最佳培养基成分的优化王建于佳弘罗红霞汪长钢张俊北京农业职业学院北京 1022 摘要乳酸菌能够有效调节机体的状态对生物体维持健康方面有重要的作用在自行分离的乳酸菌中选取 3 株高产酸生长快且抑菌效果较好的优良菌株组成复合乳酸菌筛选并优化复合乳酸菌的最佳培养基在单因素试验基础上选取 L9 3 四因素 3 水平的正交试验设计分析碳源氮源缓冲盐 3 个因素对复合乳酸菌菌体数量的影响最终确定复合乳酸菌的最佳培养基为在 MRS 培养基的基础上添加乳糖 35g/L 乳清粉 - 大豆肽粉 1:1 0g/L 乙酸钠 7g/L 硫酸镁 0.5g/L 硫酸锰 0.25g/L 采用此培养基培养的复合乳酸菌数达到 cfu/ml 比常规培养基培养的乳酸菌数提高了 3.7 倍关键词复合乳酸菌培养基优化中图分类号 TS252.5 文献标识码 B 文章编号前言杆菌 FTL2311 和 FTL10BR 进行了抗菌作用和清乳酸菌是人类和动物的肠道中占举足轻重除自由基的实验结果表明该乳杆菌抗菌作用地位的优势菌群之一能够有效地调节机体状和清除自由基的效果显著王爱丽等发现肠黏态对维持生物体健康发挥比较重要的作用乳膜上皮细胞能够与某些专性厌氧乳酸菌相粘附酸菌能够通过代谢细菌素或制造酸性环境来抑形成结构相对固定的菌膜组织和生物保护屏障, 制肠道中有害菌群平衡机体肠道的健康状态对抵御病原菌等对机体的侵袭有举足轻重的作降低机体的胆固醇和血脂水平增强机体免疫用, 降低感染病症的机率力进而增强身体的抗病抗癌能力并延缓具有优良性状的乳酸菌可以在食品业中作衰老 Chuang 等研究了热灭菌乳酸菌对免疫功为发酵剂使用也可在饲料制备中作为酸化剂能的作用调查了这些灭活乳酸菌刺激小鼠树使用还可以制作成调节肠道的各种益生制剂突状细胞 DCST 细胞的反应结果证明乳酸菌在为动物和人类的健康贡献力量将两种或多种调节免疫反应中能发挥重要的作用 Gilliland 和乳酸菌菌株进行混合复配共同发酵其发酵能 Buck 等通过研究表明胆固醇能很好地被乳酸菌力益生效果要强于单株乳酸菌复合菌的培降解并且胆盐的种类和浓度对乳酸菌降低胆养在发酵食品生产环境和能源有效利用等相固醇效果也存在着影响 Srikanjana 对分离的乳关领域已有相应的一些经验累积和应用基金项目北京市教委 2015 年度科技计划以及社科计划资助项目 KM 收稿日期作者简介王建女北京人北京农业职业学院食品与生物工程系副教授硕士研究方向食品微生物食品质量监控 2

2 王建等 : 复合乳酸菌最佳培养基成分的优化本实验从青贮饲料中在自行分离纯化 17 株单株乳酸菌, 从其中筛选出 3 株产酸性能强生长速度快, 且抑菌效果较好的优良乳酸菌菌株组成复合乳酸菌, 并对其最佳培养基成分进行筛选和优化 1 材料与方法菌种 (1) 植物乳杆菌 : 自行分离 (2) 乳酸片球菌 : 自行分离 (3) 干酪乳杆菌 : 自行分离主要试剂 (1) 脱脂乳粉 : 市售, 用于菌株活化 (2) 鲜牛乳 : 市售, 用于发酵试验 (3) MRS 培养基 : 用于乳酸菌培养主要仪器设备 : (1)SW-CJ-2F 超净工作台 : 苏州安泰空气技术有限公司 (2)150A 生化培养箱 : 江苏省金坛市医疗仪器厂 (3)BL310 电子天平 : 塞多利斯 ()828 型 ph 测试仪 :ORION 菌体生长测定 (1) 乳酸菌菌落计数取 100 μl 菌液加入到 900 μl 灭菌生理盐水, 依次做 10 倍稀释, 选取 3 个适宜的连续稀释倍数进行平板计数, 每个稀释度做 3 个平行 (2) 菌体生长曲线将复合乳酸菌接种 MRS 培养基, 培养 2 h±2 h, 每 2 h 取 1 次样, 测定吸光度值, 以培养时间 t 为横坐标, 吸光度为纵坐标, 绘制复合乳酸菌的生长曲线单因素实验 (1) 碳源的种类及添加量对菌株生长的影响固定除葡萄糖外 MRS 中其他组分的量, 分别添加 20 g/l 的蔗糖乳糖果糖木糖海藻糖麦芽糖和葡萄糖, 接种培养后计数, 确定最佳碳源另在 MRS 培养基中分别添加和 50 g/l 最佳碳源, 接种培养后计数, 确定最佳碳源的浓度 (2) 氮源的种类及添加量对菌株生长的影响将 MRS 中的氮源替换为 25 g 的大豆肽粉, 25 g 乳清蛋白,25 g 鱼粉,50 g 玉米浆干粉, 12.5 g 大豆肽粉 g 乳清蛋白粉,25 g 玉米浆干粉 g 大豆肽粉, 灭菌接入种子,37 培养 1 h 后进行平板活菌计数, 确定最佳氮源在培养基中分别添加和 50 g/l 最佳氮源, 接种培养后计数, 确定最佳氮源的浓度 (3) 缓冲盐种类及添加量对菌株生长的影响根据已选出的最佳碳源氮源及其浓度, 添加缓冲盐分别为磷酸二氢钾 2 g/l 乙酸钠 5 g/l 柠檬酸铵 2 g/l 磷酸二氢钾 2 g/l + 乙酸钠 5 g/l + 柠檬酸铵 2 g/l 和空白对照, 接种培养后计数, 确定最适缓冲盐在培养基中分别添加和 20 g/l 最适缓冲盐, 接种培养后计数, 确定最佳缓冲盐的浓度正交试验优化培养基根据单因素实验结果, 以活菌数为 Y 值, 设计 L9(3 ) 正交表进行正交试验, 试验因素和水平如表 1 所示表 1 正交实验设计因素和水平因素水平乳糖用量 /g/l A 乳清粉 - 大豆肽粉用量 /g/l B 乙酸钠添加量 /g/l C 注 : 乳糖用量乳清粉 - 大豆肽粉用量和乙酸钠添加量的实际值分别用 A B 和 C 表示 27

3 北京农业职业学院学报 2 结果与分析 201 年第1期 (2) 碳源的添加量乳糖浓度对复合乳酸菌生长的影响见图 3 ２１复合乳酸菌菌体生长曲线复合乳酸菌生长曲线见图 1 OD00 ph 7 10 OD ph 时间/h 图 1 复合乳酸菌生长曲线如图 1 所示复合乳酸菌在接种后 0 h 内图 3 乳糖浓度对复合乳酸菌生长的影响从图 3 可以看出随着培养基中乳糖含量的提高复合乳酸菌的菌体数量也出现增长细胞数量增长比较缓慢处于生长延滞期 10 当乳糖含量为 30 g/l 时菌体数量达到最高但 h 迅速生长进入到对数生长时期 h 生乳糖含量继续增加时菌体数量反而出现降低长速率几乎不变处于稳定期 18 h 以后进入到因此确定培养基乳糖含量为 30 g/l 为宜衰亡期菌体数量开始减少在复合乳酸菌培养过程中培养基 ph 值变化是逐渐降低而后处于氮源的种类及添加量对复合乳酸菌生长的影响平稳这可能是乳酸菌在生长过程中不断产生乳 (1) 氮源的种类酸等有机酸而当生长环境中的有机酸浓度累积不同氮源对复合乳酸菌生长的影响见图到一定水平时菌体生长就会受到制约２２单因素实验碳源的种类及添加量的影响 (1) 碳源的种类不同碳源对复合乳酸菌生长的影响见图 2 图不同氮源对复合乳酸菌生长的影响注 1 酵母膏 + 牛肉膏 + 蛋白胨 2 玉米浆干粉 3 大豆肽粉鱼粉 5 乳清蛋白粉大豆肽粉 + 乳清蛋白粉 7 玉米浆干粉 + 大豆肽粉由于乳酸菌缺乏相应的蛋白酶分解蛋白的能力有限只能相应利用一些富含氨基酸肽类的有机氮源将复合乳酸菌接种于添加不同图 2 不同碳源对复合乳酸菌生长的影响氮源的培养基中并控制各组总粗蛋白量相同如图 2 所示与基础碳源为葡萄糖时的菌白粉为氮源的培养基中菌体数量最高第 3 如图所示第组即添加大豆肽粉 + 乳清蛋体数量相比当培养基中添加乳糖为碳源时组即添加大豆肽粉次之菌体数量最高其次是海藻糖而其余组的菌体 (2) 氮源的添加量数量均低于葡萄糖组因而确定乳糖为复合乳不同氮源浓度对复合乳酸菌生长的影响见酸菌的最佳碳源 28 图 5

4 王建等 : 复合乳酸菌最佳培养基成分的优化图 5 不同氮源浓度对复合乳酸菌生长的影响如图 5 所示, 在培养基中添加不同量的大豆肽粉 + 乳清蛋白粉, 其培养后的菌体数量也不同, 当大豆肽粉 + 乳清蛋白粉控制在 20 g/l 时, 菌体数量最多 2.2. 缓冲盐种类及添加量对复合乳酸菌生长的影响 (1) 缓冲盐种类不同种类缓冲盐对复合乳酸菌生长的影响见图图不同种类缓冲盐对复合乳酸菌生长的影响注 :1 不添加缓冲盐 ;2 乙酸钠 ;3 磷酸二氢钾 ; 柠檬酸铵 ; 5 磷酸二氢钾 + 乙酸钠 + 柠檬酸铵缓冲盐能调整培养基的酸度控制在一定的范围内, 缓解乳酸菌菌体的正常生长会被自身产酸所抑制的现象, 从而促进菌体的生长如图所示, 在培养基中添加不同种类的缓冲盐, 其中第 2 组添加乙酸钠作为缓冲盐, 其菌体数量较其它组的要高, 差异明显, 因此选择乙酸钠作为复合乳酸菌培养基中的缓冲盐比较适宜 (2) 缓冲盐添加量不同浓度缓冲盐对复合乳酸菌生长的影响见图 7 图 7 不同浓度缓冲盐对复合乳酸菌生长的影响由图 7 看出, 当培养基中乙酸钠的添加量为 8 12 和 1 g/l 时, 菌体数量均较大, 且 3 组数据相差不大, 但从经济方面考虑, 选取 8 g/l 作为乙酸钠的最适合添加量根据表 1 因素和水平进行正交试验设计, 得到 9 组试验, 试验结果均为平均值, 如表 2 表 2 培养基的最佳组合正交实验设计及结果试验号 A B C D( 空列 ) 活菌数 (lg(cfu/ml)) k k k R

5 北京农业职业学院学报 201 年第 1 期由表 2 可知, 各因素对活菌数的影响顺序为 A( 乳糖添加量 )> C( 乙酸钠添加量 )> B( 乳清粉 - 大豆肽粉添加量 ); 最优组合为 A3B2C1, 即乳糖 35 g/l, 乳清粉 - 大豆肽粉 (1:1)0 g/l, 乙酸钠 7 g/l 优化后活菌数可达 cfu/ml, 是基础培养条件下培养后活细胞数量的 3.7 倍 3 讨论优化培养基的目的, 主要是提高乳酸菌数, 从而获得大量活的乳酸菌但复合乳酸菌在其培养的过程中会受到诸多因素的影响目前, 对乳酸菌的培养条件和培养基的优化研究较多, 但不同的菌株, 其研究结果也不尽相同 Chiara S 对乳酸菌培养条件培养基成分和发酵工艺参数进行了优化, 大幅度提高了菌体数量他认为乳酸菌发酵剂和各种益生菌制剂的制备都要有适宜的培养基, 促使菌体大量繁殖, 才能使乳酸菌在后期干燥处理以及存储时获得较高的活菌存留率田菊梅等先通过单因素实验研究了培养温度起始 ph 值及接种量对低温乳酸菌的影响, 再试验响应面法进一步分析和优化培养条件, 其结果为接种量 3.00 % 起始 ph.0 培养温度 2.32, 活菌数达 10.25±0.02 lg(cfu/ml) 胡渊等以 MRS 肉汤培养基为基础培养基, 优化干酪乳杆菌的最佳培养基成分, 得到最佳碳源为以 3.77 % 的葡萄糖和乳糖质量比为 1:1 的混合糖为碳源,1.9% 酵母提取粉为氮源,3.9 % 黄豆浆为促生长因子, 优化后培养 2 h, 活菌数达 cfu/ml, 提高了 8.21 倍隋欣等研究复合乳酸菌基础培养基及增殖因子, 结果表明经蛋白水解酶处理后的脱脂乳中, 添加适宜的培养成分 : 蛋白胨 0.8% 酵母粉 0.8% 吐温 0.1% 乳糖 0.5%, 可促进混合乳酸菌的富集培养, 达到增殖的目的本试验在以上研究的基础上, 针对从青贮饲料中分离出的优良乳酸菌株组成的复合乳酸菌, 对其最佳培养基成分进行了优化, 即乳糖 35 g/l, 乳清粉 - 大豆肽粉 (1:1)0 g/l, 乙酸钠 7 g/l, 获得活菌数可达 cfu/ml 该优化结果使得复合乳酸菌的菌体数量有了明显的提高, 活菌数是未经优化的基础培养基培养后的 3.7 倍, 为后期研究复合乳酸菌的富集培养和工业发酵打下基础参考文献 [1] Chuang L,Wu KG, Pai C,et al.heat-killed cells of lactobacilli skew the immune response toward T helper 1 polarization in mouse splenocytes and dendrite cells [J]. J Agric Food Chem,2007,(55): [2] GILLILAND S E, NELSON C R, MAXWELL C. Assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1985, (9): [3]BUCK L M, GILLILAND S E.Comparisons of freshly isolated strains of Lactobacillus acidophilus of human intestinal origin for ability to assimilate cholesterol during growth [J].J Dairy Sci, 199, (77): [] Srikanjana K, Siriporn O.Antibacterial and antioxidant activities of acid and bile resistant strains of lactobacillus fermentum isolated from miang[j].braz J Microbiol, 2009,(0):757-7 [5] 王爱丽, 武庆斌, 孙庆林. 肠道菌群与肠道黏膜免疫系统的相互作用机制 [J]. 中国微生态学杂志,2009, 1(): [] 徐颖宣, 徐尔尼, 冯乃宪, 等. 微生物混菌发酵应用研究进展 [J]. 中国酿造,2008, (9):1-. [7]Chiara S, Vincenzo A, Vivien V, et al.cell density cultivation of probiotics and lactic acid production [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2003, 82(2): [8] 田菊梅, 梁琪, 张炎, 等. 低温乳酸菌混菌培养条件的优化 [J]. 食品工业科技,2013, 3(1): [9] 胡渊, 刘成国, 黄茜, 等. 干酪乳杆菌增殖培养基的优化研究 [J]. 食品与机械,201, 30(2):20-. [10] 隋欣, 姜铁民, 王建, 等. 乳酸菌混合培养菌株基础培养基及增殖因子的筛选 [J]. 食品研究与开发, 2005, 2(): ( 责任编辑宋晓华 ) 30

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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