丁焕弟等自制 NSE 单抗的鉴定及其双抗夹心 ELISA 方法的建立第 10 期 923 化的监测, 可以达到监测病情发展, 评价治疗效果, 及早提示复发情况的目的本文希望通过制备效价高特异性好能识别人体内 NSE 蛋白的单克隆抗体, 并用此抗体建立双抗夹心 ELISA 试剂盒 1 材料与方法

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溪秦
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1 922 中国免疫学杂志 2012 年第 28 卷 doi: /j. issn X 免疫学技术与方法 1 自制 NSE 单抗的鉴定及其双抗夹心 ELISA 方法的建立 2 丁焕弟林志妙杨赟于占娇龚慧婷李晓彤 ( 厦门大学生命科学学院杂交瘤抗体中心, 厦门 ) 中国图书分类号 R 文献标识码 A 文章编号 X( 2012) [ 摘要 ] 目的 : 制备并鉴定 NSE( Neuron-specific enolase) 单克隆抗体, 建立可检测 NSE 蛋白的双抗夹心 ELISA 方法方法 : 用本实验室已表达纯化的 NSE 融合蛋白免疫 BALB /c 小鼠, 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体采用 WB IP IF IHC 等方法对获得的 NSE 单抗进行鉴定及亚型检测利用辣根过氧化物酶标记纯化后的 NSE 单抗, 建立一个可检测 NSE 蛋白的双抗夹心 ELISA 法结果 : 通过分析和鉴定, 选定 2 株可稳定分泌抗 NSE 抗体的杂交瘤细胞株, 效价达 ~ , 亚型为 IgG2b 免疫印迹结果显示, 该抗体不仅能识别细胞内源 NSE 蛋白, 还能识别分泌到细胞培养上清液中的 NSE 蛋白, 此外还可用于免疫荧光及免疫组化检测文中所建立的双抗夹心 ELISA 法, 最低检测极限为 ng /ml 结论 : 成功获得了效价高灵敏度好及特异性强的 NSE 单抗, 建立了一个双抗体夹心 ELISA 检测系统, 具有良好的临床应用前景 [ 关键词 ] 神经元特异性烯醇化酶 ( NSE) ; 单克隆抗体 ; 鉴定 ; 双抗体夹心 ELISA Characterization of NSE monoclonal antibodies and establishment of a doubleantibody sandwich ELISA assay DING Huan-Di,LIN Zhi-Miao,YANG Yun,YU Zhan-Jiao,GONG Hui-Ting,LI Xiao-Tong. Hybridoma and Antibody Center,School of Life Sciences,Xiamen University,Xiamen ,China [Abstract] Objective: Preparation and characterization of monoclonal antibodies against NSE protein,and establishment of a double-antibody sandwich ELISA assay. Methods: BALB / c mice were immunized by using purified recombinant NSE,and monoclonal antibodies were generated by hydridoma technique. These antibodies were characterized with ELISA,Western blot,immunofluorescent and Immunohistochemical staining. The isotypes of these antibodies were determined with an antibody isotyping kit. With Horseradish Peroxidase labelled NSE monoclonal antibody,we were able to establish a double-antibody sandwich ELISA to detect NSE protein. Results: Two positive hybridoma cell lines were selected for test,the titers of these two monoclonal antibodies could reach ,and their isotypes were IgG2b. Our NSE antibodies could detect not only endogernous NSE protein from cells,but also secreted NSE protein from cells in culture medium by Western blot,in addition,they could be used for immunofluorescent and immunohistochemical staining. The minimum amount of NSE protein could be detected by this double-antibody sandwich ELISA was ng / ml. Conclusion: Our NSE monoclonal antibodies achieved good sensitivity and specificity with high titers,and we established a doubleantibody sandwich ELISA assay which could be used for clinical test in future. [Key words] Neuron-specificenolase( NSE) ; Monoclonal antibody; Identification; Double-antibody sandwich ELISA 神经元特异性烯醇化酶 ( Neuron-specific enolase,nse) 是烯醇化酶的一种同工酶, 烯醇化酶是普遍存在于生物体内的糖酵解代谢酶, 它催化中间产物磷酸烯醇式丙酮酸的生成目前已发现 5 种烯醇化酶的同工酶, 由 3 种免疫性质不同的亚基 ( α β 1 本文为福建省科技重点项目 ( 编号项目 No. 2011Y0050) 和厦门市科技计划项目 ( No. 3502Z ) 2 通讯作者, xtli@ xmu. edu. cn 作者简介 : 丁焕弟 ( 1985 年 - ), 女, 在读硕士, 主要从事抗肿瘤单克隆抗体及诊断试剂盒的研究, com γ) 组成, 分别是 αα ββ γγ αβ αγ, 已经证明这 3 个亚基来自不同的基因位点 [1] α 亚基主要存在于肝肾等组织, 故称其为非神经系统的烯醇化酶 ( NNE) ; β 亚基主要存在于骨骼肌和心肌, 故称其为肌肉特异性的烯醇化酶 ( MSE) ; γ 亚基主要存在于神经组织,γγ 型特异定位于神经元和神经内分泌细胞中, 故命名为神经元特异性烯醇化酶 [2] 通过研究神经元和神经内分泌细胞起源的肿瘤, 如小细胞肺癌患者血清及脑脊液中 NSE 水平明显升高, 提出通过对这些患者血清 NSE 活性水平变

2 丁焕弟等自制 NSE 单抗的鉴定及其双抗夹心 ELISA 方法的建立第 10 期 923 化的监测, 可以达到监测病情发展, 评价治疗效果, 及早提示复发情况的目的本文希望通过制备效价高特异性好能识别人体内 NSE 蛋白的单克隆抗体, 并用此抗体建立双抗夹心 ELISA 试剂盒 1 材料与方法 1. 1 材料 PEG HT HAT RPMI1640 培养基抗体亚型鉴定试剂盒辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG 以及荧光标记的羊抗鼠 IgG 均购自 Sigma 公司 ; 小牛血清购自 Gibco 辣根过氧化物酶( HRP) 购自泰天和生物公司, 其他生化试剂均为国产分析纯试剂 1. 2 方法 NSE 单克隆抗体的制备及亚型鉴定取小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 SP2 /0 按常规方法进行细胞融合 [3], 通过间接 ELISA 法筛选 [4], 采用有限稀释法进行数次亚克隆, 获得可稳定分泌 NSE 单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 按常规方法制备腹水并纯化采用间接 ELISA 法梯度稀释制备的抗体, 测定其效价, 并采用免疫球蛋白标准亚型鉴定试剂盒进行抗体亚型鉴定, 用山羊抗鼠 IgA IgM IgG IgG1 IgG2a IgG2b IgG3, 检测抗体的亚型, 亚型鉴定的具体操作步骤按试剂盒说明书进行免疫印迹分析 ( Western blot,wb) 将收集的细胞裂解液, 首先进行 SDS-PAGE 电泳 ; 然后用 5% 的脱脂奶粉进行封闭, 室温 2 小时 ; 加一抗, 室温孵育 1 小时,PBST 洗涤 ; 加入辣根过氧化物酶标记的二抗, 室温孵育 1 小时,PBST 充分洗涤 ; 加入显色液显影摄片免疫荧光实验将细胞接种到预先放置有无水乙醇浸泡过的盖玻片的培养皿中, 待细胞贴壁后 4% 多聚甲醛固定 10 分钟 ; 加渗透液置冰上渗透 10 分钟 ; 5% 的 BSA 封闭 1 小时 ; 加一抗孵育 3 小时, 洗涤 ; 加荧光二抗室温避光孵育 1 小时, 洗涤 ; DAPI 染核 5 分钟, 洗涤 ; 封片, 镜检拍片免疫组化组织切片脱蜡与水化后, 进行抗原修复 ; 再用 3% 过氧化氢阻断内源性过氧化物酶的活性 ; 用正常山羊血清封闭液封闭滴加稀释好的一抗, 室温静置 1 小时或 4 过夜, 洗涤 ; 滴加生物素标记的二抗, 洗涤 ; 滴加链霉菌抗生物素 - 过氧化物酶溶液, 洗涤 ; AEC 显色, 在显微镜下观察掌握染色程度, 洗涤 ; 苏木素复染, 洗涤 ; 封片镜检拍片双抗夹心 ELISA 法检测系统的建立用活化的辣根过氧化物酶标记抗体试剂盒, 对抗体进行标记按 ELISA 双抗体夹心法测抗原的基本试验程序 [5], 采用棋盘滴定试验取纯化后的数株抗体分别稀释至 mg /ml, 包被酶标板分别与 ng /ml 的 NSE 融合蛋白反应, 以 BRCA1 融合蛋白为阴性对照,0. 2% 的 BSA 为空白对照然后再分别加入不同浓度酶标抗体, 稀释度和读取 OD450 值根据 OD 值和 P /N 值, 确定包被抗体和酶标抗体的最佳搭配和工作浓度, 建立 ELISA 检测系统封闭条件以及酶标抗体作用时间的优化以 2% BSA 为封闭液,BRCA1 融合蛋白为阴性对照, 0. 2% BSA 为空白对照选择 37 封闭 2 小时 37 封闭 4 小时和 4 封闭过夜, 然后进行夹心 ELISA 反应, 以确定最适合封闭条件确定最适封闭条件后, 在最适的酶标抗体浓度下, 将反应时间设为 : 37,30 分钟 50 分钟 1 小时 1. 5 小时和 2 小时, 以确定酶标抗体的最佳反应时间标准曲线制作及灵敏度的确定取标准的 NSE 融合蛋白, 自 ng /ml 开始倍比稀释, 以 BRCA1 融合蛋白为阴性对照,0. 2% BSA 为空白对照进行双抗夹心 ELISA 检测, 重复 3 次, 每次设 3 个复孔以 OD450 值为纵坐标,NSE 融合蛋白浓度的对数为横坐标做标准曲线试剂盒特异性检测我们采用双夹心 ELISA 法来检测, 分别用 NSE 融合蛋白 BRCA1 融合蛋白标签蛋白和 BSA 蛋白做交叉反应来检测双夹心试剂盒的特异性, 稀释检测蛋白浓度为 100 ng / ml, 进行双夹心 ELISA 检测试剂盒重复性和稳定性检测将我们的抗体包被好酶标板, 置于 4 储存 3 个月, 重复我们的检测标准蛋白制备标准曲线实验梯度稀释蛋白分别为 ng /ml, 每个浓度做 3 个复孔计算 P /N 值, 以 P /N 2. 1 所对应的 NSE 融合蛋白的最低浓度, 作为该试剂盒检测标准品的最低检测极限, 与初始的最低检测极限进行比较 2 结果 2. 1 抗体效价及亚型鉴定我们采用常规杂交瘤技术得到稳定分泌抗 NSE 抗体的杂交瘤细胞, 并制备腹水, 将所抽取的腹水使用以 Protein G 进行亲和纯化, 采用间接 ELISA 法检测发现 3 号和 4 号抗体效价最高, 达到 ~ 抗体亚类的测定结果显示, 抗体的亚型为 IgG2b( 图 1) 2. 2 NSE 单克隆抗体的 WB 检测我们采用过表达系统检测 NSE 单克隆抗体, 将带有 HA 标签的

中国免疫学杂志 2012 年第 28 卷 924 图1 Fig 1 单克隆抗体亚型鉴定 The isotype identification of NSEmAbs 图3 检测分泌到细胞培养上清中的 NSE 蛋白 Fig 3 Detection of secreted NSE protein in cell culture medium 图4 內源免疫荧光检测 NSE(

粒的量增加而增多( 图 3) 2 3 NSE 抗体免疫荧光检测 WB 检测表明在许多不同癌细胞株中都有 NSE 的大量表达 ( 结果未在 NSE 真核表达载体转染 HeLa 细胞进行 WB 检测结果在 50 kd 左右检测到了目的蛋白 NSE( 图 2A) 本文显示) 用免疫荧光方法对图 4 中的 3 株细胞进行检测结果表明在肺癌细胞

细胞作为阳性对照指示 2 4 NSE 抗体免疫组化检测 NSE 的位置取乳腺癌的组织切片进行染色结果显示: 自制的 NSE 单克隆抗体可在乳腺癌组织中检测到 NSE 蛋白其中蓝色部分然后我们将带 HA 标签的 NSE 真核表达载体梯度转染 293T 细胞转染前各盘细胞换等量的细胞为苏木素染核的颜色红褐色为我们的抗体着色部位主要位于胞浆( 图

3 中国免疫学杂志 2012 年第 28 卷 924 图1 Fig 1 单克隆抗体亚型鉴定 The isotype identification of NSEmAbs 图3 检测分泌到细胞培养上清中的 NSE 蛋白 Fig 3 Detection of secreted NSE protein in cell culture medium 图4 內源免疫荧光检测 NSE( 100) Fig 4 Immunofluorescence detection of NSE ( 100) 将细胞裂解进行 WB 检测结果表明我们的抗体可在细胞培养上清液中检测到目的蛋白 NSE 与细图2 Fig 2 NSE 单克隆抗体的 WB 检测 Western blot with our NSEmAb 胞裂解液中 NSE 的位置相同而且随着我们转染质粒的量增加而增多( 图 3) 2 3 NSE 抗体免疫荧光检测 WB 检测表明在许多不同癌细胞株中都有 NSE 的大量表达 ( 结果未在 NSE 真核表达载体转染 HeLa 细胞进行 WB 检测结果在 50 kd 左右检测到了目的蛋白 NSE( 图 2A) 本文显示) 用免疫荧光方法对图 4 中的 3 株细胞进行检测结果表明在肺癌细胞 H299 乳腺癌细胞接着我们用自制的 NSE 抗体进行了细胞内源 NSE 蛋白的检测结果显示未转染的 293T 细胞中可检 SK-BR-3 中可检测到目的蛋白 NSE 其定位于细胞质中而在 HeLa 细胞中则未检测到 NSE( 图 4) 测到细胞内源 NSE 蛋白的表达 ( 图 2B) 以转染了 NSE 真核表达载体的 293T 细胞作为阳性对照指示 2 4 NSE 抗体免疫组化检测 NSE 的位置取乳腺癌的组织切片进行染色结果显示: 自制的 NSE 单克隆抗体可在乳腺癌组织中检测到 NSE 蛋白其中蓝色部分然后我们将带 HA 标签的 NSE 真核表达载体梯度转染 293T 细胞转染前各盘细胞换等量的细胞为苏木素染核的颜色红褐色为我们的抗体着色部位主要位于胞浆( 图 5) 培养基转染带 HA 标签的 NSE 真核表达载体 DNA 分别为 μg; 转染空载体的 DNA 分别 g 为 μ 转染 36 小时后收集细胞上清并 2 5 双抗夹心 ELISA 法检测系统的建立抗体效价检测结果表明#4 抗体的效价最高因此对其进行了HRP 标记棋盘滴定实验结果显示 #3 抗体和

丁焕弟等表1 自制 NSE 单抗的鉴定及其双抗夹心 ELISA 方法的建立第 10 期 925 棋盘滴定实验结果 Tab 1 The result of Checkboard ELISA Concentration of coating NSEmAb( μg / ml) HRP labeled Dilution of NSEmAb HRP-NSEmAb 1 2 000 4 272 727 1

4 丁焕弟等表1 自制 NSE 单抗的鉴定及其双抗夹心 ELISA 方法的建立第 10 期 925 棋盘滴定实验结果 Tab 1 The result of Checkboard ELISA Concentration of coating NSEmAb( μg / ml) HRP labeled Dilution of NSEmAb HRP-NSEmAb Coating NSEmAb P /N 图7 双抗夹心 ELISA 特异性检测 Fig 7 图5 NSE 单克隆抗体的免疫组化染色 Fig 5 Specificity detection of double-antibody sandwich ELISA Immunohistochemical staining with NSE antibody 小时时与其它组之间 OD 值差异明显但作用 30 分钟时阳性 OD 值偏低; 在 2 小时时阴性值偏高 P / N 值偏低易出现假阳性反应最后考虑到时间和 OD 值问题我们选择封闭条件为 37 2 小时酶标抗体作用时间为 1 小时 2 7 标准曲线的建立标准蛋白浓度在 ng / ml 检测范围内曲线趋近直线线性关系最佳以 OD450 值为纵坐标 NSE 融合蛋白浓度的对数为横坐标做标准曲线( 图 6) 通过计算 9 个阴性图6 双抗夹心 ELISA 法的标准曲线 Fig 6 Standard curve of double-antibody sandwich ELISA 酶标#4 抗体配对效果最好 #3NSE 抗体包被浓度为 2 μg / ml 酶标抗体稀释度为时效果最佳在蛋白标准品浓度为 100 ng / ml 时 #3 和酶标 #4 抗体各组合的 P / N 值见表双抗夹心 ELISA 法的优化在检测蛋白浓度为 300 ng / ml 时以 OD450 值和 P / N 值为优化标孔的平均值 ( x ) 为以 P / N 2 1 ( P = N = ) 的最低 NSE 融合蛋白浓度为标准计算试剂盒的最低检测极限为 8 85 ng / ml 标准差 ( SD) 为吸收值 x + 2SD = 根据标准曲线的回归方程 y = 0 321x R2 = 其相对应的浓度为 6 49 ng / ml 即该方法的检测灵敏度为 6 49 ng / ml 2 8 试剂盒的特异性的鉴定以检测蛋白浓度为 100 ng / ml 对试剂盒的特异性进行鉴定结果显示 4 过夜时阳性和准不同封闭条件下的结果显示 NSE 双夹心试剂盒与 NSE 融合蛋白结合的 OD450 值显著高于与其它蛋白结合的 OD450 值( 图 7) 37 封闭 4 小时和 2 小时差别阴性值都稍微偏高小时 1. 5 小不大酶标抗体在作用时间 50 分钟定时时 OD 值之间差异不明显在作用 30 分钟和 2 双单抗夹心 ELISA 法的可重复性及稳定性鉴用 #3 NSE 抗体包被好的酶标板置于4 储存 ( 下转第 935 页)

5 鄢仁晴等肺结核患者外周血 CD4 + 和 CD8 + 记忆性 T 细胞亚群 IL-17 IL-27 表达的初步探讨第 10 期 Matthews K,Wilkinson K A,Kalsdorf B et al. Predominance of interleukin-22 over interleukin-17 at the site of disease in human tuberculosis[j]. Tuberculosis,2011; 91( 6) : Peng M Y,Wang Zh H,Yao Ch Y et al. Interleukin 17-producing γδt cells increased in patients with active pulmonary tuberculosis [J]. 细胞与分子免疫学英文版,2008; 5( 3) : Walrath J,Zukowski L,Krywiak A et al. Resident Th1-like effector memory cells in pulmonary recall responses to mycobacterium tuberculosis[j]. Am J Respir Cell Mol Biol,2005; 33( 1) : Huster K M,Koffler M,Stemberqer C et al. Unidirectional development of CD8 + central memory T cells into protective Listeria-specific effector memory T cells [J]. Eur J Immunol,2006; 36 ( 6) : 范艳, 杨利桃, 李丽 et al. 人外周血卡介苗 ( BCG) 特异性中央型和记忆型 CD4 + 细胞的特 [J]. 中国免疫学杂志,2006; 22( 5) : Wang X,Cao Z,Jiang J et al. Association of mycobacterial antigenspecific CD4( + ) memory T cell subsets with outcome of pulmonary tuberculosis[j]. Infect,2010; 60( 2) : 孙丽. 关于 CD8 细胞在结核病免疫治疗效果评价中的意义之我见 [J]. 中国防痨杂志,2002; 24( 1) : Jeyanathan M,Mu J,McCormick S et al. Murine airway luminal antituberculosis memory CD8 T cells by mucosal immunization are maintained via antigen-driven in situ proliferation,independent of peripheral T cell recruitment[j]. Am J Respir Crit Care Med, 2010; 181( 8) : Scriba T J,Kalsdorf B,Abrahams D A et al. Distinct,specific IL- 17 and IL-22 producing CD4 + T cell subsets contribute to the human anti-mycobacterial immune response[j] J Immunol,2008; 180 ( 3) : 项杰, 章晓联, 席淑红. 结核病人血清 IL-27 TNF-α IFN-γ 的检测及其免疫学意义 [J]. 数理医药学杂志,2009; 22 ( 2) : Villarino V,Larkin J,Sarisc J et al. Positive and negative regulation of the IL-27 receptor during lymphoid cell activation [J]. Immunol, 2005; 174( 12) : Holscher C,Holsher A,Ruckerl D et al. The IL-27 receptor chain WSX2-1 differentially regulates antibacterial immunity and survival during experimental tuberculosis[j]. Immunol,2005; 174 ( 6 ) : Villarino A V,Larkin J 3 rd,saris C J et al. Positive and negative regulati on of the IL-27 receptor during lymphoid cell activation[j]. Immunol,2005; 174( 12) : Holscher C,Holscher A,Ruckerl D et al. The IL-27 receptor chain WSX2-1 differentially regulates antibacterial immunity and survival during experimental tuberculosis[j]. Immunol,2005; 174 ( 6 ) : Batten M,Li J,Yi S et al. Interleukin 27 limits autoimmune encephalomyelitis by supp ressing the development of interleukin 17 producing T cells[j]. Nat Immunol,2006; 7( 9) : Stumhofer J S,Laurence A,Wilson E H et al. Interleukin 27 negatively regulates the development of interleukin 17 producing T helper cells during chronic inflammation of the central nervous system[j]. Nat Immunol,2006; 7( 9) : [ 收稿修回 ] ( 编辑许四平 ) ( 上接第 925 页 ) 3 个月后, 重复我们建立标准曲线检测标准蛋白的实验结果回归方程为 y = x ,R 2 = , 最低检测极限为 ng /ml OD450 值与储存前有一定的区别, 但曲线斜率最低检测极限与储存前变化不大, 并不影响试剂盒本身的测定, 说明该试剂盒在 4 条件下至少可以保存 3 个月, 我们的试剂盒具有较高的稳定性和可重复性 3 讨论神经元特异性烯醇化酶是目前公认的小细胞肺癌高特异性高敏感性的肿瘤标志物 [6,7], 并与病情的分期密切相关因此, 开发一种准确方便和经济的检测方法, 对该指标的进一步临床应用具有重要意义自从 Reeve [8] 于 1986 年成功地制作了 NSE 单克隆抗体以来, 其在 APUD 肿瘤中的诊断已得到了广泛的应用本实验中自制的 NSE 单克隆抗体效价高稳定性好, 并对这些单抗进行了 WB IF IHC 多种免疫学实验, 证实我们的抗体可特异性地识别细胞的 NSE 蛋白, 特别是该抗体可以很好地识别分泌到细胞培养基上清液中的 NSE 蛋白, 为将来进行临床血液检测打下良好的基础同时本研究所建立的双抗夹心 ELISA 定量检测方法及可行性的初步验证, 为相关诊断试剂盒的应用奠定了坚实基础 4 参考文献 1 Jacobi C,Reiber H. Clinical relevance of increased neuron-specific enolase concentration in cerebrospinal fluid[j]. Clin Chim Acta, 1988; 177 ( 1) : Schaarschmidt H,Prange H W,Reiber H et al. Neuron-specific enolase concentrations in blood as a prognostic parameter in cerebrovascular diseases[j]. Stroke,1994; 25 ( 3) : 邱玉华, 张学光. 鼠抗人 sil-6rmab 的制备及 sil-6r 检测方法的建立 [J]. 细胞与分子免疫学杂志,1997; 13( 4) : 徐志凯. 实用单克隆抗体技术 [M]. 西安 : 陕西科学技术出版社, 1992: 鲍建芳, 沈建根. 免疫学实验技术 [M]. 杭州 : 浙江大学出版社, 2006: 李蓉, 李睿. 肺癌肿瘤标记物研究进展 [J]. 国外医学肿瘤分册,1996; 23( 2) : 杨德昌, 杨拴盈. 肺癌诊断水平的现状与进展 [J]. 中华结核和呼吸杂志,2001; 24( 8) : Reeve J L,Stewart J,Watson J V et al. Neuron specific enolase expression in carcinoma of the lung[j]. Br J Cancer,1986; 53( 4) : [ 收稿修回 ] ( 编辑许四平 )

材料方法

材料方法生物技术通报姜燕采用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体及对照抗体羊抗鼠利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原在内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白抗体方法检测效价免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡法检测效价的结果显示鼠抗人