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叮邢
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1 2015 年 10 月 Vol.33 No.10 October 2015 Chinese Journal of Chromatography 1040 ~ 1045 研究论文 DOI: / SP.J 高效液相色谱四极杆 / 静电场轨道阱高分辨质谱测定奶粉中的低聚果糖刘芸 1, 丁涛 1, 徐素丽 2, 吴斌 1, 沈崇钰 1, 张睿 1, 王艳 1 1, 费晓庆 (1. 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心, 江苏南京 ; 2. 南京医科大学公共卫生学院, 江苏南京 ) 摘要 : 建立了高效液相色谱四极杆 / 静电场轨道阱高分辨质谱法测定奶粉中低聚果糖的方法奶粉样品用水溶解, 加乙酸锌沉淀蛋白, 经离心 0 22 μm 粒径的微孔膜过滤后, 采用 Carbohydrate 色谱柱 ( 100 mm 2 1 mm, 2 6 μm) 进行分离, 以乙腈与 0 1% 乙酸水溶液为流动相进行梯度洗脱质谱采用正离子 Target MS / MS 模式, 在分离窗口为 m / z 4 0 和碰撞能为 30 ev 的条件下, 提取响应值较高且在待测样品中无干扰的目标子离子的精确质量数, 此方法能够很好地排除样品中的基质干扰在所建立的色谱质谱条件下, 蔗果三糖 (GF 2 ) 蔗果四糖 ( GF 3 ) 和蔗果五糖 (GF 4 ) 能够得到较好的分离, 高分辨质谱提取的质量准确度小于 (5 ppm), 整个分析时间只需 10 min 该方法对 GF 2 和 GF 3 的检出限可达 100 μg / kg, 对 GF 4 的检出限可达 55 μg / kg 待测物质采用外标法定量, 线性关系良好, 相关系数均大于通过加标验证, 在 5 10 和 20 mg / kg 3 个加标水平下, 奶粉中 GF 2 的平均回收率在 75 8% ~ 107 3% 范围内, 相对标准偏差 (RSD) 在 1 6% ~ 8 3% 范围内该方法样品前处理过程简单, 只需沉淀蛋白质, 通过二级子离子的选择即可排除基质干扰, 分析时间短, 测定结果准确可靠, 适用于任何奶粉的高通量测定关键词 : 高效液相色谱四极杆 / 静电场轨道阱质谱 ; 高分辨质谱 ; 低聚果糖 ; 奶粉中图分类号 :O658 文献标识码 :A 文章编号 : (2015) Determination of fructo oligosaccharides in milk powder by high performance liquid chromatography quadrupole / electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry LIU Yun 1, DING Tao 1, XU Suli 2, WU Bin 1, SHEN Chongyu 1, ZHANG Rui 1, WANG Yan 1, FEI Xiaoqing 1 (1. Animal, Plant and Food Inspection Center, Jiangsu Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing , China; 2. School of Public Health, Nanjing Medical University, Nanjing , China) Abstract: A method of high performance liquid chromatography quadrupole / electrostatic field Orbitrap high resolution mass spectrometry ( HPLC Q / Orbitrap MS) was developed to deter mine fructo oligosaccharides in milk powder. The milk powder samples were dissolved in deion ized water. Subsequently, an aqueous solution of zinc acetate was used to precipitate protein. After centrifugation, the final aqueous solution was filtered by a polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane with pore size of 0 22 μm. The analytes were separated on a Carbohydrate column (100 mm 2 1 mm, 2 6 μm) through gradient elution with the combination of acetoni trile and 0 1% formic acid aqueous solution. The target MS / MS templates were performed at isolation window of m / z 4 0 and collision energy of 30 ev in positive mode to extract the accu rate product ion mass of analytes. Under the optimal condition, 1 kestose ( GF 2 ), nystose 通讯联系人.Tel:(025) ,E mail:dingt@ jsciq.gov.cn. 基金项目 : 江苏出入境检验检疫局科技计划项目 (2015KJ29); 国家科技支撑计划课题 (2014BAK19B00,2014BAK19B02). 收稿日期 :

2 第 10 期刘芸, 等 : 高效液相色谱四极杆 / 静电场轨道阱高分辨质谱测定奶粉中的低聚果糖 1041 (GF 3 ) and 1 F β fructofuranosyl nystose ( GF 4 ) were well separated and the accuracy of extracted mass routinely detected was below (5 ppm). The whole analysis time is only ten minutes. The detection limits for GF 2 and GF 3 were 100 μg / kg, and the detection limit for GF 4 was 55 μg / kg. Good linearities were obtained in their respective linear ranges with correla tion coefficients higher than The average recoveries at three spiked levels (5, 10 and 20 mg / kg) were in the range of 75 8% % and the relative standard deviations (RSDs) were in the range of 1 6% -8 3%. The proposed method is simple, sensitive, fast and only in need of precipitation of proteins. The interference of matrix can be eliminated through the selection of product ion. The results were convenient and reliable and thus can be used in the large batch determination of any milk powder. Key words: high performance liquid chromatography quadrupole / electrostatic field orbitrap mass spectrometry ( HPLC Q / Orbitrap MS); high resolution mass spectrometry ( HRMS); fruc to oligosaccharides; milk powder 低聚果糖 ( fructo oligosaccharides, FOS), 又名蔗果低聚糖寡果糖或蔗果三糖族低聚糖, 它是由蔗糖和 1 ~ 3 个果糖基通过 β 1,2 糖苷键结合而成的聚合度 (DP) 为 2 ~ 9 的低聚糖低聚果糖包括蔗果三糖 (1 kestose, GF 2 ) 蔗果四糖( nystose, GF 3 ) 和蔗果五糖 ( 1 F β fructofuranosyl nystose, GF 4 ) [1,2] 低聚果糖具有良好的生理功能, 特别对人体内微生物环境有双向调节作用, 增加人体内有益菌群双歧杆菌, 抑制有害菌的繁殖, 改善肠道环境, 防止便秘 ; 此外还具有降低血清胆固醇促进人体内 B 族维生素的合成, 预防龋齿提高机体免疫力等重要功能, 又被称作双歧因子 [3] 目前已广泛使用于奶粉牛奶和乳饮料等各类食品中作为功能性配料 [4-8] 如何准确快速地对低聚果糖的含量进行检测, 成为国家食品安全监管部门和生产厂商迫切需要解决的问题食品中添加的低聚果糖主要有两种来源, 一种是以蔗糖为原料, 由果糖基转移酶转化精制而得到, 其主要成分为 GF 2 ; 另一种是以菊苣或菊芋提取的菊粉为原料, 经酶解或酸解而生成的果聚糖, 其主要包括果果三糖 (inulo triose, F 2 ) 果果四糖 ( inulo tetraose, F 3 ) 和果果五糖 ( inulo pentaose, F 4 ) [9] 目前, 国家标准中没有相应的检测低聚果糖含量的方法,AOAC [10] 规定了采用酶解法可以定量检测食物中的果聚糖和低聚果糖, 该方法适用于以菊粉为原料经过酶解制得的低聚果糖的定量分析而国内食品中添加的低聚果糖以第一种来源为主, 直接采用适合的溶剂浸提, GF 2 GF 4 就可以游离出来, 无需采用复杂的酶解法处理由于低聚糖类物质没有紫外吸收, 目前的研究中, 对其含量测定通常采用高效液相色谱示差折光检测器 (HPLC RID) 的方法 [11,12] 高效液相色谱蒸发光散射检测器 ( HPLC ELSD) [13,14] 和离子色谱法 [15,16] HPLC RID 法要求色谱系统平衡时间较长, 分析过程中要求恒温, 且无法进行梯度洗脱 [17], 同时由于其检测灵敏度不高, 只能测定低聚果糖含量较高的样品, 而国内添加益生元的食品中低聚果糖的含量在 0 5% ~ 2% ( 质量分数 ), 因此,HPLC RID 不适用于低聚果糖的测定 HPLC ELSD 和离子色谱法克服了 HPLC RID 方法的不足, 虽然灵敏度较好, 能够达到分析检测的要求, 但是抗基质干扰能力差, 添加低聚果糖的乳粉和乳制品中一般也会含有一些单糖和双糖, 而这些单双糖的分离会影响到低聚果糖的准确定量 ; 对于基质简单的样品, 要达到低聚果糖的良好分离度, 则需要牺牲分析时间 ; 而对于基质较复杂的样品,HPLC ELSD 和离子色谱法则会存在定量结果不准确以及样品前处理复杂等 [9] 不足耿丽娟等在运用离子色谱法测定奶粉中低聚果糖时前处理还需要用 SPE 柱进行样品脱脂处理, 步骤较繁琐, 且分析时间为 30 min, 不能满足高通量分析本研究针对基质复杂的乳粉和米粉样品, 充分利用高效液相色谱四极杆 / 静电场轨道阱高分辨质谱灵敏度高和抗干扰能力强的特点, 建立了一种前处理过程简便分析时间短测定结果准确的方法 1 实验部分 1.1 仪器试剂和材料四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪 Q Exac tive( 赛默飞世尔科技公司 ), 配备有 HESI Ⅱ 源, 液相色谱系统为 Dionex 3000 高压液相色谱, 自动进

3 1042 色谱第 33 卷样器 ; 涡旋混合器 ( XW 80A 型, 上海医科大学仪器厂 ); 高速离心机 ( Sigma, 德国公司 ); LP403 分析天平 ( 赛多利斯, 德国公司 ) 低聚果糖标准样品采用日本株式会社的色谱级标准试剂套装, 包含蔗果三糖 ( 纯度 99 9%) 蔗果四糖 ( 纯度 99 9%) 蔗果五糖( 纯度 99 9%); 乙腈 ( 色谱纯 ) 购自德国 Merck 公司 ; 冰醋酸 ( 色谱纯 ) 购自美国 TEDIA 公司 ; 乙酸锌 ( 分析纯 ) 购自南京化学试剂有限公司所有实验用水均由 Milli Q 超纯水系统 ( 美国 ) 制备 1.2 标准溶液的配制分别精确称量 10 0 mg( 精确至 0 1 mg) 蔗果三糖蔗果四糖蔗果五糖标准品, 用超纯水溶解并定容至 10 ml, 配成 1 0 g / L 的标准贮备液, 密封保存于 4 冰箱中标准工作溶液的配制 : 根据需要, 吸取一定量的标准储备液, 用水逐级稀释, 分别稀释成和 1 0 mg / L 低聚果糖混合标准使用液, 于 4 冰箱中贮存 1.3 样品前处理准确称取奶粉样品 1 g 于 50 ml 容量瓶中, 加入约 20 ml 左右的水, 涡旋 30 s 混合均匀, 加入 1 ml 浓度为 10 mmol / L 的乙酸锌水溶液混合均匀后, 超声 20 min, 最后加水定容, 混合均匀后取适量溶液采用 r / min 的离心机高速离心 5 min, 经 0 22 μm 的水相滤膜过滤至进样瓶中, 稀释 10 倍供高效液相色谱四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪测定如果低聚果糖浓度仍较高, 可根据线性范围适当稀释 1.4 色谱质谱条件色谱条件色谱柱为 Agilent Carbohydrate(100 mm 2 1 mm, 2 6 μm); 流动相为 0 1% 甲酸水溶液 ( A) 和乙腈 ( B); 流速 0 60 ml / min; 进样量 10 μl; 柱温箱温度 25 采用梯度洗脱的分离模式, 具体洗脱程序为 : 0 ~ 2 min, 80% B; 2 ~ 5 min, 80% B ~ 20% B; 5 ~ 8 5 min, 20% B; 8 5 ~ 9 min, 20% B ~ 80% B; 9 ~ 10 min, 80% B 质谱条件可加热的电喷雾离子源 ( HESI Ⅱ); 采用正离子扫描模式 ; 毛细管温度 320, 鞘气 ( N 2 ) 流速 50 L / min, 辅助气 (N 2 ) 流速 8 L / min, 吹扫气 (N 2 ) 流速 5 L / min; 喷雾电压 3 kv, 透镜电压 50 V; 采用正离子 Target MS / MS 扫描模式 ; 分辨率 R = , 碰撞能 30 ev, AGC target 2e 5, 最大驻留时间 100 ms, 分离窗口 m / z 结果和讨论 2.1 沉淀剂的选择奶粉基质复杂, 含有大量蛋白, 因此在实验前, 首先选择合适的沉淀剂进行处理常用除蛋白的方法有乙腈酸盐沉淀法和等电点法虽然乙腈是挥发性的有机溶剂, 具有较好的沉淀蛋白的作用, 与液相色谱质谱方法的处理步骤相匹配, 但其对于奶粉样品中的蛋白沉淀不完全, 因此不使用该方法, 实验比较了 ( A ) 6% ( v / v ) 冰醋酸水溶液 ( B ) 10 mmol / L 乙酸锌水溶液和 (C) 等电点调节 ph 法 ( 用 5 mol / L 盐酸调节 ph 为 1 90±0 50, 放置 2 min, 再用 5 mol / L 氢氧化钠调节 ph 为 4 70±0 50)3 种方法的差异以空白国内婴幼儿配方奶粉 ( S1) 和国外某品牌婴幼儿奶粉 (S2) 为例, 比较了不同方法沉淀蛋白的回收率情况, 结果如表 1 所示中性乙酸锌沉淀蛋白的回收率最高, 其次为冰乙酸溶液, 而等电点法 [4] 回收率最低文献报道, 强酸会分解部分双糖和低聚糖, 可能导致等电点法回收率最低因此, 最终选择 10 mmol / L 乙酸锌水溶液作为奶粉中低聚果糖测定的蛋白沉淀剂表 1 采用不同沉淀蛋白方式处理奶粉样品的比较 Table 1 Comparison of different precipitation methods for milk powder samples Recoveries / % Milk sample Precipitation GF 2 GF 3 GF 4 S1 A B C S2 A B C S1: domestic milk sample; S2: foreign milk sample. A: 6% (v / v) acetic acid aqueous solution; B: 10 mmol / L zinc ace tate solution; C: adjusting the ph based on the isoelectric point. 2.2 色谱柱和色谱条件的优化对于糖的分析, 常用的是氨基柱和碳水化合物柱考虑到色谱柱的使用寿命, 选用碳水化合物柱对低聚果糖进行分析碳水化合物柱属于正相色谱柱, 乙腈比例由多到少变化时, 对分析物的洗脱能力逐渐增强实验主要对 Carbohydrate ( 100 mm 2 1 mm, 2 6 μm) 和 Carbohydrate(150 mm 4 6 mm, 5 μm) 两种规格的色谱柱进行了比较对于低聚果糖标准品的分离, 两种色谱柱均显示了相同的较好的分离度 ; 但对于奶粉实际样品的分离, 由于

4 第 10 期刘芸, 等 : 高效液相色谱四极杆 / 静电场轨道阱高分辨质谱测定奶粉中的低聚果糖 1043 基质复杂干扰较大, 两种色谱柱的效果都不令人满意大部分添加低聚果糖的奶粉中会含有一些单糖和双糖, 而这些单糖和双糖的分离会对低聚果糖的准确定量产生影响, 所以实验中选用柱效高填料粒径较小的 2 6 μm 的色谱柱同时, 也确立了梯度洗脱的程序对实际样品进行分离分析, 以排除基质干扰的影响 2.3 质谱条件的优化本实验在 ESI + 模式下, 采用流动注射方式, 首先对 GF 2 进行高分辨质谱全扫描, 以准分子离子 [M+H] + 理论精确质量数提取色谱图在全扫描采集模式下分辨率 ( R) 为时, 得到一级全扫描的质谱图, 分析物相对质量偏差小于但在实际奶粉样品测定中, 发现一级全扫描质谱图提取的色谱峰干扰较大, 不能进行准确定量 ( 见图 1a) 换用 Target SIM 质谱模式后, 发现实际样品中的干扰仍然无法消除因此在 Target MS / MS 模式下, 进行二级质谱分离分析, 在碰撞能为 30 ev 时, 以 [M+H] + 离子为母离子得到的二级碎片离子的全扫描质谱图见图 2, 选择丰度相对较高和相对分子质量较大的碎片离子, GF 2 选择的子离子均为 , 实际奶粉样品没有干扰, 具体质谱图如图 1b 所示 Fig. 1 图 1 实际样品中 GF 2 的 (a) 一级全扫描质谱图和 (b) 二级提取离子流色谱图 ( a) First full scan accurate mass spectra and ( b) second extracted chromatograms of GF 2, GF 3 and GF 4 in milk samples 2.4 方法学评价线性范围及检出限基于优化的色谱和质谱条件, 采用 Orbitrap 高分辨质谱对 1.2 节配制的 GF 2 混合标准溶液进行定量分析分别以各物质二级定量离子的色谱峰面积为纵坐标 y 以相应的质量浓度为横坐标 x, 绘制标准曲线在空白样品中添加低浓度的各目标化合物, 获得信噪比为 3(S / N = 3) 时对应的浓度为此方法的检出限, 获得信噪比为 10(S / N = 10) 时对应的浓度为此方法的定量限所得结果如表 2 所示 GF 2 的相关系数 ( r) 大于表 2 GF 2 的线性方程相关系数保留时间检出限和定量限 Table 2 Regression equations, correlation coefficients ( r), retention times (t R ), limits of detection ( LODs, n Compound = 5) and limits of quantification ( LOQs, n = 5) of the GF 2, GF 3 and GF 4 compounds Regression equation r t R / min LOD / LOQ / (μg / kg) (μg / kg) GF 2 y = x GF 3 y = x GF 4 y = x y: peak area; x: mass concentration, mg / L. Linear range: mg / L.

5 1044 色谱第 33 卷图 2 GF 2 标准物质的二级全扫描质谱图 Fig. 2 Second full scan accurate mass spectra of GF 2, GF 3 and GF , 且在 0 1 ~ 2 0 mg / L 范围内线性关系良好回收率和精密度分别对空白国内婴幼儿配方奶粉 ( S1) 和国外婴幼儿奶粉 (S2) 进行了 5 10 和 20 mg / kg 共 3 个不同添加水平的加标回收率试验, 对于每个添加水平重复测定 5 次, 测得 GF 2 的回收率范围和相对标准偏差范围见表 3, 可以看出, 回收率在 75 8% ~ 107 3% 范围内,RSD 在 1 6% ~ 8 3% 范围内可见, 该方法对不同品牌奶粉的检测具有通用性, 能够用于日常分析检测表 3 2 种不同品牌奶粉中 GF 2 的加标回收率 (n = 5) Table 3 Recoveries of GF 2, GF 3 and GF 4 spiked in two different kinds of milk samples (n = 5) Milk sample Spiked / (mg / 100 g) GF 2 Recovery / % RSD / % GF 3 Recovery / % RSD / % GF 4 Recovery / % RSD / % S S 实际样品的检测本研究以实验室从各超市抽查的样品为分析对象, 其中包括不同品牌的 5 种进口婴幼儿奶粉和 5 种国产奶粉 ( 包括 2 种孕妇奶粉 2 种婴幼儿配方奶粉 1 种老年奶粉 ), 按照 1 3 节的样品前处理方法处理样品, 采用优化后的 LC MS / MS 条件定性和定量分析奶粉中的低聚果糖, 结果如表 4 所示, 可见市售奶粉中的低聚果糖含量基本与标签值一致, 只有一个奶粉的低聚果糖值与标签不符, 其他都略高于标签值

6 第 10 期刘芸, 等 : 高效液相色谱四极杆 / 静电场轨道阱高分辨质谱测定奶粉中的低聚果糖 1045 表 4 10 种奶粉样品中低聚果糖的检测结果及标签值 (n = 5) Table 4 Determination results and labeled values of fructo oligosaccharides ( FOS) in ten milk powder samples ( n = 5) Sample No. GF 2 / (mg / 100 g) GF 3 / (mg / 100 g) GF 4 / (mg / 100 g) Total / (mg / 100 g) Labeled value / (mg / 100 g) 结论本研究通过优化样品前处理条件和色谱分离条件, 建立了奶粉中低聚果糖的高效液相色谱四极杆 / 静电场轨道阱高分辨质谱检测方法该方法避免了复杂的样品前处理过程, 具有分析时间短, 样品基质对目标化合物的测定无干扰, 精密度和灵敏度高, 定量结果准确可靠等优点应用于实际乳粉样品的检测结果表明, 该方法可以较好地识别出市售乳粉中的各组分低聚果糖, 并能够对奶粉样品中添加的低聚果糖进行准确定量参考文献 : [1] Zhang W. Journal of Biological ( 张伟. 生物学杂志 ), 2000, 17(1): 7 [2] Jiang B, Zhang T, Wang Z. Journal of Wuxi University for Light Industry ( 江波, 张涛, 王璋. 无锡轻工大学学报 ), 2001, 20(5): 445 [3] Chen M X, Zhu W J. Biology Teaching ( 陈木香, 朱文杰. 生物学教学 ), 2008, 33(5): 61 [4] Liu Y F, Li D, Tang H C, et al. Journal of Dairy Science and Technology ( 刘玉峰, 李东, 唐华澄, 等. 乳业科学与技术 ), 2012, 35(1): 40 [5] Gnoth M J, Kunz C, Kinne Saffran E, et al. J Nutr, 2000, 130(12): 3014 [6] Gao X J. Liquor Making ( 高晓娟. 酿酒 ), 2008, 35(4): 90 [7] GB [8] Robefrorid M B. Am J Clin Nutr, 2001, 73(Suppl): 406 [9] Geng L J, Huang J R, Feng F, et al. Chinese Journal of Chromatography ( 耿丽娟, 黄峻榕, 冯峰, 等. 色谱 ), 2014, 32(12): 1380 [10] AOAC Official Method [11] Wei F, Wu Z Y, Ma L Y, et al. Asia Pacific Traditional Medicine ( 魏锋, 吴朝阳, 马玲云, 等. 亚太传统医药 ), 2009, 5(9): 20 [12] Ding H L, Li C, Jin P, et al. Chinese Journal of Chroma tography ( 丁洪流, 李灿, 金萍, 等. 色谱 ), 2013, 31(8): 804 [13] Wang Y Z, Yao P J, Wei Y A. Food Industry ( 王银珍, 姚评佳, 魏远安. 食品工业 ), 2009(2): 71 [14] Lin S J, Xiao H L, Guo B K. Chinese Journal of Health Inspection ( 林赛君, 肖海龙, 郭柏坤. 中国卫生检验杂志 ), 2009, 19(11): 2549 [15] Wang M H, Li M, Guo J, et al. Chinese Journal of Health Inspection ( 王美菡, 李敏, 郭健, 等. 中国卫生检验杂志 ), 2007, 17(6): 961 [16] Zhang Y Y, Nie S P, Wan C, et al. Food Science ( 张媛媛, 聂少平, 万成, 等. 食品科学 ), 2009, 30(18): 237 [17] Bai J, Jiang J D, Tao D L. Food Science ( 白靖, 姜金斗, 陶大利. 食品科学 ), 2014, 35(2): 257

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.